CN111235175B

CN111235175B - 提高植物再生能力的靶基因、调控分子及其应用

Info

Publication number: CN111235175B
Application number: CN201911200120.5A
Authority: CN
Inventors: 王佳伟; 吴连宇; 王龙
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2018-11-29
Filing date: 2019-11-29
Publication date: 2023-06-30
Anticipated expiration: 2039-11-29
Also published as: CN111235175A; WO2020108620A1

Abstract

本发明涉及提高植物再生能力的靶基因、调控分子及其应用。本发明揭示了调节植物再生能力的新的靶标HAM。靶向于HAM的miRNA通过抑制HAM，发挥促进植物再生的作用。本发明提供了具有普适性的、有效和简便的提高植物再生率的新技术，为植物的改良育种提供新的途径，具有良好的应用前景。

Description

提高植物再生能力的靶基因、调控分子及其应用

技术领域

本发明属于植物学领域，更具体地，本发明涉及提高植物再生能力的靶基因、调控分子及其应用。

背景技术

再生(regeneration)是指生物体的整体或器官因创伤而发生部分丢失，在剩余部分的基础上又生长出与丢失部分在形态和功能上相同结构的过程。在动物中，九头蛇、涡虫、棘皮动物(海星、海百合)等物种将其身体部分切割后，都能在伤口处再生出完整的形态。植物细胞同样具有全能性(totipotent)，离体植物器官(比如根、下胚轴和叶)可以通过组织培养实现植株再生。例如从柳树上取下一段枝条，上下切断，下端插入潮湿的沙土或水中，经过一段时间，就会从上下切割表面分别长出芽和不定根。将秋海棠属或景天科植物的叶子从母体分离下来，放在潮湿环境下，容易产生不定根与不定芽。

植物在胚胎发育过程中建立起茎尖分生组织(shoot apical meristem，SAM)与根尖分生组织(root apical meristem，RAM)。这两个分生组织具有持续分裂分化的能力，从而可以在胚后不断产生新的侧生器官(lateral organ，例如叶、根和花)，导致植物的发育呈现无限性。

高等植物再生可分为三种：组织再生(tissue regeneration)，体细胞胚再生(somatic embryogenesis)和器官从头再生(de novo organogenesis)。组织再生是指组织或器官在损伤或缺失后，可以修复或重新生长出能够替代原来组织器官行使功能的结构。体细胞胚再生是指离体的已分化的细胞，在一定条件培养下，重新具备分化能力，并且可以经过类似胚胎发育的过程形成完整植株。植物器官从头再生是指受伤或离体的植物组织长出不定根或不定芽的过程。器官从头再生是植物再生的重要方式，与体细胞胚再生不同，植物器官从头再生的过程仅需诱导外植体(explant，即离体组织或器官)形成SAM和RAM，无需经过类似胚胎发育的过程。

1957年Skoog and Miller发现生长素和细胞分裂素是植物器官从头再生的决定因素。在组织培养过程中，首先利用高浓度外源生长素(CIM)诱导外植体形成愈伤组织(callus)；愈伤组织再经过进一步诱导形成不定根(高生长素/细胞分裂素配比，RIM)或不定芽(高细胞分裂素/生长素配比，SIM)。但是，通过不同激素配比诱导植物体细胞再生成为芽具有明显的物种特异性，一些重要农作物的栽培种和一些非模式植物的再生效率极低，大大延长了作物育种和分子生物学实验周期，是目前困扰植物基础科学研究和创新农业发展的核心问题。

与根从头再生相比，芽从头再生过程的分子机制仍不清晰。WUSCHEL(WUS)是芽从头再生的重要调控因子。WUS是第一个被发现的WOX基因，它在SAM干细胞龛的组织中心(organizer center，OC)表达，对于维持SAM干细胞活性至关重要。CLAVATA3(CLV3)在茎尖干细胞(stem cell)中表达，是WUS的直接下游靶基因。CLV3可以通过CLV1-CLV2受体激酶通路抑制WUS的表达，形成WUS-CLV3反馈抑制通路，使得WUS的表达局限在OC区域。CLV-WUS这一反馈调控机制在促进细胞分化进程与维持SAM干细胞分裂及分化的平衡等方面发挥了重要作用。研究发现，wus突变体完全丧失芽再生能力，表明WUS也是调控芽再生的关键因子。有趣的是细胞分裂素在OC处高度积累，提示细胞分裂素可能通过直接激活WUS的表达建立SAM。

