CN111349573A - 一种酵母菌的高密度发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及酵母菌的发酵领域，具体涉及一种酵母菌的高密度发酵方法。该方法包括：将酵母菌接种至发酵培养基中进行发酵，在酵母菌发酵的对数生长期，开始向所述发酵培养基中添加营养补充剂，所述营养补充剂含有酵母粉、葡萄糖、钾盐、镁盐和铵盐。本发明通过在酵母菌发酵的对数生长期，向发酵液中添加含有酵母粉、葡萄糖、钾盐、镁盐和铵盐的营养补充剂，能够有效地弥补酵母菌生长过程中营养物质的不足和不平衡，从而使得发酵条件有利于酵母菌菌体的繁殖，提高发酵液中的菌体密度，从而提高发酵后菌体的干重；同时，由于酵母菌生长繁殖速度的提高，使得发酵周期也显著缩短。

Description

一种酵母菌的高密度发酵方法

技术领域

本发明涉及酵母菌的发酵领域，具体涉及一种酵母菌的高密度发酵方法。

背景技术

产朊假丝酵母菌是一种非常好的单细胞蛋白质饲料。含有较高的粗蛋白质、氨基酸及多种维生素，同时含有多种动物所需的消化酶(淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等)，对营养物质的消化利用起着重要作用。

然而现有的发酵产朊假丝酵母菌的方法，主要是将产朊假丝酵母菌接种到发酵培养基中，在200-600rpm的转速下于30-35℃下进行培养30个小时左右，然而按照现有方法进行产朊假丝酵母菌的发酵培养，不利于产朊假丝酵母菌菌体繁殖，从而导致发酵终点酵母菌菌体密度低，且发酵时间较长。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供一种酵母菌的高密度发酵方法，采用本发明的方法进行酵母菌的培养，能够有效缩短发酵周期，提高发酵终点的菌体密度。

为了实现上述目的，本发明提供一种酵母菌的高密度发酵方法，该方法包括：将酵母菌接种至发酵培养基中进行发酵，其中，在酵母菌发酵的对数生长期，开始向所述发酵培养基中添加营养补充剂，所述营养补充剂含有酵母粉、葡萄糖、钾盐、镁盐和铵盐。

优选的，在酵母菌发酵的对数生长期，当发酵液的OD值为0.2-0.4，还原糖含量在0.4-0.6重量％时，开始向所述发酵培养基中添加营养补充剂。

优选的，所述发酵培养基含有葡萄糖、钾盐、镁盐和铵盐。

本发明通过在酵母菌发酵的对数生长期，向发酵液中添加含有酵母粉、葡萄糖、钾盐、镁盐和铵盐的营养补充剂，能够有效地弥补酵母菌生长过程中营养物质的不足和不平衡，从而使得发酵条件有利于酵母菌菌体的繁殖，提高发酵液中的菌体密度，从而提高发酵后菌体的干重；同时，由于酵母菌生长繁殖速度的提高，使得发酵周期也显著缩短。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明提供一种酵母菌的高密度发酵方法，该方法包括：将酵母菌接种至发酵培养基中进行发酵，其中，在酵母菌发酵的对数生长期，开始向所述发酵培养基中添加营养补充剂，所述营养补充剂含有酵母粉、葡萄糖、钾盐、镁盐和铵盐。

尽管在酵母菌发酵的对数期向发酵培养基中添加如上的营养补充剂即可实现本发明的目的，但本发明的发明人通过不断地对酵母菌发酵过程中生长繁殖慢且发酵终点菌体密度低的原因进行分析和总结，进一步发现在发酵的对数期对于钾盐和铵盐的需求量增大，而对于镁盐的需求量减少，因此，通过添加营养补充剂来调整发酵液中营养物质的比例，能够进一步促进菌体的生长繁殖，从而提高发酵液中的菌体密度和发酵后的菌体干重，缩短发酵时间。

