CN111238893B - 一种用于检查肺癌的体液细胞的提取方法 - Google Patents

一种用于检查肺癌的体液细胞的提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细胞病理检测领域，具体涉及一种用于检查肺癌的体液细胞的提取方法。所述提取方法包括：痰液收集过程和痰液制片过程。本发明采用的痰液标本液可以将痰标本保存7天不变性，也不会出现风干的情况，同时无毒无害，对吐痰的人安全；痰液保存液可以降低浓稠痰液的表面张力，以降低痰液的粘稠度，能将大分子的蛋白质水解成多肽及氨基酸等产物，同时保护痰液细胞免受损伤，让其有效分解出来；将结核杆菌等有传染性的细菌迅速灭活，保护实验室操作人员的健康；极大地提高了采样质量和检测阳性率，降低了痰液粘稠，易于涂片及镜检观察，而且提高了痰液细胞的保存时间，送检周转时间充足，能够真正惠及大众。

Description

一种用于检查肺癌的体液细胞的提取方法
技术领域
本发明涉及细胞病理检测领域，具体涉及一种用于检查肺癌的体液细胞的提取方法。
背景技术
肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的临床表现比较复杂，症状和体征的有无、轻重以及出现的早晚，取决于肿瘤发生部位、病理类型、有无转移及有无并发症，以及患者的反应程度和耐受性的差异。肺癌早期症状常较轻微，甚至可无任何不适。中央型肺癌症状出现早且重，周围型肺癌症状出现晚且较轻，甚至无症状，常在体检时被发现。肺癌的症状大致分为：局部症状、全身症状、肺外症状、浸润和转移症状。
根据临床症状、体征、影像学检查和组织病理学检查做出诊断。肺癌的早期诊断具有重要意义，只有在病变早期得到诊断和治疗，才能获得较好的疗效。肺癌早期缺乏典型症状，对40岁以上人群，应定期进行胸部X线普查。出现肺癌原发症状或转移症状者及时做胸部X线片检查或胸部CT检查，发现肺部有肿块阴影时，应首先考虑到肺癌的诊断，应作进一步检查，经过组织病理学检查明确诊断。肺癌的筛查和早期诊断，达到肺癌的早诊早治具有重要意义。
目前临床检查痰液中肺癌细胞主要采用痰标本直接涂片法，由于痰液粘稠，粘液掩盖细胞成份，不易于涂片及镜检观察，而且痰液中的脱落细胞分散在粘液中，使视野中的细胞密度小，细胞易变形或破坏，检测阳性率低。痰液细胞保存时间短，送检周转时间不够，不能够真正惠及大众。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明第一个方面提供了一种用于检查肺癌的体液细胞的提取方法，所述提取方法包括：痰液收集过程和痰液制片过程。
作为一种优选的技术方案，所述痰液收集过程包括如下步骤：
(1)清晨空腹，涮牙嗽口，收集第一口晨痰；
(2)打开包装，取出痰液标本收集瓶；
(3)收集了第一口痰后，再收集第二口痰或再收集第二口痰和第三口痰；
(4)拧紧盖，将痰液与痰液标本液混匀，做好标记，得痰液标本。
作为一种优选的技术方案，按质量百分数计，所述痰液标本液包括：螯合剂0.01-2％、氯化钠0.05-10％、蔗糖0.02-4％、防腐剂0.1-2％、杀菌剂0.5-5％、余量去离子水。
作为一种优选的技术方案，所述防腐剂选自咪唑烷基脲类防腐剂、咪唑啉盐酸盐、苯并三唑盐、酚类防腐剂、脱氢乙酸盐、丙酸盐、山梨酸盐及其衍生物的至少一种或混合物。
作为一种优选的技术方案，所述杀菌剂选自异噻唑啉酮类杀菌剂、甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂、吡咯类杀菌剂、三唑类杀菌剂、季铵盐、吡唑酰胺类杀菌剂、抗生素类杀菌剂、甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂、二硫代氨基甲酸酯类杀菌剂中的一种或多种。
作为一种优选的技术方案，所述异噻唑啉酮类杀菌剂选自1,2苯并异噻唑啉酮、辛基异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮、甲基氯异噻唑啉酮中的一种或多种。
作为一种优选的技术方案，所述痰液制片过程包括如下步骤：
(1)将痰液标本倒入痰液保存液，混匀，做好标记；
(2)振荡至黏液充分分解，将溶解后的痰液标本离心去上清；
(3)加清洗液，重新振荡混匀，得混悬液；
(4)制片；
(5)染色；
(6)镜检。
作为一种优选的技术方案，按质量百分数计，所述痰液保存液包括：螯合剂0.05-5％、盐类物质0.05-10％、消化剂0.02-4％、防腐剂0.1-2％、杀菌剂0.005-0.02％、甲醇10-30％、余量去离子水。
作为一种优选的技术方案，所述盐类物质包括无机盐和有机酸盐。
作为一种优选的技术方案，所述有机酸盐选自羧酸盐、磺酸盐、亚磺酸盐、硫羧酸盐中的一种或多种。
