CN111281894A - 加氏乳杆菌在预防和/或治疗代谢性疾病中的用途和组合物 - Google Patents

加氏乳杆菌在预防和/或治疗代谢性疾病中的用途和组合物 Download PDF

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Abstract

一种加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）在制备用于预防和/或治疗代谢性疾病的组合物中的用途和含有该加氏乳杆菌的组合物，本发明首次发现，加氏乳杆菌具有预防和/或治疗代谢性疾病（如肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化相关疾病、心血管疾病）的作用。

Description

加氏乳杆菌在预防和/或治疗代谢性疾病中的用途和组合物
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种加氏乳杆菌在预防和/或治疗代谢性疾病中的用途和含有该加氏乳杆菌的组合物。
背景技术
肥胖症(Obesity)、糖尿病(Diabetes)、动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)与心血管疾病是代谢性疾病的几种类型。代谢性疾病包括脂质代谢性疾病和胰岛素代谢性疾病，其中脂质代谢性疾病包括肥胖、动脉粥样硬化相关疾病、心血管疾病等，而胰岛素代谢性疾病包括糖尿病等。
肥胖症是一种慢性疾病，许多因素都会导致肥胖，其发病起源至今未研究清楚。外因以饮食过多而活动过少为主，热量摄入多于热量消耗，使脂肪合成增加是肥胖的物质基础。内因为脂质代谢紊乱而致肥胖。肥胖同时也是一系列疾病的诱导因子，如高血压、糖尿病、冠心病、胆囊病、骨关节炎、睡眠中呼吸窒息、呼吸失调、子宫瘤、前列腺癌、乳腺癌和结肠癌等。根据NIH的报告，目前约有9700万美国人超重和过度肥胖，其中与过度肥胖相关的II型糖尿病人数达到约1510万人，每年约有20万人死于与肥胖症相关的疾病。目前有研究表明，肥胖人群肠道微生物的多样性明显要比正常人群肠道微生物的多样性低。
糖尿病是一种由多种因素引起的血糖过高的疾病，主要是由于胰岛素分泌不足或者胰岛素功能缺陷所引起的代谢性障碍，引起糖尿病发生的常见的高危因素有遗传因素、环境因素以及不良的生活习惯。其中二型糖尿病(T2D)是一种非胰岛素依赖糖尿病，其患病人数占所有糖尿病的患者数量的90％。大量研究表明二型糖尿病的发病与肠道菌群的紊乱有着密切的联系，肠道菌群在与宿主之间调节能量平衡和炎症反应有着密切的联系，二型糖尿病的发病主要是胰岛素抵抗和低水平的炎症反应引起的。
动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病、脑梗死、外周血管病的主要原因。脂质代谢障碍为动脉粥样硬化的病变基础，其特点是受累动脉病变从内膜开始，一般先有脂质和复合糖类积聚、出血及血栓形成，进而纤维组织增生及钙质沉着，并有动脉中层的逐渐蜕变和钙化，导致动脉壁增厚变硬、血管腔狭窄。病变常累及大中肌性动脉，一旦发展到足以阻塞动脉腔，则该动脉所供应的组织或器官将缺血或坏死。由于在动脉内膜积聚的脂质外观呈黄色粥样，因此称为动脉粥样硬化。动脉粥样硬化是多因素共同作用引起的，发病机制复杂，主要危险因素有高血压、高血脂和大量吸烟，还有糖尿病、肥胖和遗传因素等。
动脉粥样硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease,ACVD)是发达国家的头号杀手，在发展中国家也日渐普遍。近年来，我国经济迅速发展，人民生活水平大幅度提高，生活方式正在发生深刻变化。工作和生活的节奏加快，饮食热量增加但体力活动减少。不良生活方式所引起的肥胖等心血管病危险因素显著增加，心脑血管病的发病率因而迅速上升。此外，脑卒中、心肌梗死等疾病可导致严重残疾，生活质量降低，医疗负担沉重。高发病率、死亡率、致残率使心脑血管病成为本世纪我国重大的公共卫生问题。
ACVD主要包括冠心病(coronary heart disease,CHD)、中风和周围动脉疾病。ACVD的病因是多方面的，许多相关因素都与生活方式有关，包括吸烟、致动脉粥样硬化饮食、超重或肥胖及惯于久坐、缺乏体力活动等。冠心病的主要病因是动脉粥样硬化，以及由此引起的心肌缺血、坏死的病理改变。其病理发病机制主要是由于脂质代谢紊乱使血脂升高，血管内壁脂质沉积、浸溶，血管内皮泡沫细胞形成，血管壁慢性炎性反应使冠脉血管内皮功能和形态的损伤，形成血管内皮粥样斑块，进一步出现斑块破裂，血栓形成，血管狭窄或闭塞使冠脉血液循环障碍，心肌缺血，心肌细胞受损，导致心功能不全。随着生活水平提高，我国冠心病发病率和死亡率也逐年升高，并有年轻化趋势。
冠心病也是一种常见的心脏病，是指因冠状动脉狭窄、供血不足而引起的心肌机能障碍或器质性病变，故又称缺血性心脏病(IHD)。主要表现有胸闷、气短、心悸、心慌，阵发性夜间呼吸困难、呼吸急促，严重缺血缺氧时可发生面色苍白、恶心、出汗、甚至晕厥等影响正常的工作生活。人体由于长期高脂血症形成动脉粥样硬化后，使冠状动脉内血流量变小、血管腔内变窄，心肌注血量减少，造成心肌缺血，导致心绞痛，形成冠心病。
目前用于治疗肥胖的手段有节食、锻炼、行为治疗、药物治疗和康复手术。糖尿病的降糖药物有磺酰尿素类、α-葡萄糖甙酶抑制剂和双胍类。冠心病的治疗方式主要通过药物、介入、手术治疗手段。
对于肥胖的治疗手段而言，节食锻炼对普通的大众并没有显著的改善，因其需要长期性的坚持，导致大多数人选择放弃；去除体内脂肪手术能达到立竿见影的效果，但存在诸多的限制因素，如手术风险，除脂效果以及费用昂贵等；而药物治疗例如苯丙醇胺(phenylpropanolamine，PPA)、罗氏鲜(orlistat，XenicalⅢ)和诺美婷(sibutramine，ReductilTM)，则有可能会发生对药物的局部或者全身过敏。用于治疗糖尿病的药物会产生多种副作用，例如会引起严重的肝肾损伤，容易引发腹胀，腹泻等，长期服用容易出现失活。药物治疗冠心病可产生头痛，恶心呕吐以及皮肤过敏等不良反应；虽然介入治疗有了巨大的进展，但是复发的概率仍是很高，再狭窄的问题一直限制着支架的发展，现有的药物支架，可预防复发，但有可能会形成血栓，严重者会发生猝死；手术治疗又面临手术创伤大，费用高，年老体弱和重要器官功能严重受损的高危患者手术风险高等缺点。
因此本领域迫切需要开发一种新的，无毒副作用的，用于预防和/或治疗代谢性疾病(如肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化相关疾病、心血管疾病)的组合物，尤其是药物组合物。
发明内容
本发明提供一种加氏乳杆菌在预防和/或治疗代谢性疾病中的用途和含有该加氏乳杆菌的组合物。
根据第一方面，一种实施例中提供一种加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)在制备用于预防和/或治疗代谢性疾病的组合物中的用途。
在优选实施例中，上述加氏乳杆菌的16s rDNA的序列如SEQ ID NO.:1所示或与SEQ ID NO.:1所示的序列有99％以上的相似度。
在优选实施例中，上述加氏乳杆菌是加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)TF08-1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC 60092。
在优选实施例中，上述加氏乳杆菌来自肠道、动物粪便、发酵池、和/或厌氧反应器。
在优选实施例中，上述加氏乳杆菌来源于人或非人哺乳动物。
在优选实施例中，上述非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠)、灵长类动物(如猴)。