因此，优选的，在所述营养补充剂中，酵母粉的含量为0.01-0.5重量％，葡萄糖含量为0.5-5重量％，钾盐含量为0.6-5重量％，镁盐含量为0.05-0.8重量％，铵盐含量为1.2-8重量％。

更优选的，在所述营养补充剂中，酵母粉的含量为0.05-0.3重量％，葡萄糖含量为1-3重量％，钾盐含量为0.8-3重量％，镁盐含量为0.1-0.5重量％，铵盐含量为1.5-5重量％。

再进一步优选的，在所述营养补充剂中，酵母粉的含量为0.08-0.2重量％，葡萄糖含量为1.5-2.5重量％，钾盐含量为0.9-1.1重量％，镁盐含量为0.2-0.4重量％，铵盐含量为2-4重量％。

根据本发明，所述钾盐可以为发酵领域中常规使用的各种钾盐，例如，可以为但不限于，氯化钾、硫酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾等等，优选的，所述钾盐为磷酸氢二钾。

根据本发明，所述镁盐可以为发酵领域中常规使用的各种镁盐，例如，可以为但不限于，氯化镁、硫酸镁等等，优选的，所述镁盐为硫酸镁。

根据本发明，所述铵盐可以为发酵领域中常规使用的各种铵盐，例如，可以为但不限于，氯化铵、硫酸铵等等，优选的，所述镁盐为硫酸铵。

尽管本发明只要在酵母菌的对数生长期向发酵培养基中添加如上所述的营养补充剂即可实现本发明的目的，但本发明的发明人发现，当发酵液的OD值为0.2-0.4(例如，可以为0.2、0.22、0.24、0.26、0.28、0.3、0.32、0.34、0.36、0.38、0.4)，还原糖含量在0.4-0.6重量％(例如，可以为0.4重量％、0.42重量％、0.44重量％、0.46重量％、0.48重量％、0.5重量％、0.52重量％、0.54重量％、0.56重量％、0.58重量％、0.6重量％)时，开始向所述发酵培养基中添加所述营养补充剂，发酵终点菌体密度能够得到进一步提高，发酵时间进一步缩短。其中，OD值的测定可以通过以一定的时间间隔对发酵液进行取样并通过使用紫外分光光密度进行测定获得，所述还原糖的含量可以通过以一定的时间间隔对发酵液进行取样并通过费林试剂法进行测定获得。

根据本发明的发明人的实践经验，在正常的酵母菌发酵过程中，当将酵母菌接种到发酵培养基中后的6-10小时，发酵培养基中酵母菌的OD值净增长和还原糖含量一般可达到上述水平。因此，在本发明的一种可替代的实施方式中，为了节省操作步骤，还可以在当将酵母菌接种到发酵培养基中后的6-10小时时开始向发酵培养基中添加所述营养补充剂。

根据本发明，所述营养补充剂的添加状态可以以固体状态添加，也可以以其水溶液的状态添加，优选情况下，以其水溶液的状态添加到所述发酵培养基中。其中，所述水溶液中各物质的含量可以按照如上所述进行设定。

根据本发明，对所述营养补充剂的添加方式以及添加量没有特别的限制，例如，可以向所述发酵培养基中连续添加所述营养补充剂。当以连续添加的方式添加营养补充剂的水溶液，并优选使所述营养补充剂的水溶液中各组分的浓度在上述优选范围内，其流速的控制可以根据实际情况进行调整。通常情况下，以每升发酵培养基为基准，所述营养补充剂的流速为0.05-0.1L/h。

或者，还可以分多次向所述发酵培养基中添加所述营养补充剂。当以分多次添加的方式加入营养补充剂时，所述营养补充剂的加入状态可以以固体的状态加入，也可以以其水溶液的状态加入，但通常以其水溶液的状态加入，并优选使所述营养补充剂水溶液中各组分的浓度在上述优选范围内，每次的添加量和相邻两次添加的间隔时间可以根据实际情况进行调整。通常情况下，以每升发酵培养基为基准，其每次的添加量为0.05-0.2L，相邻两次添加的时间间隔优选为1-2小时。

