CN111321172A - 一种利用CRISPR-Cas9技术建立CDK13基因敲除动物模型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于利用基因修饰技术制作基因敲除动物模型的领域，公开了一种利用CRISPR‑Cas9技术建立CDK13基因敲除动物模型的方法，包括靶向小鼠CDK13基因的gRNA载体构建、mRNA制备、显微注射获得F0小鼠、鉴定筛选出阳性F0代小鼠、阳性F0代小鼠性成熟后与WT小鼠配繁、筛选鉴定出阳性F1代杂合子小鼠和获得纯合后代；本发明还提供了一种利用CRISPR‑Cas9技术建立CDK13基因敲除动物模型的试剂盒。本发明能够简便高效的实现基因组的精确修饰，具有效率高的优点，降低了基因编辑模型制备的难度和成本，本发明提供的试剂盒加速了基因编辑模型的制备进入生产阶段的速度，能够更好的进行CDK13基因敲除的研究。
Description
技术领域
本发明属于利用基因修饰技术制作基因敲除动物模型的领域，具体涉及一种利用CRISPR-Cas9技术建立CDK13基因敲除动物模型的方法。
背景技术
CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Shot Palindromic repeats/CRISPR-associated)系统，是一种来源于细菌获得性免疫的由RNA介导Cas蛋白对目的基因进行靶向修饰的技术。经过研究者改造过的Type II CRISPR/Cas9系统自2013年成功敲除哺乳动物细胞后，现在己经被应用于多种模式生物的基因敲除。CRISPR/Cas9系统载体构建简单快速、易操作、省时省力周期短，且几乎对所有物种都适用。针对每个基因，CRISPR/Cas9只需要构建一个sgRNA(single guideRNA)，而且效率都很高，序列选择限制较小，只需要基因组上出现GG就可以。与zinc-fingernucleases(ZFNs)and TALEN相比，CRISPR/Cas9系统具有相同或者更高的基因编辑效率，更便宜。相对于TALEN，CRISPR/Cas9引起的脱靶效应较高，但是使用成对sgRNA/Cas9-D10A>截短的sgRNA或者FoKI-dCas9可以极大的降低脱靶效应。
本发明欲利用基因编辑技术在基因组水平上对目的基因序列进行替换，切除或插入外源DNA序列。经典的基因编辑技术依赖于同源重组及干细胞全能性来完成个体特定基因的改造，但其仍然存在效率低、技术要求高和成本高等缺点，严重制约了生产。而CRISPR-Cas9系统作为新一代编辑技术，能够简便高效实现基因组精确修饰，提高效率，降低了基因编辑模型制备的难度和成本。
发明内容
基于以上问题，本发明提供一种利用CRISPR-Cas9技术建立CDK13基因敲除动物模型的方法，本发明能够简便高效的实现基因组精确修饰，具有效率高的优点，降低了基因编辑模型制备的难度和成本。
为解决以上技术问题，本发明提供了一种利用CRISPR-Cas9技术建立CDK13基因敲除动物模型的方法，包括以下步骤：
S1：靶向小鼠CDK13基因的gRNA载体构建
通过对CDK13基因进行分析，选择合适的敲除区域，选定具体的敲除区域后，根据靶基因设计一对相应的gRNA序列，并合成gRNA序列，gRNA序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2；
S2：mRNA制备
将步骤S1中合成的一对gRNA序列在体外转录成mRNA；
S3：显微注射获得F0小鼠
将步骤S2中获得的mRNA与cas9质粒一并通过显微注射的方式注射入目标受精卵中，培育后获得F0代小鼠；
S4：鉴定筛选出阳性F0代小鼠
剪除出生的F0代小鼠的鼠尾，将鼠尾裂解后提取DNA做genetyping鉴定，根据鉴定结果挑选出有正确敲除的阳性F0代小鼠；
S5：阳性F0代小鼠性成熟后与WT小鼠配繁
将阳性F0代小鼠饲养至6-8周龄性成熟之后与WT小鼠配繁；
S6：筛选鉴定出阳性F1代杂合子小鼠
剪除步骤S5中配繁获得的F1代小鼠的鼠尾，提取DNA后做genetyping鉴定，确定基因型后筛选出其中的F1代杂合子小鼠；
S7：将步骤S6中的雌性F1代杂合子小鼠和雄性F1代杂合子小鼠自交，获得纯合后代。
为解决以上技术问题，本发明还提供了一种利用CRISPR-Cas9技术建立CDK13基因敲除动物模型的试剂盒，包括gRNA序列以及相应的配套检测试剂，所述gRNA序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2，所述配套检测试剂用于检测CDK13基因的剪切效果和评估基因敲除效率。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明能够简便高效的实现基因组的精确修饰，具有效率高的优点，降低了基因编辑模型制备的难度和成本，本发明提供的试剂盒加速了基因编辑模型的制备进入生产阶段的速度，能够更好的进行CDK13基因敲除的研究。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例：