有益效果：本发明提供了一套完整的肺癌的体液细胞的提取方法，本发明采用的痰液标本液可以将痰标本保存7天不变性，也不会出现风干的情况，同时无毒无害，对吐痰的人安全，也将结核杆菌等有传染性的细菌迅速灭活，保护实验室操作人员的健康；本发明采用的痰液保存液可以降低浓稠痰液的表面张力，以降低痰液的粘稠度，能将大分子的蛋白质水解成多肽及氨基酸等产物，同时保护痰液细胞免受损伤，让其有效分解出来，也将结核杆菌等有传染性的细菌迅速灭活，保护实验室操作人员的健康；本发明采取的肺癌的体液细胞的痰液收集过程和痰液制片过程极大地提高了采样质量和检测阳性率，降低了痰液粘稠，易于涂片及镜检观察，而且提高了痰液细胞的保存时间，送检周转时间充足，能够真正惠及大众。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明提供技术方案中的技术特征作进一步清楚、完整的描述，并非对其保护范围的限制。
在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
另外，在发明中涉及“第一”、“第二”等等的描述仅描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。
为了解决上述问题，本发明第一个方面提供了一种用于检查肺癌的体液细胞的提取方法，所述提取方法包括：痰液收集过程和痰液制片过程。
<痰液收集过程>
本发明中，所述痰液收集过程包括如下步骤：
(1)清晨空腹，涮牙嗽口，收集第一口晨痰；
(2)打开包装，取出痰液标本收集瓶；
(3)收集了第一口痰后，再收集第二口痰或再收集第二口痰和第三口痰；
(4)拧紧盖，将痰液与痰液标本液混匀，做好标记，得痰液标本。
在一种实施方式中，所述痰液收集过程包括如下步骤：
(1)清晨空腹，涮牙嗽口，收集第一口晨痰；
(2)打开包装，取出痰液标本收集瓶；
(3)收集了第一口痰后，再收集第二口痰；
(4)拧紧盖，将痰液与痰液标本液混匀，做好标记，得痰液标本；
所说痰液需是收集人用力咳出肺部深处的痰液，将肺部深处的痰液吐入收集瓶，不能是口水痰、鼻吸痰，且咳嗽时不要正对瓶口，痰到口腔再吐，也免气流将标本液吹出。
在另一种实施方式中，所述痰液收集过程包括如下步骤：
(1)清晨空腹，涮牙嗽口，收集第一口晨痰；
(2)打开包装，取出痰液标本收集瓶；
(3)收集了第一口痰后，再收集第二口痰和第三口痰；
(4)拧紧盖，将痰液与痰液标本液混匀，做好标记，得痰液标本；
所说痰液需是收集人用力咳出肺部深处的痰液，将肺部深处的痰液吐入收集瓶，不能是口水痰、鼻吸痰，且咳嗽时不要正对瓶口，痰到口腔再吐，也免气流将标本液吹出。
所说第一口晨痰、第二口痰、第三口痰的体积均约为1mL；最终收集到的痰液的体积为2-3mL。
在一种实施方式中，所述痰液、痰液标本液的体积比为1：(1-4)。
在一种优选的实施方式中，所述痰液、痰液标本液的体积比为1：(1.7-2.5)。
痰液标本液
在一种实施方式中，按质量百分数计，所述痰液标本液包括：螯合剂0.01-2％、氯化钠0.05-10％、蔗糖0.02-4％、防腐剂0.1-2％、杀菌剂0.5-5％、余量去离子水。
在一种优选的实施方式中，按质量百分数计，所述痰液标本液包括：螯合剂0.01-0.1％、氯化钠0.05-0.2％、蔗糖0.1-0.5％、防腐剂0.1-2％、杀菌剂0.5-5％、余量去离子水。
在一种优选的实施方式中，按质量百分数计，所述痰液标本液包括：螯合剂0.02％、氯化钠0.1％、蔗糖0.2％、防腐剂0.5％、杀菌剂2％、余量去离子水。
(螯合剂)
本发明中，所述螯合剂是指能与金属离子形成络合物的物质。
在一种实施方式中，所述螯合剂选自乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二铵、乙二胺四乙酸四钠、乙二胺四乙酸四铵中的一种或几种的组合。
在一种优选的实施方式中，所述螯合剂为乙二胺四乙酸二钠。
(氯化钠)
本发明中，所述氯化钠的化学式为NaCl，无色立方结晶或细小结晶粉末，味咸。外观是白色晶体状，其来源主要是海水，是食盐的主要成分。医疗上用来配置生理盐水，生活上可用于调味品。
(蔗糖)
本发明中，所述蔗糖，是食糖的主要成分，双糖的一种，由一分子葡萄糖的半缩醛羟基与一分子果糖的半缩醛羟基彼此缩合脱水而成。蔗糖有甜味，无气味，易溶于水和甘油，微溶于醇。相对密度1.587(25℃)。有旋光性，但无变旋光作用。蔗糖几乎普遍存在于植物界的叶、花、茎、种子及果实中。在甘蔗、甜菜及槭树汁中含量尤为丰富。蔗糖味甜，是重要的食品和甜味调味品。分为白砂糖、赤砂糖、绵白糖、冰糖、粗糖(黄糖)。
(防腐剂)
本发明中，所述防腐剂是能抑制微生物活动，防止腐败变质的一类添加剂。要使痰液有一定的保藏期，就需要采用一定的措施来防止微生物的感染和繁殖。
在一种实施方式中，所述防腐剂选自咪唑烷基脲类防腐剂、咪唑啉盐酸盐、苯并三唑盐、酚类防腐剂、脱氢乙酸盐、丙酸盐、山梨酸盐及其各种衍生物的至少一种或混合物。
所述咪唑烷基脲类防腐剂包括但不限于重氮咪唑烷基脲、咪唑烷基脲、1,3-二甲羟甲基二甲基乙内酰脲中的一种或多种。
所述咪唑啉盐酸盐包括但不限于2-(2-苯并呋喃)-2-咪唑啉盐酸盐、2-氯甲基咪唑啉盐酸盐、偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐、2-苄基-2-咪唑啉盐酸盐中的任一种。
所述苯并三唑盐包括但不限于苯并三氮唑钠盐、四丁基苯并三唑盐、四丁基苯并三唑盐、苯并三唑铜、5-丁基-苯并三唑钠盐中的任一种。
