CN111388422A - 一种阳离子角鲨烯脂质体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种阳离子角鲨烯脂质体及其制备方法，所述阳离子角鲨烯脂质体包括以下组分：磷脂、固醇、角鲨烯、十八胺、无菌蒸馏水以及甘油。本发明以磷脂、固醇、角鲨烯、十八胺、无菌蒸馏水和甘油为原材料，将角鲨烯包埋于脂质体中制成角鲨烯脂质体，从而保护角鲨烯免受外界的不利影响，增强角鲨烯的稳定性；同时，通过十八胺的添加使角鲨烯脂质体表面带正电荷，使得角鲨烯脂质体相互间具有静电斥力，更加有利于脂质体的稳定，大大提高了角鲨烯的稳定性和生物可利用率，拓宽了角鲨烯在各种领域的应用，为角鲨烯用于免疫增强剂、疫苗佐剂及其他药物传输体系提供了基础，具有良好的应用前景。

Description

一种阳离子角鲨烯脂质体及其制备方法

技术领域

本发明涉及角鲨烯技术领域，具体涉及一种阳离子角鲨烯脂质体及其制备方法。

背景技术

角鲨烯主要来源于鲨鱼肝油中，此外人体器官中也有角鲨烯的存在，例如存在于包括肝脏、皮肤、脂肪细胞、指甲、血液和脑等器官。在植物油中，角鲨烯也被广泛发现，例如它在花生油、南瓜籽油、小麦胚芽油、米糠油和橄榄油等中广泛存在。研究发现角鲨烯具有较强的生物活性，在血液中输送活性氧的能力很强，可增强机体生理功能，提高免疫力，还可帮助抵抗紫外线伤害，是性能优良的血液输氧剂和生物抗氧化剂。许多研究结果表明，角鲨烯对于肿瘤的治疗具有一定的生物活性，其作用机理是可以抑制肿瘤细胞的生长，并增强机体的免疫力，从而增强对肿瘤的抵抗力。除了较好的抗肿瘤作用以外，对其它一些疾病，如溃疡、痔疮、皮炎和皮肤烫伤等症状也有一定的疗效，并可治疗或辅助治疗高血脂症。这些作用引起了食品学、药学及免疫学界的广泛关注和研究。

然而，角鲨烯是含有6个双键的三萜烯化合物，具有不饱和度高、易氧化等特点，在环境中其性质极不稳定，因此如何对角鲨烯进行有效的保护，对于其进一步的推广和应用具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种阳离子角鲨烯脂质体及其制备方法，旨在提高角鲨烯的稳定性。

为实现上述目的，本发明提出一种阳离子角鲨烯脂质体，包括以下组分：

磷脂、固醇、角鲨烯、十八胺、蒸馏水以及甘油。

可选地，所述磷脂、固醇、角鲨烯、十八胺、蒸馏水以及甘油的质量比为(300～350)：(30～60)：(150～250)：(1～5)：(30000～40000)：(380～1260)。

