CN111254114A - 一种人口腔黏膜干细胞转化成星形胶质细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种人口腔黏膜干细胞转化成星形胶质细胞的培养方法，所述方法，包括人口腔黏膜干细胞的培养、诱导、分化。本发明采用自体口腔黏膜干细胞诱导分化为星形胶质细胞，采用自体口腔黏膜干细胞诱导的星形胶质细胞用于临床不存在伦理问题，且降低免疫排斥反应。经口腔黏膜干细胞诱导的星形胶质细胞纯度高，纯度达95%以上，诱导分化时间为8‑10天。

Description

一种人口腔黏膜干细胞转化成星形胶质细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及一种人口腔黏膜干细胞转化成星形胶质细胞的培养方法，属于生物与新医药技术领域。
背景技术
星形胶质细胞，是哺乳动物脑内分布最广泛的一类细胞，历来被认为是神经系统的支持细胞，起着营养和保护、离子缓冲、递质代谢的作用。
CN104870634A公开了再生用于在神经系统中治疗疾病和损伤的功能性神经元，使用特殊的转录因子可使大脑皮层的星形胶质细胞转化为功能性神经细胞，因此，体内方法可以治疗老年痴呆以及脑梗等神经疾病。但是，在中枢神经系统损伤（例如：帕金森病、多发性硬化症、癫痫、肌萎缩性脊髓侧索硬化症）的治疗中，无法通过体内方法大量获得星形胶质细胞，仍需通过外科手术补充大量星形胶质细胞。因此，通过体外方法大量获得星形胶质细胞具有重要的现实意义。
口腔黏膜干细胞（hOMSC）是由口腔粘膜的固有层细胞培养而成。口腔粘膜干细胞和神经嵴起源于同一胚层，且有报道hOMSC是一种由神经嵴衍生的干细胞类型。口腔粘膜损伤的愈合主要靠再生，愈合速度比皮肤或其他结缔组织快，而且似乎不受年龄和性别的影响。hOMSC能够被诱导分化为多种神经细胞，具有多样性。
CN102703387A专利是对星形胶质细胞的直接分离和培养，选用的是动物来源的大脑皮质组织，在培养过程中使用了高浓度的小牛血清，获得的细胞仅供用于科研研究，无法用于临床。
CN102559593A公开了一种从人胚胎干细胞分化成神经细胞的方法，包括人胚胎干细胞的分离纯化、人胚胎干细胞单层贴壁及预诱导、神经细胞的诱导，其中预诱导时间为2天，诱导为10天；细胞分化均一度为85％；该诱导方法并不适用于星形胶质细胞，因为诱导因子不一致。
CN102899285A公开了一种体外诱导胚胎干细胞分化成为神经细胞方法，可以将胚胎干细胞诱导分化为脊髓运动神经元、少突胶质细胞，但是并未诱导得到星形胶质细胞。
CN105960453A是利用人多能干细胞定向分化为星形胶质细胞的，选用的来源不仅包含人多能干细胞，还包括人胚胎干细胞。该专利存在诱导周期长的缺陷，步骤复杂且所需时间长，诱导的星形胶质细胞的纯度低。
胚胎干细胞容易培养，且发展为成熟的细胞系，用来做实验比较快速，目前星形胶质细胞的诱导分化基本来源于人胚胎干细胞和人多能干细胞，或直接分离动物来源的大脑皮质组织。
这些来源诱导的星形胶质细胞用于临床涉及到伦理问题，且会引起免疫排斥反应。胚胎干细胞移植到体内会存在成瘤的风险，人多能干细胞的来源也不尽相同，诱导得到的星形胶质细胞所需时间长。而自体干细胞来源于个体，不是成熟的细胞系，需要从原代培养开始，操作起来非常困难，容易造成实验失败，所述本领域人员一般不采用自体干细胞来诱导星形胶质细胞。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种人口腔黏膜干细胞转化成星形胶质细胞的培养方法，实现以下发明目的：
（1）采用一种与神经细胞同一来源且容易获取的自体干细胞，来诱导星形胶质细胞；
（2）诱导后的细胞纯度高，诱导时间短。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：
一种人口腔黏膜干细胞转化成星形胶质细胞的培养方法，所述方法，包括人口腔黏膜干细胞的培养、诱导、分化。
以下是对上述技术方案的进一步改进：