所述酚类防腐剂包括但不限于苯酚、间甲苯酚、对甲苯酚、邻甲苯酚、氯甲酚、苄醇中的任一种。
所述脱氢乙酸盐包括但不限于脱氢乙酸、脱氢乙酸钠、脱氢乙酸钾中的任一种。
所述丙酸盐包括但不限于丙酸、丙酸钠、丙酸钾中的任一种。
所述山梨酸盐包括但不限于山梨酸、山梨酸钠、山梨酸钾中的任一种。
在一种优选的实施方式中，所述防腐剂为咪唑烷基脲类防腐剂。
在一种优选的实施方式中，所述咪唑烷基脲类防腐剂选自杰马A、咪唑烷基脲、1,3-二甲羟甲基二甲基乙内酰脲中的一种或多种。
在一种更优选的实施方式中，所述防腐剂为杰马A(CAS号为78491-02-8)。
(杀菌剂)
本发明中，所述杀菌剂又称杀生剂、杀菌灭藻剂、杀微生物剂等，通常是指能有效地控制或杀死水系统中的微生物，如细菌、真菌和藻类的化学制剂。
在一种实施方式中，所述杀菌剂选自异噻唑啉酮类杀菌剂、甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂、吡咯类杀菌剂、三唑类杀菌剂、季铵盐、吡唑酰胺类杀菌剂、抗生素类杀菌剂、甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂、二硫代氨基甲酸酯类杀菌剂中的一种或多种。
所述异噻唑啉酮类杀菌剂包括但不限于1,2苯并异噻唑啉酮(BIT)、辛基异噻唑啉酮(OIT)、甲基异噻唑啉酮、甲基氯异噻唑啉酮中的一种或多种。
所述甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂包括但不限于烯肟菌胺、苯醚菌酯、醚菌酯、嘧菌酯、啶氧菌酯、肟菌酯、唑菌胺酯中的一种或多种。
所述吡咯类杀菌剂包括但不限于咯菌腈B1、拌种咯B2中的一种或多种。
所述三唑类杀菌剂包括但不限于叶菌唑、丙硫菌唑、氟环唑、烯唑醇、己唑醇、三唑醇、戊唑醇中的一种或多种。
所述季铵盐包括但不限于N-十八烷基-γ-双季铵盐、双十二烷基-γ-双季铵盐中的一种或多种。
所述吡唑酰胺类杀菌剂包括但不限于氟唑菌酰胺B1或氟唑菌苯胺B2、联苯吡菌胺B3、氟唑环菌胺B4、苯并烯氟菌唑B5中的一种或多种。
所述抗生素类杀菌剂包括但不限于春雷霉素、硫酸链霉素、井冈霉素、多抗霉素、梧宁霉素、灭瘟素、抗菌霉素、宁南霉素、嘧肽霉素、水合霉素中的任一种。
所述甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂包括但不限于嘧菌酯、醚菌酯、苯氧菌胺、醚菌胺、氟嘧菌酯、肟醚菌胺、啶氧菌酯、唑菌胺酯、肟菌酯、烯肟菌酯、烯肟菌胺中的一种或多种。
所述二硫代氨基甲酸酯类杀菌剂包括但不限于代森锌、代森铵、代森锰、代森联、代森锰锌、甲基代森锌、丙森锌、福美双、福美铁、福美锌等中的一种或多种。
在一种优选的实施方式中，所述杀菌剂为异噻唑啉酮类杀菌剂。
在一种优选的实施方式中，所述异噻唑啉酮类杀菌剂选自1,2苯并异噻唑啉酮、辛基异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮、甲基氯异噻唑啉酮中的一种或多种。
在一种优选的实施方式中，所述异噻唑啉酮类杀菌剂为卡松。
所述卡松的化学名称为5-氯-2甲基-4-异噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮，简称就是异噻唑啉酮；所述卡松的分子式为C4H4ClNOS+C4H5NOS；所述卡松的CAS号为26172-55-4，2682-20-4。
在一种实施方式中，所述卡松选自卡松DL501、卡松DL604、卡松DL606、卡松DL502、卡松DL701、卡松DL102、卡松DL503、卡松DL702、卡松DLx601、卡松DL504、卡松DL703、卡松DL-T20、卡松DL505、卡松DL605、卡松DL-T10、科莱恩NIPAGUARD CG中的一种或多种。
在一种优选的实施方式中，所述卡松为卡松DL606。
所述卡松DL606购买自广州市良坤化工有限公司。
发明人采用特定的标本液用以处理痰液，以延长痰液的保存时间，发明人在研究中发现采用异噻唑啉酮类杀菌剂可提高保存时间，但单独采用异噻唑啉酮类杀菌剂仅能使保存时间最多延长3天左右，而发明人意外发现当本发明中采用一定量的防腐剂，尤其是咪唑烷基脲类防腐剂时能使保存时间延长更多，发明人认为可能的原因是，咪唑烷基脲类防腐剂杂环上的活性部分容易与痰液细菌分子上的碱基形成氢键，呈正电性，并和蔗糖一起协同作用在呈负电性的细菌细胞上吸附，形成一层无色抗菌保护膜，增加了长期抗菌效果。
<痰液制片过程>
本发明中，所述痰液制片过程包括如下步骤：
(1)将痰液标本倒入痰液保存液，混匀，做好标记；
(2)振荡至黏液充分分解，将溶解后的痰液标本离心去上清；
(3)加清洗液，重新振荡混匀，得混悬液；
(4)制片；
(5)染色；
(6)镜检。
在一种实施方式中，所述痰液标本、痰液保存液的体积比为1：(1-3)。
在一种优选的实施方式中，所述痰液标本、痰液保存液的体积比为1：(1.4-1.9)。
痰液保存液
在一种实施方式中，按质量百分数计，所述痰液保存液包括：螯合剂0.05-5％、盐类物质0.05-10％、消化剂0.02-4％、防腐剂0.1-2％、杀菌剂0.005-0.02％、甲醇10-30％、余量去离子水。