可选地，所述磷脂包括大豆卵磷脂和蛋黄卵磷脂中的至少一种。

可选地，所述固醇包括胆固醇、谷甾醇和豆甾醇中的至少一种。

可选地，所述阳离子角鲨烯脂质体的表面平均电位为20～45mV，平均粒径为150～220nm。

此外，本发明还提出一种如上所述的阳离子角鲨烯脂质体的制备方法，包括以下步骤：

将磷脂、固醇、角鲨烯和十八胺溶解于乙醇中，制得油相；

将甘油加入到蒸馏水中制成水相；

在搅拌作用下，将所述水相注入到所述油相中，制成均一透明的乳液；

去除所述乳液中的乙醇，得到中间产物；

向所述中间产物中加入蒸馏水，震荡混合，得到角鲨烯脂质体粗混悬液；

对所述角鲨烯脂质体粗混悬液进行均质处理，制得角鲨烯脂质体。

可选地，在搅拌作用下，将所述水相注入到所述油相中，制成均一透明的乳液的步骤中：

所述水相中蒸馏水的体积与所述油相中乙醇的体积比为1:1。

可选地，在搅拌作用下，将所述水相注入到所述油相中，制成均一透明的乳液的步骤，包括：

在400～800r/min速率的磁力搅拌作用下，将所述水相注入到所述油相中，制成均一透明的乳液。

可选地，去除所述乳液中的乙醇，得到中间产物的步骤，包括：

在20～40℃下，通过旋转蒸发除去所述乳液中的乙醇，得到中间产物。

可选地，对所述角鲨烯脂质体粗混悬液进行均质处理，制得角鲨烯脂质体的步骤中：

所述均质处理为在超声功率80～120W的条件下，超声处理10～20min。

本发明提供的技术方案中，以磷脂、固醇、角鲨烯、十八胺、无菌蒸馏水和甘油为原材料，将角鲨烯包埋于脂质体中制成角鲨烯脂质体，从而保护角鲨烯免受外界的不利影响，增强角鲨烯的稳定性；同时，通过十八胺的添加使得角鲨烯脂质体表面带正电荷，如此，角鲨烯脂质体相互间具有静电斥力，更加有利于脂质体的稳定，大大提高了角鲨烯的稳定性和生物可利用率，拓宽了角鲨烯在各种领域的应用，为角鲨烯用于免疫增强剂、疫苗佐剂及其他药物传输体系提供了基础，具有良好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明提供的阳离子角鲨烯脂质体的制备方法的一实施例的流程示意图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

角鲨烯是含有6个双键的三萜烯化合物，具有不饱和度高、易氧化等特点，在环境中其性质极不稳定，因此如何对角鲨烯进行有效的保护，对于其进一步的推广和应用具有非常重要的意义。

脂质体是20世纪60年代由Bangham博士在剑桥大学首次发现并命名的，并于1965年在分子生物杂志上发表。脂质体是由类脂组成的双分子空心球。当类脂分散在水中时，类脂由于其固有的特性，在水中自发地形成空心的双层球，在球的中间可加载亲水成分，而在双层膜中间可加载脂溶性成分。现在类脂应用最多的是卵磷脂。脂质体根据其形态可分为3种：多层脂质体(MLV)、大的单层体(LUV)和小的单层体(SUV)，这一般取决于制备工艺。脂质体系由磷脂为膜材及附加剂组成，磷脂为两性物质，其结构上有亲水及亲油基团。正是由于脂质体的这种类膜结构，使其能够携带各种亲水的、疏水的和两亲的物质，它们被包入脂质体内部水相，插入类脂双分子层或吸附连接在脂质体的表面，由于细胞质膜在细胞间物质传送以及其具有的细胞识别功能和方位的确定功能，脂质体具有良好的靶向性，因而近年来被广泛研究应用于定向药物载体。

鉴于此，本发明提出一种阳离子角鲨烯脂质体，以脂质体包埋角鲨烯，从而提高角鲨烯的稳定性。在本发明提供的阳离子角鲨烯脂质体的一实施例中，所述阳离子角鲨烯脂质体包括以下组分：磷脂、固醇、角鲨烯、十八胺、蒸馏水以及甘油。本发明提供的技术方案中，以磷脂、固醇、角鲨烯、十八胺、无菌蒸馏水和甘油为原材料，将角鲨烯包埋于脂质体中制成角鲨烯脂质体，从而保护角鲨烯免受外界的不利影响，增强角鲨烯的稳定性；同时，通过十八胺的添加使角鲨烯脂质体表面带正电荷，如此，角鲨烯脂质体相互间具有静电斥力，更加有利于脂质体的稳定，大大提高了角鲨烯的稳定性和生物可利用率，拓宽了角鲨烯在各种领域的应用，为角鲨烯用于免疫增强剂、疫苗佐剂及其他药物传输体系提供了基础，具有良好的应用前景。

进一步地，在本实施例中，所述磷脂、固醇、角鲨烯、十八胺、蒸馏水以及甘油的质量比为(300～350)：(30～60)：(150～250)：(1～5)：(30000～40000)：(380～1260)。在所述阳离子角鲨烯脂质体的制备过程中，为便于操作，原料中的液体可以以体积量取，此操作方法下，所述磷脂、固醇、角鲨烯、十八胺、蒸馏水以及甘油的添加比例为(300～350)mg：(30～60)mg：(150～250)mg：(1～5)mg：(30～40)mL：(0.3～1)mL，其中，以蒸馏水的密度为1g/cm³、甘油的密度为1.26g/cm³计算，即可得出上述的质量比，下文中均以液体原料采用体积量取的方式进行描述。