在优选实施例中，上述代谢性疾病为脂质代谢性疾病和/或胰岛素代谢性疾病。
在优选实施例中，上述代谢性疾病选自下组：肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化相关疾病、心血管疾病、或它们的组合。
在优选实施例中，上述动脉粥样硬化相关疾病选自下组：冠心病、冠状动脉疾病(CAD)、动脉粥样硬化性心脏病、动脉粥样硬化性心血管疾病、缺血性心脏病、或其组合。
在优选实施例中，上述心血管疾病选自下组：急性冠状动脉综合征、心绞痛、动脉硬化、动脉粥样硬化、颈动脉粥样硬化、脑血管疾病、脑梗塞、充血性心力衰竭、先天性心脏病、冠心病、冠状动脉疾病、冠脉斑块稳定(coronary plaque stabilization)、血脂异常症、异常脂蛋白血症、内皮功能障碍、家族性高胆固醇血症、家族性复合高脂血症、低α脂蛋白血症、高甘油三酯血症、高β脂蛋白血症、高胆固醇血症、高血压、高血脂、间歇性跛行、局部缺血、局部缺血再灌注损伤、缺血性心脏病、心肌缺血、代谢综合征、多发性脑梗塞痴呆、心肌梗塞、肥胖症、外周血管疾病、再灌注损伤、再狭窄、肾动脉粥样硬化、风湿性心脏病、中风、血栓形成性紊乱、暂时性局部缺血发作以及与阿尔茨海默病、肥胖症、糖尿病、综合X、阳痿、多发性硬化症、帕金森病、炎性疾病有关的脂蛋白异常、或其组合。
在优选实施例中，上述组合物包括：(a)安全有效量的加氏乳杆菌和/或其代谢产物；以及(b)食品上可接受的载体或药学上可接受的载体。
在优选实施例中，上述组合物还包括生长因子(较佳地，牛奶生长因子)。
在优选实施例中，上述组合物选自下组：食品组合物、保健组合物、药物组合物、饮料组合物、饲料组合物、或它们的组合。
在优选实施例中，上述组合物为口服制剂。
在优选实施例中，上述组合物为液态制剂、固态制剂、半固态制剂。
在优选实施例中，上述组合物的剂型选自下组：粉末剂、散剂、片剂、糖衣剂、胶囊剂、颗粒剂、悬浮剂、溶液剂、糖浆剂、滴剂、舌下含片、或它们的组合。
在优选实施例中，上述食品组合物包括乳液制品、溶液制品、粉末制品、或悬浮液制品。
在优选实施例中，上述食品组合物包括乳品、乳粉、或乳液。
在优选实施例中，上述液态制剂选自下组：溶液制品或悬浮液制品。
在优选实施例中，上述组合物中，含有0.0001-99wt％，较佳地0.1-90wt％上述加氏乳杆菌和/或其代谢产物，以上述组合物的总重量计。
在优选实施例中，上述组合物为单元剂型(一片、一粒胶囊或一小瓶)，每个单元剂型中上述组合物的质量为0.05-5g，较佳地为0.1-1g。
在优选实施例中，上述组合物还含有其它益生菌和/或益生元。
在优选实施例中，上述组合物是益生菌剂、微生态制剂或药物制剂。
在优选实施例中，上述益生菌剂是益生菌奶制品或益生菌片。
在优选实施例中，上述益生菌选自下组：乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、或它们的组合。
在优选实施例中，上述益生元选自下组：低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚木糖(XOS)、低聚乳果糖(LACT)、大豆低聚糖(SOS)、菊粉(Inulin)、寡聚糖、或它们的组合。
在优选实施例中，上述组合物还含有有助于保持加氏乳杆菌活力的物质(如保护剂)。
在优选实施例中，上述有助于保持加氏乳杆菌活力的物质(如保护剂)选自下组：半胱氨酸、谷胱甘肽、丁基羟基茴香醚、二丁基甲基甲苯、生育酚、竹叶抗氧化物、D-异抗坏血酸及其钠盐、抗坏血酸钠、抗坏血酸钙、磷脂、维生素C(抗坏血酸)、维生素E、或它们的组合，特别是维生素C。
在优选实施例中，上述有助于保持加氏乳杆菌活力的物质(如保护剂)的重量比为0.1-2％，较佳地，0.5-1.5％，更佳地，0.5-1.0％，以上述组合物的总重计。
在优选实施例中，以组合物1g计，上述有助于保持加氏乳杆菌活力的物质(如保护剂)的含量为1mg-20mg，较佳地，5mg-15mg，更佳地，5mg-10mg。
根据第一方面，一种实施例中还提供一种加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)在制备用于选自下组的一种或多种用途的组合物中的用途：
(i)降低哺乳动物的血脂水平；
(ii)降低哺乳动物的体重；
(iii)改善哺乳动物的心肌缺血；
(iv)改善哺乳动物的血管病变；
(v)降低哺乳动物的血糖；
(vi)改善哺乳动物的葡萄糖耐受不良。
在优选实施例中，按上述组合物的总体积或总重量计，上述组合物中含有1×10-1至1×1020cfu/mL或1×10-1至1×1020cfu/g的加氏乳杆菌，较佳地含有1×104至1×1015cfu/mL或1×104至1×1015cfu/g的加氏乳杆菌。
根据第二方面，一种实施例中提供一种用于预防和/或治疗代谢性疾病的组合物，该组合物包括：(a)安全有效量的加氏乳杆菌和/或其代谢产物；以及(b)食品上可接受的载体或药学上可接受的载体。
在优选实施例中，上述代谢性疾病为脂质代谢性疾病和/或胰岛素代谢性疾病。
在优选实施例中，上述代谢性疾病选自下组：肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化相关疾病、心血管疾病、或它们的组合。
在优选实施例中，上述加氏乳杆菌的16s rDNA的序列如SEQ ID NO.:1所示或与SEQ ID NO.:1所示的序列有99％以上的相似度。
在优选实施例中，上述加氏乳杆菌是加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)TF08-1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC 60092。
在优选实施例中，上述加氏乳杆菌来自肠道、动物粪便、发酵池、和/或厌氧反应器。
在优选实施例中，上述加氏乳杆菌来源于人或非人哺乳动物。
在优选实施例中，上述非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠)、灵长类动物(如猴)。
在优选实施例中，上述代谢性疾病选自下组：肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化相关疾病、心血管疾病、或它们的组合。
在优选实施例中，上述组合物还包括生长因子(较佳地，牛奶生长因子)。
在优选实施例中，上述组合物选自下组：食品组合物、保健组合物、药物组合物、饮料组合物、饲料组合物、或它们的组合。
在优选实施例中，上述组合物为口服制剂。
在优选实施例中，上述组合物为液态制剂、固态制剂、半固态制剂。
在优选实施例中，上述组合物的剂型选自下组：粉末剂、散剂、片剂、糖衣剂、胶囊剂、颗粒剂、悬浮剂、溶液剂、糖浆剂、滴剂、舌下含片、或它们的组合。
在优选实施例中，上述食品组合物包括乳液制品、溶液制品、粉末制品、或悬浮液制品。
在优选实施例中，上述食品组合物包括乳品、乳粉、或乳液。
在优选实施例中，上述液态制剂选自下组：溶液制品或悬浮液制品。
在优选实施例中，上述组合物中，含有0.0001-99wt％，较佳地0.1-90wt％上述加氏乳杆菌和/或其代谢产物，以上述组合物的总重量计。
在优选实施例中，上述组合物为单元剂型(一片、一粒胶囊或一小瓶)，每个单元剂型中上述组合物的质量为0.05-5g，较佳地为0.1-1g。
在优选实施例中，上述组合物还含有其它益生菌和/或益生元。
在优选实施例中，上述组合物是益生菌剂、微生态制剂或药物制剂。
在优选实施例中，上述益生菌剂是益生菌奶制品或益生菌片。
在优选实施例中，上述益生菌选自下组：乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、或它们的组合。
在优选实施例中，上述益生元选自下组：低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚木糖(XOS)、低聚乳果糖(LACT)、大豆低聚糖(SOS)、菊粉(Inulin)、寡聚糖、或它们的组合。