在一种优选的实施方式中，按质量百分数计，所述痰液保存液包括：螯合剂0.05-0.5％、盐类物质0.1-2％、消化剂0.2-2％、防腐剂0.1-2％、杀菌剂0.005-0.02％、甲醇10-30％、余量去离子水。
在一种更优选的实施方式中，按质量百分数计，所述痰液保存液包括：螯合剂0.2％、盐类物质0.5％、消化剂0.8％、防腐剂0.5％、杀菌剂0.01％、甲醇20％、余量去离子水。
(螯合剂)
所述痰液保存液中的螯合剂同痰液标本液中的螯合剂。
(盐类物质)
本发明中，所述盐类物质是指一类金属离子或铵根离子(NH4 +)与酸根离子或非金属离子结合的化合物。
在一种实施方式中，所述盐类物质包括无机盐和有机酸盐。
所述无机盐包括但不限于氯化钠、氯化钾、氯化镁、硝酸钙、硝酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾碳酸氢钾、硫酸钠、硫酸铜、硫酸钾、亚硫酸钠、碳酸铵、硫酸铵、氯化铜、氯化铁、氯化亚铁、硝酸钾、硝酸铜、硝酸镁、硝酸铝、氯化铝、硫酸铝、碳酸钙、硫酸钡、硝酸钡、氯化钡中的任一种。
在一种优选的实施方式中，所述无机盐为氯化钠、氯化钾的混合物。
在一种优选的实施方式中，所述氯化钠、氯化钾的质量比为(1-2)：1。
在一种优选的实施方式中，所述氯化钠、氯化钾的质量比为1.5：1。
在一种实施方式中，所述有机酸盐选自羧酸盐、磺酸盐、亚磺酸盐、硫羧酸盐中的一种或多种。
所述羧酸盐包括但不限于甲酸钠、乙酸钠、乙酸钾、苯甲酸钠、柠檬酸钠、水杨酸钠、乙酸镁、乙酸铵、乙酸铜、乙酸钡、丙酸钠、丙酸钾、乙酸铝、柠檬酸铵、柠檬酸镁、甲酸镁、苯甲酸钾、水杨酸钾中的任一种。
所述磺酸盐包括但不限于磺酸钠、磺酸钙、磺酸镁、磺酸钡、磺酸钾、磺酸铵、磺酸铝、磺酸铜中的任一种。
所述亚磺酸盐包括但不限于亚磺酸钠、亚磺酸钾、亚磺酸铵、亚磺酸镁中的任一种。
所述硫羧酸盐包括但不限于硫氢化钠、硫酸钠、苯硫酸钠、硫代乙酸钠、硫代乙酸钾、硫代乙酸镁中的任一种。
在一种优选的实施方式中，所述有机酸盐为羧酸盐。
在一种更优选的实施方式中，所述有机酸盐为乙酸镁。
在一种更优选的实施方式中，所述盐类物质为乙酸镁、氯化钠、氯化钾的混合物。
在一种最优选的实施方式中，所述乙酸镁、氯化钠、氯化钾的质量比为2.5：1.5：1。
在通常的方法中，采用无机盐增加痰液中水样层的厚度，使痰液黏稠度降低，而发明人在研究中意外发现当采用盐类为氯化钠、乙酸镁、氯化钾的混合物时，痰液粘稠度较单独加无机盐时粘稠度降低更容易，使测试结果更准确；发明人推测可能是在加入乙酸镁后，保存液中的镁离子可通过离子交换吸附在凝胶表面，使表面正电荷增多形成静电斥力，抑制其自身的团聚降低粘稠度，而也可能是由于氯化钠和氯化钾这两种离子强度很高的无机盐的存在下，乙酸根离子的羧基端与酸性糖蛋白结合，使蛋白自己的微环境发生变化，和保存液中其余组分的协同下更有利于蛋白结构的松散。而且乙酸镁的加入在一定程度上还能抑制异噻唑啉酮类杀菌剂的光降解。
(消化剂)
本发明中，所述消化剂是指消化浓稠痰液的试剂。
在一种实施方式中，所述消化剂选自甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、盐酸、硫酸、硝酸、过甲酸、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、蔗糖、葡萄糖、胰蛋白酶、中性蛋白酶、二硫苏糖醇中的一种或多种。
在一种优选的实施方式中，所述消化剂为胰蛋白酶和/或二硫苏糖醇。
在一种优选的实施方式中，所述消化剂为胰蛋白酶和二硫苏糖醇的复配物；所述胰蛋白酶和二硫苏糖醇的质量比为1：1。
胰蛋白酶
本发明中，所述胰蛋白酶为蛋白酶的一种，是从牛、羊、猪的胰脏提取的一种丝氨酸蛋白水解酶。在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。在胰脏是胰蛋白酶的前体胰蛋白酶原被合成后，作为胰液的成分而分泌，受肠激酶，或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。
所述胰蛋白酶的化学式为C6H15O12P3，CAS号为9002-07-7。
所述胰蛋白酶为肽链内切酶，对精氨酸和赖氨酸肽链具有选择性水解作用，可使天然蛋白、变性蛋白、纤维蛋白和黏蛋白等水解为多肽或氨基酸。由于血清中含有非特异性抑肽酶，故胰蛋白酶不会消化正常组织，而能分解黏痰、脓性痰等黏性分泌物，能促进抗生素、化疗药物向病灶渗透。
二硫苏糖醇
本发明中，所述二硫苏糖醇(Dithiothreitol，简称为DTT)是一种小分子有机还原剂。其还原状态下为线性分子，被氧化后变为包含二硫键的六元环状结构。DTT的用途之一是作为巯基化DNA的还原剂和去保护剂。巯基化DNA末端硫原子在溶液中趋向于形成二聚体，特别是在存在氧气的情况下。这种二聚化大大降低了一些偶联反应实验(如DNA在生物感应器中的固定)的效率。
所述二硫苏糖醇的化学式为C4H10O2S2，CAS号为3483-12-3。
(防腐剂)
所述痰液保存液中的防腐剂同痰液标本液中的防腐剂。
(杀菌剂)
所述痰液保存液中的杀菌剂同痰液标本液中的杀菌剂。