磷脂(Phospholipid)，也称磷脂类、磷脂质，是指含有磷酸的脂类，属于复合脂。在本发明中，所述磷脂可选用动物磷脂或植物磷脂，其中，动物磷脂主要来源于蛋黄、牛奶、动物体脑组织、肝脏、肾脏及肌肉组织部分；植物磷脂主要存在于油料种子，且大部分存在于胶体相内，并与蛋白质、糖类、脂肪酸、菌醇、维生素等物质以结合状态存在，是一类重要的油脂伴随物。进一步地，在本实施例中，所述磷脂更优选为大豆卵磷脂和蛋黄卵磷脂中的至少一种，来源更广泛，既可以是上述两种磷脂中的任意一种，也可以是以上两种磷脂的混合物。

固醇(sterol)又称甾醇，是类固醇的一类，是含有羟基的类固醇。它们均以环戊烷多氢菲为基本结构，并含有羟基，故称为固醇类化合物，是广泛存在于生物体内的一种重要的天然活性物质，按其原料来源分为动物性甾醇、植物性甾醇和菌类甾醇等三大类。动物性甾醇以胆固醇为主，植物性甾醇主要为谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇等，而麦角甾醇则属于菌类甾醇。上述三种来源的固醇均可作为本发明中所需的固醇，而在本实施例中更优选为包括胆固醇、谷甾醇和豆甾醇中的至少一种，更容易获得，既可以是上述多种固醇中的任意一种，也可以是其中两种或两种以上的混合物。

更进一步地，所述阳离子角鲨烯脂质体中，角鲨烯的包埋率达85.85～92.65％，所述阳离子角鲨烯脂质体的表面带正电荷，平均电位为20～45mV，平均粒径为150～220nm。由此，大大提高了角鲨烯的稳定性和生物可利用率，扩大了角鲨烯的应用范围。

此外，本发明还提出一种如上所述的阳离子角鲨烯脂质体的制备方法，先采用改良后的乙醇注入法，将磷脂、固醇、角鲨烯和十八胺溶解于乙醇中制成均一透明的乳液，再除去其中的乙醇后加水水化，得到角鲨烯脂质体粗混悬液，最后通过均质处理获得纳微米粒径范围内的阳离子角鲨烯脂质体，图1所示为本发明提供的阳离子角鲨烯脂质体的制备方法的一实施例。请参阅图1，在本实施例中，所述阳离子角鲨烯脂质体的制备方法包括：

步骤S10、将磷脂、固醇、角鲨烯和十八胺溶解于乙醇中，制得油相；

步骤S20、将甘油加入到蒸馏水中制成水相；

步骤S30、在搅拌作用下，将所述水相注入到所述油相中，制成均一透明的乳液；

先将磷脂、固醇、角鲨烯和十八胺溶解于乙醇中，作为油相；然后以甘油和蒸馏水的混合物作为水相；再将所述油相和水相混合，制成均一透明的乳液。如此，通过改良的乙醇注入法，以无水乙醇为中间溶剂，将角鲨烯等原料溶解分散于水相中。可以理解的是，在制备所述水相的步骤中、以及后续加水水化的步骤中，均需要添加蒸馏水，因此，原材料中准备的蒸馏水应当分作两部分，一部分用于制备所述水相，其体积与用于制备油相的乙醇体积比为1:1；剩余部分用于后续的水化处理获得角鲨烯脂质体粗混悬液。其中，假设用于制备所述水相的蒸馏水用量为a，后续用于水化的蒸馏水用量为b，a和b的具体数值不做限定，以a+b满足上述对所有原材料的添加量限定为准，但考虑到角鲨烯等原材料的快速分散和溶解，在具体操作时更优选为a：b＝2：(1～2)。

在通过步骤S10和步骤S20分别制得所述油相和所述水相后，将两者充分混合均一透明的乳液。需要说明的是，步骤S10和步骤S20的先后顺序并不限于此，也可以是步骤S20在前、步骤S10在后，或者步骤S10和步骤S20同步进行，只需要在步骤S30之前，分别完成所述油相和所述水相的制备即可。

