CN111333703A - 一种针对癌细胞基因损伤增殖信号通路的基因治疗药剂 - Google Patents
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Abstract
p53是一种肿瘤抑制基因，在所有恶性肿瘤中，50%以上会出现突变，其控制着细胞周期的启动，基因受损，强烈的细胞增殖信号，染色体形成和分配错误，都会增加P53的半衰期，如果这个细胞受损，又不能得到修复，使这个细胞程序性凋亡或免疫清除，通过基因治疗技术在癌细胞中表达P53蛋白来诱导癌细胞凋亡和免疫清除，可有效抑制癌细胞的增殖。正常人体细胞有2个P53基因拷贝，和MDM2蛋白相互制约形成动态平衡，我通过基因导入实验观察P53的表达量，超过正常细胞的大约20倍以上，正常细胞就会受到影响，本发明通过基因治疗技术控制P53表达量在20倍以下，不影响正常细胞又能使癌细胞凋亡和免疫清除。
Description
技术领域
此项发明是根据基因治疗技术领域，和基因工程技术领域癌症治疗领域的发明的成果。
背景技术
基因治疗是将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的。也包括转基因等方面的技术应用。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。从广义说，基因治疗还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。体细胞基因治疗：体细胞基因治疗是将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗目的。这种方法的理想措施是将外源正常基因导入靶体细胞内染色体特定基因座位，用健康的基因确切地替换异常的基因，使其发挥治疗作用。病毒介导基因转移，病毒介导基因转移是通过转换方式完成基因转移，即以病毒为载体，将外源目的基因通过基因重组技术，将其组装于病毒上，让这种重组病毒去感染受体宿主细胞，这种病毒称为病毒运载体。DNA病毒介导载体：有人发现，因缺少E1区而致复制缺陷的腺病毒，可在表达E1基因的细胞中繁殖。后来证明，载有外源DNA的复制缺陷腺病毒呈现相同繁殖的特点。1993年美法等国成功采用腺病毒载体进行心、脑、肺、肝内胆管和肌肉组织的体内基因转移。它代表了基因治疗的新方向，采用复制缺陷的腺病毒进行基因治疗有以下优点：①该病毒可感染分裂和非分裂的细胞，并能得到大量基因产物，对神经细胞、心肌细胞等基因缺陷的纠正有特殊意义；②病毒颗粒相对稳定，并易于纯化和浓缩，且感染力不降低；③可有效转导多种靶细胞后而少游离于细胞基因组外，并持续表达；④已用于基因治疗的Ad5属腺病毒C亚群，无致癌性。前述的新腺病毒载体还有一大优点是可以成功地运载48000bp的基因，而其它病毒只能运输70 00bp的基因。这些优点显示了腺病毒介导载体的广阔应用前景。癌症是起源于上皮组织的恶性肿瘤，是恶性肿瘤中最常见的一类。相对应的，起源于间叶组织的恶性肿瘤统称为肉瘤。有少数恶性肿瘤不按上述原则命名，如肾母细胞瘤、恶性畸胎瘤等。一般人们所说的“癌症”习惯上泛指所有恶性肿瘤。癌症具有细胞分化和增殖异常、生长失去控制、浸润性和转移性等生物学特征，其发生是一个多因子、多步骤的复杂过程，分为致癌、促癌、演进三个过程，与吸烟、感染、职业暴露、环境污染、不合理膳食、遗传因素相关。癌细胞，是一种变异的细胞，是产生癌症的病源。癌细胞与正常细胞不同，有无限增殖、可转化和易转移三大特点，能够无限增殖并破坏正常的细胞组织。癌细胞除了分裂失控外（能进行多极分裂），还会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分。分恶性和良性两种。自行设定增殖速度，累积到10亿个以上我们才会察觉。癌细胞的增殖速度用倍增时间计算,1个变2个,3个变6个，以此类推。比如，胃癌、肠癌、肝癌、胰腺癌、食道癌的倍增时间平均是31天；乳腺癌倍增时间是40多天。由于癌细胞不断倍增，癌症越往晚期发展得越快。p53基因，人体抑癌基因。该基因编码一种分子量为43.7KDa的蛋白质，但因蛋白条带出现在Marker所示53KDa处，命名为P53。因为蛋白中含有大量的脯氨酸，电泳速度被拖慢。p53基因的失活对肿瘤形成起重要作用。mdm2突变与 P53突变不共存,p53是一个重要的抗癌基因，其野生型使癌细胞凋亡，从而防止癌变；还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能。p53的突变型会提高癌变。有p53缺陷的细胞没有这种控制，甚至在不利条件下继续分裂。像所有其它肿瘤抑制因子一样，p53基因在正常情况下对细胞分裂起着减慢或监视的作用。 细胞中抑制癌变的基因“p53”会判断DNA变异的程度，如果变异较小，这种基因就促使细胞自我修复，若DNA变异较大，“p53”就诱导细胞凋亡。p53是重要的肿瘤抑制基因，自从该基因在1979年被首次报道以来，有关研究论文在Medline上可查到20000余篇。人们最初认为p53基因是一种癌基因，但随着近十年研究的深入，p53作为抑癌基因的功能逐渐被揭示出来。在人类50%以上的肿瘤组织中均发现了p53基因的突变，这是肿瘤中最常见的遗传学改变，说明该基因的改变很可能是人类肿瘤产生的主要发病因素。
发明内容
基因治疗载体抑癌信号通路介绍:正常人体细胞有2个P53基因拷贝，和MDM2蛋白负反馈调节相互制约形成动态平衡，P53表达量增加会促进MDM2蛋白的表达量，MDM2会泛素P53蛋白降解其活性，在正常细胞P53蛋白活性保持在较低水平，半衰期在6～20分钟，通过P53基因治疗癌症，难点在于如何控制表达量，P53基因在正常细胞表达量大约超过20倍，正常细胞就会受影响，相关的抑癌信号通路可能会启动。P53的抑癌信号通路如下:DNA损伤会引发多种细胞反应,包括DNA修复、细胞周期延迟或阻滞、细胞凋亡等。其中细胞周期延迟或阻滞是通过DNA损伤关卡完成的。DNA损伤关卡主要包括3个组成部分,即感应因子(如ATM和ATR)、信号传导因子(如Chk1和Chk2)和效应因子(包括多种能激活CDKs的磷酸酯酶,如Cdc25A、Cdc25B和Cdc25C)。DNA损伤关卡主要包括G1/S、S和G2/M关卡。DNA损伤发生在G1期时,通过ATM-Chk2-Cdc25A或ATR-Chk1-Cdc25A途径启动G1/S阻滞,随后是由p53介导的G1/S期阻滞的维持过程。在S期发生的DNA损伤引发的S期关卡的激活主要通过两条途径即ATM(ATR)-Chk2(Chk1)-Cdc25A-Cdk2途径和ATM-NBS1/SMC1途径,阻滞DNA的复制。G2/M期关卡的作用是阻止在G2期DNA受损的细胞进行有丝分裂,根据损伤的形式不同,分别激活ATM-Chk2-Cdc25和ATR-Chk1-Cdc25两条通路,抑制Cdc2/CyclinB的活性,阻止细胞进入M期，如果DNA受无法修复，单链DNA受损处会聚集ATR蛋白启动活性，双链DNA受损处会聚集ATM蛋白启动活性，当DNA受损无法修复时，激活的ATR和ATM蛋白会浓度越来越多，ATR和ATM蛋白会抑制MDM2蛋白活性，MDM2蛋白活性浓度降低，活性浓度降低的MDM2蛋白无法泛素P53蛋白抑制其活性，P53蛋白的活性从几分钟延长到几个小时，ATR和ATM蛋白会直接磷酸化P53蛋白，磷酸化的P53蛋白结合力增加活性提高，另外ATR和ATM蛋白会增加CHK1和CHK2蛋白的浓度，CHK1和CHK2蛋白也会磷酸化P53蛋白，P53的活性浓度提高也会提高下游执行细胞程序性凋亡蛋白的活性，当活性浓度达到一定时，细胞就会无法承受执行凋亡蛋白的破坏，从而发生程序性凋亡，P53蛋白会激活Bcl2激酶，Bcl2激酶激活Bim蛋白，Bim蛋白激活Bax/Bak蛋白，Bax/Bak蛋白会在线粒体外膜多聚化，形成一个漏斗形状的通道，使线粒体和细胞质通透，线粒体里的Cyt c蛋白被释放出来，Cyt c蛋白和死亡配体Apaf-1蛋白结合，Apaf-1蛋白被活化后，会多聚化形成一个容器状结构，Procaspase-9蛋白会进入Apaf-1蛋白形成的容器结构里，并活化Procaspase-9蛋白，被活化的Procaspase-9蛋白会激活Procaspase-3和Procaspase-7蛋白，Procaspase-3和Procaspase-7蛋白有蛋白酶的结构域，被激活后会切割上千种蛋白和酶，其中切割细胞的骨架蛋白使细胞形状发生变化，形成多个凋亡小体，切割核纤层蛋白使核纤层解聚，使细胞核收缩，切割粘着蛋白使细胞与其它细胞分离，使基因受损无法修复的细胞发生程序性凋亡，一般癌细胞都是由基因受损产生，这是使用P53基因杀死癌症信号通路之一。P53蛋白还作用于清除衰老细胞，衰老细胞特点是端粒DNA耗尽，端粒末端有一种包裹蛋白把端粒末端包裹起来，当端粒基因消耗到包裹蛋白无法识别端粒DNA序列时，端粒DNA末端就会暴露出来，暴露出来的DNA就会被ATM和ATM结合上去并活化，活化的ATM和ATR蛋白就会抑制MDM2蛋白的活性，使P53不被泛素化增加P53的活性，启动细胞的程序性凋亡，将衰老细胞清除，避免致癌的可能性。通过癌细胞强的增殖信号激活P53信号通路，杀死癌细胞，CDKN2A蛋白是细胞周期调控网络的重要成员,通过p53蛋白途径和非p53蛋白途径调控细胞周期,抑制肿瘤发生,研究表明，CDKN2A蛋白在大多数原发肿瘤中表达缺失或低表达，CDKN2A蛋白被活化后，可以抑制MDM2蛋白活性，P53活性浓度就会大大提高，通过P53活性浓度，决定细胞是否暂停增殖、修复受损基因、免疫清除或者凋亡，激活CDKN2A蛋白的是E2F转录因子，癌细胞的增殖依赖E2F转录因子，染色体的复制需要E2F介导，在正常细胞中E2F转录因子和RB蛋白结合活性被抑制，在癌细胞中RB蛋白突变，或者上游增殖信号通路蛋白功能获得性突变，在P53信号通路受损和端粒酶基因被启动，细胞一般就会形成癌细胞，在正常增殖细胞中E2F转录因子、CDKN2A蛋白、P53蛋白，的活性保持中度水平，活性在高的水平细胞增殖就会停止，而癌细胞增殖不受控制，连续增殖的癌细胞E2F转录因子的活性也会连续增加，CDKN2A蛋白、P53蛋白受E2F转录因子调控，活性随着增加，P53蛋白极高的活性浓度，癌细胞就会发生严重自噬和炎症反应，免疫细胞就会被召集过来，免疫清除癌细胞，和以上所述P53蛋白的活性调控Procaspase-3和Procaspase-7的活性，极高活性浓度就会把细胞核切割出漏洞，一旦细胞核无法承受Procaspase-3和Procaspase-7破坏，细胞核形成漏洞，凋亡蛋白进入细胞核，染色体被暴露出来，癌细胞就发生程序性凋亡。
附图说明图1是第1种腺病毒形态结构和内部基因元件示意图，图2是第2种腺病毒形态结构和内部基因元件示意图，图3是电泳实验拍照和实验数据示意图，图4是正常肝实质细胞和肝癌细胞的存活数量统计图。
图1腺病毒载体特征参数:
Ad5 Psi 67..217 151 == misc_signal
CMV enhancer 287..666 380 == enhancer
chicken beta-actin promoter 668..945 278 => promoter