发明人在研究的过程中发现加入一定的胰蛋白酶不仅能分解黏痰、脓性痰等黏性分泌物，将其水解为多肽或氨基酸，还能延长保存时间，可能的原因是胰蛋白酶表面含有多种酪氨酸、色氨酸等其他疏水性芳香型氨基酸，而凝胶糖蛋白上的疏水多肽链和胰蛋白酶表面的疏水型氨基酸产生疏水作用，使越来越多的凝胶分散从而被解离。进一步研究中，发明人发现若将胰蛋白酶替换为二硫苏糖醇时同样具有优异效果，发明人推测可能是在各组分的协同作用下使二硫苏糖醇能将包埋于酸性糖蛋白内部的二硫键还原，提高其自身对痰液的分解性能；在后续研究中为降低痰液粘稠度，发明人意外发现当采用氯化钾和氯化钠与二硫苏糖醇一起使用时，痰液的表面张力降低，粘稠度较单独采用二硫苏糖醇时有明显降低，发明人推测可能的原因是痰液有两层，底层的水样层和表层的凝胶层，凝胶层富含有酸性糖蛋白的水分，而二硫苏糖醇中所含的活性基团与更容易与酸性糖蛋白形成氢键，使蛋白质分子散开，减小其自身的团簇作用力，而由于氯化钾和氯化钠等盐的存在，促进凝胶层被分解后的酸性糖蛋白因为盐析作用而分解出来，使包埋于酸性糖蛋白内部的二硫键得到还原，同时下层水体积增大降低粘稠度。此外发明人还发现二硫苏糖醇与胰蛋白酶同时存在时，粘稠度同样下降。
(甲醇)
本发明中，所述甲醇又名羟基甲烷、木醇、木精，化学式为CH3OH。
清洗液
本发明中，所述清洗液是清洗细胞，尽量让痰的黏稠物去掉，细胞片背景干净的液体产品。
在一种实施方式中，所述清洗液可以多种多样，有缓冲液，或者其它液体。
所述清洗液包括但不限于磷酸钠和磷酸氢二钠的缓冲液、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的缓冲液、碳酸钠和碳酸氢钠的缓冲液、碳酸钾和碳酸氢钾的缓冲液、磷酸钾和磷酸氢二钾的缓冲液、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的缓冲液中的任一种。
在一种优选的实施方式中，所述清洗液为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的缓冲液PBS溶液。
在一种实施方式中，所述清洗液的体积为2-10mL。
在一种优选的实施方式中，所述清洗液的体积为5mL。
制片
本发明中，所述制片是抽取保存瓶中的肺癌体液细胞标本注到载玻片上，形成细胞薄层，去除废液。
在一种实施方式中，所述制片过程选取的方式包括但不限于膜式制片、离心涂片、手工沉降、沉降制片染色、划片、滴片、手工涂抹、模式、离心沉降、自然沉降、液基细胞制片中的任一种。
在一种优选的实施方式中，所述制片过程选取的方式为液基细胞制片。
所述液基细胞制片包括：将膜筒的具有多孔膜的一端浸入液基细胞的样本液中，并使膜筒的腔体内形成负压，提取液基细胞；将膜筒的具有多孔膜的一端按压向载玻片，使膜筒提取到的液基细胞转移到载玻片上，完成制片；其中膜筒包括筒体和多孔膜，多孔膜设置在筒体的一端，膜筒内形成腔体，多孔膜上设置有多个连通至腔体的取样孔。
所述液基细胞制片根据液基细胞学原理，利用了气动与液动原理，将收集的细胞样本进行细胞分散、过滤采集和转移。由旋转机构带动过滤膜筒柔和地混匀细胞样本；计算机控制的气动、流体动力系统用于细胞采集的全过程；采用生化学原理，把收集在过滤膜上的细胞向玻片自然吸附，达到细胞完美转移，单层均匀平铺的目的，便于染色和诊断。
所述液基细胞制片的步骤如下：
(1)现将已采样的细胞保存液瓶编上号码，然后将标准瓶放入振荡器，振荡，使细胞完全脱落到标本瓶保存液中；
(2)取适量离心管编上与标本瓶相对应的号码；
(3)取标本瓶里的液体经过过滤器加入相对应号码的离心管中；
(4)将离心管放入离心机，离心，取出离心管迅速倒掉上清液；
(5)将离心管在振荡器上振荡20秒，使离心管底部聚集的细胞恢复悬浮状态，然后按照编码顺序将离心管放入制片机；
(6)将预处理载玻片固定在制片机载玻板上；
(7)打开仪器电源，根据显示屏上的指示进行充管操作，充管结束后用吸水纸将加样针上挂滴的液体吸干，再根据仪器提示选择样品数，按确认，运行，机器进行自动制片；
(8)仪器结速运行后，去下载玻片，放入玻片架；
(9)将离心管丢弃，根据提示进行排管，结束后，关闭电源，整理好剩余的试剂，清洁仪器表面。
所述液基细胞制片的优点如下：
(1)经过处理液处理后，去除了标本中的黏液、血液等，因而背景较干净；同时，由于制片过程始终处于液态环境，因此保存了细胞的完整性，使得细胞内的核质结构更加清楚；
(2)由于采用了程序化制片，因此可以控制涂片的细胞量，使细胞均匀分布；
(3)液基细胞学涂片的阅片面积小，不易发生视疲劳，减少漏诊，提高阳性率；
(4)采用了自动制片，减少了人工接触标本的机会，减少了污染及人为干扰因素，有利于制片的质量控制，进而提高了诊断的准确性与可靠性；
(5)对于细胞成分少的标本，能够较大程度的收集标本中的细胞成分，以保证涂片中的细胞数量。
所述液基细胞制片可以克服传统制片由于受到标本数量、退变程度、血细胞多少、制片厚薄的影响，造成涂片厚薄不均、细胞重叠、结构不清、细胞形态变异等缺点导致传统涂片的阳性符合率低。