除了激素外，非编码RNA也参与了植物再生的调控。miRNA是植物中普遍存在的小分子非编码RNA，在植物的各项生命活动中发挥着重要作用，是基因表达的重要调控因子。目前已发现调控茎尖分生组织维持与建立的一些关键基因都在转录后水平受到miRNA的调控。例如，miR164靶标的NAC类转录因子CUP-SHAPED COTYLEDON1(CUC1)和CUC2参与SAM的边界区的维持和建立；HD-ZIP III类转录因子PHB/PHV/REV是miR165/6的靶标基因，phb phbrev三突变体呈现出SAM缺失的表型；F-box类基因LCR是miR394的靶基因，miR394在SAM的最外层细胞表达，通过短距离移动形成浓度梯度参与SAM的维持。但是，这些发现是不够的，还不能满足解释植物再生的机理所需，本领域仍需进一步的探索。

发明内容

本发明的目的在于提供提高植物再生能力的靶基因、调控分子及其应用

在本发明的第一方面，提供一种提高植物再生能力的方法，所述方法包括下调植物中HAM(HAIRY MERISTEM)；所述的HAM包括其同源物。

在一个优选例中，所述的下调植物中HAM包括下调其表达或活性。

在另一优选例中，所述的下调HAM包括：在植物中敲除或沉默HAM基因，或抑制HAM蛋白的活性；较佳地，包括但不限于：以特异性干扰HAM基因表达的干扰分子来沉默HAM，以基因编辑方法(如基于CRISPR系统的基因编辑)敲除HAM基因，以同源重组方法敲除HAM基因，或以紫外胁迫抑制HAM表达。

在另一优选例中，所述的干扰分子是以HAM的编码基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。

在另一优选例中，所述的干扰分子是以HAM的编码基因或其转录本为抑制或沉默靶标的微小RNA，其是miR171；较佳地，上调植物中miR171或其同源基因、或它们的编码基因或前体基因，从而下调HAM表达。

在另一优选例中，所述的上调植物中miR171或其同源基因、或它们的编码基因或前体基因包括上调它们的表达或活性。

在另一优选例中，所述的miRNA的前体能在植物中被加工成miR171或其同源基因。

在另一优选例中，所述的提高植物再生能力的方法为转基因方法。

在另一优选例中，通过miR171上调剂进行上调，包括选自下组的miR171上调剂：(a)多核苷酸，所述的多核苷酸能被植物转录或加工成miR171或其同源基因、或它们的编码基因或前体基因，较佳地，所述多核苷酸具有SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:10所示的序列；(b)表达构建物，所述的表达构建物含有miR171或其同源基因、或它们的编码基因或前体基因、或(a)中所述的多核苷酸；(c)miR171或其同源基因、或它们的编码基因或前体基因的激动剂。

在另一优选例中，将(a)～(c)任一所述的上调剂引入到植物中，从而实现所述的上调。

在另一优选例中，利用农杆菌转化法将所述上调剂引入到植物中；较佳地，所述方法包括：(1)提供农杆菌，所述农杆菌携带(a)～(c)任一所述的上调剂；(2)将植物细胞、组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述(a)～(c)任一所述的上调剂转入植物；和(3)选择出转入了所述上调剂的植物。

在另一优选例中，所述的miR171的核苷酸序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示；或所述的miR171的同源基因与miR171的序列同源性≥80％，较佳地≥90％，更佳地≥95％，进一步更佳地≥99％。

