CN111239293A - 一种萜酚有关物质的hplc-pda检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种萜酚有关物质的HPLC‑PDA检测方法，采用色谱条件如下：色谱柱采用反相C18色谱柱；流动相包括流动相A与流动相B，流动相A为乙腈，流动相B为水；采用梯度洗脱，梯度洗脱程序按以下程序进行：0‑10分钟，流动相A与流动相B的体积比由10:90线性变化为60:40；10‑30分钟，流动相A与流动相B的体积比由60:40线性变化为80:20；30‑34分钟，流动相A与流动相B的体积比由80:20线性变化为81:19；34‑40分钟，流动相A与流动相B的体积比由81:19线性变化为100:0，并维持该体积比至60分钟。采用本发明方法的条件，主峰与相邻杂质峰能完全分离，各主要降解杂质峰之间也能完全分离，且主峰纯度高，杂质检出率高于现有方法。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种萜酚有关物质的HPLC-PDA检测方法。
背景技术
高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上发展起来的一种新的色谱技术。HPLC不受样品挥发度和热稳定性的限制，几乎能够分析所有的有机、高分子及生物试样，并且它具有高柱效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、样品量少、应用范围广、自动化等优点。该法已成为现代分析技术的重要手段之一。
美国药典方法(USP)条件为：色谱柱：填料L1(十八烷基键合多孔硅胶，简称：ODS)，4μm，4.6x150mm；HPLC检测波长：228nm；流速：1mL/min；柱温：20℃；流动相：甲醇:水:四氢呋喃:乙腈＝45:25:20:10(必要时进行微调)，0.45μm滤膜过滤并脱气；系统适用性溶液：精密量取一定体积的USPΔ9-萜酚RS和USP Exo-萜酚RS溶液，至合适的容量瓶中，用无水乙醇稀释至Δ9-萜酚浓度为200μg/mL，Exo-萜酚浓度为10μg/mL；标准品母液溶液(a)：精密量取一定体积的USPΔ9-萜酚RS溶液，用无水乙醇定量稀释至0.2mg/mL；标准品溶液(b)：精密量取一定体积的标准品母液溶液(a)，用无水乙醇逐步稀释(如需要)至浓度约0.004mg/mL；灵敏度溶液(c)：精密量取一定体积的标准品溶液(b)，用无水乙醇稀释至浓度约0.2μg/mL。供试品溶液(d)：精密称量20mg萜酚，转移至100mL容量瓶中，用无水乙醇溶解定容至刻度，混匀。标准品溶液和供试品溶液尽量避免暴露于空气和光照下。所有样品在24h内检测完毕。
进样系统适用性溶液，计算信噪比(S/N)：
S/N＝(2H)/h
其中H为峰高，h为平均基线噪音的振幅；信噪比不低于10。
步骤：分别进样10μL的标准品溶液和供试品溶液，记录色谱图，并记录所有峰的峰面积。按加校正因子的主成分外标法以峰面积计算每种杂质相对于萜酚的百分占比：
100(1/F)(CV/W)(rU/rS)
其中，F为每种杂质的相对响应因子(见表1)；C为标准品溶液(b)中Δ9-萜酚的浓度(mg/mL)；V为供试品溶液(d)的体积(mL)；W为配制供试品溶液(d)的萜酚重量(mg)；rU为供试品溶液(d)中每种杂质的峰面积；rS为标准品溶液(b)中Δ9-萜酚的峰面积。各杂质限度如表1所示，总杂不超过5.0％。
表1各杂质限度
| 名称 | 相对保留时间 | 相对响应因子 | 限度(％) |
| CBN(Cannabinol) | 0.78 | 2.7 | 1.5 |
| Δ<sup>9</sup>-萜酚 | 1.00 | 1.0 | — |
| Exo-萜酚 | 1.07 | 0.92 | 0.5 |
| Δ<sup>8</sup>-萜酚 | 1.18 | 0.90 | 2.0 |
| 其他各单杂总和 | — | 1.0 | 1.0 |
上述美国药典方法(USP)主要适用于合成型的萜酚，而对于从植物体中提取分离得到的萜酚则不太适用，且该方法为等度洗脱，分离效能有限，对于植物源性萜酚原料药降解杂质峰的检出及其分离效果不甚理想。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种同时适用于检测从植物体中提取分离得到的萜酚有关物质的HPLC-PDA检测方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种萜酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，采用色谱条件如下：