在优选实施例中，上述组合物还含有有助于保持加氏乳杆菌活力的物质(如保护剂)。
在优选实施例中，上述有助于保持加氏乳杆菌活力的物质(如保护剂)选自下组：半胱氨酸、谷胱甘肽、丁基羟基茴香醚、二丁基甲基甲苯、生育酚、竹叶抗氧化物、D-异抗坏血酸及其钠盐、抗坏血酸钠、抗坏血酸钙、磷脂、维生素C(抗坏血酸)、维生素E、或它们的组合。
在优选实施例中，上述有助于保持加氏乳杆菌活力的物质(如保护剂)的重量比为0.1-2％，较佳地，0.5-1.5％，更佳地，0.5-1.0％，以上述组合物的总重计。
在优选实施例中，以组合物1g计，上述有助于保持加氏乳杆菌活力的物质(如保护剂)的含量为1mg-20mg，较佳地，5mg-15mg，更佳地，5mg-10mg。
根据第二方面，一种实施例中还提供一种用于选自下组的一种或多种用途的组合物，该组合物包括：(a)安全有效量的加氏乳杆菌和/或其代谢产物；以及(b)食品上可接受的载体或药学上可接受的载体：
(i)降低哺乳动物的血脂水平；
(ii)降低哺乳动物的体重；
(iii)改善哺乳动物的心肌缺血；
(iv)改善哺乳动物的血管病变；
(v)降低哺乳动物的血糖；
(vi)改善哺乳动物的葡萄糖耐受不良。
在优选实施例中，按上述组合物的总体积或总重量计，上述组合物中含有1×10-1至1×1020cfu/mL或1×10-1至1×1020cfu/g的加氏乳杆菌，较佳地含有1×104至1×1015cfu/mL或1×104至1×1015cfu/g的加氏乳杆菌。
根据第三方面，一种实施例中提供一种制备第二方面的组合物的方法，该方法包括：
将(a)加氏乳杆菌和/或其代谢产物、与(b)食品上可接受的载体或药学上可接受的载体混合，从而形成第二方面的组合物。
本发明选用加氏乳杆菌对2型糖尿病(T2D)模型小鼠进行饲喂，观察在加氏乳杆菌灌胃后，小鼠的体重、血糖以及糖耐受情况，从而反映出加氏乳杆菌对T2D的治疗效果。并对体重、周龄等各方面相同的小鼠进行高脂喂养，并观察在高脂喂养条件下加氏乳杆菌对小鼠血清中胆固醇含量的影响，从侧面反映其对冠心病的治疗效果，能有效降低血清胆固醇含量，避免动脉粥样硬化，从而缓解冠心病。同时，通过对大鼠实验性心肌缺血的影响，研究发现加氏乳杆菌能有效改善心肌缺血疾病(如降低哺乳动物的心肌缺血ST段位移)，改善血管病变。因此，本发明的加氏乳杆菌能够用于制备预防和/或治疗代谢性疾病的组合物。
保藏信息
菌株名称：Lactobacillus gasseri TF08-1
保藏日期：2016年10月13日
保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)
保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5
保藏编号：GDMCC 60092
附图说明
图1显示了加氏乳杆菌TF08-1培养48h菌落的图片，菌落为白色、低凸起、近圆形、边缘波状，菌落直径约1-2mm。
图2显示了本发明加氏乳杆菌Lactobacillus gasseri TF08-1在显微镜下的革兰氏染色图片(1000倍)，菌体的显微形态为杆状，革兰氏阳性，不产芽孢和鞭毛。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本发明能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本发明人经过广泛而深入的研究和实验，意外地发现，加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)具有预防和/或治疗代谢性疾病(如肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化相关疾病、心血管疾病)的作用，将含有本发明的加氏乳杆菌的活性组合物饲喂实验对象，发现该组合物能够明显控制受试者(例如小鼠)体重增长的速度，有效减缓受试者(例如小鼠)体重的增加，有效降低血糖，有效改善糖尿病受试者(例如小鼠)的葡萄糖耐受不良，有效控制血液中的TC、TG、LDLC以及血粘度的水平，可以降低血脂，降低动脉粥样硬化相关疾病的相关指标，对心肌缺血具有很好的改善和保护作用。因此，可有效减轻代谢性疾病(如肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化相关疾病、心血管疾病)等病症。在此基础上，本发明人完成了本发明。
如本文所用，术语“含有”、“包括”或“包含”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”、“包括”或“包含”中。
如本文所用，术语“生长因子”包括牛奶生长因子，具体地，包括维生素类物质、嘌呤类物质、嘧啶类物质、或它们的组合的营养物质。其中，维生素类物质包括但不限于：维生素C、维生素E、维生素A、维生素A前体、维生素B6、维生素D3、维生素K、叶酸、或它们的组合；嘌呤类物质包括但不限于：嘌呤核苷，其中嘌呤核苷包括嘌呤核苷的5’-磷酸酯；嘌呤核苷的5’-磷酸酯选自下组：肌苷酸(肌苷-5’-磷酸酯；IMP)、鸟苷酸(鸟苷-5’-磷酸酯；GMP)、黄苷酸(黄嘌呤核苷-5’-磷酸酯；XMP)、腺苷酸(腺苷-5’-磷酸酯；AMP)、或它们的组合；嘧啶类物质包括所有含嘧啶结构的物质。
如本文所用，术语“降低哺乳动物的体重”、“控制哺乳动物体重的增长”与“减缓哺乳动物体重的增加”可以互换使用，是指治疗肥胖引起的体重增加症状。
如本文所用，术语“改善哺乳动物的血管病变”是指治疗动脉粥样硬化引起的血管病变症状。在本发明中，所述改善哺乳动物的血管病变包括改善选自下组的一种或多种指标：血液粘度、血液流变、血脂(主要是甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白)、心电图ST段。
如本文所用，术语“心肌缺血ST段位移”是指心肌缺血可以通过心电图检查来诊断，主要表现ST段压低或抬高。
加氏乳杆菌及其应用
如本文所用，术语“加氏乳杆菌”，“Lactobacillus gasseri”、“本发明的加氏乳杆菌”可互换使用。在一个优选例中，所述菌株为Lactobacillus gasseri TF08-1，保藏号为GDMCC 60092，分离自人(较佳地，健康女性)的粪便中。加氏乳杆菌TF08-1采用PYG培养基进行，培养条件为37℃厌氧条件。TF08-1在PYG培养基培养2天的菌落为白色、低凸起、近圆形、边缘波状，菌落直径约1-2mm，菌体的显微形态为杆状，革兰氏阳性、不产芽孢和鞭毛。过氧化氢酶和氧化酶的测试结果均为阴性，能发酵多种碳水化合物，包括葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、麦芽糖、柳醇、木糖、甘露糖、松叁糖、棉籽糖、山梨醇、鼠李糖、海藻糖，主要产生乙酸和乳酸，可少量产生异丁酸、异戊酸、戊酸、苯甲酸、3-甲基丁酸、丁二酸、己二酸。并且本发明的加氏乳杆菌Lactobacillus gasseri TF08-1对表3中的18种常见的抗生素都比较敏感。