在另一优选例中，所述的miR171为miR171a，miR171b或miR171c。

在另一优选例中，所述的植物再生包括：芽再生，根再生，细胞胚再生；或所述的植物再生包括：植物外植体为基础的再生，植物愈伤组织为基础的再生；较佳地，所述的植物外植体或愈伤组织包括(但不限于)来自下组植物组织的外植体或愈伤组织：下胚轴，子叶，根，叶片，胚胎，花器官。

在另一优选例中，所述的植物包括或所述的HAM或其同源物来自于：双子叶植物；较佳地所述的植物包括选自下组的植物：禾本科，十字花科，茄科，豆科，藜科，杨柳科，锦葵科，椴树科，芸香科，菊科，葫芦科，番木瓜科，木棉科，梧桐科，鼠李科，大戟科，桑科，土瓶草科，胡麻科，木犀科，猕猴桃科，蔷薇科的植物；较佳地，所述的植物包括或所述的HAM或其同源物来自于选自下组的植物：拟南芥，二穗短柄草，稻，番茄，烟草，甜菜，大豆，白菜，玉米，棉花，马铃薯，麦，高山南芥，芥菜，亚麻芥，油菜，Eutrema saisugineum，黄麻(包括糙叶山黄麻，异色山黄麻，长溯黄麻)，杨树，克里曼丁橘，莴苣，番南瓜，番木瓜，西葫芦，向日葵，榴莲，青蒿，南瓜，可可豆，枣树，三叶橡胶，川桑，胡杨，土瓶草，木豆，Cynara cardunculusvar.scolymus，芝麻，甜橙，蜜柑，枸橘，油橄榄，猕猴桃，月季；更佳地，所述的植物包括或所述的HAM或其同源物来自于：拟南芥，甜菜，大豆，白菜，棉花，油菜，番茄，烟草。

在另一优选例中，所述的HAM包括：HAM1，HAM2，HAM3。

在另一优选例中，所述的HAM1选自：(a)如SEQ ID NO:1氨基酸序列的蛋白；(b)将SEQ ID NO:1氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-15个；更佳地1-10个，如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)与(a)限定的蛋白序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或(d)在(a)或(b)或(c)所述蛋白的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的蛋白。

在另一优选例中，所述的HAM2选自：(a)如SEQ ID NO:3氨基酸序列的蛋白；(b)将SEQ ID NO:3氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-15个；更佳地1-10个，如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)与(a)限定的蛋白序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或(d)在(a)或(b)或(c)所述蛋白的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的蛋白。

在另一优选例中，所述的HAM3选自：(a)如SEQ ID NO:5氨基酸序列的蛋白；(b)将SEQ ID NO:5氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-15个；更佳地1-10个，如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)与(a)限定的蛋白序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或(d)在(a)或(b)或(c)所述蛋白的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的蛋白。

在另一优选例中，本发明还包括编码前面HAM1、HAM2、HAM3的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种HAM的用途，用于作为下调靶点，以提高植物再生能力；或用于筛选靶向于HAM从而提高植物再生率的试剂。

在本发明的另一方面，提供一种HAM下调剂的用途，用于提高植物再生率；较佳地，所述的HAM下调剂通过下调HAM，提高芽再生标志基因的表达；更佳地，所述芽再生标志基因包括：WUS、CLV3、CUC1或CUC2。

在一个优选例中，所述的HAM下调剂包括(但不限于)：敲除或沉默HAM基因或抑制HAM蛋白活性的下调剂；较佳地，包括：特异性干扰HAM基因表达的干扰分子，敲除HAM基因的基因编辑(如基于CRISPR系统的基因编辑)试剂，基于同源重组的敲除HAM基因的试剂。

在另一优选例中，所述的干扰分子是以HAM的编码基因或其转录本为抑制或沉默靶标的miR171或miR171上调剂，所述miR171上调剂包括：(a)多核苷酸，所述的多核苷酸能被植物转录或加工成miR171或其同源基因、或它们的编码基因或前体基因，较佳地，所述多核苷酸具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的序列；(b)表达构建物，所述的表达构建物含有miR171或其同源基因、或它们的编码基因或前体基因、或(a)中所述的多核苷酸；(c)miR171或其同源基因、或它们的编码基因或前体基因的激动剂。