所述液基细胞制片主要有三种方法：自然沉淀法，膜式吸滤法和直接离心法。三种方法制片各有其有缺点。自然沉淀法是利用离心机将样品离心分层，取出有用层液，置于载玻片上，靠重力沉落在载玻片上；膜式吸滤法是利用了微孔膜技术在真空辅助下完成制片；直接离心法则采用了离心机直接利用离心力将样品沉附在载玻片上。其中，膜式吸滤法制片法是主流制片法。现有的膜式吸滤法主要有两类，一种是吸附法，一种是过滤法。吸附法是样品处于膜的下方，当膜接触液体时，在真空作用下，小于膜孔的物质被吸走，大于膜孔的细胞被挡住并附在膜上，将膜移动到载玻片上，在膜的背离载玻片的方向形成正压力气压，将细胞吹到载玻片上。原则上说，有多少膜孔就能吸附多少细胞，若膜孔分布均匀，故细胞分布亦均匀，此时制出的细胞片清晰均匀。这种方法的缺点是涉及气压变化，不仅机构复杂，而且制片速度慢，一般在3分钟一片，此外对样品液的要求也较高，若样品液前期处理不好，会导致大面积的物质吸附在膜孔上，制出的片子会出现空白区。过滤法则是样品处于膜的上方，一般为双模过滤，第一层膜是粗滤，滤除大体积的杂质和粘液，第二层膜细滤，在真空作用下，小于膜孔的物质被吸走，大于膜孔的细胞被挡在膜孔上，机器将留在细滤膜上的细胞转移至载玻片上，完成制片。该方法对样本液也有一定的要求，如果样品液不是过浓，加样量合适，制出的片子一样清晰，但均匀性不如吸附法好，因此此方法需要操作人员根据经验判断加样量多少，否则成片质量不高，此外制片过程中需要拆解膜装置，操作复杂。
在一种更优选的实施方式中，所述制片是装载制片器具，将混悬液1-4mL倒入细胞过滤器，混匀后取2-4mL制片；旋制片器制片机图，且将多余的混悬液倒回痰液保存液瓶中。
在一种更优选的实施方式中，所述制片是装载制片器具，将混悬液3mL倒入细胞过滤器，混匀后取3mL制片；旋制片器制片机图。
染色
本发明中，所述染色是向制片过程完成的细胞片中注入染色所需染液，静置，使细胞着色。
染色是生物显微玻片标本制作中最重要的环节之一。先把破坏细胞膜的选择透过性，再使用染色剂，将生物组织浸入染色剂内，使组织细胞的某一部分染上与其他部分不同的颜色或深度不同的颜色，产生不同的折射率，以便观察。
在一种实施方式中，所述制片过程选取的方式包括但不限于：巴氏染色法、HE染色法、简单染色法、革兰氏染色法、瑞氏吉姆萨染色法、细胞免疫荧光染色法中的任一种。
所述巴氏染色法是脱落细胞染色中最好的染色方法，主要包括固定、核染色、胞浆染色、透明四个步骤；
所述HE染色法为苏木精-伊红染色法，是石蜡切片技术里常用的染色法之一，也是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基础、最广泛的技术方法；
所述简单染色法常用碱性染料如美蓝等进行简单染色；
所述革兰氏染色法主要包括结晶紫初染、碘液媒染、乙醇(或丙酮)脱色以及番红复染四个过程；
所述瑞氏吉姆萨染色法中瑞氏吉姆萨染料溶剂主要是由伊红美蓝组成；
所述细胞免疫荧光染色法的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合。
在一种优选的实施方式中，所述制片过程选取的方式为瑞氏吉姆萨染色法。
在一种更优选的实施方式中，所述瑞氏吉姆萨染色过程的具体步骤为：
(1)用瑞氏吉姆萨A液染5分钟，水洗；
(2)用瑞氏吉姆萨的B液染1秒，水洗；
(3)用瑞氏吉姆萨的C液染20秒，水洗；
(4)用瑞氏吉姆萨的D液染1分钟、水洗；
(5)用质量分数为95％酒精浸1秒钟，无水酒精浸1秒钟；
所述瑞氏吉姆萨的A液、瑞氏吉姆萨的B液、瑞氏吉姆萨的C液、瑞氏吉姆萨的D液均购买自北京绿源伯德生物科技有限公司。
镜检
本发明中，所述镜检为吹干树胶封片镜检，即细胞制片染色过程完成后镜检。
在一种实施方式中，所述痰液制片过程包括如下步骤：
(1)将痰液标本倒入痰液保存液，混匀，做好标记；
(2)振荡至黏液充分分解，将溶解后的痰液标本离心去上清；
(3)加清洗液，重新振荡混匀，得混悬液；
(4)制片；
(5)染色；
(6)镜检；
所述步骤(2)肉眼观察黏液需完全分解，如遇黏液较难分解，可加长振荡时间；所述步骤(2)中的离心速度为1000-2000rpm，离心时间为5-20min；
所述步骤(3)清洗液的体积为5mL；
所述步骤(4)装载制片器具，倒入混悬液1-4mL细胞过滤器，混匀后取2-4ml制片。
在一种优选的实施方式中，所述痰液制片过程包括如下步骤：
(1)将痰液标本倒入痰液保存液，混匀，做好标记；
(2)振荡至黏液充分分解，将溶解后的痰液标本离心去上清；
(3)加清洗液，重新振荡混匀，得混悬液；
(4)制片；
(5)染色；
(6)镜检；
所述步骤(2)肉眼观察黏液需完全分解，如遇黏液较难分解，可加长振荡时间；所述步骤(2)中的离心速度为1500rpm，离心时间为10min；
所述步骤(3)清洗液的体积为5mL；
所述步骤(4)装载制片器具，倒入混悬液2mL细胞过滤器，混匀后取2mL制片。
下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
另外，如果没有其它说明，所用原料都是市售的。
实施例
实施例1
实施例1提供了一种用于检查肺癌的体液细胞的提取方法，所述提取方法包括：痰液收集过程和痰液制片过程；
所述痰液收集过程包括如下步骤：
(1)清晨空腹，涮牙嗽口，收集第一口晨痰；