chimeric intron 946..1962 1017 == intron
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tet operator 2041..2059 19 == protein_bind
tet operator 2083..2101 19 == protein_bind
tet operator 2125..2143 19 == protein_bind
tet operator 2167..2185 19 == protein_bind
tet operator 2209..2227 19 == protein_bind
tet operator 2251..2269 19 == protein_bind
tet operator 2293..2311 19 == protein_bind
Kozak sequence 2441..2450 10 == regulatory
CDKN2A 2447..2845 399 == misc_feature
T2A 2855..2908 54 => CDS
p53 2909..4090 1182 => CDS
SV40 poly(A) signal 4166..4287 122 == polyA_signal
ori 4445..5033 589 <= rep_origin
M13 rev 5163..5179 17 => primer_bind
AmpR 5221..6081 861 <= CDS
AmpR promoter 6082..6186 105 <= promoter
CMV enhancer 6301..6680 380 == enhancer
chicken beta-actin promoter 6682..6959 278 => promoter
chimeric intron 6960..7976 1017 == intron
tTS 8037..8882 846 => CDS
T2A 8892..8945 54 => CDS
SV40 poly(A) signal 9087..9208 122 == polyA_signal
M13 fwd 9366..9382 17 => primer_bind图1构建腺病毒载体，
腺病毒载体基因在细胞里避免复制和传代细胞，可控的表达P53蛋白使正常细胞不受影响，又能诱导癌细胞程序性凋亡和免疫清除，图1腺病毒载体中P53基因和CDKN2A基因，CDKN2A可充当肿瘤抑制蛋白p53的稳定剂，因为它可以与E3泛素蛋白连接酶MDM2（负责p53降解的蛋白）相互作用并隔离。尽管在结构和功能上存在差异，CDKN2抑制剂同工型和该基因编码的产物通过CDK4和p53在细胞周期G1进程中的调节作用，在细胞周期G1调控中具有共同的功能。该基因经常在多种肿瘤中突变或缺失，并且是重要的抑癌基因，腺病毒载体中的P53基因和CDKN2A基因，通过癌细胞中的基因受损信号、强烈增殖信号、异常的细胞周期校验信号，启动其活性，通过上述介绍抑癌信号通路，引导癌细胞程序性凋亡和免疫清除。图1腺病毒载体基因无哺乳动物细胞复制起点，哺乳动物细胞复制起点，需要特定的基因序列，腺病毒将载体基因导入人体细胞，不会复制和传代细胞，载体基因游离染色体，在没有核小体的保护情况下，一次治疗的载体基因完成对癌细胞凋亡机制引导后，会在几个月内降解消失，避免影响正常细胞，图1载体中Ori复制起点，是原核生物大肠杆菌专属复制起点，大肠杆菌和哺乳动物细胞，有机体完全不一样，Ori在哺乳动物细胞不具备复制功能，携带Ori复制起点是为了方便在大肠杆菌保存载体基因，载体基因没有哺乳动物细胞复制起点，生产腺病毒载体变的困难，但是能更好把控P53蛋白的副作用。图1腺病毒载体中CAG启动子（CMV enhancer、chicken β-actin promoter、chimeric intron三启动子元件合称CAG启动子），CAG启动子保留了CMV病毒的增强子，转录能力与CMV启动子不相上下，鸡β-actin启动子则为它提供了更加广泛的表达谱，CAG启动子用于P53、CDKN2A、tTs/rtTA基因在不同体细胞稳定表达。图1腺病毒载体中TRE启动子(7个tet operator启动子合称TRE启动子)，和tTs蛋白组成诱导性表达系统，在缺乏四环素或其类似物(如多西环素)的情况下，tTS与TRE启动子结合，从而积极抑制基因转录子，而rtTA_M2无法与TRE启动子结合。在诱导药物存在的情况下，tTS与TRE启动子解离，而rtTA_M2与TRE启动子结合激活基因转录。与单独使用rtTA_M2不提供主动抑制作用相比，该系统在没有诱导药物的情况下具有较低的漏性表达，CAG启动子和TRE启动子结合调控转录P53、CDKN2A基因，提高兼容性、稳定表达，调控表达等优点，调节P53、CDKN2A基因表达，避免正常体细胞发生自噬，产生副作用。图1腺病毒载体中Ad5Ψ，是腺病毒包装信号，马达蛋白识别Ad5Ψ序列信号，将基因载体注入腺病毒内，包装成腺病毒颗粒。图1腺病毒中AmpR、AmpR promoter，：使大肠杆菌对氨苄西林产生抗药性，AmpR promoter只能大肠杆菌里具备启动子功能，AmpR在哺乳动物细胞无法表达，将载体基因保存到大肠杆菌复制，筛选出导入载体基因的大肠杆菌，纯化提取载体基因。图1腺病毒载体中SV40 poly(A) signal，形成发夹结构，转录终止和多聚腺苷酸mRNA转录的PolII RNA聚合酶，mRNA出入核孔信号，使P53、CDKN2A、tTs/rtTA，mRNA出入细胞核孔表达。
图2腺病毒载体特征参数：
tet operator 11..29 19 == protein_bind
tet operator 47..65 19 == protein_bind
tet operator 83..101 19 == protein_bind
tet operator 119..137 19 == protein_bind
tet operator 155..173 19 == protein_bind
tet operator 191..209 19 == protein_bind
tet operator 227..245 19 == protein_bind
CDKN2A 383..781 399 == misc_feature
T2A 791..844 54 => CDS
p53 845..2026 1182 => CDS
SV40 poly(A) signal 2093..2214 122 == polyA_signal
ori 2327..2915 589 <= rep_origin
M13 fwd 3038..3054 17 => primer_bind
AmpR 3103..3963 861 <= CDS
AmpR promoter 3964..4068 105 <= promoter
Ad5 Psi 4258..4408 151 == misc_signal
CMV enhancer 4697..5076 380 == enhancer
chicken beta-actin promoter 5078..5355 278 => promoter
chimeric intron 5356..6372 1017 == intron
Tet3G 6433..7179 747 => CDS
T2A 7190..7243 54 => CDS
tTS 7244..8092 849 => CDS
SV40 poly(A) signal 8233..8354 122 == polyA_signal
oriP 8644..10,433 1790 == rep_origin
M13 rev 10,456..10,472 17 => primer_bind图2腺病毒载体中oriP复制起点，是爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）染色体的1.7-kb区域，支持在人类细胞中复制和稳定维持质粒。oriP包含两个基本成分，称为DS和FR，两者均包含EBV编码蛋白EBNA-1的多个结合位点。DS似乎起oriP的复制子的作用，而FR与EBNA-1一起起作用，以防止质粒的丢失而使细胞增殖。由于EBNA-1在通过FR稳定质粒中的作用，携带oriP质粒需要EBNA-1才能够有效复制，DS包含两对紧密间隔的EBNA-1结合位点，任一对中的两个位点都是活性所必需的，包括一对紧密间隔的EBNA-1结合位点，当另一半删除时，它具有显着的复制器活动。除EBNA-1结合位点外，DS的两个半部分共有的唯一重要的DNA序列是一个9bp的序列，在“左半部分”中两次出现，在“右半部分”中一次出现，但对DS的每半部分的活性都有显着贡献。两个胸腺嘧啶出现在DS的EBNA-1结合位点1和4内的唯一位置，当EBNA-1结合时对高锰酸盐氧化变得敏感，但每个突变都变成共有碱基腺嘌呤，实际上提高了每一个胸腺嘧啶的活性。 总之oriP的DS是EBNA-1依赖性复制子，其最小活性核心似乎只是两个适当间隔的EBNA-1结合位点,在人体细胞中，图2腺病毒载体没有EBNA-1的表达，oriP复制起点在正常细胞中，拷贝数非常低甚至无法拷贝，在实验中表明oriP在癌细胞中拷贝数量会大大提高，这利于把控P53、CDKN2A抑癌基因表达，避免抑癌基因的副作用同时，又能针对癌细胞提高杀伤力，而需要大量基因拷贝，包装成腺病毒，EBNA-1可以和腺病毒骨架质粒一起表达，oriP复制起点就可以大量拷贝载体基因。到达生产与治疗的调控。图2腺病毒载体中Ori复制起点，是原核生物大肠杆菌专属复制起点，大肠杆菌和哺乳动物细胞，有机体完全不一样，Ori在哺乳动物细胞不具备复制功能，携带Ori复制起点是为了方便在大肠杆菌保存载体基因。图2腺病毒载体中CAG启动子（CMV enhancer、chicken β-actin promoter、chimeric intron三启动子元件合称CAG启动子），CAG启动子保留了CMV病毒的增强子，转录能力与CMV启动子不相上下，鸡β-actin启动子则为它提供了更加广泛的表达谱，CAG启动子用于CDKN2A、tTs/Tet-On 3G基因在不同体细胞稳定表达。图2腺病毒载体中TRE3G启动子(改进的7个tet operator启动子区域合称TRE3G启动子)，和Tet-On 3G、tTS组成诱导性启动子，Tet-On 3G激酶是由rtTA激酶改进而来，具有更高的敏感性，Tet3G调控表达系统通过诱导药物（如四环素和强力霉素等）改变调控蛋白的构象，与TRE3G启动子结合，仅在四环素或其类似物(如强力霉素)存在的情况下激活基因转录。与它的前身rtTA相比，它对诱导药物具有更高的敏感性 ，tTS阻遏蛋白它与TRE、TRE3G启动子结合，只有在没有四环素或其类似物(如强力霉素)的情况下才会主动抑制基因转录，CAG启动子和TRE启动子结合转录CDKN2A基因，提高兼容性、稳定表达，调控表达等优点，合理应用抑癌基因治疗，避免副作用，通过物理手段阻止CAG启动子上的RNA聚合酶通过，和阻止RNA聚合酶和TRE3G启动子结合，腺病毒载体在细胞中越多，tTS阻遏蛋白就越多，形成负反馈调控，动态平衡调控p53基因的表达，到达能诱导癌细胞程序性凋亡和免疫清除，又能避免副作用。图2腺病毒载体中Ad5Ψ，是腺病毒包装信号，马达蛋白识别Ad5Ψ序列信号，将基因载体注入腺病毒内，包装成腺病毒颗粒。图2腺病毒中AmpR、AmpR promoter，：使大肠杆菌对氨苄西林产生抗药性，AmpR promoter只能大肠杆菌里具备启动子功能，AmpR在哺乳动物细胞无法表达，将载体基因保存到大肠杆菌复制，筛选出导入载体基因的大肠杆菌，纯化提取载体基因。图2腺病毒载体中SV40 poly(A) signal，形成发夹结构，转录终止和多聚腺苷酸mRNA转录的Pol IIRNA聚合酶，mRNA出入核孔信号，使P53、CDKN2A、tTs/Tet-On3G，mRNA出入细胞核孔表达。腺病毒载体治疗癌症的药效过程腺病毒治疗载体经过静脉输液的方式进入体内，腺病毒治疗载体会随血液循环运输到身体各个部位，腺病毒治疗载体会随机