本发明提供了加氏乳杆菌在治疗和/或预防代谢性疾病(如肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化相关疾病、心血管疾病)的应用。对体重、周龄等各方面相同的受试者(例如小鼠)进行高脂饲料喂养和注射链酶尿素(STZ)诱导造成2型糖尿病(T2D)模型，观察在加氏乳杆菌灌胃后，受试者的体重、血糖以及糖耐受情况，从而反映出加氏乳杆菌对T2D的治疗效果。对体重、周龄等各方面相同的受试者(例如小鼠)进行高脂喂养，观察在高脂喂养条件下加氏乳杆菌对受试者血清中胆固醇含量的影响，从侧面反映其对冠心病的治疗效果。同时，通过对大鼠实验性心肌缺血的影响，研究发现加氏乳杆菌能有效改善心肌缺血疾病(如降低哺乳动物的心肌缺血ST段位移)，改善血管病变。根据本发明的实验结果，发现本发明的加氏乳杆菌能够改善与代谢性疾病(如肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化相关疾病、心血管疾病)相关的一系列指标，例如，能够明显控制受试者(例如小鼠)体重增长的速度，有效减缓受试者(例如小鼠)体重的增加，有效降低血糖，有效改善糖尿病受试者(例如小鼠)的葡萄糖耐受不良，有效控制血液中的TC、TG、LDLC以及血粘度的水平，可以降低血脂，降低动脉粥样硬化相关疾病的相关指标。根据本发明的另一个优选实施例采用SD大鼠作为试验大鼠，用垂体后叶素处理SD大鼠，经加氏乳杆菌来治疗的垂体后叶素处理的SD大鼠，与未治疗的对照组(模型组)相比，其与心血管疾病相关的指标(心肌缺血ST段位移)得到显著降低，可知，加氏乳杆菌对心肌缺血具有很好的改善和保护作用。因此，本发明的加氏乳杆菌可有效减轻代谢性疾病(如肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化相关疾病、心血管疾病)等病症。
组合物及其应用
本发明的加氏乳杆菌可用于制备用于治疗和/或预防代谢性疾病的组合物，较佳地，组合物包括食品组合物、保健组合物、药物组合物、饮料组合物、或饲料组合物，优选地，为药物组合物。组合物包括有效量的加氏乳杆菌，在一个优选例中，组合物还包括生长因子(如牛奶生长因子)。在一个优选例中，组合物还包括选自下组的益生菌：乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、或它们的组合；和/或选自下组的益生元：低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚木糖(XOS)、低聚乳果糖(LACT)、大豆低聚糖(SOS)、菊粉(Inulin)、寡聚糖、或它们的组合。在一个优选例中，组合物还包括选自下组的有助于保持加氏乳杆菌活力的物质(如保护剂)：半胱氨酸、谷胱甘肽、丁基羟基茴香醚、二丁基甲基甲苯、生育酚、竹叶抗氧化物、D-异抗坏血酸及其钠盐、抗坏血酸钠、抗坏血酸钙、磷脂、维生素C(抗坏血酸)、维生素E、或它们的组合。以组合物的总重计，有助于保持加氏乳杆菌活力的物质(如保护剂)的重量比为0.1-2％，较佳地，0.5-1.5％，更佳地，0.5-1.0％。在一优选例中，组合物为液态制剂、固态制剂、半固态制剂。在一优选例中，液态制剂选自下组：溶液制品或悬浮液制品。在一优选例中，组合物的剂型选自下组：粉末剂、散剂、片剂、糖衣剂、胶囊剂、颗粒剂、悬浮剂、溶液剂、糖浆剂、滴剂、舌下含片、或它们的组合。
本发明的组合物可以以口服液、片剂、针剂、口崩片、冻干粉制剂或胶囊的任一种形式给药，优选肠溶剂型(如胶囊)，在本发明中，如无特别说明，本发明所用的赋形剂、药物允许的媒介和载体主要是根据适合菌或其代谢产物特性和所需的特定给药方式进行选择，有利于菌或其代谢产物顺利通过胃而被给药者吸收。这些物质可根据给药途径进行选择。
本发明的组合物可进一步包含那些通常用于药物制剂的赋形剂中任何附加的赋形剂，为的是例如稳定组合物自身，或使其容易地分散或赋予其适宜的味道。在赋形剂当中，菊粉、果糖、淀粉、低聚木糖、二氧化硅、缓冲试剂以及风味剂是合适的实例。
乳糖、麦芽糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、细结晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁或矿物油等都可用作本发明中药物组合物的载体、赋形剂或稀释剂等。
此外，本发明的药物组合物可进一步包括润滑剂、润湿剂、乳化剂、悬浮液稳定剂、防腐剂、甜味剂和香料等。本发明的药物组合物可通过多种公知的方法以肠衣制剂生产，以便于药物组合物的活性成分即微生物能顺利通过胃而不被胃酸所破坏。
另外，本发明的微生物可以常规方法制备的胶囊形式使用。例如，标准赋形剂和本发明的冷干微生物混合制成小球药丸，然后将药丸装填入明胶胶囊中。此外，本发明的微生物和药物允许使用的赋形剂如液体胶、纤维素、硅酸盐或矿物油等混合制作悬浮液或分散液，这种悬浮液或分散液可装入软的明胶胶囊中。
本发明的药物组合物可制成肠衣片供口服使用。本发明中的术语“肠衣”，包括所有常规药物允许使用的包衣，这些包衣不被胃酸降解，但在小肠中能充分分解并快速释放出本发明的微生物。本发明的肠衣能在合成胃酸如pH＝1的HCl溶液中在36-38℃维持2小时以上，并优选在合成肠液如pH＝7.0的缓冲液中在1.0小时内分解。
本发明的肠衣为以每片约16-30mg进行包衣，较佳地16-25mg，更佳地16-20mg进行包衣。本发明中肠衣厚度为5-100μm，理想的厚度为20-80μm。肠衣成分选自己公开知晓的常规聚合物。
本发明优选的肠衣由纤维素乙酸邻苯二甲酸酯聚合物或偏苯三酸酯聚合物以及异丁烯酸的共聚物(例如，含有40％以上异丁烯酸和含有甲基纤维素邻苯二甲酸羟丙酯或其酯类衍生物的异丁烯酸的共聚物)制备。
本发明中肠衣所使用的纤维素乙酸邻苯二甲酸酯的粘度为约45-90cp，乙酰含量17-26％，邻苯二甲酸含量30-40％。用于肠衣中的纤维素乙酸偏苯三酸酯粘度为约5-21cp，乙酞含量17-26％。纤维素乙酸偏苯三酸酯由Eastman科达公司生产，可用于本发明中的肠衣材料。
用于本发明肠衣中的羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，分子量一般为20,000-130,000道尔顿，理想分子量为80,000-100,000道尔顿，羟丙基含量为5-10％，甲氧基含量为18-24％，邻苯二甲酰基含量为21-35％。
用于本发明肠衣中的羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯为HP50，由日本Shin-EtsuChemidnl Co.Ltd.生产。HP50含有6-10％羟丙基，20-24％甲氧基，21-27％的丙基，其分子量为84,000道尔顿。另一种肠衣物质为HP55，HP55含有5-9％的羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，18-22％甲氧基，27-35％的邻苯二甲酸，其分子量为78,000道尔顿。
本发明肠衣如下制备：使用常规方法将肠衣溶液喷雾到核心上。该肠包衣方法中所有溶剂为醇类(如乙醇)、酮类(如丙酮)、卤代烃化合物(如二氯甲烷)、或它们的组合物。将软化剂如二-正丁基邻苯二甲酸酯和三乙酸甘油酯加入到肠衣溶液中，其比例为1份包衣物对约0.05份或约0.3份软化剂。喷雾方法优选连续执行，所喷雾的料量可根据包衣所采用的条件进行控制。喷雾压力可随意调节，一般而言，能在平均1-1.5巴压力下获得理想的结果。
本发明中“药物有效量”、“安全有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。比如，在本发明中，可制备含有1×10-1至1×1020cfu/mL或cfu/g(特别的，可含有1×104至1×1015cfu/mL或cfu/g；更特别地，可含有1×106至1×1010cfu/ml或cfu/g)的加氏乳杆菌和/或其代谢产物的制剂。
当用于制备药物组合物时，所用的加氏乳杆菌或其代谢产物的有效剂量可随施用的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。适用于内服的剂量形式，包含与固态或液态药学上可接受的载体密切混合的约1×10至1×1015cfu/ml或cfu/g(较佳地，可含有1×104至1×1010cfu/ml或cfu/g；更佳地，可含有1×106至1×1010cfu/ml或cfu/g)的活性加氏乳杆菌或发酵产生的活性成分。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