本发明的发明人发现，由于以连续性的方法向发酵培养基中添加营养补充剂，可使发酵培养基中各营养组分的含量和比例控制在较好的水平内。因此，优选情况下，采用连续添加的方式向发酵培养基中添加所述营养补充剂。

本发明中，尽管可以一直添加所述营养补充剂直到发酵的终点，但通常当在发酵结束前的4-8小时，酵母菌正处于生长的稳定期末期或已经进入衰亡期，发酵培养基中菌体的含量变化不大，因此，为了节省成本及操作时间，优选地，在发酵结束前的4-8小时内停止添加所述营养补充剂。

本领域公知的，微生物的生长可以按照如下表1的方式进行分类，且每个生长期的特点和成因如表1所示。

表1

根据本发明，对所述酵母菌进行发酵的条件可以按照本领域常规的方法进行，例如，所述发酵的温度为30-35℃，转速为200-600rpm。

根据本发明，当在酵母菌发酵生长的对数期，向发酵培养基中添加本发明的营养补充剂，相比于不添加营养补充剂，当达到相同的菌体密度时，发酵时间可以缩短10个小时左右，当采用相同的发酵时间时，采用本申请的方法得到的发酵液中的菌体密度显著高于不添加营养补充剂的发酵液的菌体密度，提高量可达3个数量级。由此可见，本发明的方法能够显著缩短发酵的时间以及提高发酵终点的发酵密度。

根据本发明，所述酵母菌的发酵培养基可以为本领域常规的用于酵母菌发酵的培养基，例如，可以为常规的YEPD培养基，而根据本发明一种优选的实施方式，所述发酵培养基含有葡萄糖、钾盐、镁盐和铵盐。

根据本发明，所述钾盐可以为发酵领域中常规使用的各种钾盐，例如，可以为但不限于，氯化钾、硫酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾等等，优选的，所述钾盐为磷酸氢二钾。

根据本发明，所述镁盐可以为发酵领域中常规使用的各种镁盐，例如，可以为但不限于，氯化镁、硫酸镁等等，优选的，所述镁盐为硫酸镁。

根据本发明，所述铵盐可以为发酵领域中常规使用的各种铵盐，例如，可以为但不限于，氯化铵、硫酸铵等等，优选的，所述镁盐为硫酸铵。

其中，葡萄糖、钾盐、镁盐和铵盐的含量可以在较宽的范围内进行调整，但本发明的发明人发现，在酵母菌发酵生长的调整期如果投入大量的钾盐和铵盐会使得其在发酵培养基中的适应能力变弱，而适当的增加镁盐可以使得其适应能力变强，因此，根据本发明一种优选的实施方式，在所述发酵培养基中，所述葡萄糖的含量为1-3重量％，所述钾盐的含量为0.1-0.5重量％，所述镁盐的含量为1-3重量％，所述铵盐的含量为0.5-1.0重量％；在该优选的情况下，可以使得酵母菌快速的进入对数期，从而进一步缩短发酵周期。而当再进一步优选的情况下，在对数期向发酵培养基中添加高钾、高氮以及低镁，同时补充酵母粉和葡萄糖的营养补充剂(如以上所述的)，能够进一步提高酵母菌的生长繁殖特性。

其中，优选的，所述发酵培养基的pH值为6-6.2(指灭菌前的pH值)。

根据本发明，所述酵母菌的接种量可以在较宽的范围内改变，优选的情况下，酵母菌的接种量为0.1-0.2重量％。

本发明发酵所使用的酵母菌可以为商购的酵母菌固体制剂或酵母菌菌种，例如，CGMCC2.1180。

所述酵母菌可以采用常规的方法接种，例如，在被接种至发酵培养基中之前，将所述酵母菌经过活化处理，之后将得到的种子液加入到发酵培养基中。酵母菌种子培养的程度可以通过OD值进行监控，一般情况下，当种子液的OD值达到0.18-0.30，优选0.20-0.25时停止培养。