所述的植物再生包括：植物外植体为基础的再生，植物愈伤组织为基础的再生；较佳地，所述的植物外植体或愈伤组织包括(但不限于)来自下组植物组织的外植体或愈伤组织：下胚轴，子叶，根，叶片，胚胎，花器官。

在本发明的另一方面，提供一种HAM的用途，用于作为鉴定再生能力的分子标记；所述的HAM包括其同源物。

在本发明的另一方面，提供一种miR171或其同源基因、或它们的编码基因或前体基因的用途，用于作为鉴定再生能力的分子标记。

在本发明的另一方面，提供一种定向选择再生能力增强的植物的方法，所述方法包括：鉴定待测植物中HAM的表达，若是该待测植物的HAM表达显著低于该类(或该种)植物的HAM平均表达值，则其为(潜在地为)再生能力增强的植物；所述的HAM包括其同源物。

在本发明的另一方面，提供一种定向选择再生能力增强的植物的方法，所述方法包括：鉴定待测植物中miR171或其同源基因、或它们的编码基因或前体基因的表达，若是该待测植物的miR171或其同源基因、或它们的编码基因或前体基因的表达显著高于该类(或该种)植物的平均表达值，则其为(潜在地为)再生能力增强的植物。

在本发明的另一方面，提供一种筛选提高植物再生能力的试剂的方法，所述方法包括：(1)将候选物质加入到含有HAM的体系中；(2)观测(1)的体系中HAM的表达或活性；若所述候选物质抑制(较佳地是统计学上抑制；如降低20％以上，较佳地抑制50％以上，更佳地抑制80％以上)HAM的表达或活性，则表明该候选物质是提高植物再生能力的试剂；所述的HAM包括其同源物。

在本发明的另一方面，提供一种筛选提高植物再生能力的试剂的方法，所述方法包括：(1)将候选物质加入到含有miR171或其同源基因、或它们的编码基因或前体基因的体系中；(2)观测(1)的体系中miR171或其同源基因、或它们的编码基因或前体基因的表达或活性；若所述候选物质提高(较佳地是统计学上提高；如提高20％以上，较佳地提高50％以上，更佳地提高80％以上)miR171或其同源基因、或它们的编码基因或前体基因的表达或活性，则表明该候选物质是提高植物再生能力的试剂。

在一个优选例中，所述的方法还包括设置对照组与测试组，以观测候选物质在测试组与对照组中的区别。

在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对HAM，或其上游或下游蛋白或基因设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物(如激素)等。

在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对miR171或其编码基因或前体基因设计的表达构建物、激动剂等。

在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系(细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、植物组织体系、植物器官体系。

在另一优选例中，所述方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或转基因试验，以从候选物质中进一步确定对于提高植物再生能力效果优异的物质。

在本发明的另一方面，提供表达构建物或含有该表达构建物的试剂盒，所述表达构建物含有多核苷酸，所述的多核苷酸能被植物转录或加工成miR171或其同源基因、或它们的编码基因或前体基因；或，其含有miR171或其同源基因的编码基因或前体基因；较佳地，所述的表达构建物为表达载体。

在本发明的另一方面，提供一种植物细胞，其中含有所述的表达构建物，或其中包含外源引入的miR171或其同源基因、或它们的编码基因或前体基因。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、miR171的进化分析。斜线标示区域代表在所有陆生植物中均能找到。

图2、HAM蛋白保守性分析。HAM蛋白在陆生植物中高度同源，黑框突出显示不同物种植物中被miR171所识别并剪切的核苷酸位点所对应的蛋白质序列，该位点高度保守。

图3、miR171调控芽再生。野生型(WT)和mir171a，mir171b和mir171ab双突变体在SIM生长，统计芽再生率。n＝30。

图4、miR171与其靶基因HAM调控芽再生。野生型(WT)、MIR171C-OX(OVX)、ham1ham2 ham3三突变体、35S::rHAM1和35S::rHAM3外植体在SIM生长，统计芽再生率。n＝30。