加氏乳杆菌或其代谢产物可通过口服等途径给予。固态载体包括：淀粉、乳糖、磷酸二钙、微晶纤维素、蔗糖和白陶土，而液态载体包括：培养基、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要适合加氏乳杆菌或其代谢产物特性和所需的特定给药方式。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有利地被包括，例如调味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂如维生素E、维生素C、BHT和BHA。
从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是固态组合物，尤其是片剂和/或固体填充或液体填充的胶囊。口服给药是优选的。
将本发明组合物施用给个体(受试者/受试对象)，每天给药1次或多次。给药剂量单位表示其形式上能分开且适用于人类或其他所有哺乳动物个体的剂量。每一单位含有药物允许的载体和有效治疗量的本发明微生物。给药量随病人的体重和代谢性疾病(如肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化相关疾病、心血管疾病)的严重程度、所包括的补充活性组份和所使用的微生物而变化。此外如可能，可分开给药，并且如需要可连续给药。因此，给药量不会对本发明造成限制。此外，本发明中的“组合物”不仅意味着药品而且表示可作为功能性食品和健康补充食品。在一个优选例中，组合物包括：饮料、食品、药品、动物饲料等。
在本发明的一个优选例中，还提供了一种食品组合物，它含有有效量的加氏乳杆菌和/或其代谢产物，以及余量的食品上可接受的载体，食品组合物的剂型选自固体、乳品、溶液制品、粉末制品、或悬浮液制品。在一优选例中，食品组合物还可含有生长因子(如牛奶生长因子)。在一优选例中，组合物还包括选自下组的益生菌：乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、或它们的组合；和/或选自下组的益生元：低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚木糖(XOS)、低聚乳果糖(LACT)、大豆低聚糖(SOS)、菊粉(Inulin)、寡聚糖、或它们的组合。在一个优选例中，组合物还包括选自下组的有助于保持加氏乳杆菌活力的物质(如保护剂)：半胱氨酸、谷胱甘肽、丁基羟基茴香醚、二丁基甲基甲苯、生育酚、竹叶抗氧化物、D-异抗坏血酸及其钠盐、抗坏血酸钠、抗坏血酸钙、磷脂、维生素C(抗坏血酸)、维生素E、或它们的组合。
在一优选例中，组合物的配方如下：1×10至1×1015cfu/mL的加氏乳杆菌和/或其代谢产物；以及食品上或药学上可接受的载体，和/或赋形剂。
在另一优选例中，组合物的配方如下：1×104至1×1010cfu/mL的加氏乳杆菌和/或其代谢产物；以及食品上或药学上可接受的载体，和/或赋形剂。
微生态制剂
微生态制剂是一种包含益生菌及代谢产物的生物制剂或者是可以增加益生菌的膳食补充剂，可以通过调节、维持肠道内微生态平衡，达到提高人体健康水平的目的。主要包括益生菌、益生元和合生元。
在本发明中，微生态制剂包括(a)安全有效量的加氏乳杆菌和/或其代谢产物；以及(b)食品上可接受的载体或药学上可接受的载体。在一优选例中，制剂还包括生长因子(如牛奶生长因子，较佳地，包括维生素类物质、嘌呤类物质、和/或嘧啶类物质)。在一个优选例中，制剂还包括选自下组的益生菌：乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、或它们的组合；和/或选自下组的益生元：低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚木糖(XOS)、低聚乳果糖(LACT)、大豆低聚糖(SOS)、菊粉(Inulin)、寡聚糖、或它们的组合。在一个优选例中，组合物还包括选自下组的有助于保持加氏乳杆菌活力的物质(如保护剂)：半胱氨酸、谷胱甘肽、丁基羟基茴香醚、二丁基甲基甲苯、生育酚、竹叶抗氧化物、D-异抗坏血酸及其钠盐、抗坏血酸钠、抗坏血酸钙、磷脂、维生素C(抗坏血酸)、维生素E、或它们的组合。
加氏乳杆菌的生产方法
通常，加氏乳杆菌可以用常规方法制得。在本发明中，提供了一种能够大规模生产加氏乳杆菌的方法，具体地，包括如下步骤：
(a)在适合培养的条件下，对本发明的加氏乳杆菌进行培养，从而获得培养产物；
(b)任选地，从培养产物分离加氏乳杆菌菌体和/或其代谢产物；和
(c)任选地，将上一步骤获得的培养产物或加氏乳杆菌菌体和/或其代谢产物与食品上可接受的载体或药学上可接受的载体混合，从而制得组合物。
在本发明中，适合培养的条件指任何适于培养本发明的加氏乳杆菌的条件，在一优选实施方式中，适合培养的条件指采用PYG培养基于37℃厌氧培养24h-72h。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明的加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)能够显著治疗和/或预防脂质代谢性相关疾病(如肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化相关疾病、心血管疾病等疾病)。
(b)本发明的加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)能够显著降低体重、血脂(如降低总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、血粘度水平)。
(c)本发明的加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)能够显著改善心肌缺血以及血管病变。
(d)本发明的加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)能够显著降低血糖以及改善哺乳动物的葡萄糖耐受不良。
(e)本发明的加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)的疗效明显，毒副作用小，费用大大降低。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中的条件，或按照《微生物：实验手册》(James Cappuccino和Natalie Sherman编，Pearson Education出版社)中的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
如无特别说明，实施例所用的材料和试剂均为市售产品。
实施例1：加氏乳杆菌TF08-1的分离鉴定
1、样品收集
分离的样品来自于一位16岁健康女性志愿者的粪便样品，志愿者居住于广东省深圳市。并详细记录该志愿者的饮食情况和身体情况。
2、菌株的分离培养
提前制备好分离培养基，培养基选用PYG培养基(购自环凯微生物科技公司)，具体成分为：蛋白胨5g，胰化酪蛋白5g，酵母粉10g，牛肉膏5g，葡萄糖5g，K2HPO4 2g，Tween801mL，Cysteine-HCl·H2O 0.5g，硫化钠0.25g，血红素5mg，维生素K11μL，无机盐溶液(每L无机盐溶液含有CaCl2·2H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.5g，K2HPO4 1g，KH2PO4 1g，NaHCO3 10g，NaCl 2g)40mL，刃天青1mg，蒸馏水950mL，pH6.8～7.0，115℃灭菌25min。固体培养基加入1.5％的琼脂，在厌氧操作箱中倾倒。