优选情况下，所述酵母菌经过活化处理的方法包括：将酵母菌接种在酵母菌种子培养基中进行培养，所述酵母菌菌剂在种子培养基中的接种量可以为0.05-0.15重量％。

根据本发明，所述酵母菌种子培养基的制备方法没有特别的限制，只要得到的种子液能够适用于酵母菌的发酵即可，例如，所述种子培养基中可以含有0.4-0.6重量％的酵母粉，0.8-1.2重量％的蛋白胨，0.4-0.6重量％的葡萄糖，培养基的pH值为6-6.2(指灭菌前的pH值)。

根据本发明，所述酵母菌种子的培养条件可以在很大范围内改变，例如所述培养的条件可以包括：温度为30-35℃，转速为100-120rpm。

根据本发明，本发明的方法可以适用于任意酵母菌的发酵培养，但更适合产朊假丝酵母菌，因此，优选的，所述酵母菌为产朊假丝酵母菌。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，

发酵液的OD值通过紫外分光光度计(722N，可见分光光度计)进行测定；

还原糖的含量通过费林试剂法进行测定；

发酵液的菌体密度以活菌数的形式表示，活菌数的测定方法如下：

在预定的时间内发酵液适当的稀释后涂布于酵母菌固体培养平板中(葡萄糖2重量％，磷酸氢二钾0.3重量％，硫酸镁2重量％，硫酸铵0.8重量％，琼脂1重量％)，于32-33℃下倒置培养12小时，对菌落数进行计数并计算得到菌体密度，以CFU/mL表示；

产朊假丝酵母菌，CGMCC2.1180。

制备例

本实施例用于说明酵母菌种子液的制备

(1)将保存在超低温冰箱中产朊假丝酵母菌提前0.5h自然解冻，按照0.1重量％的接种量转接至活化一级种子摇瓶中。在往复式摇瓶柜内于30-32℃、转速120rpm下培养。OD600长至0.20-0.25之间停止培养，得到酵母菌种子液。

种子培养基：酵母粉0.5重量％，蛋白胨1重量％，葡萄糖0.5重量％，pH值为6.0-6.2。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的酵母菌的高密度发酵方法

(1)将葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸铵混合，并加入适量的去离子水，其中，各组分的添加量使得得到的发酵培养基中，葡萄糖的含量为2.0重量％，磷酸氢二钾的含量为0.3重量％，硫酸镁的含量为2.0重量％，硫酸铵的含量为0.8重量％。将得到的发酵培养基的pH值调节至6.0-6.2，并在121℃下灭菌20min，降至室温后备用。

(2)以0.15重量％的接种量将制备例得到的种子液接种至步骤(1)制备的发酵培养基中，并在32-33℃，400rpm的转速下进行培养，并不断取样监测发酵液的OD值和还原糖含量，当OD值净增长达到0.3时(还原糖量控制值0.5重量％)开始流加营养补充剂，所述营养补充剂含有0.1重量％的酵母粉、2.0重量％的葡萄糖、1.0重量％的磷酸氢二钾、0.3重量％的硫酸镁和3.0重量％的硫酸铵，添加前在121℃下灭菌20min。其中，以每升发酵培养基计，所述营养补充剂添加的流速为0.05-0.07L/h，并在发酵结束前6小时停止流加。

在发酵的过程中，测定发酵15小时、20小时和30小时发酵液的菌体密度，结果见表2。

实施例2

本实施例用于说明本发明提供的酵母菌的高密度发酵方法

(1)将葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸铵混合，并加入适量的去离子水，其中，各组分的添加量使得得到的发酵培养基中，葡萄糖的含量为3.0重量％，磷酸氢二钾的含量为0.1重量％，硫酸镁的含量为3.0重量％，硫酸铵的含量为0.5重量％。将得到的发酵培养基的pH值调节至6.0-6.2，并在121℃下灭菌20min，降至室温后备用。