图5、来源于根和叶片外植体芽再生实验。培养皿左半部为来自于叶片的愈伤组织在SIM上的生芽情况。培养皿右半部为来自于根的愈伤组织在SIM上的生芽情况。相较于野生型(Col-0)，miR171C-OX并不会促进根来源愈伤组织的芽再生能力(右半部)，而miR171C-OX可以显著促进叶片来源外植体愈伤组织的芽再生能力(左半部)。

图6、WUS和CLV3的表达模式。野生型(WT)和miR171C-OX在SIM生长诱导芽再生。在不同时间点取材，通过定量PCR检测WUS和CLV3的表达量。内参选取UBQ10。n＝3。其中SIM2h、4h、8h、24h、48h、96h分别表示在SIM培养基上培养2、4、8、24、48、96小时。

图7、诱导表达miR171c可以提高拟南芥芽再生率。PER8-MIR171C外植体(下胚轴)先在含有DMSO(对照组)或ES(实验组)的CIM培养基上培养7天，然后转移至无ES或DMSO的SIM培养基上培养24天。统计再生芽数量。n＝32。

图8、诱导表达miR171c可以在不经历愈伤组织形成的条件下提高拟南芥芽再生率。野生型与PER8-MIR171C外植体(根)在含有DMSO(对照组)或ES(实验组)的SIM培养基上。统计再生芽数量。n＝32。

图9、诱导表达miR171c促进体细胞胚的发生。PER8-MIR171C幼胚在含有DMSO(对照组)或ES(实验组)的E5培养基上生长15天，然后转移到MS培养基上。n＝30。

图10、诱导表达miR171c促进根再生。不同植物在1/2MS培养基上生长12天，然后在B5，B5(20μM DMSO)或B5(含有20μM ES)的培养基上考察生根能力。统计每天的生根率(生根植物/总植物)，从处理后第6天统计到第16天。n＝60。

图11、拟南芥野生型Col-0及MIR171C-OX材料在芽从头再生过程中，芽再生标志基因WUS和CLV3的表达量变化趋势；其中，CIM3d、5d、7d分别表示在CIM培养基上培养3、5、7天；SIM2d、4d、8d分别表示在SIM培养基上培养2、4、8天。

图12、靶向HAM可以直接或间接放大芽建立的标志基因CUC信号途径。其中，CIM3d、5d、7d分别表示在CIM培养基上培养3、5、7天；SIM1d、2d、4d、8d分别表示在SIM培养基上培养1、2、4、8天。

图13、PER8-MIR171C植物中HAM2的mRNA水平被显著降低。

图14、转化过表达miR171C的质粒或者共转过表达miR171C的质粒，可以显著提高甜菜的转基因效率。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，揭示了调节植物再生能力的新的靶标HAM及其同源物。在植物体内，靶向于HAM的miR171通过抑制HAM，发挥促进植物再生的作用。本发明提供了具有普适性的、有效和简便的提高植物再生率的新技术，为植物的改良育种提供新的途径，具有良好的应用前景。