(2)打开包装，取出痰液标本收集瓶；
(3)收集了第一口痰后，再收集第二口痰；
(4)拧紧盖，将痰液与5mL痰液标本液混匀，做好标记，得痰液标本；
所说痰液需是收集人用力咳出肺部深处的痰液，将肺部深处的痰液吐入收集瓶，不能是口水痰、鼻吸痰，且咳嗽时不要正对瓶口，痰到口腔再吐，也免气流将标本液吹出；
按质量百分数计，所述痰液标本液包括：螯合剂0.01％、氯化钠0.05％、蔗糖0.1％、防腐剂0.1％、杀菌剂0.5％、余量去离子水；
所述螯合剂为乙二胺四乙酸二钠；
所述防腐剂为杰马A(CAS号为78491-02-8)；
所述杀菌剂为卡松DL606，购买自广州市良坤化工有限公司；
所述痰液制片过程包括如下步骤：
(1)将痰液标本倒入10mL痰液保存液，混匀，做好标记；
(2)振荡至黏液充分分解，将溶解后的痰液标本在离心速度为1500rpm下离心10min，去上清；
(3)加5mL清洗液，重新振荡混匀，得混悬液；
(4)制片；
(5)染色；
(6)镜检；
按质量百分数计，所述痰液保存液包括：螯合剂0.05％、盐类物质0.1％、消化剂0.2％、防腐剂0.1％、杀菌剂0.005％、甲醇10％、余量去离子水；
所述盐类物质为乙酸镁、氯化钠、氯化钾的混合物；所述乙酸镁、氯化钠、氯化钾的质量比为2.5：1.5：1；
所述消化剂为胰蛋白酶和二硫苏糖醇的复配物；所述胰蛋白酶和二硫苏糖醇的质量比为1：1；所述胰蛋白酶的化学式为C6H15O12P3，CAS号为9002-07-7；所述二硫苏糖醇的化学式为C4H10O2S2，CAS号为3483-12-3；
所述清洗液为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的缓冲液PBS溶液；
所述制片是装载制片器具，将混悬液2mL倒入细胞过滤器，混匀后取2mL制片；旋制片器制片机图；
所述染色为瑞氏吉姆萨染色，具体步骤为：(1)用瑞氏吉姆萨A液染5分钟，水洗；
(2)用瑞氏吉姆萨的B液染1秒，水洗；
(3)用瑞氏吉姆萨的C液染20秒，水洗；
(4)用瑞氏吉姆萨的D液染1分钟、水洗；
(5)用质量分数为95％酒精浸1秒钟，无水酒精浸1秒钟；
所述瑞氏吉姆萨的A液、瑞氏吉姆萨的B液、瑞氏吉姆萨的C液、瑞氏吉姆萨的D液均购买自北京绿源伯德生物科技有限公司；
所述镜检为吹干树胶封片镜检。
实施例2
实施例2提供了一种用于检查肺癌的体液细胞的提取方法，所述提取方法包括：痰液收集过程和痰液制片过程；
所述痰液收集过程包括如下步骤：
(1)清晨空腹，涮牙嗽口，收集第一口晨痰；
(2)打开包装，取出痰液标本收集瓶；
(3)收集了第一口痰后，再收集第二口痰和第三口痰；
(4)拧紧盖，将痰液与5mL痰液标本液混匀，做好标记，得痰液标本；
按质量百分数计，所述痰液标本液包括：螯合剂0.1％、氯化钠0.2％、蔗糖0.5％、防腐剂2％、杀菌剂5％、余量去离子水；
所述螯合剂为乙二胺四乙酸二钠；
所述防腐剂为杰马A(CAS号为78491-02-8)；
所述杀菌剂为卡松DL606，购买自广州市良坤化工有限公司；
所述痰液制片过程包括如下步骤：
(1)将痰液标本倒入15mL痰液保存液，混匀，做好标记；
(2)振荡至黏液充分分解，将溶解后的痰液标本在离心速度为1500rpm下离心10min，去上清；
(3)加5mL清洗液，重新振荡混匀，得混悬液；
(4)制片；
(5)染色；
(6)镜检；
按质量百分数计，所述痰液保存液包括：螯合剂0.5％、盐类物质2％、消化剂2％、防腐剂2％、杀菌剂0.02％、甲醇30％、余量去离子水；
所述盐类物质同实施例1；
所述消化剂同实施例1；
所述清洗液为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的缓冲液PBS溶液；
所述制片同实施例1；
所述染色同实施例1；
所述镜检为吹干树胶封片镜检。
实施例3
实施例3提供了一种用于检查肺癌的体液细胞的提取方法，所述提取方法包括：痰液收集过程和痰液制片过程；
所述痰液收集过程包括如下步骤：
(1)清晨空腹，涮牙嗽口，收集第一口晨痰；
(2)打开包装，取出痰液标本收集瓶；
(3)收集了第一口痰后，再收集第二口痰和第三口痰；
(4)拧紧盖，将痰液与5mL痰液标本液混匀，做好标记，得痰液标本；
按质量百分数计，所述痰液标本液包括：螯合剂0.02％、氯化钠0.1％、蔗糖0.2％、防腐剂0.5％、杀菌剂2％、余量去离子水；
所述螯合剂为乙二胺四乙酸二钠；
所述防腐剂为杰马A(CAS号为78491-02-8)；
所述杀菌剂为卡松DL606，购买自广州市良坤化工有限公司；
所述痰液制片过程包括如下步骤：
(1)将痰液标本倒入15mL痰液保存液，混匀，做好标记；
(2)振荡至黏液充分分解，将溶解后的痰液标本在离心速度为1500rpm下离心10min，去上清；
(3)加5mL清洗液，重新振荡混匀，得混悬液；
(4)制片；
(5)染色；
(6)镜检；
按质量百分数计，所述痰液保存液包括：螯合剂0.2％、盐类物质0.5％、消化剂0.8％、防腐剂0.5％、杀菌剂0.01％、甲醇20％、余量去离子水；
所述盐类物质同实施例1；
所述消化剂同实施例1；