(2)以0.1重量％的接种量将制备例得到的种子液接种至步骤(1)制备的发酵培养基中，并在32-33℃，400rpm的转速下进行培养，并不断取样监测发酵液的OD值和还原糖含量，当OD值净增长达到0.2时(还原糖量控制值0.6重量％)开始流加营养补充剂，所述营养补充剂含有0.08重量％的酵母粉、2.5重量％的葡萄糖、0.9重量％的磷酸氢二钾、0.4重量％的硫酸镁和2重量％的硫酸铵，添加前在121℃下灭菌20min。其中，以每升发酵培养基计，所述营养补充剂添加的流速为0.07-0.09L/h，并在发酵结束前4小时停止流加。

在发酵的过程中，测定发酵15小时、20小时和30小时发酵液的菌体密度，结果见表2。

实施例3

本实施例用于说明本发明提供的酵母菌的高密度发酵方法

(1)将葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸铵混合，并加入适量的去离子水，其中，各组分的添加量使得得到的发酵培养基中，葡萄糖的含量为1.0重量％，磷酸氢二钾的含量为0.5重量％，硫酸镁的含量为1.0重量％，硫酸铵的含量为1.0重量％。将得到的发酵培养基的pH值调节至6.0-6.2，并在121℃下灭菌20min，降至室温后备用。

(2)以0.2重量％的接种量将制备例得到的种子液接种至步骤(1)制备的发酵培养基中，并在32-33℃，400rpm的转速下进行培养，并不断取样监测发酵液的OD值和还原糖含量，当OD值净增长达到0.4时(还原糖量控制值0.4重量％)开始流加营养补充剂，所述营养补充剂含有0.2重量％的酵母粉、1.5重量％的葡萄糖、1.1重量％的磷酸氢二钾、0.2重量％的硫酸镁和2.0重量％的硫酸铵，添加前在121℃下灭菌20min。其中，以每升发酵培养基计，所述营养补充剂添加的流速为0.08-0.1L/h，并在发酵结束前6小时停止流加。

在发酵的过程中，测定发酵15小时、20小时和30小时发酵液的菌体密度，结果见表2。

实施例4

本实施例用于说明本发明提供的酵母菌的高密度发酵方法

按照实施例1的方法进行酵母菌的发酵，不同的是，所述营养补充剂含有0.05重量％的酵母粉、1重量％的葡萄糖、3重量％的磷酸氢二钾、0.1重量％的硫酸镁和5.0重量％的硫酸铵；当发酵液的OD值净增长为0.1(还原糖量控制值1.0重量％)时添加所述营养补充剂，结果见表2。

实施例5

本实施例用于说明本发明提供的酵母菌的高密度发酵方法

按照实施例1的方法进行酵母菌的发酵，不同的是，所述营养补充剂含有0.3重量％的酵母粉、3重量％的葡萄糖、0.8重量％的磷酸氢二钾、0.5重量％的硫酸镁和1.5重量％的硫酸铵；当发酵液的OD值净增长为0.5(还原糖量控制值0.2重量％)时添加所述营养补充剂，结果见表2。