收集的新鲜粪便样品转移至厌氧箱，取0.2g粪便悬浮于1ml无菌PBS(磷酸盐缓冲液)中，充分混匀，然后进行梯度稀释，取100ul稀释液进行平板涂布，37℃厌氧培养3-4天，厌氧的气体组分为N2：CO2：H2＝90：5：5。待平板长出菌落选取单个菌落进行划线分纯，获得纯培养菌株，然后进行鉴定和功能验证。
3、菌株的16S rDNA鉴定
分离得到的菌株进行16S rDNA鉴定，以确定菌株的物种分类信息。将获得的分离菌株在液体PYG培养基中培养24h，取1ml菌液进行10000r/min离心5min，收集菌体，提取菌株的基因组DNA，以基因组DNA作为模板进行16S rDNA的扩增，使用16S rDNA的通用引物(8F-AGAGTTTGATCATGGCTCAG(SEQ ID NO：2)和1492R-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT(SEQ IDNO：3))，16S rDNA的扩增条件为：95℃预变性4min，然后95℃变性30s，57℃退火40s，72℃延伸1min30s，30个循环。对产生的16S rDNA产物进行纯化，3730测序，获得菌株的16S rDNA序列(SEQ ID NO：1)，然后进行NCBI的数据库的比对。TF08-1同数据库中同源性最高的菌为Lactobacillus gasseri，相似度为99.9％。可以判定TF08-1属于加氏乳杆菌。
4、TF08-1的生理生化特征
TF08-1培养48小时的菌落为白色、低凸起、近圆形、边缘波状，菌落直径约1-2mm(图1)，菌体的显微形态为杆状，革兰氏阳性(图2)，不产芽孢和鞭毛。TF08-1的过氧化氢酶反应为阴性，氧化酶阴性，兼性厌氧，碳源利用情况使用API 20A(购自法国梅里埃)试剂盒进行检测。结果如表1(+，表示阳性反应；-，表示阴性反应；w表示弱阳性反应)。
表1
编号 反应 结果 编号 反应 结果
1 吲哚产生 - 11 明胶水解 -
2 脲素(脲酶) - 12 七叶灵 +
3 葡萄糖 + 13 甘油 w
4 甘露醇 w 14 纤维二糖 +
5 乳糖 w 15 甘露糖 +
6 蔗糖 + 16 松叁糖 w
7 麦芽糖 + 17 棉籽糖 w
8 柳醇 + 18 山梨醇 w
9 木糖 + 19 鼠李糖 w
10 阿拉伯糖 w 20 海藻糖 +
实施例2：加氏乳杆菌TF08-1的生物活性物质
TF08-1的生物活性物质主要考察发酵产物中的有机酸和短链脂肪酸的产生情况。取培养48h的TF08-1的发酵液1ml，进行10000r/min离心处理，取上清进行有机酸和短链脂肪酸的检测，有机酸主要检测的活性物质有：3-甲基丁酸，戊酸，奎宁酸，乳酸，草酸，丙二酸，苯甲酸，马来酸，丁二酸，反富马酸，苹果酸，己二酸，酒石酸，莽草酸，柠檬酸，异柠檬酸和L-抗坏血酸；短链脂肪酸主要检测的活性物质有：乙酸、丙酸、丁酸、戊酸。使用安捷伦气相色谱(GC-7890B,Agilent)进行检测。有机酸的检测条件是：色谱柱为122-5532G DB-5ms(40m×0.25mm×0.25um)，柱温：270～290℃；进样口温度：250℃；气体流量:0.86ml/min；短链脂肪酸的检测条件是：色谱柱是HP-INNOWax(Cross-Linked PEG)，30m×0.25mm×0.25um的毛细柱进行分析，检测器为氢火焰离子检测器，GC参数设置为柱温：180～200℃；气化室温度：240℃；检测温度：210℃；进样量：2μL；载气流量：N2，50mL/min；氢气流量：50mL/min；空气流量：600～700ml/min。测得有机酸和短链脂肪酸的结果详见表2。
表2
Figure BDA0001897162780000171
实施例3：加氏乳杆菌TF08-1的抗生素敏感情况
考察TF08-1对常见20种抗生素的敏感情况，采用药敏纸片法进行实验，取培养至对数期的TF08-1的菌液100ul进行平板涂布，将抗生素药敏片贴在平板表面，37℃培养48h，测量抑菌圈大小，其结果如表3。
表3
Figure BDA0001897162780000172
Figure BDA0001897162780000181
药敏试验表明，TF08-1对除了苯唑西林和头孢曲松钠之外的抗生素均比较敏感。
实施例4加氏乳杆菌TF08-1对肥胖动物模型的治疗效果
肥胖动物模型采用C57BL/6雄性小鼠(购自广东省医学实验动物中心)，8周龄，体重20±2g，在SPF环境下自由进食和饮水。随机分成3个组，每组10只。
对照组：每天喂食普通维持饲料。
TF08-1组：每天喂食高脂饲料，4周后，加灌胃TF08-1菌液(1×108cfu/ml)，灌胃9周。
肥胖模型组：每天喂食高脂饲料，4周后，加灌胃等量的培养基，灌胃9周。
实验期中，每周记录小鼠体重、状态、进食量等数据。实验结束后处死小鼠，记录脂肪重量，并取血清，用Elisa试剂盒检测血脂。结果如下表4所示。
表4灌胃加氏乳杆菌后各组小鼠与灌胃前相比的体重增长情况
Figure BDA0001897162780000182
随着实验的进行小鼠的体重逐渐增高，从肥胖小鼠模型以及TF08-1组能够看出，高脂饲料喂养后，灌胃加氏乳杆菌TF08-1能够明显控制小鼠体重增长的速度，说明加氏乳杆菌TF08-1可以有效减缓肥胖模型小鼠的体重的增长(相对于模型组*P＜0.05)。
实施例5加氏乳杆菌TF08-1对糖尿病动物模型的治疗效果
T2D动物模型采用C57bL/6小鼠(购自广东省医学实验动物中心)，8周龄，体重20±2g，小鼠试验的环境为SPF级，适应性喂养1周进行分组造模。造模方法采用高脂饲料喂养和注射链霉尿素(STZ)诱导，空腹血糖值(FBG)达到10mM/L以上可作为T2D模型小鼠。实验选用小鼠30只，随机分成3组。
模型组：T2D模型的小鼠采用生理盐水进行灌胃。
TF08-1治疗组：T2D模型的小鼠采用TF08-1菌液(1×108cfu/ml)进行灌胃治疗。
二甲双胍治疗组：T2D模型的小鼠，采用阳性药物二甲双胍进行干预治疗。
按照分组情况进行实验，T2D成模后(FBG>10)开始进行治疗，治疗持续2个月。每日记录小鼠的进食活动情况，并称量体重(表5)，每周进行尾静脉采血，检测小鼠的空腹血糖值(表6)，在治疗第四周和实验结束时候测量小鼠的葡萄糖耐量(OGTT)(表7)。
表5体重变化表
Figure BDA0001897162780000191
随着试验的进行小鼠的体重逐渐升高，TF08-1和二甲双胍治疗组的小鼠体重增加的幅度比模型组低，由此可以说明，TF08-1可以有效减缓小鼠体重的增加(同模型组比较*P<0.05/**P<0.01)。同时通过统计，TF08-1在控制小鼠的体重增加要比二甲双胍更加有效。
表6加氏乳杆菌TF08-1对造模小鼠空腹血糖影响的实验结果
Figure BDA0001897162780000192
Figure BDA0001897162780000201
表6的结果显示，随着治疗的进行，TF08-1和二甲双胍组的小鼠空腹血糖值逐渐下降，小鼠的血糖值趋向于正常，降糖的效果比较显著，说明TF08-1可以有效的降低血糖(同模型组比较*P值<0.05/**P<0.01)。同时TF08-1组小鼠的血糖值比二甲双胍组的血糖值更低，可见TF08-1降空腹血糖的能力优于二甲双胍。
表7加氏乳杆菌TF08-1对造模小鼠糖耐受的影响
Figure BDA0001897162780000202
对小鼠的葡萄糖耐受(OGTT)情况测试(表7)，结果显示在灌胃葡萄糖之后，30min小鼠的血糖值达到最高(18.3-22.8mmol/L)，然后二甲双胍组和TF08-1血糖匀速的下降，120min时降至10.0mmol/L和10.6mmol/L，而模型组小鼠的血糖为15.1，在这个时间点，TF08-1血糖值与模型组有显著的差异(*P值<0.05)，综合葡萄糖耐受的整个过程来看，相比之下，TF08-1可以有效改善糖尿病小鼠的葡萄糖耐受不良的情况。在整个调节葡萄糖的过程中，TF08-1在各个时间点的血糖值比二甲双胍的低，由此可见TF08-1对糖尿病小鼠葡萄糖耐受能力的改善效果更佳。