所述清洗液为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的缓冲液PBS溶液；
所述制片同实施例1；
所述染色同实施例1；
所述镜检为吹干树胶封片镜检。
实施例4
实施例4提供了一种用于检查肺癌的体液细胞的提取方法，同实施例3，不同之处在于，所述痰液标本液中无杰马A。
实施例5
实施例5提供了一种用于检查肺癌的体液细胞的提取方法，同实施例3，不同之处在于，所述痰液标本液中无蔗糖。
实施例6
实施例6提供了一种用于检查肺癌的体液细胞的提取方法，同实施例3，不同之处在于，所述痰液标本液中无卡松DL606。
实施例7
实施例7提供了一种用于检查肺癌的体液细胞的提取方法，同实施例3，不同之处在于，所述痰液标本液中杰马A被山梨酸钠代替；所述山梨酸钠的CAS号为7757-81-5。
实施例8
实施例8提供了一种用于检查肺癌的体液细胞的提取方法，同实施例3，不同之处在于，所述痰液保存液中无杰马A。
实施例9
实施例9提供了一种用于检查肺癌的体液细胞的提取方法，同实施例3，不同之处在于，所述痰液保存液中无卡松DL606。
实施例10
实施例10提供了一种用于检查肺癌的体液细胞的提取方法，同实施例3，不同之处在于，所述消化剂中无胰蛋白酶。
实施例11
实施例11提供了一种用于检查肺癌的体液细胞的提取方法，同实施例3，不同之处在于，所述消化剂中无二硫苏糖醇。
实施例12
实施例12提供了一种用于检查肺癌的体液细胞的提取方法，同实施例3，不同之处在于，所述消化剂为胰蛋白酶和二硫苏糖醇的复配物；所述胰蛋白酶和二硫苏糖醇的质量比为1：0.2；所述胰蛋白酶的化学式为C6H15O12P3，CAS号为9002-07-7；所述二硫苏糖醇的化学式为C4H10O2S2，CAS号为3483-12-3。
实施例13
实施例13提供了一种用于检查肺癌的体液细胞的提取方法，同实施例3，不同之处在于，所述痰液保存液中无氯化钠、无氯化钾。
实施例14
实施例14提供了一种用于检查肺癌的体液细胞的提取方法，同实施例3，不同之处在于，所述痰液保存液中杰马A被山梨酸钠代替；所述山梨酸钠的CAS号为7757-81-5。
实施例15
实施例15提供了一种用于检查肺癌的体液细胞的提取方法，同实施例3，不同之处在于，所述痰液保存液中无乙酸镁。
实施例16
实施例16提供了一种用于检查肺癌的体液细胞的提取方法，同实施例3，不同之处在于，所述痰液保存液中乙酸镁被乙酸钠代替。
性能测试
选择年龄为50岁患有肺癌晚期的男性作为受试志愿者，清晨空腹，涮牙嗽口后，清晨7：00收集晨痰，收集16天，对实施例1-16用于检查肺癌的体液细胞的提取方法的痰液细胞进行测试。
1.保存时间：分别观察实施例1-16用于检查肺癌的体液细胞的提取方法得到的痰液标本能否取到吞噬细胞，并观察细胞形态是否保持晨痰采集时细胞的原始形态，记录细胞未发生膨胀、固缩等形态变化的时间即为保存时间，测试结果见表1。
2.不同时间下粘稠度：对实施例1-16所述将痰液标本倒入痰液保存液得到的痰液，振荡5min、10min、30min，用肉眼观察其粘稠度，所述将痰液标本倒入痰液保存液得到的痰液充分分解记为A、所述将痰液标本倒入痰液保存液得到的痰液部分分解记为B、所述将痰液标本倒入痰液保存液得到的痰液少量分解记为C，所述将痰液标本倒入痰液保存液得到的痰液不分解记为D，不同时间下粘稠度见表1。
表1性能测试结果
Figure BDA0002374441970000221
前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。

Claims (1)

1.一种用于检查肺癌的体液细胞的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括：痰液收集过程和痰液制片过程；
所述痰液收集过程包括如下步骤：
(1)清晨空腹，涮牙嗽口，收集第一口晨痰；
(2)打开包装，取出痰液标本收集瓶；
(3)收集了第一口痰后，再收集第二口痰或再收集第二口痰和第三口痰；
(4)拧紧盖，将痰液与痰液标本液混匀，做好标记，得痰液标本；
按质量百分数计，所述痰液标本液包括：螯合剂0.01-2％、氯化钠0.05-10％、蔗糖0.02-4％、防腐剂0.1-2％、杀菌剂0.5-5％、余量去离子水；所述防腐剂为咪唑烷基脲类防腐剂；所述杀菌剂为异噻唑啉酮类杀菌剂，所述异噻唑啉酮类杀菌剂选自1,2苯并异噻唑啉酮、辛基异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮、甲基氯异噻唑啉酮中的一种或多种；
所述痰液制片过程包括如下步骤：
(1)将痰液标本倒入痰液保存液，混匀，做好标记；
(2)振荡至黏液充分分解，将溶解后的痰液标本离心去上清；
(3)加清洗液，重新振荡混匀，得混悬液；
(4)制片；
(5)染色；
(6)镜检；
按质量百分数计，所述痰液保存液包括：螯合剂0.05-5％、盐类物质0.05-10％、消化剂0.02-4％、防腐剂0.1-2％、杀菌剂0.005-0.02％、甲醇10-30％、余量去离子水；所述盐类物质包括无机盐和有机酸盐，有机酸盐为乙酸镁。
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