所述诱导，将第3-5代人口腔黏膜干细胞放在NIM培养基中诱导3天以上。
所述NIM培养基的组成为：Neurobasal和DMEM/F12培养基按照1：0.5-1的体积比混合，添加体积百分比为0.5-1%的N2添加剂，体积百分比为1-3%的B27添加剂，2-4mM的谷氨酰胺，15-25ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子bFGF，15-25ng/mL的表皮细胞生长因子EGF。
所述NIM培养基的组成为：Neurobasal和DMEM/F12培养基按照1：1的体积比混合，添加体积百分比为0.5%的N2添加剂，体积百分比为2%的B27添加剂，2mM的谷氨酰胺，20ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子bFGF，20ng/mL的表皮细胞生长因子EGF。
所述分化，将诱导阶段后的细胞消化下来，收集细胞离心，用NDM培养基重新悬浮细胞，贴壁培养30-60min，去除培养基，加入新的分化用培养基，继续培养5-7天，优选为6天，定期更换新鲜的培养基，诱导成星形胶质细胞。
优选为每隔2天更换新鲜的培养基。
所述分化用培养基为NDM培养基中，加入下列因子：包含终浓度为40-60ng/ml的BDNF、0.45-0.55mM的IBMX、150-250uM的Ascorbic acid、0.8-1.2mM的db-CAMP和45-55ng/ml的Neuregulin。
所述分化用培养基为NDM培养基中，加入下列因子：包含终浓度为50 ng/ml的BDNF、0.5mM的IBMX、200uM的Ascorbic acid、1mM的db-CAMP和50ng/ml的Neuregulin。
所述用NDM培养基重新悬浮细胞，按19000-21000个/cm2接种到新的培养皿中，进行贴壁培养。
所述NDM培养基为含有体积百分比为1-3%的B27添加剂和2-4mM的谷氨酰胺的Neurobasal培养基。
优选为：NDM培养基为含有体积百分比为2%的B27添加剂和2mM的谷氨酰胺的Neurobasal培养基。
所述人口腔黏膜干细胞的培养，将人口腔黏膜切片切碎，放入低糖DMEM中培养，加入青霉素、链霉素、2-4mM谷氨酰胺、9-11%的胎牛血清，获得原代细胞，传代培养获得第3-5代的人口腔黏膜干细胞。
所述人口腔黏膜干细胞的培养，待原代细胞达到70%融合度时，将其传代培养获得足够量的人口腔黏膜干细胞。
本发明中采用人口腔黏膜干细胞诱导分化为星形胶质细胞，由专业人员取出人口腔黏膜切片，培养获得人口腔黏膜干细胞，进行诱导分化为星形胶质细胞。
所述诱导、分化，细胞培养条件为37℃，5%CO2；
本发明中选用的hOMSC胞具有以下优点：（1）口腔粘膜具有很高的再生能力，不受个体年龄的影响。（2）hOMSC 是一种神经嵴（NC）衍生的干细胞类型，与神经细胞来源于同一个胚层。（3）hOMSC还可培养分化成多种神经细胞，具有多样性。基于以上有点，hOMSC是自体细胞治疗神经退行性疾病和精神紊乱的一个极好来源。
本发明基于hOMSC上述的优点，将其诱导分化为星形胶质细胞，用于修复神经缺损，改善神经功能，治疗各种神经和精神疾病。
与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：
本发明采用自体口腔黏膜干细胞诱导分化为星形胶质细胞，采用自体口腔黏膜干细胞诱导的星形胶质细胞用于临床不存在伦理问题，且降低免疫排斥反应。经口腔黏膜干细胞诱导的星形胶质细胞纯度高，纯度达95%以上，诱导分化时间为8-10天，星形胶质细胞的增殖倍数达10.5-11.5倍以上。且诱导的星形胶质细胞具有分泌神经因子的功能，促进神经元的存活。
附图说明
图1为本发明培养的第三代人口腔黏膜干细胞的显微镜图；
图2为本发明人口腔黏膜干细胞诱导形成的星形胶质细胞的显微镜图；
图3为本发明流式细胞术检测hOMSC细胞标志物CD105的表达率的流式图；