色谱柱采用反相C18色谱柱；
流动相包括流动相A与流动相B，流动相A为乙腈，流动相B为水；
采用梯度洗脱，梯度洗脱程序按以下程序进行：0-10分钟，流动相A与流动相B的体积比由10:90线性变化为60:40；10-30分钟，流动相A与流动相B的体积比由60:40线性变化为80:20；30-34分钟，流动相A与流动相B的体积比由80:20线性变化为81:19；34-40分钟，流动相A与流动相B的体积比由81:19线性变化为100:0，并维持该体积比至60分钟。
优选地，上述检测方法中，所述色谱柱柱长为150mm。
优选地，上述检测方法中，检测波长为226-230nm，最佳检测波长为228nm。
优选地，上述检测方法中，流速为0.5-1.0mL/min,最佳流速为0.8mL/min。
优选地，上述检测方法中，柱温为28-32℃，最佳柱温为30℃。
优选地，上述检测方法中，进样量为8-12μL，最佳进样量为10μL。
优选地，上述检测方法中，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶。
本发明还提供了一种萜酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备：精密称取适量萜酚原料药，用色谱甲醇溶解稀释定容得到供试品溶液；
(2)色谱条件：
色谱柱采用反相C18色谱柱；
流动相包括流动相A与流动相B，流动相A为乙腈，流动相B为水；
采用梯度洗脱，梯度洗脱程序按以下程序进行：0-10分钟，流动相A与流动相B的体积比由10:90线性变化为60:40；10-30分钟，流动相A与流动相B的体积比由60:40线性变化为80:20；30-34分钟，流动相A与流动相B的体积比由80:20线性变化为81:19；34-40分钟，流动相A与流动相B的体积比由81:19线性变化为100:0，并维持该体积比至60分钟；
(3)测定方法：
限度：除去溶剂峰，按面积归一化法计，总杂不得过0.5％；
系统适应性理论板数按萜酚峰计算≥10000，萜酚峰与相邻杂质峰的分离度≥1.5。
优选地，上述检测方法中，色谱柱柱长为150mm，检测波长为226-230nm，最佳检测波长为228nm，流速为0.5-1mL/min,最佳流速为0.8mL/min，柱温为28-32℃，最佳柱温为30℃，进样量为8-12μL，最佳进样量为10μL。
优选地，上述检测方法中，供试品溶液浓度范围在0.2mg/mL。
本发明的有益效果是：本发明提供了一萜酚原料药有关物质的HPLC-PDA检测方法，该方法同时适用于检测从植物体中提取分离得到的萜酚有关物质，采用本发明方法的条件，主峰与相邻杂质峰能完全分离，各主要降解杂质峰之间也能完全分离，且主峰纯度高，杂质检出率高于现有方法。
附图说明
图1为背景技术所述美国药典方法(USP)检测图谱；
图2-3为对照例1所述HPLC-PDA检测方法检测图谱；
图4为实施例1所述HPLC-PDA检测方法检测图谱。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。
实施例1
一种萜酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取萜酚原料药20mg，精密称定，置于100mL容量瓶中，色谱甲醇稀释定容至刻度，摇匀，即得，供试品溶液浓度为200μg/mL；
(2)色谱条件：
高效液相色谱仪：Waters e2695 HPLC with 2998PDA；
填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；
色谱柱：CromCoreTM 120C18(4.6mm×150mm,3μm)；
进样量：10μL；
柱温：30℃；
检测波长：228nm；
流速：0.8mL/min；
流动相包括流动相A与流动相B，流动相A为乙腈，流动相B为水；
采用梯度洗脱，梯度洗脱程序按以下程序进行：0-10分钟，流动相A与流动相B的体积比由10:90线性变化为60:40；10-30分钟，流动相A与流动相B的体积比由60:40线性变化为80:20；30-34分钟，流动相A与流动相B的体积比由80:20线性变化为81:19；34-40分钟，流动相A与流动相B的体积比由81:19线性变化为100:0，并维持该体积比至60分钟；避光操作，并在24h内测定完毕。
(3)测定方法：
限度：除去溶剂峰，按面积归一化法计，总杂不得过0.5％；
系统适应性理论板数按萜酚峰计算≥10000，萜酚峰与相邻杂质峰的分离度≥1.5。