实施例6加氏乳杆菌TF08-1对高血脂症动物模型的治疗效果
实验采用C57bL/6小鼠(购自广东省医学实验动物中心)，正常饲养，鼠龄6周。总共40只小鼠，鼠房环境为SPF(Specific pathogen Free)级别。购买的小鼠适应性饲养1周后随机分为4组，每组10只，采用边造模边干预模式。
模型对照组：每天高脂饲料+2ml PBS(磷酸缓冲液)。
TF08-1组：每天高脂饲料+2ml 1×109cfu/ml TF08-1菌液。
通脉降脂片组(治疗高血脂的阳性药物)：每天高脂饲料+0.6g/kg通脉降脂片。
正常对照组：饲喂普通饲料。
分别在造模干预前后每周记录小鼠的状态、进食量等数据。实验结束后处死小鼠，记录脂肪含量，收集血清，参照试剂盒使用说明检测血清中血脂的含量，包括总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDLC)和低密度脂蛋白(LDLC)。末次颈动脉取血，做血液流变学检查。结果如下表8所示。
表8加氏乳杆菌TF08-1对小鼠血脂影响的实验结果
Figure BDA0001897162780000211
血脂中的主要成份是胆固醇和甘油三酯，血浆中胆固醇和甘油三脂水平的升高与动脉粥样硬化的发生有密切的关系。从表8可以看出，TF08-1的干预可以有效控制血液中的TC、TG、LDLC以及血粘度的水平(相对于模型组*P＜0.05)。且与通脉降脂片的效果大致相同，说明加氏乳杆菌TF08-1的确可以降低血脂，降低动脉粥样硬化相关疾病、心血管疾病的相关指标，并能够显著降低血液粘度，从而有效地防止血液处于高黏、高凝状态，改善血液流变学，改善血管病变。
实施例7加氏乳杆菌TF08-1对大鼠实验性心肌缺血的影响
实验采用SD大鼠(广东省医学实验动物中心)，雌雄各半，体重180～220克，正常饲养，鼠龄6周，总共30只大鼠，鼠房环境为SPF(Specific pathogen Free)级别。购买的大鼠适应性饲养1周后随机分为3组，每组10只。
模型组：每天灌胃2.5ml/kg PBS，连续10天。
TF08-1组：每天灌胃1×109cfu/ml TF08-1菌液2.5ml/kg，连续10天。
复方丹参组：每天灌胃2g/kg复方丹参片(国药准字Z21020381，天津天士力(辽宁)制药有限责任公司生产)，连续10天。
末次灌胃后1h，记录标I导联心电图，由舌下iv(静脉注射)脑垂体后叶素1单位/kg(国药准字H31022259，规格2ml:6单位，由上海上药第一生化药业有限公司生产)，容量为1ml/kg，于15S注射完毕，然后立即描记5S、15S、30S、lmin、2min、3min和5min的心电图变化，测量比较给垂体后叶素前后ST段抬高的变化，以组间t检验进行统计分析。具体实验结果如表9所示。
表9菌剂和复方丹参片对垂体后叶素致大鼠心肌缺血ST段位移的影响
Figure BDA0001897162780000221
通过表9中数据统计显示，本发明提供的加氏乳杆菌TF08-1能有效降低大鼠心肌缺血ST段位移(相对于模型组**P<0.01)，表明本发明提供的菌剂对心肌缺血具有很好的改善和保护作用，且效果优于复方丹参组。
实施例8：含加氏乳杆菌TF08-1的食品组合物
原料配比如表10。
表10
原料 质量百分比(％)
加氏乳杆菌TF08-1 0.5
牛奶 90.0
白糖 9.0
维生素C 0.5
按照上述配方比例混合牛奶、白糖，搅拌至完全混合，预热，20Mpa压力均质，90℃左右杀菌5-10分钟，冷却至40-43℃，混入保护剂维生素C，接种1-100×106cfu/g的加氏乳杆菌TF08-1菌，即制成含加氏乳杆菌TF08-1菌的食品组合物。
实施例9：含加氏乳杆菌TF08-1的药物组合物
原料配比见表11。
表11
原料 质量百分比(％)
加氏乳杆菌TF08-1 1.0
乳糖 2.0
酵母粉 2.0
蛋白胨 1.0
纯净水 93.5
维生素C 0.5
按照比例将乳糖、酵母粉、蛋白胨以纯净水混合均匀，预热到60-65℃，20Mpa压力均质，90℃左右杀菌20-30分钟，冷却至36-38℃，混入保护剂维生素C，接入加氏乳杆菌TF08-1活菌(1-500×106cfu/mL)，36-38℃发酵至pH值为6.0，离心，冷冻干燥至水份含量小于3％，即制备加氏乳杆菌TF08-1菌冷冻干燥物。称取0.5克加氏乳杆菌TF08-1冷冻干燥物与麦芽糊精等量混合后装入胶囊中，即制成含加氏乳杆菌TF08-1的药物组合物。
实施例10：用于治疗代谢性疾病的药物的制备方法
1、菌液准备：将加氏乳杆菌TF08-1(1×109cfu/ml)进行厌氧培养，厌氧培养基采用PYG培养基，经过37℃厌氧发酵2-3天。
2、生长因子制备：将脱脂牛奶、酪蛋白进行混合、离心、超滤获得牛奶生长因子粗提物(含有维生素类物质、嘌呤类物质、嘧啶类物质的营养物质)。
3、药物剂型制作：将5体积的生长因子和1体积的保护剂维生素C加入到100体积的TF08-1发酵的菌液中，充分搅拌混匀，然后加入淀粉辅料(如麦芽糊精)制备药物剂型。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大生命科学研究院
<120> 加氏乳杆菌在预防和/或治疗代谢性疾病中的用途和组合物
<130> 18I27195
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1400
<212> DNA
<213> Lactobacillus gasseri
<400> 1
ggtgcttgca ccagatgaaa ctagatacaa gcgagcggcg gacgggtgag taacacgtgg 60
gtaacctgcc caagagactg ggataacacc tggaaacaga tgctaatacc ggataacaac 120
actagacgca tgtctagagt ttaaaagatg gttctgctat cactcttgga tggacctgcg 180
gtgcattagc tagttggtaa ggtaacggct taccaaggca atgatgcata gccgagttga 240
gagactgatc ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt 300
agggaatctt ccacaatgga cgcaagtctg atggagcaac gccgcgtgag tgaagaaggg 360
tttcggctcg taaagctctg ttggtagtga agaaagatag aggtagtaac tggcctttat 420
ttgacggtaa ttacttagaa agtcacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt 480
aggtggcaag cgttgtccgg atttattggg cgtaaagcga gtgcaggcgg ttcaataagt 540
ctgatgtgaa agccttcggc tcaaccggag aattgcatca gaaactgttg aacttgagtg 600
cagaagagga gagtggaact ccatgtgtag cggtggaatg cgtagatata tggaagaaca 660
ccagtggcga aggcggctct ctggtctgca actgacgctg aggctcgaaa gcatgggtag 720
cgaacaggat tagataccct ggtagtccat gccgtaaacg atgagtgcta agtgttggga 780
ggtttccgcc tctcagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacgacc 840
gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 900
aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat ccagtgcaaa cctaagagat 960
taggtgttcc cttcggggac gctgagacag gtggtgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg 1020
tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg tcattagttg ccatcattaa 1080
gttgggcact ctaatgagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaag 1140
tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacggta caacgagaag 1200
cgaacctgcg aaggcaagcg gatctctgaa agccgttctc agttcggact gtaggctgca 1260
actcgcctac acgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcacgccg cggtgaatac 1320
gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatgaga gtctgtaaca cccaaagccg 1380
gtgggataac ctttatagga 1400
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 2
agagtttgat catggctcag 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 3
tagggttacc ttgttacgac tt 22

Claims (10)

1. 一种加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）在制备用于预防和/或治疗代谢性疾病的组合物中的用途；
优选地，所述代谢性疾病为脂质代谢性疾病和/或胰岛素代谢性疾病；
更优选地，所述代谢性疾病选自下组：肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化相关疾病、心血管疾病、或它们的组合。
2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述加氏乳杆菌的16s rDNA的序列如SEQID NO.:1所示或与SEQ ID NO.:1所示的序列有99%以上的相似度；
优选地，所述加氏乳杆菌是加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）TF08-1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC 60092。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物包括：(a)安全有效量的加氏乳杆菌和/或其代谢产物；以及(b)食品上可接受的载体或药学上可接受的载体；
优选地，所述组合物选自下组：食品组合物、保健组合物、药物组合物、饮料组合物、饲料组合物、或它们的组合；
优选地，所述组合物还含有有助于保持加氏乳杆菌活力的物质；
优选地，所述组合物还含有其它益生菌和/或益生元；
优选地，所述组合物是益生菌剂、微生态制剂或药物制剂；
更优选地，所述益生菌剂是益生菌奶制品或益生菌片。
4. 一种加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）在制备用于选自下组的一种或多种用途的组合物中的用途：
(i) 降低哺乳动物的血脂水平；
(ii) 降低哺乳动物的体重；
(iii) 改善哺乳动物的心肌缺血；
(iv) 改善哺乳动物的血管病变；
(v) 降低哺乳动物的血糖；
(vi) 改善哺乳动物的葡萄糖耐受不良。
5. 根据权利要求1至4任一项所述的用途，其特征在于，按所述组合物的总体积或总重量计，所述组合物中含有1×10-1至1×1020 cfu/mL或1×10-1至1×1020 cfu/g的加氏乳杆菌，较佳地含有1×104至1×1015 cfu/mL或1×104至1×1015 cfu/g的加氏乳杆菌。
6.一种用于预防和/或治疗代谢性疾病的组合物，其特征在于，所述组合物包括：(a)安全有效量的加氏乳杆菌和/或其代谢产物；以及(b)食品上可接受的载体或药学上可接受的载体；
优选地，所述代谢性疾病为脂质代谢性疾病和/或胰岛素代谢性疾病；
更优选地，所述代谢性疾病选自下组：肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化相关疾病、心血管疾病、或它们的组合；
优选地，所述加氏乳杆菌的16s rDNA的序列如SEQ ID NO.:1所示或与SEQ ID NO.:1所示的序列有99%以上的相似度；
更优选地，所述加氏乳杆菌是加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）TF08-1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC 60092。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述组合物选自下组：食品组合物、保健组合物、药物组合物、饮料组合物、饲料组合物、或它们的组合；
优选地，所述组合物还含有有助于保持加氏乳杆菌活力的物质；
优选地，所述有助于保持加氏乳杆菌活力的物质选自半胱氨酸、谷胱甘肽、丁基羟基茴香醚、二丁基甲基甲苯、生育酚、竹叶抗氧化物、D-异抗坏血酸或其钠盐、抗坏血酸钠、抗坏血酸钙、磷脂、维生素C和维生素E中的至少一种；
更优选地，所述有助于保持加氏乳杆菌活力的物质是维生素C；
优选地，所述组合物还含有其它益生菌和/或益生元；
更优选地，所述益生菌选自乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌中的至少一种；
更优选地，所述益生元选自低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚乳果糖、大豆低聚糖、菊粉和寡聚糖中的至少一种；
优选地，所述组合物是益生菌剂、微生态制剂或药物制剂；
更优选地，所述益生菌剂是益生菌奶制品或益生菌片。
8.一种用于选自下组的一种或多种用途的组合物，其特征在于，所述组合物包括：(a)安全有效量的加氏乳杆菌和/或其代谢产物；以及(b)食品上可接受的载体或药学上可接受的载体：
(i) 降低哺乳动物的血脂水平；
(ii) 降低哺乳动物的体重；
(iii) 改善哺乳动物的心肌缺血；
(iv) 改善哺乳动物的血管病变；
(v) 降低哺乳动物的血糖；
(vi) 改善哺乳动物的葡萄糖耐受不良。
9. 根据权利要求6至8任一项所述的组合物，其特征在于，按所述组合物的总体积或总重量计，所述组合物中含有1×10-1至1×1020 cfu/mL或1×10-1至1×1020 cfu/g的加氏乳杆菌，较佳地含有1×104至1×1015 cfu/mL或1×104至1×1015 cfu/g的加氏乳杆菌。
10.一种制备权利要求6至8任一项所述的组合物的方法，其特征在于，所述方法包括：
将(a)加氏乳杆菌和/或其代谢产物、与(b)食品上可接受的载体或药学上可接受的载体混合，从而形成权利要求6至8任一项所述的组合物。
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