图4为本发明流式细胞术检测hOMSC细胞标志物CD73的表达率的流式图；
图5为本发明流式细胞术检测hOMSC细胞标志物CD45的表达率的流式图；
图6为本发明流式细胞术检测hOMSC细胞标志物CD34的表达率的流式图；
图7为本发明流式细胞术检测hOMSC细胞标志物Nestin的表达率的流式图；
图8为本发明RT-PCR方法鉴定的星形胶质细胞的细胞标志物相对表达量的柱状图；
图9为本发明制备的星形胶质细胞的免疫组化染色图。
具体实施方式
实施例1：一种人口腔黏膜干细胞转化成星形胶质细胞的培养方法
包括以下步骤：
（1）hOMSC的培养
将人口腔黏膜切片用生理盐水清洗两遍，用灭过菌的剪刀剪碎，放入低糖DMEM培养基中进行培养，加入终浓度为100U/mL青霉素和100ug/mL的链霉素、2mM谷氨酰胺、10%的胎牛血清，获得原代细胞。
待原代细胞达到70%融合度时，利用消化液将其消化下来，1500rpm离心5min，以8000-10000个/cm2的密度进行接种，进行传代培养获得纯度一致的第3代的人口腔黏膜干细胞，显微镜图片见附图1。
（2）诱导阶段
将获得的第3代的人口腔黏膜干细胞放在NIM培养基中放在37℃，5%CO2的培养箱中诱导培养3天；NIM培养基的配方如下：Neurobasal和DMEM/F12（购自gibco公司）培养基1：1（体积比）混合，添加0.5%（体积百分比）的N2添加剂（购自gibco公司，货号：17502048），2%（体积百分比）的B27添加剂（购自gibco公司，货号：17504044），2mM的谷氨酰胺，20ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子bFGF（购自absin，货号：abs00001s），20ng/mL的表皮细胞生长因子EGF（购自赛业生物，货号：HEGFP-0501）。
（3）分化阶段
用细胞消化液accutase（购自Gibco，货号：A1110501）将细胞消化下来，收集细胞1500rpm离心5min，用NDM培养基重新悬浮细胞计数，按20000个/cm2接种到新的培养皿中，放回37℃，5%CO2培养箱贴壁30min。去除培养基，加入新的NDM培养基，并加入下列因子，包含终浓度为50 ng/ml的BDNF（购自MCE公司，目录号：HY-P7116A）、0.5mM的IBMX（购自MCE公司，货号为：28822-58-4）、200uM的Ascorbic acid(维生素C)（购自MCE公司，货号：50-81-7）、1mM的db-cAMP（购自MCE公司，货号为：16980-89-5）和50ng/ml的Neuregulin（购自MCE公司，目录号：HY-7365），放回37℃，5%CO2培养箱继续培养6天，每隔2天更换含有上述因子的新鲜的NDM培养基，分化成星形胶质细胞（附图2）。NDM培养基为含有体积百分比为2%的B27添加剂（购自gibco公司，货号：17504044）和2mM的谷氨酰胺的Neurobasal培养基（购自购自gibco公司，货号：21103049）。
实施例2：hOMSC的鉴定
将培养的第三代hOMSC细胞用于鉴定，利用流式细胞仪鉴定干细胞表面标志物。流式细胞实验检测的细胞标志物包括CD73、CD105、CD45、CD34和nestin。具体实验步骤如下：
（1）收集待检测的hOMSC，用PBS清洗细胞，用PBS、10%FCS、1%的叠氮化钠调节细胞悬液浓度至1-5×106细胞/mL，转移至Falcon管中。
（2）稀释偶联一抗至0.5ug/mL，添加到Falcon管中。在4℃下避光孵育30min。
（3）清洗细胞三次，并在400g离心5min，然后重悬于1mLPBS、10%FCS、1%的叠氮化钠中。
（4）上机检测，分析实验结果。
结果如附图3-7所示，流式实验中第三代hOMSC细胞标志物CD105的表达率为99.5%，CD73的表达率为99.6%，CD45的表达率为1.2%，CD34的表达率为0.6%，nestin的表达率为67.5%。 hOMSC流式检测结果中，细胞标志物nestin的表达也进一步验证hOMSC是由神经嵴干细胞衍生而来的，与神经细胞起源于同一胚层。