接触细胞壁，如图1和图2所示腺病毒治疗载体 ，有很多突纤维，这些突出纤维是打开细胞膜，胞吞作用的蛋白钥匙，细胞膜表面有很多监测蛋白分子，监测蛋白分子和营养物质结合才能开启细胞膜胞吞作用，识别需要的营养物质进入和预防有害物质进入细胞，腺病毒治疗载体的突出纤维欺骗了监测蛋白分子，以为腺病毒治疗载体是营养物质，与突出纤维结合，监测蛋白分子在与细胞膜结合，开启胞吞作用，会把腺病毒治疗载体送入细胞内，腺病毒治疗载体进入细胞内 ，细胞会以为是营养物质，一种特殊的蛋白会把腺病毒治疗载体膜泡剪出包裹起来，送往红细胞浆质分选站，这里是分解营养物质和把营养物质送往需要的地方，腺病毒治疗载体进入红细胞浆质分选站，里面的氢离子泵会释放酸性物质，腺病毒治疗载体在酸性物质的作用下开始分解，有两层衣壳首先是第一层的衣壳蛋白脱落，部分脱落衣壳蛋白与红细胞浆质内壁结合，破坏内壁腺病毒治疗载体逃出红细胞浆质分选站漂移接近细胞核，由于腺病毒治疗载体第一层蛋白衣壳被破坏稳定性不高加上有蛋白酶的分解下，第二层蛋白衣壳开始裂解，释放出治疗载体DNA，图1腺病毒载体在细胞中不会拷贝，图2腺病毒载体在正常细胞拷贝数量非常低或不拷贝，虽然会拷贝但表达把控更加严格，在癌细胞中会提高拷贝数量，在四环素、强力素作用下，调控基因正常表达数量，诱导性启动子功能发挥，指引解旋酶打开载体DNA双链，打开载体DNA链后，RNA聚合酶与DNA单链结合，在ATP能量提供下合成带有P53、CDKN2A基因的mRNA，核糖体与mRNA结合，在ATP能量提供下翻译出多肽，多肽折叠形成P53蛋白、CDKN2A激酶，通过上述抑癌信号通路激活激活Procaspase-3和Procaspase-7蛋白，让癌细胞发生程序性凋亡或免疫清除。腺病毒载体的包装方法 Tet-On3G表达调控系统也可以用于各种病毒包装在细菌和哺乳动物细胞都适用，特点是不用pcr扩增基因，无需每次都需要导入包装质粒，把包装全部所需的质粒导入受体细胞，通过Tet-On3G表达调控系统，控制病毒基因表达，在没有四环素情况下不会产生病毒颗粒，不会影响受体细胞的生长分裂，培养扩增受体细胞，拿出部分受体细胞加入四环素培养，此时病毒基因激活包装产生病毒颗粒 ，如此可以批量包装各种病毒载体 。实验室和生物公司都是采用pcr扩增和基因导入的方法包装，不仅成本高而且效率低，实验方法比如一组腺病毒包装质粒 pAAV-RC2、pAAV-MCS、pHelper质粒一起包装成腺相关病毒，pAAV-RC2的载体含有CAP和REP基因，这些基因可以产生产生传染性病毒所需的衣壳和DNA复制蛋白将该载体共转染到包装细胞系中，制备重组的复制缺陷型AAV病毒，pAAV-RC质粒含有AAV-2rep和CAP基因，分别编码复制蛋白和病毒衣壳结构蛋白。建立REP和CAP基因产物的正确表达水平是实现高滴度病毒生产的重要步骤。pAAV-RC从两个不同的启动子指导REP和CAP的表达，把这两个启动子酶切掉换成TRE3G启动子，调控REP和CAP的表达，pAAV-MCS和pHelper其中一个或两个，插入Tet3G基因和EBNA1基因，图2腺病毒载体的拷贝需要EBNA1基因，它序列长度1926bp编码一种56.kDa的复制因子，并在转导入人体体细胞后从其启动子表达该蛋白质。EBNA1蛋白进而识别OriP序列，并诱导与宿主细胞DNA扩增同时发生腺图2病毒载体扩增，先将这两个质粒和目的基因载体导入受体细胞，过一段时间受体细胞表达有足够多的Tet3G蛋白，在将pAAV-RC2导入受体细胞，培养扩增受体细胞，拿出部分受体细胞加入四环素培养，REP和CAP表达激活，腺病毒载体在受体细胞完成包装，此方法适用于所有的宿主细胞和病毒包装，将部分病毒衣壳蛋白基因用Tet-On3G系统调控表达，可高效率包装出图2病毒载体。预期实验 P53是公认的抑癌基因，有很多抑癌实验都获得成功，较少部分的临床试验也获得成功，使用重组腺病毒载体携带P53基因治疗癌症早在15多年前，已经有科学家做了临床试验，出现了有一些公布的实验和相关的专利，15年过去了重组腺病毒P53，因避免不了副作用，无法应用到癌症患者，还是停留在实验阶段，有极少部分临床试验获得成功，只有在集中的良性肿瘤中，通过定量注射治疗载体，才能避免副作用，这些良性肿瘤通常不会致命，在具有扩散性致命的癌症中，无法得到实用，本发明可以应用到癌症中，具有实用性和新颖性。图3实验是把控抑癌基因的表达，P53和CDKN2A基因使用到癌症治疗中控制表达是重点，实验使用PHEBo携带LTR复制起点的质粒，序列长度为9.7KB，使用P367携带oriP复制起点和EBNA-1基因的质粒，序列长度为9.7KB，使用PHEBo只携带oriP复制起点的质粒，序列长度7KB,对比质粒拷贝效率实验，将3种质粒转染细胞中48小时，提取出来，放进电泳槽，质粒的拷贝量可以在电泳槽中凸显出来，“oriP +”代表携带oriP复制起点，“- ”代表不携带，“EBNA-1 ”+代表携带EBNA-1基因，“-”代表不携带，电泳实验可以看出来，携带oriP复制起点，而没有携带EBNA-1基因的质粒，在电泳1、2、3、4、5、6、7、8、9、10跑道位置完中完全看不见，携带oriP复制起点和EBNA-1基因的质粒，在11、12跑道，位置中可以看见，拷贝数量和携带LTR复制起点的质粒数量差不多，实验表明oriP在没有EBNA-1基因的情况下，拷贝数量非常低甚至无法拷贝，这利用在治疗癌症中把控P53基因，CDKN2A基因的表达，避免副作用。携带oriP复制起点，在带有EBNA-1基因的腺病毒骨架质粒，可以大量拷贝，这利于腺病毒载体的生产。图4是一个正常肝实质细胞，和肝癌细胞加入腺病毒载体的效果统计，将上述合成的腺病毒载体基因，包装成腺病毒颗粒，加入到分别培养的，正常的肝实质细胞和癌变的肝细胞中，加入微量的四环素，第1天使用细胞计数板统计两种细胞的密度，统计实验的肝癌细胞密度大于正常肝实质细胞，第5天统计两种细胞的存活密度，使用Trypan Blue是检测细胞膜完整性最常用的生物染色试剂。健康的正常细胞能够排斥Trypan Blue，死亡的细胞可被Trypan Blue染成蓝色。细胞经Trypan Blue染色后，通过显微镜，镜下计数，对细胞存活率定量分析计数，第5天分析结果肝癌细胞存活密度有所减少，正常肝实质细胞存活没有变化，第10天分析结果肝癌细胞明显发生分子生物学凋亡小体现象，存活密度从10ul/350降到10ul/100，正常肝实质细胞存活密度有所提高，第15分析结果肝癌细胞存活密度从10ul/100降到10ul/30，而正常肝实质细胞，有血清培养下仍然正常扩增，存活密度从10ul/230提升到10ul/290，实验表明创造的腺病毒载体对正常细胞没有影响，同时又能诱导癌细胞发生程序性凋亡，针对癌细胞才有杀伤效果。具体实施用于治疗癌症的腺病毒载体，一次使用量在一万亿个腺病毒颗粒，通过上述现有包装技术，可以批量包装出腺病毒颗粒，纯化出无毒无害的腺病毒注射液，达到医用级别，对没有扩散的癌细胞，在无菌医疗室使用微针注射到癌变的组织，已扩散的癌细胞，使用静脉输液的方式，输入癌症患者体内治疗，患者需要服用四环素药物，医生必须掌握四环素药物使用技巧，以微克为计量单位，根据患者的年龄体重，定量使用四环素药物，药物用量错误会发生严重副作用，图1腺病毒载体和图2腺病毒载体，四环素药物用量不一样，图2腺病毒载体抑制癌基因将在患者体内长期存在，患者需了解和禁吃包含类四环素药物和食品，如包含金霉素、土霉素、四环素、及半合成衍生物甲烯土霉素、强力霉素、二甲胺基四环素的药物和食品，过量会引起炎症反应，包含这些成分的药物和食品比较稀有，不会影响正常生活，目前来说，还是缺乏有效对抗癌症的药物，患者一个月做一次腺病毒抑癌基因疗法，可保证患者生命不受威胁，能够正常生活，合理利用腺病毒抑癌基因治疗，可达到PD-1、PD-L1抗体治疗的效果，对于其它抑癌药物无法有效抵抗癌症，腺病毒载体可给他们多一个希望。
序列表
<110> 刘玉文
<120> 一种针对癌细胞基因损伤增殖信号通路的基因治疗药剂
<141> 2020-04-07
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9514
<212> DNA
<213> 图1腺病毒载体序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
ctgctctgat gccgcatagt agccagcccc gacacccgcc acacccgctg acgcgccctg 60
acgggcgtgt acacaggaag tgacaatttt cgcgcggttt taggcggatg ttgtagtaaa 120
tttgggcgta accgagtaag atttggccat tttcgcggga aaactgaata agaggaagtg 180
aaatctgaat aattttgtgt tactcatagc gcgtaatctg ctctgatgcc gcatagtagc 240
cagccccgac acccgccaca cccgctgacg cgccctgacg ggcctcgaca ttgattattg 300
actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 360
cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 420
ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 480
caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 540
ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 600
tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 660
accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca 720
cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg 780
gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg 840
agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg 900
cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagt cgctgcgcgc 960
tgccttcgcc ccgtgccccg ctccgccgcc gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg 1020
accgcgttac tcccacaggt gagcgggcgg gacggccctt ctcctccggg ctgtaattag 1080
cgcttggttt aatgacggct tgtttctttt ctgtggctgc gtgaaagcct tgaggggctc 1140
cgggagggcc ctttgtgcgg ggggagcggc tcggggggtg cgtgcgtgtg tgtgtgcgtg 1200
gggagcgccg cgtgcggctc cgcgctgccc ggcggctgtg agcgctgcgg gcgcggcgcg 1260
gggctttgtg cgctccgcag tgtgcgcgag gggagcgcgg ccgggggcgg tgccccgcgg 1320
tgcggggggg gctgcgaggg gaacaaaggc tgcgtgcggg gtgtgtgcgt gggggggtga 1380
gcagggggtg tgggcgcgtc ggtcgggctg caaccccccc tgcacccccc tccccgagtt 1440
gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg ctccgtacgg ggcgtggcgc ggggctcgcc 1500
gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc 1560
ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc ccccggagcg ccggcggctg tcgaggcgcg 1620
gcgagccgca gccattgcct tttatggtaa tcgtgcgaga gggcgcaggg acttcctttg 1680
tcccaaatct gtgcggagcc gaaatctggg aggcgccgcc gcaccccctc tagcgggcgc 1740
ggggcgaagc ggtgcggcgc cggcaggaag gaaatgggcg gggagggcct tcgtgcgtcg 1800
ccgcgccgcc gtccccttct ccctctccag cctcggggct gtccgcgggg ggacggctgc 1860
cttcgggggg gacggggcag ggcggggttc ggcttctggc gtgtgaccgg cggctctaga 1920
gcctctgcta accatgttca tgccttcttc tttttcctac agctcctggg caacgtgctg 1980
gttattgtgc tgtctcatca ttttggcaaa gaattgggta ccgagctcga ctttcacttt 2040
tctctatcac tgatagggag tggtaaactc gactttcact tttctctatc actgataggg 2100
agtggtaaac tcgactttca cttttctcta tcactgatag ggagtggtaa actcgacttt 2160
cacttttctc tatcactgat agggagtggt aaactcgact ttcacttttc tctatcactg 2220
atagggagtg gtaaactcga ctttcacttt tctctatcac tgatagggag tggtaaactc 2280
gactttcact tttctctatc actgataggg agtggtaaac tcgacctata taagcagagc 2340
tcgtttagtg aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg acctccatag 2400
aagacaccgg gaccgatcca gcctccgcgg ccccgaattg gccaccatgg tgcgcaggtt 2460
cttggtgacc ctccggattc ggcgcgcgtg cggcccgccg cgagtgaggg ttttcgtggt 2520
tcacatcccg cggctcacgg gggagtgggc agcgccaggg gcgcccgccg ctgtggccct 2580
cgtgctgatg ctactgagga gccagcgtct agggcagcag ccgcttccta gaagaccagg 2640
tcatgatgat gggcagcgcc cgagtggcgg agctgctgct gctccacggc gcggagccca 2700
actgcgccga ccccgccact ctcacccgac ccgtgcacga cgctgcccgg gagggcttcc 2760
tggacacgct ggtggtgctg caccgggccg gggcgcggct ggacgtgcgc gatgcctggg 2820
gccgtctgcc cgtggacctg gctgaggaag cggagagggc aggggaagtc ttctaacatg 2880
cggggacgtg gaggaaaatc ccggccccat ggaggagccg cagtcagatc ctagcgtcga 2940
gccccctctg agtcaggaaa cattttcaga cctatggaaa ctacttcctg aaaacaacgt 3000
tctgtccccc ttgccgtccc aagcaatgga tgatttgatg ctgtccccgg acgatattga 3060
acaatggttc actgaagacc caggtccaga tgaagctccc agaatgccag aggctgctcc 3120
ccgcgtggcc cctgcaccag cagctcctac accggcggcc cctgcaccag ccccctcctg 3180
gcccctgtca tcttctgtcc cttcccagaa aacctaccag ggcagctacg gtttccgtct 3240
gggcttcttg cattctggga cagccaagtc tgtgacttgc acgtactccc ctgccctcaa 3300
caagatgttt tgccaactgg ccaagacctg ccctgtgcag ctgtgggttg attccacacc 3360
cccgcccggc acccgcgtcc gcgccatggc catctacaag cagtcacagc acatgacgga 3420
ggttgtgagg cgctgccccc accatgagcg ctgctcagat agcgatggtc tggcccctcc 3480
tcagcatctt atccgagtgg aaggaaattt gcgtgtggag tatttggatg acagaaacac 3540
ttttcgacat agtgtggtgg tgccctatga gccgcctgag gttggctctg actgtaccac 3600
catccactac aactacatgt gtaacagttc ctgcatgggc ggcatgaacc ggaggcccat 3660
cctcaccatc atcacactgg aagactccag tggtaatcta ctgggacgga acagctttga 3720
ggtgcgtgtt tgtgcctgtc ctgggagaga ccggcgcaca gaggaagaga atctccgcaa 3780
gaaaggggag cctcaccacg agctgccccc agggagcact aagcgagcac tgcccaacaa 3840
caccagctcc tctccccagc caaagaagaa accactggat ggagaatatt tcacccttca 3900
gatccgtggg cgtgagcgct tcgagatgtt ccgagagctg aatgaggcct tggaactcaa 3960
ggatgcccag gctgggaagg agccaggggg gagcagggct cactccagcc acctgaagtc 4020
caaaaagggt cagtctacct cccgccataa aaaactcatg ttcaagacag aagggcctga 4080
ctcagactga ctgctctgat gccgcatagt agccagcccc gacacccgcc acacccgctg 4140
acgcgccctg acgggccaga catgataaga tacattgatg agtttggaca aaccacaact 4200
agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta 4260
accattataa gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag 4320
gttcaggggg aggtgtggga ggttttttaa agcaagtaaa acctctacaa atgtggtact 4380
gctctgatgc cgcatagtag ccagccccga cacccgccac acccgctgac gcgccctgac 4440
gggctttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 4500
ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 4560
tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctctcttcgg 4620
gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 4680
gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 4740
gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 4800
ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 4860
ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 4920
ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 4980
gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 5040
ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 5100
tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt 5160
ttcaggaaac agctatgaca aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag 5220
ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat 5280
agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc 5340
cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa 5400
ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca 5460
gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa 5520
cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt 5580
cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc 5640
ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact 5700
catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc 5760
tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg 5820
ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct 5880
catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc 5940
cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag 6000
cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac 6060
acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg 6120
ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt 6180
tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac 6240
attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt cggcgcgccg cggccgcctc 6300
gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 6360
catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 6420
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 6480
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 6540
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 6600
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 6660
tagtcatcgc tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct 6720
cccccccctc cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga 6780
tgggggcggg gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg 6840
gcggggcgag gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc 6900
cttttatggc gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg 6960
gagtcgctgc gcgctgcctt cgccccgtgc cccgctccgc cgccgcctcg cgccgcccgc 7020
cccggctctg actgaccgcg ttactcccac aggtgagcgg gcgggacggc ccttctcctc 7080
cgggctgtaa ttagcgcttg gtttaatgac ggcttgtttc ttttctgtgg ctgcgtgaaa 7140
gccttgaggg gctccgggag ggccctttgt gcggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg 7200
tgtgtgtgtg cgtggggagc gccgcgtgcg gctccgcgct gcccggcggc tgtgagcgct 7260
gcgggcgcgg cgcggggctt tgtgcgctcc gcagtgtgcg cgaggggagc gcggccgggg 7320
gcggtgcccc gcggtgcggg gggggctgcg aggggaacaa aggctgcgtg cggggtgtgt 7380
gcgtgggggg gtgagcaggg ggtgtgggcg cgtcggtcgg gctgcaaccc cccctgcacc 7440
cccctccccg agttgctgag cacggcccgg cttcgggtgc ggggctccgt acggggcgtg 7500
gcgcggggct cgccgtgccg ggcggggggt ggcggcaggt gggggtgccg ggcggggcgg 7560
ggccgcctcg ggccggggag ggctcggggg aggggcgcgg cggcccccgg agcgccggcg 7620
gctgtcgagg cgcggcgagc cgcagccatt gccttttatg gtaatcgtgc gagagggcgc 7680
agggacttcc tttgtcccaa atctgtgcgg agccgaaatc tgggaggcgc cgccgcaccc 7740
cctctagcgg gcgcggggcg aagcggtgcg gcgccggcag gaaggaaatg ggcggggagg 7800
gccttcgtgc gtcgccgcgc cgccgtcccc ttctccctct ccagcctcgg ggctgtccgc 7860
ggggggacgg ctgccttcgg gggggacggg gcagggcggg gttcggcttc tggcgtgtga 7920
ccggcggctc tagagcctct gctaaccatg ttcatgcctt cttctttttc ctacagctcc 7980
tgggcaacgt gctggttatt gtgctgtctc atcattttgg caaagaattg gccaccatgt 8040
ctagattaga taaaagtaaa gtgattaaca gcgcattaga gctgcttaat gaggtcggaa 8100
tcgaaggttt aacaacccgt aaactcgccc agaagctagg tgtagagcag cctacattgt 8160
attggcacgt gcgcaacaag cagactctta tgaacatgct ttcagaggca atactggcga 8220
agcatcacac ccgttcagca ccgttaccga ctgagagttg gcagcagttt ctccaggaaa 8280
atgctctgag tttccgtaaa gcattactgg tccatcgtga tggagcccga ttgcatatag 8340
ggacctctcc tacgcccccc cagtttgaac aagcagaggc gcaactacgc tgtctatgcg 8400
atgcagggtt ttcggtcgag gaggctcttt tcattctgca atctatcagc cattttacgt 8460
tgggtgcagt attagaggag caagcaacaa accagataga aaataatcat gtgatagacg 8520
ctgcaccacc attattacaa gaggcattta atattcaggc gagaacctct gctgaaatgg 8580
ccttccattt cgggctgaaa tcattaatat ttggattttc tgcacagtta gatgaaaaaa 8640
agcatacacc cattgaggat ggtaataaac caaaaaagaa gagaaagcta gcagtgtcag 8700
tgacatttga agatgtggct gtgctcttta ctcgggacga gtggaagaag ctggatctgt 8760
ctcagagaag cctgtaccgt gaggtgatgc tggagaatta cagcaacctg gcctccatgg 8820
caggattcct gtttaccaaa ccaaaggtga tctccctgtt gcagcaagga gaggatccct 8880
ggggctccgg agagggcagg ggaagtcttc taacatgcgg ggacgtggag gaaaatcccg 8940
gccccctgct ctgatgccgc atagtagcca gccccgacac ccgccacacc cgctgacgcg 9000
ccctgacggg cctgctctga tgccgcatag tagccagccc cgacacccgc cacacccgct 9060
gacgcgccct gacgggccag acatgataag atacattgat gagtttggac aaaccacaac 9120
tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt 9180
aaccattata agctgcaata aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca 9240
ggttcagggg gaggtgtggg aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca aatgtggtac 9300
tgctctgatg ccgcatagta gccagccccg acacccgcca cacccgctga cgcgccctga 9360
cgggcgtaaa acgacggcca gtctgctctg atgccgcata gtagccagcc ccgacacccg 9420
ccacacccgc tgacgcgccc tgacgggcct gctctgatgc cgcatagtag ccagccccga 9480
cacccgccac acccgctgac gcgccctgac gggc 9514
<210> 2
<211> 10515
<212> DNA
<213> 图2腺病毒载体序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
ctgcttttac tccctatcag tgatagagaa cgtatgaaga gtttactccc tatcagtgat 60
agagaacgta tgcagacttt actccctatc agtgatagag aacgtataag gagtttactc 120
cctatcagtg atagagaacg tatgaccagt ttactcccta tcagtgatag agaacgtatc 180
tacagtttac tccctatcag tgatagagaa cgtatatcca gtttactccc tatcagtgat 240
agagaacgta taagctttag gcgtgtacgg tgggcgccta taaaagcaga gctcgtttag 300
tgaaccgtca gatcgcctgg agcaattcca caacactttt gtcttatacc aactttccgt 360
accacttcct accctcgtaa acatggtgcg caggttcttg gtgaccctcc ggattcggcg 420
cgcgtgcggc ccgccgcgag tgagggtttt cgtggttcac atcccgcggc tcacggggga 480
gtgggcagcg ccaggggcgc ccgccgctgt ggccctcgtg ctgatgctac tgaggagcca 540
gcgtctaggg cagcagccgc ttcctagaag accaggtcat gatgatgggc agcgcccgag 600
tggcggagct gctgctgctc cacggcgcgg agcccaactg cgccgacccc gccactctca 660
cccgacccgt gcacgacgct gcccgggagg gcttcctgga cacgctggtg gtgctgcacc 720
gggccggggc gcggctggac gtgcgcgatg cctggggccg tctgcccgtg gacctggctg 780
aggaagcgga gagggcaggg gaagtcttct aacatgcggg gacgtggagg aaaatcccgg 840
ccccatggag gagccgcagt cagatcctag cgtcgagccc cctctgagtc aggaaacatt 900
ttcagaccta tggaaactac ttcctgaaaa caacgttctg tcccccttgc cgtcccaagc 960
aatggatgat ttgatgctgt ccccggacga tattgaacaa tggttcactg aagacccagg 1020
tccagatgaa gctcccagaa tgccagaggc tgctccccgc gtggcccctg caccagcagc 1080
tcctacaccg gcggcccctg caccagcccc ctcctggccc ctgtcatctt ctgtcccttc 1140
ccagaaaacc taccagggca gctacggttt ccgtctgggc ttcttgcatt ctgggacagc 1200
caagtctgtg acttgcacgt actcccctgc cctcaacaag atgttttgcc aactggccaa 1260
gacctgccct gtgcagctgt gggttgattc cacacccccg cccggcaccc gcgtccgcgc 1320
catggccatc tacaagcagt cacagcacat gacggaggtt gtgaggcgct gcccccacca 1380
tgagcgctgc tcagatagcg atggtctggc ccctcctcag catcttatcc gagtggaagg 1440
aaatttgcgt gtggagtatt tggatgacag aaacactttt cgacatagtg tggtggtgcc 1500
ctatgagccg cctgaggttg gctctgactg taccaccatc cactacaact acatgtgtaa 1560
cagttcctgc atgggcggca tgaaccggag gcccatcctc accatcatca cactggaaga 1620
ctccagtggt aatctactgg gacggaacag ctttgaggtg cgtgtttgtg cctgtcctgg 1680
gagagaccgg cgcacagagg aagagaatct ccgcaagaaa ggggagcctc accacgagct 1740
gcccccaggg agcactaagc gagcactgcc caacaacacc agctcctctc cccagccaaa 1800
gaagaaacca ctggatggag aatatttcac ccttcagatc cgtgggcgtg agcgcttcga 1860
gatgttccga gagctgaatg aggccttgga actcaaggat gcccaggctg ggaaggagcc 1920
aggggggagc agggctcact ccagccacct gaagtccaaa aagggtcagt ctacctcccg 1980
ccataaaaaa ctcatgttca agacagaagg gcctgactca gactgatgat gccgcatagt 2040
agccagcccc gacacccgcc acacccgctg acgcgccctg acgcagacat gataagatac 2100
attgatgagt ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa 2160
atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attataagct gcaataaaca agttaacaac 2220
aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt tttttaaagc 2280
aagtaaaacc tctacaaatg tggtaggcgg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc 2340
gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag 2400
gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga 2460
ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc 2520
atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 2580
tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt 2640
ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca 2700
gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca 2760
ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag 2820
ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca 2880
agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg 2940
ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa 3000
aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatggta aaacgacggc cagtaagttt 3060
taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 3120
tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt 3180
cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc 3240
gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc 3300
cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg 3360
ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac 3420
aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg 3480
atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc 3540
tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact 3600
gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc 3660
aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat 3720
acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc 3780
ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 3840
tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 3900
aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 3960
catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 4020
atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca ctgctctgat 4080
gccgcatagt agccagcccc gacacccgcc acacccgctg acgcgccctg acgggctacc 4140
acatttgtag aggttttact tgctttaaaa aacctcccac acctccccct gaacctgaaa 4200
cataaaatga atgcaattgt tgttgttctc gctcctgggc aacgtgctgg ttattgggtg 4260
tacacaggaa gtgacaattt tcgcgcggtt ttaggcggat gttgtagtaa atttgggcgt 4320
aaccgagtaa gatttggcca ttttcgcggg aaaactgaat aagaggaagt gaaatctgaa 4380
taattttgtg ttactcatag cgcgtaatag ctcgactttt aaactcgacc tatataagca 4440
gagctcgttt agtgaaccgt cacgccatcc acgctgtttt gacctccata gaagacaccg 4500
ggaccgatcc agcctccgcg gccccgaatt gtgctgtctt catcattttg gcaaagaatt 4560
gctgctctga tgccgcatag tagccagccc cgacacccgc cacacccgct gacgcgccct 4620
gacgggcctg ctctgatgcc gcatagtagc cagccccgac acccgccaca cccgctgacg 4680
cgccctgacg ggcctcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg 4740
tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg 4800
cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata 4860
gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc 4920
cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac 4980
ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg 5040
cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc 5100
ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt tattttttaa 5160
ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg 5220
cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc 5280
gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga 5340
agcgcgcggc gggcgggagt cgctgcgcgc tgccttcgcc ccgtgccccg ctccgccgcc 5400
gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg accgcgttac tcccacaggt gagcgggcgg 5460
gacggccctt ctcctccggg ctgtaattag cgcttggttt aatgacggct tgtttctttt 5520
ctgtggctgc gtgaaagcct tgaggggctc cgggagggcc ctttgtgcgg ggggagcggc 5580
tcggggggtg cgtgcgtgtg tgtgtgcgtg gggagcgccg cgtgcggctc cgcgctgccc 5640
ggcggctgtg agcgctgcgg gcgcggcgcg gggctttgtg cgctccgcag tgtgcgcgag 5700
gggagcgcgg ccgggggcgg tgccccgcgg tgcggggggg gctgcgaggg gaacaaaggc 5760
tgcgtgcggg gtgtgtgcgt gggggggtga gcagggggtg tgggcgcgtc ggtcgggctg 5820
caaccccccc tgcacccccc tccccgagtt gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg 5880
ctccgtacgg ggcgtggcgc ggggctcgcc gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg 5940
gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc 6000
ccccggagcg ccggcggctg tcgaggcgcg gcgagccgca gccattgcct tttatggtaa 6060
tcgtgcgaga gggcgcaggg acttcctttg tcccaaatct gtgcggagcc gaaatctggg 6120
aggcgccgcc gcaccccctc tagcgggcgc ggggcgaagc ggtgcggcgc cggcaggaag 6180
gaaatgggcg gggagggcct tcgtgcgtcg ccgcgccgcc gtccccttct ccctctccag 6240
cctcggggct gtccgcgggg ggacggctgc cttcgggggg gacggggcag ggcggggttc 6300
ggcttctggc gtgtgaccgg cggctctaga gcctctgcta accatgttca tgccttcttc 6360
tttttcctac agctcctggg caacgtgctg gttattgtgc tgtctcatca ttttggcaaa 6420
gaattggcca ccatgtctag actggacaag agcaaagtca taaactctgc tctggaatta 6480
ctcaatggag tcggtatcga aggcctgacg acaaggaaac tcgctcaaaa gctgggagtt 6540
gagcagccta ccctgtactg gcacgtgaag aacaagcggg ccctgctcga tgccctgcca 6600
atcgagatgc tggacaggca tcatacccac tcctgccccc tggaaggcga gtcatggcaa 6660
gactttctgc ggaacaacgc caagtcatac cgctgtgctc tcctctcaca tcgcgacggg 6720
gctaaagtgc atctcggcac ccgcccaaca gagaaacagt acgaaaccct ggaaaatcag 6780
ctcgcgttcc tgtgtcagca aggcttctcc ctggagaacg cactgtacgc tctgtccgcc 6840
gtgggccact ttacactggg ctgcgtattg gaggaacagg agcatcaagt agcaaaagag 6900
gaaagagaga cacctaccac cgattctatg cccccacttc tgaaacaagc aattgagctg 6960
ttcgaccggc agggagccga acctgccttc cttttcggcc tggaactaat catatgtggc 7020
ctggagaaac agctaaagtg cgaaagcggc gggccgaccg acgcccttga cgattttgac 7080
ttagacatgc tcccagccga tgcccttgac gactttgacc ttgatatgct gcctgctgac 7140
gctcttgacg attttgacct tgacatgctc cccgggtaac ggaagcggag agggcagggg 7200
aagtcttcta acatgcgggg acgtggagga aaatcccggc cccatgtcta gattagataa 7260
aagtaaagtg attaacagcg cattagagct gcttaatgag gtcggaatcg aaggtttaac 7320
aacccgtaaa ctcgcccaga agctaggtgt agagcagcct acattgtatt ggcacgtgcg 7380
caacaagcag actcttatga acatgctttc agaggcaata ctggcgaagc atcacacccg 7440
ttcagcaccg ttaccgactg agagttggca gcagtttctc caggaaaatg ctctgagttt 7500
ccgtaaagca ttactggtcc atcgtgatgg agcccgattg catataggga cctctcctac 7560
gcccccccag tttgaacaag cagaggcgca actacgctgt ctatgcgatg cagggttttc 7620
ggtcgaggag gctcttttca ttctgcaatc tatcagccat tttacgttgg gtgcagtatt 7680
agaggagcaa gcaacaaacc agatagaaaa taatcatgtg atagacgctg caccaccatt 7740
attacaagag gcatttaata ttcaggcgag aacctctgct gaaatggcct tccatttcgg 7800