本实施例色谱条件下的检测图谱如图4所示。
实施例2
一种萜酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取萜酚原料药20mg，精密称定，置于100mL容量瓶中，色谱甲醇稀释定容至刻度，摇匀，即得，供试品溶液浓度为200μg/mL；
(2)色谱条件：
高效液相色谱仪：Waters e2695 HPLC with 2998PDA；
填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；
色谱柱：CromCoreTM 120C18(4.6mm×150mm,3μm)；
进样量：8μL；
柱温：28℃；
检测波长：226nm；
流速：0.5mL/min；
流动相包括流动相A与流动相B，流动相A为乙腈，流动相B为水；
采用梯度洗脱，梯度洗脱程序按以下程序进行：0-10分钟，流动相A与流动相B的体积比由10:90线性变化为60:40；10-30分钟，流动相A与流动相B的体积比由60:40线性变化为80:20；30-34分钟，流动相A与流动相B的体积比由80:20线性变化为81:19；34-40分钟，流动相A与流动相B的体积比由81:19线性变化为100:0，并维持该体积比至60分钟；避光操作，并在24h内测定完毕。
(3)测定方法：
限度：除去溶剂峰，按面积归一化法计，总杂不得过0.5％；
系统适应性理论板数按萜酚峰计算≥10000，萜酚峰与相邻杂质峰的分离度≥1.5。
实施例3
一种萜酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取萜酚原料药20mg，精密称定，置于100mL容量瓶中，色谱甲醇稀释定容至刻度，摇匀，即得，供试品溶液浓度为200μg/mL；
(2)色谱条件：
高效液相色谱仪：Waters e2695 HPLC with 2998PDA；
填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；
色谱柱：CromCoreTM 120C18(4.6mm×150mm,3μm)；
进样量：12μL；
柱温：32℃；
检测波长：230nm；
流速：1.0mL/min；
流动相包括流动相A与流动相B，流动相A为乙腈，流动相B为水；
采用梯度洗脱，梯度洗脱程序按以下程序进行：0-10分钟，流动相A与流动相B的体积比由10:90线性变化为60:40；10-30分钟，流动相A与流动相B的体积比由60:40线性变化为80:20；30-34分钟，流动相A与流动相B的体积比由80:20线性变化为81:19；34-40分钟，流动相A与流动相B的体积比由81:19线性变化为100:0，并维持该体积比至60分钟；避光操作，并在24h内测定完毕。
(3)测定方法：
限度：除去溶剂峰，按面积归一化法计，总杂不得过0.5％；
系统适应性理论板数按萜酚峰计算≥10000，萜酚峰与相邻杂质峰的分离度≥1.5。
对照例1
一种萜酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取萜酚原料药20mg，精密称定，置于100mL容量瓶中，色谱甲醇稀释定容至刻度，摇匀，即得，供试品溶液浓度为200μg/mL；
(2)色谱条件：
高效液相色谱仪：Waters e2695 HPLC with 2998PDA；
填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；
色谱柱：
C18(4.6mm×250mm,5μm)；
进样量：10μL；
柱温：25℃；
检测波长：228nm；
流速：1.0mL/min；
流动相包括流动相A与流动相B，流动相A为乙腈，流动相B为水；
梯度洗脱程序：0-11分钟，流动相A与流动相B的体积比由80:20线性变化为95:5；11-12分钟，流动相A与流动相B的体积比由95:5线性变化为100:0，并维持该体积比至40分钟；避光操作，并在24h内测定完毕。
(3)测定方法：
限度：除去溶剂峰，按面积归一化法计，总杂不得过0.5％。
系统适应性理论板数按酚峰计算≥10000，萜酚峰与相邻杂质峰的分离度≥1.5。
检测图谱如图2-3所示。
对照例1方法与美国药典方法(USP)相比：由图1与图2的对比可知，采用美国药典方法(USP)色谱条件检测出来的有关物质个数及杂质含量明显少于对照例1方法。