进一步地，步骤S30中的搅拌作用可以通过机械搅拌、磁力搅拌等方式实现，优选为磁力搅拌，操作方式更为简便高效，在本实施例中，步骤S30可按以下方式进行：在400～800r/min速率的磁力搅拌作用下，将制得的水相注入到油相中，继续搅拌10～20min，使其形成均一透明的乳液。

步骤S40、去除所述乳液中的乙醇，得到中间产物；

去除所述乳液中的乙醇，可以采用例如旋转蒸发等通过连续蒸馏易挥发性溶剂的方式实现，具体地，在本实施例中，步骤S40包括：在20～40℃下，通过旋转蒸发除去所述乳液中的乙醇，得到中间产物。

步骤S50、向所述中间产物中加入蒸馏水，震荡混合，得到角鲨烯脂质体粗混悬液；

向所述中间产物中加入剩余量的蒸馏水，在室温下震荡3～5min进行水化，使角鲨烯插入磷脂双分子层中，得到角鲨烯脂质体粗混悬液。

步骤S60、对所述角鲨烯脂质体粗混悬液进行均质处理，制得角鲨烯脂质体。

在制得所述角鲨烯脂质体混悬液后，通过均质处理获得纳微米粒径范围内且粒径分布均匀的角鲨烯脂质体，所述均质处理可以采用探头超声或者高压均质机循环均质的方式，在本实施例中采用探头超声处理的方式，具体可按照以下方式操作：在超声功率80～120W的条件下，间歇超声10～20min，此处所指间歇超声是指，超声处理的总时长为10～20min，分多次间歇进行，以避免连续超声处理导致物料温度升高，影响角鲨烯脂质体的性能。

本发明提供的制备方法中，先采用改良后的乙醇注入法，将磷脂、固醇、角鲨烯和十八胺溶解于乙醇中制成均一透明的乳液，然后逆向蒸发去除乙醇，再加水水化，使角鲨烯插入磷脂双分子层中，通过脂质体包埋角鲨烯，制成角鲨烯脂质体，从而保护角鲨烯免受外界的不利影响，增强角鲨烯的稳定性；同时，通过十八胺的添加使制得的角鲨烯脂质体表面带正电荷，如此，角鲨烯脂质体相互间具有静电斥力，更加有利于脂质体的稳定，大大提高了角鲨烯的稳定性和生物可利用率；再进一步结合均质处理，能够获得不同粒径分布范围内的角鲨烯脂质体，拓宽了角鲨烯在各种领域的应用，为角鲨烯用于免疫增强剂、疫苗佐剂及其他药物传输体系提供了基础，并且此制备方法简单易行，可大规模工业化生产，具有良好的应用前景。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

(1)称取大豆卵磷脂300mg、胆固醇30mg、角鲨烯150mg和十八胺1mg，用20mL的无水乙醇溶解，制得油相；称取0.3mL的甘油加入到20mL的蒸馏水中，制得水相；然后在400r/min速率的磁力搅拌作用下，将制得的水相注入到油相中，继续搅拌15min，使其形成均一透明的乳液；

(2)将制得的乳液置于梨形瓶中，在20℃的水浴下旋转蒸发去除乙醇，得到中间产物；

(3)向步骤(2)中的梨形瓶中加入10mL的蒸馏水，在室温下震荡5min，得到角鲨烯脂质体粗混悬液；

(4)在80W的超声功率下，将制得的角鲨烯脂质体粗混悬液间歇超声10min，制得阳离子角鲨烯脂质体。

实施例2

(1)称取大豆卵磷脂325mg、胆固醇45mg、角鲨烯200mg和十八胺2.5mg，用20mL的无水乙醇溶解，制得油相；称取0.5mL的甘油加入到20mL的蒸馏水中，制得水相；然后在600r/min速率的磁力搅拌作用下，将制得的水相注入到油相中，继续搅拌20min，使其形成均一透明的乳液；

(2)将制得的乳液置于梨形瓶中，在30℃的水浴下旋转蒸发去除乙醇，得到中间产物；

(3)向步骤(2)中的梨形瓶中加入15mL的蒸馏水，在室温下震荡5min，得到角鲨烯脂质体粗混悬液；

(4)在100W的超声功率下，将制得的角鲨烯脂质体粗混悬液间歇超声15min，制得阳离子角鲨烯脂质体。

实施例3

(1)称取大豆卵磷脂350mg、胆固醇60mg、角鲨烯250mg和十八胺5mg，用20mL的无水乙醇溶解，制得油相；称取1mL的甘油加入到20mL的蒸馏水中，制得水相；然后在800r/min速率的磁力搅拌作用下，将制得的水相注入到油相中，继续搅拌10min，使其形成均一透明的乳液；