gctgaaatca ttaatatttg gattttctgc acagttagat gaaaaaaagc atacacccat 7860
tgaggatggt aataaaccaa aaaagaagag aaagctagca gtgtcagtga catttgaaga 7920
tgtggctgtg ctctttactc gggacgagtg gaagaagctg gatctgtctc agagaagcct 7980
gtaccgtgag gtgatgctgg agaattacag caacctggcc tccatggcag gattcctgtt 8040
taccaaacca aaggtgatct ccctgttgca gcaaggagag gatccctggt aatgctctga 8100
tgccgcatag tagccagccc cgacacccgc cacacccgct gacgcgccct gacgggcctg 8160
ctctgatgcc gcatagtagc cagccccgac acccgccaca cccgctgacg cgccctgacg 8220
ggccagacat gataagatac attgatgagt ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa 8280
aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attataagct 8340
gcaataaaca agttaacaac aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg 8400
tgtgggaggt tttttaaagc aagtaaaacc tctacaaatg tgctgctctg atgccgcata 8460
gtagccagcc ccgacacccg ccctgctctg atgccgcata gtagccagcc ccgacacccg 8520
ccacacccgc tgacgcgccc tgacgggcac acccgctgac gcgccctgac gggcgtctgc 8580
tctgatgccg catagtagcc agccccgaca cccgccacac ccgctgacgc gccctgacgg 8640
gcacaggaaa aggacaagca gcgaaaattc acgccccctt gggaggtggc ggcatatgca 8700
aaggatagca ctcccactct actactgggt atcatatgct gactgtatat gcatgaggat 8760
agcatatgct acccggatac agattaggat agcatatact acccagatat agattaggat 8820
agcatatgct acccagatat agattaggat agcctatgct acccagatat aaattaggat 8880
agcatatact acccagatat agattaggat agcatatgct acccagatat agattaggat 8940
agcctatgct acccagatat agattaggat agcatatgct acccagatat agattaggat 9000
agcatatgct atccagatat ttgggtagta tatgctaccc agatataaat taggatagca 9060
tatactaccc taatctctat taggatagca tatgctaccc ggatacagat taggatagca 9120
tatactaccc agatatagat taggatagca tatgctaccc agatatagat taggatagcc 9180
tatgctaccc agatataaat taggatagca tatactaccc agatatagat taggatagca 9240
tatgctaccc agatatagat taggatagcc tatgctaccc agatatagat taggatagca 9300
tatgctatcc agatatttgg gtagtatatg ctacccatgg caacattagc ccaccgtgct 9360
ctcagcgacc tcgtgaatat gaggaccaac aaccctgtgc ttggcgctca ggcgcaagtg 9420
tgtgtaattt gtcctccaga tcgcagcaat cgcgccccta tcttggcccg cccacctact 9480
tatgcaggta ttccccgggg tgccattagt ggttttgtgg gcaagtggtt tgaccgcagt 9540
ggttagcggg gttacaatca gccaagttat tacaccctta ttttacagtc caaaaccgca 9600
gggcggcgtg tgggggctga cgcgtgcccc cactccacaa tttcaaaaaa aagagtggcc 9660
acttgtcttt gtttatgggc cccattggcg tggagccccg tttaattttc gggggtgtta 9720
gagacaacca gtggagtccg ctgctgtcgg cgtccactct ctttcccctt gttacaaata 9780
gagtgtaaca acatggttca cctgtcttgg tccctgcctg ggacacatct taataacccc 9840
agtatcatat tgcactagga ttatgtgttg cccatagcca taaattcgtg tgagatggac 9900
atccagtctt tacggcttgt ccccacccca tggatttcta ttgttaaaga tattcagaat 9960
gtttcattcc tacactagta tttattgccc aaggggtttg tgagggttat attggtgtca 10020
tagcacaatg ccaccactga accccccgtc caaattttat tctgggggcg tcacctgaaa 10080
ccttgttttc gagcacctca catacacctt actgttcaca actcagcagt tattctatta 10140
gctaaacgaa ggagaatgaa gaagcaggcg aagattcagg agagttcact gcccgctcct 10200
tgatcttcag ccactgccct tgtgactaaa atggttcact accctcgtgg aatcctgacc 10260
ccatgtaaat aaaaccgtga cagctcatgg ggtgggagat atcgctgttc cttaggaccc 10320
ttttactaac cctaattcga tagcatatgc ttcccgttgg gtaacatatg ctattgaatt 10380
agggttagtc tggatagtat atactactac ccgggaagca tatgctaccc gtttgctctg 10440
atgccgcata gtagccagga aacagctatg accagccccg acacccgcca cacccgctga 10500
cgcgccctga cgggc 10515
Claims (5)
1.一种携带P53基因、CDKN2A基因、tTS基因、TRE启动子的腺病毒颗粒,其特征在于:（1）TRE为P53基因、CDKN2A的启动子；(2)腺病毒载体无哺乳动物细胞复制起点、在哺乳动物细胞中腺病毒载体不会复制不会传代细胞，调控P53基因、CDKN2A基因表达；（3）TRE启动子为tTS蛋白结合靶点，通过四环素、强力素调控P53基因、CDKN2A基因表达。
2.如1所述包括腺病毒衣壳蛋白，基因元件:Ad5 Psi 、TRE、Kozak sequence、CDKN2A 、T2A 、p53、SV40 poly(A) signal 、ori 、M13 rev、AmpR 、AmpR 、promoter 、CAG 、tTS 、T2A、SV40 poly(A) signal 、M13 fwd的腺病毒颗粒。
3.一种携带P53基因、CDKN2A基因、Tet3G基因、tTS基因、oriP复制起点、TRE3G启动子的腺病毒颗粒，其特征在于: （1）TRE3G为P53基因、CDKN2A基因的启动子；（2）EBNA1为oriP包装腺病毒载体转录因子，oriP在正常细胞低复制，癌细胞中高复制；调控P53基因、CDKN2A基因表达；（3）TRE3G启动子为Tet3G蛋白、tTS蛋白的结合靶点，通过四环素、强力素调控P53基因、CDKN2A基因表达。
4.如3所述包括腺病毒衣壳蛋白，基因元件:TRE3G、CDKN2A 、T2A 、p53 、SV40 poly(A)signal 、ori 、M13 fwd 、AmpR 、 AmpR promoter 、 Ad5 Psi 、CAG 、Tet3G 、T2A 、tTS、SV40、poly(A) signal 、oriP 、M13 rev的腺病毒颗粒。
5.通过腺病毒骨架质粒结合TRE3G启动子、Tet3G蛋白、EBNA1基因，包装生产如2所述腺病毒载体。
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| CN117701638A (zh) * | 2023-12-18 | 2024-03-15 | 苏州新芽基因生物技术有限公司 | 一种抑制残留aav载体质粒和质粒骨架转录活性的方法 |
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|---|---|---|---|---|
| CN101148681A (zh) * | 2006-10-27 | 2008-03-26 | 王尚武 | 一种靶向性共表达p53和Mda-7的重组腺病毒 |
| US20090004145A1 (en) * | 2006-02-08 | 2009-01-01 | Rajagopal Ramesh | Compositions and methods involving gene therapy and proteasome modulation |
| CN110499329A (zh) * | 2019-09-03 | 2019-11-26 | 黄映辉 | 一种携带p53、p14ARF双抑癌基因表达盒的腺病毒的构建方法 |
-
2020
- 2020-04-07 CN CN202010262711.1A patent/CN111333703A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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