一种利用CRISPR-Cas9技术建立CDK13基因敲除动物模型的方法，包括以下步骤：
S1：靶向小鼠CDK13基因的gRNA载体构建
通过对CDK13基因进行分析，选择合适的敲除区域，选定具体的敲除区域后，根据靶基因设计一对相应的gRNA序列，并合成gRNA序列，gRNA序列如下：
| gRNA名称 | 序列 | PAM |
| gRNA1 | AGACAGCTCTTACTAGACTTTGG(SEQ ID NO.1) | TGG |
| gRNA2 | CCTCAGACTATATCTACTAAGGG(SEQ ID NO.2) | GGG |
S2：mRNA制备
将步骤S1中合成的一对gRNA序列在体外转录成mRNA；
S3：显微注射获得F0小鼠
将步骤S2中获得的mRNA与cas9质粒一并通过显微注射的方式注射入目标受精卵中，培育后获得F0代小鼠；
S4：鉴定筛选出阳性F0代小鼠
剪除出生的F0代小鼠的鼠尾，将鼠尾裂解后提取DNA做genetyping鉴定，根据鉴定结果挑选出有正确敲除的阳性F0代小鼠；
S5：阳性F0代小鼠性成熟后与WT小鼠配繁
将阳性F0代小鼠饲养至6-8周龄性成熟之后与WT小鼠配繁；
S6：筛选鉴定出阳性F1代杂合子小鼠
剪除步骤S5中配繁获得的F1代小鼠的鼠尾，提取DNA后做genetyping鉴定，确定基因型后筛选出其中的F1代杂合子小鼠；
S7：将步骤S6中的雌性F1代杂合子小鼠和雄性F1代杂合子小鼠自交，获得纯合后代。
一种利用CRISPR-Cas9技术建立CDK13基因敲除动物模型的试剂盒，包括gRNA序列以及相应的配套检测试剂，所述gRNA序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，所述配套检测试剂用于检测CDK13基因的剪切效果和评估基因敲除效率。
如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。
<110> 温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属育英儿童医院
<120> 一种利用CRISPR-Cas9技术建立CDK13基因敲除动物模型的方法
<130> 2019
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 1
agacagctct tactagactt tgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 2
cctcagacta tatctactaa ggg 23
Claims (2)
1.一种利用CRISPR-Cas9技术建立CDK13基因敲除动物模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：靶向小鼠CDK13基因的gRNA载体构建
通过对CDK13基因进行分析，选择合适的敲除区域，选定具体的敲除区域后，根据靶基因设计一对相应的gRNA序列，并合成gRNA序列，gRNA序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
S2：mRNA制备
将步骤S1中合成的一对gRNA序列在体外转录成mRNA；
S3：显微注射获得F0小鼠
将步骤S2中获得的mRNA与cas9质粒一并通过显微注射的方式注射入目标受精卵中，培育后获得F0代小鼠；
S4：鉴定筛选出阳性F0代小鼠
剪除出生的F0代小鼠的鼠尾，将鼠尾裂解后提取DNA做genetyping鉴定，根据鉴定结果挑选出有正确敲除的阳性F0代小鼠；
S5：阳性F0代小鼠性成熟后与WT小鼠配繁
将阳性F0代小鼠饲养至6-8周龄性成熟之后与WT小鼠配繁；
S6：筛选鉴定出阳性F1代杂合子小鼠
剪除步骤S5中配繁获得的F1代小鼠的鼠尾，提取DNA后做genetyping鉴定，确定基因型后筛选出其中的F1代杂合子小鼠；
S7：将步骤S6中的雌性F1代杂合子小鼠和雄性F1代杂合子小鼠自交，获得纯合后代。
2.一种利用CRISPR-Cas9技术建立CDK13基因敲除动物模型的试剂盒，其特征在于，包括gRNA序列以及相应的配套检测试剂，所述gRNA序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，所述配套检测试剂用于检测CDK13基因的剪切效果和评估基因敲除效率。
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