(2)将制得的乳液置于梨形瓶中，在40℃的水浴下旋转蒸发去除乙醇，得到中间产物；

(3)向步骤(2)中的梨形瓶中加入20mL的蒸馏水，在室温下震荡5min，得到角鲨烯脂质体粗混悬液；

(4)在120W的超声功率下，将制得的角鲨烯脂质体粗混悬液间歇超声20min，制得阳离子角鲨烯脂质体。

上述各实施例制得的阳离子角鲨烯脂质体的平均电位、平均粒径，以及角鲨烯在脂质体中的包埋率如下表1所示。

表1各实施例制得的阳离子角鲨烯脂质体的相关参数

	包埋率(％)	平均电位(mV)	平均粒径(nm)
				实施例1	90.56	20	210
实施例2	92.65	30	180
				实施例3	85.85	45	150

根据表1中的结果可知，通过本发明实施例制备的阳离子角鲨烯脂质体，角鲨烯在脂质体中的包埋率为85.85～92.65％，大大提高了角鲨烯的稳定性；脂质体表面带正电荷，平均电位为20～45mV；粒径分布均匀，平均粒径为150～220nm。说明通过本发明实施例提供的方法制得的产品质量可控性高，可进行大规模生产。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种阳离子角鲨烯脂质体，其特征在于，包括以下组分：

磷脂、固醇、角鲨烯、十八胺、蒸馏水以及甘油。

2.如权利要求1所述的阳离子角鲨烯脂质体，其特征在于，所述磷脂、固醇、角鲨烯、十八胺、蒸馏水以及甘油的质量比为(300～350)：(30～60)：(150～250)：(1～5)：(30000～40000)：(380～1260)。

3.如权利要求1所述的阳离子角鲨烯脂质体，其特征在于，所述磷脂包括大豆卵磷脂和蛋黄卵磷脂中的至少一种。

4.如权利要求1所述的阳离子角鲨烯脂质体，其特征在于，所述固醇包括胆固醇、谷甾醇和豆甾醇中的至少一种。

5.如权利要求1所述的阳离子角鲨烯脂质体，其特征在于，所述阳离子角鲨烯脂质体的表面平均电位为20～45mV，平均粒径为150～220nm。

6.一种如权利要求1至5任意一项所述的阳离子角鲨烯脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将磷脂、固醇、角鲨烯和十八胺溶解于乙醇中，制得油相；

将甘油加入到蒸馏水中制成水相；

在搅拌作用下，将所述水相注入到所述油相中，制成均一透明的乳液；

去除所述乳液中的乙醇，得到中间产物；

向所述中间产物中加入蒸馏水，震荡混合，得到角鲨烯脂质体粗混悬液；

对所述角鲨烯脂质体粗混悬液进行均质处理，制得角鲨烯脂质体。

7.如权利要求6所述的阳离子角鲨烯脂质体的制备方法，其特征在于，在搅拌作用下，将所述水相注入到所述油相中，制成均一透明的乳液的步骤中：

所述水相中蒸馏水的体积与所述油相中乙醇的体积比为1:1。

8.如权利要求6所述的阳离子角鲨烯脂质体的制备方法，其特征在于，在搅拌作用下，将所述水相注入到所述油相中，制成均一透明的乳液的步骤，包括：

在400～800r/min速率的磁力搅拌作用下，将所述水相注入到所述油相中，制成均一透明的乳液。

9.如权利要求6所述的阳离子角鲨烯脂质体的制备方法，其特征在于，去除所述乳液中的乙醇，得到中间产物的步骤，包括：

在20～40℃下，通过旋转蒸发除去所述乳液中的乙醇，得到中间产物。

10.如权利要求6所述的阳离子角鲨烯脂质体的制备方法，其特征在于，对所述角鲨烯脂质体粗混悬液进行均质处理，制得角鲨烯脂质体的步骤中：

所述均质处理为在超声功率80～120W的条件下，超声处理10～20min。

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