实施例3：星形胶质细胞的鉴定方法
（1）RT-PCR的方法：
首先使用RNeasy Plant Mini Kit（购自Qiagen公司，货号：74904）提取人口腔黏膜干细胞（hOMSC）和人口腔黏膜干细胞诱导的星形胶质细胞（hOMSC-Astroglia）的RNA，提取方法见试剂盒说明书。使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒（购自TaKaRa公司，货号：RR047A）逆转录二者的RNA形成cDNA，操作方法见试剂盒说明书。使用二者cDNA作为模板，荧光定量PCR试剂购自赛诺公司，检测的基因包括NGF、GDNF、BDNF、GFAP、EAAT2，以β-atcin基因作为内参基因。定量PCR引物序列见表1。每个PCR反应设3个重复。RT-PCR的程序设置为：94℃ 3min，（94℃ 15s，58℃ 30s，72℃ 30s）×35cycle，在退火过程收集荧光。
表1 荧光定量的基因及引物序列
Figure 778134DEST_PATH_IMAGE002
结果如附图8所示，新诱导的星形胶质细胞的细胞标志物GFAP和EAAT2的mRNA表达量与原始人口腔黏膜干细胞相比明显提高，且具有显著性的差异。且细胞因子NGF、GDNF和BDNF的mRNA表达量也明显提高，证明成功将hOMSC诱导分化为星形胶质细胞，且星形胶质细胞具有分泌神经因子的功能。
NGF：神经生长因子；GDNF：神经胶质源神经营养因子； BDNF：脑源性神经营养因子
上述因子均为星形胶质细胞自行分泌的神经因子。
（1）免疫细胞化学实验检测星形胶质细胞GFAP蛋白的表达，GFAP抗体试剂购自联科生物，货号：70—ab33170—050。主要步骤如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
将待检细胞接种在细胞爬片（购自晶安生物，规格为φ24mm）上，37℃、5%CO2培养箱 中培养5天。
Figure 819908DEST_PATH_IMAGE004
将细胞爬片取出，使用PBS缓冲液（购自索莱宝公司，货号：P1020-500ml）清洗3 次，1分钟/次。
Figure DEST_PATH_IMAGE005
加入200uL丙酮固定15min，吸掉丙酮，空气中干燥5min，用PBS清洗3次，2min/ 次。
Figure 786596DEST_PATH_IMAGE006
加入200uL含有0.5% Triton X-100的DPBS（购自索莱宝公司，货号：D1040- 500ml），室温放置20min；PBS清洗2次，5分钟/次，清洗过程中动作不易剧烈。
Figure DEST_PATH_IMAGE007
加入200uL 3%的H2O2，室温静置15min；DPBS清洗样本3次，2分钟/次。
Figure 837597DEST_PATH_IMAGE008
加入200uL血清封闭液，室温放置20min，倒掉多余液体。
Figure DEST_PATH_IMAGE009
将一抗按1:20的比例进行稀释，加到爬片上，放在湿盒中，37℃孵育1小时，PBS 清洗3次，5分钟/次；
Figure 589652DEST_PATH_IMAGE010
加入二抗，37℃孵育30min；PBS清洗3次，5分钟/次；
Figure DEST_PATH_IMAGE011
加入试剂D，37℃放置30min；PBS清洗3次，5分钟/次；
Figure 536749DEST_PATH_IMAGE012
DAB显色，避光4min，蒸馏水清洗2次，1分钟/次；苏木青复染1分钟；蒸馏水清洗2次， 1分钟/次。室温干燥5min，用中性树脂封片，进行镜检。
结果如附图9所示，箭头所指的细胞中GFAP明显表达，与RT-PCR方法的结果吻合，强有力的证明此细胞为星形胶质细胞。