实施例6

本实施例用于说明本发明提供的酵母菌的高密度发酵方法

按照实施例1的方法进行酵母菌的发酵，不同的是，所述发酵培养基为含有0.5重量％酵母粉、1重量％蛋白胨和2重量％葡萄糖的培养基，结果见表2。

对比例1

本对比例用于说明参比的酵母菌的发酵方法

按照实施例1的方法进行酵母菌的发酵，不同的是，不添加营养补充剂，结果见表2。

对比例2

本对比例用于说明参比的酵母菌的发酵方法

按照实施例1的方法进行酵母菌的发酵，不同的是，所述营养补充剂的组成和发酵培养基相同，结果见表2。

对比例3

本对比例用于说明参比的酵母菌的发酵方法

按照实施例1的方法进行酵母菌的发酵，不同的是，所述营养补充剂的添加时机为将酵母菌接种至发酵培养基中开始，结果见表2。

表2

	15h活菌数(CFU/mL)	20h活菌数(CFU/mL)	30h活菌数(CFU/mL)
				实施例1	2.1×10<sup>8</sup>	3.5×10<sup>10</sup>	3.8×10<sup>11</sup>
实施例2	1.9×10<sup>8</sup>	2.6×10<sup>10</sup>	3.5×10<sup>11</sup>
				实施例3	2.5×10<sup>8</sup>	3.8×10<sup>10</sup>	4.2×10<sup>11</sup>
实施例4	1.1×10<sup>8</sup>	1.5×10<sup>10</sup>	9.0×10<sup>10</sup>
				实施例5	1.2×10<sup>8</sup>	8.1×10<sup>9</sup>	8.2×10<sup>10</sup>
实施例6	8.4×10<sup>7</sup>	1.5×10<sup>9</sup>	9.6×10<sup>9</sup>
				对比例1	1.1×10<sup>7</sup>	2.2×10<sup>8</sup>	2.8×10<sup>8</sup>
对比例2	5.1×10<sup>7</sup>	9.6×10<sup>8</sup>	1.4×10<sup>9</sup>
				对比例3	3.6×10<sup>7</sup>	1.0×10<sup>9</sup>	4.3×10<sup>9</sup>

通过表1的结果可以看出，由实施例1-6和对比例1-3的比较可以看出，在酵母菌发酵的对数生长期添加本发明的营养补充剂能够有效提高发酵终点的菌体密度。由实施例1和实施例4-5的比较可以看出，在本发明优选的营养补充剂各组分的含量以及优选的添加时机加入所述营养补充剂，能够进一步提高发酵终点的菌体密度。由实施例1和实施例6的比较可以看出，采用本发明优选的发酵培养基也能够进一步提高发酵终点的菌体密度。

此外，由表2还可以看出，达到和对比例菌体密度相当的水平时，采用本发明的方法，能够显著的缩短发酵的时间。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种酵母菌的高密度发酵方法，该方法包括：将酵母菌接种至发酵培养基中进行发酵，其特征在于，在酵母菌发酵的对数生长期，开始向所述发酵培养基中添加营养补充剂，所述营养补充剂含有酵母粉、葡萄糖、钾盐、镁盐和铵盐。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述营养补充剂中，酵母粉的含量为0.01-0.5重量％，葡萄糖含量为0.5-5重量％，钾盐含量为0.6-5重量％，镁盐含量为0.05-0.8重量％，铵盐含量为1.2-8重量％。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，在所述营养补充剂中，酵母粉的含量为0.05-0.3重量％，葡萄糖含量为1-3重量％，钾盐含量为0.8-3重量％，镁盐含量为0.1-0.5重量％，铵盐含量为1.5-5重量％。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，在酵母菌发酵的对数生长期，当发酵液的OD值为0.2-0.4，还原糖含量在0.4-0.6重量％时，开始向所述发酵培养基中添加营养补充剂。

5.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，向所述发酵培养基中添加所述营养补充剂的方法包括：向所述发酵培养基中连续添加所述营养补充剂；或者，向所述发酵培养基中分多次添加所述营养补充剂，相邻两次添加所述营养补充剂的时间间隔为1-2小时。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，向所述发酵培养基中连续添加所述营养补充剂，相对于每升的发酵培养基，所述营养补充剂的添加速度为0.05-0.1L/h；

或者，向所述发酵培养基中分多次添加所述营养补充剂，相对于每升的发酵培养基，所述营养补充剂每次的添加量为0.05-0.2L。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，在发酵结束前的4-8小时内停止添加所述营养补充剂。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵的条件包括：温度为30-35℃，转速为200-600rpm。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵培养基含有葡萄糖、钾盐、镁盐和铵盐；

优选的，在所述发酵培养基中，所述葡萄糖的含量为1-3重量％，所述钾盐的含量为0.1-0.5重量％，所述镁盐的含量为1-3重量％，所述铵盐的含量为0.5-1.0重量％。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酵母菌为产朊假丝酵母菌。