实施例1方法与对照例1方法相比：由图3与图4的对比可知，采用对照例1方法，萜酚原料药有降解杂质产生时主峰与相邻杂质峰不能达到基线分离。采用实施例1方法，主峰与相邻杂质峰能完全分离，各主要降解杂质峰之间也能完全分离，且主峰纯度高，检出的杂质含量高于对照例1方法。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。
尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。
Claims (10)
1.一种萜酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，其特征在于，采用色谱条件如下：
色谱柱采用反相C18色谱柱；
流动相包括流动相A与流动相B，流动相A为乙腈，流动相B为水；
采用梯度洗脱，梯度洗脱程序按以下程序进行：0-10分钟，流动相A与流动相B的体积比由10:90线性变化为60:40；10-30分钟，流动相A与流动相B的体积比由60:40线性变化为80:20；30-34分钟，流动相A与流动相B的体积比由80:20线性变化为81:19；34-40分钟，流动相A与流动相B的体积比由81:19线性变化为100:0，并维持该体积比至60分钟。
2.根据权利要求1所述的一种萜酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，其特征在于，所述色谱柱柱长为150mm。
3.根据权利要求1所述的一种萜酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，其特征在于，检测波长为226-230nm，最佳检测波长为228nm。
4.根据权利要求1所述的一种萜酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，其特征在于，流速为0.5-1mL/min,最佳流速为0.8mL/min。
5.根据权利要求1所述的一种萜酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，其特征在于，柱温为28-32℃，最佳柱温为30℃。
6.根据权利要求1所述的一种萜酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，其特征在于，进样量为8-12μL，最佳进样量为10μL。
7.根据权利要求1所述的一种萜酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，其特征在于，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶。
8.一种萜酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备：精密称取适量萜酚原料药，用色谱甲醇溶解稀释定容得到供试品溶液；
(2)色谱条件：
色谱柱采用反相C18色谱柱；
流动相包括流动相A与流动相B，流动相A为乙腈，流动相B为水；
采用梯度洗脱，梯度洗脱程序按以下程序进行：0-10分钟，流动相A与流动相B的体积比由10:90线性变化为60:40；10-30分钟，流动相A与流动相B的体积比由60:40线性变化为80:20；30-34分钟，流动相A与流动相B的体积比由80:20线性变化为81:19；34-40分钟，流动相A与流动相B的体积比由81:19线性变化为100:0，并维持该体积比至60分钟；
(3)测定方法：
限度：除去溶剂峰，按面积归一化法计，总杂不得过0.5％；
系统适应性理论板数按萜酚峰计算≥10000，萜酚峰与相邻杂质峰的分离度≥1.5。
9.根据权利要求8所述的一种萜酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，其特征在于，色谱柱柱长为150mm，检测波长为226-230nm，最佳检测波长为228nm，流速为0.5-1mL/min,最佳流速为0.8mL/min，柱温为28-32℃，最佳柱温为30℃，进样量为8-12μL，最佳进样量为10μL。
10.根据权利要求8所述的一种萜酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，其特征在于，供试品溶液浓度范围在0.2mg/mL。
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2020
- 2020-03-02 CN CN202010134940.5A patent/CN111239293A/zh active Pending
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