本发明制备的星形胶质细胞，纯度达到95%以上。
实施例4 星形胶质细胞诱导中的增殖倍数
将实施例1获得第3代的人口腔黏膜干细胞按8000个/cm2接种到T75瓶中，接种三瓶作为重复实验，按照实施例1的方法诱导分化成星形胶质细胞，用细胞消化液accutase消化后，分别收集细胞。利用台盼蓝计数法计算诱导后的星形胶质细胞数量，为6.52±0.21×106，为初始细胞量的10.87±0.35倍。利用此种方法诱导分化的星形胶质细胞其增殖倍数达到了10.87±0.35倍。

Claims (10)

1.一种人口腔黏膜干细胞转化成星形胶质细胞的培养方法，其特征在于：所述方法，包括人口腔黏膜干细胞的培养、诱导、分化。
2.根据权利要求1所述的一种人口腔黏膜干细胞转化成星形胶质细胞的培养方法，其特征在于：所述诱导，将第3-5代人口腔黏膜干细胞放在NIM培养基中诱导3天以上。
3.根据权利要求2所述的一种人口腔黏膜干细胞转化成星形胶质细胞的培养方法，其特征在于：所述NIM培养基的组成为：Neurobasal和DMEM/F12培养基按照1：0.5-1的体积比混合，添加体积百分比为0.5-1%的N2添加剂，体积百分比为1-3%的B27添加剂，2-4mM的谷氨酰胺，15-25ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子bFGF，15-25ng/mL的表皮细胞生长因子EGF。
4.根据权利要求2所述的一种人口腔黏膜干细胞转化成星形胶质细胞的培养方法，其特征在于：所述NIM培养基的组成为：Neurobasal和DMEM/F12培养基按照1：1的体积比混合，添加体积百分比为0.5%的N2添加剂，体积百分比为2%的B27添加剂，2mM的谷氨酰胺，20ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子bFGF，20ng/mL的表皮细胞生长因子EGF。
5.根据权利要求1所述的一种人口腔黏膜干细胞转化成星形胶质细胞的培养方法，其特征在于：所述分化，将诱导阶段后的细胞消化下来，收集细胞离心，用NDM培养基重新悬浮细胞，贴壁培养30-60min，去除培养基，加入新的分化用培养基，继续培养5-7天，定期更换新鲜的培养基，诱导成星形胶质细胞。
6.根据权利要求1所述的一种人口腔黏膜干细胞转化成星形胶质细胞的培养方法，其特征在于：所述分化用培养基为NDM培养基中，加入下列因子：包含终浓度为40-60ng/ml的BDNF、0.45-0.55mM的IBMX、150-250uM的Ascorbic acid、0.8-1.2mM的db-CAMP和45-55ng/ml的Neuregulin。
7.根据权利要求1所述的一种人口腔黏膜干细胞转化成星形胶质细胞的培养方法，其特征在于：所述分化用培养基为NDM培养基中，加入下列因子：包含终浓度为50 ng/ml的BDNF、0.5mM的IBMX、200uM的Ascorbic acid、1mM的db-CAMP和50ng/ml的Neuregulin。
8.根据权利要求5所述的一种人口腔黏膜干细胞转化成星形胶质细胞的培养方法，其特征在于：所述用NDM培养基重新悬浮细胞，按19000-21000个/cm2接种到新的培养皿中，进行贴壁培养。
9.根据权利要求5-7任一项所述的一种人口腔黏膜干细胞转化成星形胶质细胞的培养方法，其特征在于：所述NDM培养基为含有体积百分比为1-3%的B27添加剂和2-4mM的谷氨酰胺的Neurobasal培养基。
10.根据权利要求1所述的一种人口腔黏膜干细胞转化成星形胶质细胞的培养方法，其特征在于：所述人口腔黏膜干细胞的培养，将人口腔黏膜切片切碎，放入低糖DMEM中培养，加入青霉素、链霉素、2-4mM谷氨酰胺、9-11%的胎牛血清，获得原代细胞，传代培养获得第3-5代的人口腔黏膜干细胞。
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