本发明揭示了新的参与植物再生能力调控的基因，为HAM及其同源物。HAM在植物中高度保守地存在，本发明中不仅限于来自拟南芥或玉米的HAM。

如本文所用，所述的“植物”是适用于进行转基因操作的植物，可以是双子叶植物、单子叶植物或裸子植物；可以包括农作物、花卉植物或林业植物等。较佳地，所述的“植物”包括双子叶植物；更佳地包括(但不仅限于)：禾本科，十字花科，茄科，豆科，藜科，杨柳科，锦葵科，椴树科，芸香科，菊科，葫芦科，番木瓜科，木棉科，梧桐科，鼠李科，大戟科，桑科，土瓶草科，胡麻科，木犀科，猕猴桃科，蔷薇科的植物；例如，十字花科鼠耳芥属如拟南芥；禾本科稻属植物如水稻，禾本科小麦属植物如小麦，禾本科玉米属植物如玉米等；十字花科芸薹属的大白菜、小白菜、油菜；锦葵科棉属作物如棉花；茄科番茄属植物如番茄，茄科烟草属植物如烟草，藜科甜菜属的甜菜，豆科大豆属的大豆等。根据本发明人对于植物的大规模分析，本发明中所靶向的HAM基因/蛋白，其同源物广泛地存在于植物中，且以高度保守的方式存在，这体现在本发明的图2中。同样地，靶向于HAM基因或其同源物的miR171或其同源基因也广泛地存在于植物中，且以高度保守的方式存在。因此，可以理解，本发明的植物并不限于实施例中所列举的。

如本文所用，所述的“同源物”包括在多个物种中HAM的同源多肽或基因，例如拟南芥中为HAM，在陆生棉(Gossupium hirsutum)中为SCL6，SCL22，SCL27和SCL15等；在烟草(Nicotiana tabacum)中SCL6，SCL15和SCL22等；在番茄中(Solanum lycopersicum)中为NP_001333839.1，NP_001333836.1(HAM)，XP_004232383.1(SCL15)和XP_004232402.1(SCL7)等；在油菜(Brassica napus)中为BnaAnng18540D和BnaAnng18550D；在玉米(Zeamays L.)中为GRMZM2G037792_T01(GRAS79)，GRMZM5G825321_T01(GRAS transcriptionfactor)，GRMZM5G825321_T02(GRAS transcription factor)。在水稻中为OsHAM1，OsHAM2，OsHAM3，和OsHAM4。玉米ZmMIR171靶向于GRMZM2G037792(GRAS79)，GRMZM5G825321_T01(GRAS transcription factor)和GRMZM5G825321_T02(GRAS transcription factor)。

例如，在拟南芥中存在HAM1，HAM2，HAM3。该HAM1具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，以及SEQ ID NO:2所示核苷酸序列，其中第882～902为miR171的靶向位点；该HAM2具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列，以及SEQ ID NO:4所示核苷酸序列，其中第801～821为miR171的靶向位点；该HAM3具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列，以及SEQ ID NO:6所示核苷酸序列，其中第672～692为miR171的靶向位点。miR171的靶向位点是保守的，均包含“GGGATATTGGCGCGGCTCAA”的序列，因此，可以理解的是，miR171a、miR171b、miR171c均能够靶向于HAM1，HAM2，HAM3来发挥下调后者(HAM1，HAM2，HAM3)的作用。

本发明中，还包括具有与所示多肽具有相同功能的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。本发明还提供所述多肽的类似物。这些类似物与天然多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。编码HAM的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。编码HAM成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

本发明提供了一种提高植物再生能力的方法，包括：下调植物中HAM或其同源物。

本发明中，所述的植物再生包括芽再生、根再生、细胞胚再生等。并且，所述的植物再生包括植物外植体为基础的再生、植物愈伤组织为基础的再生等。

根据本发明的解释，在得知了所述的HAM对于植物再生能力的调控机制后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低HAM的表达或使之缺失表达，比如将携带反义HAM基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达HAM蛋白；或将HAM基因进行敲除。

作为本发明的一种实施方式，可通过敲除HAM基因，从而下调植物中HAM基因的表达。

作为本发明的一种实施方式，可采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除HAM基因，提高植物再生能力。合适的sgRNA靶位点，会带来更高的基因编辑效率，所以在着手进行基因编辑前，设计并找到合适的靶位点较为重要。在设计特异性靶位点后，还需要进行体外细胞活性筛选，以获得有效的靶位点用于后续实验。

作为本发明的一种实施方式，可采用病毒诱导的基因沉默(VIGS)抑制HAM，从而提高植物再生能力。

应理解，本领域技术人员在得知了HAM与植物性状的相关性以后，可以以各种途径制备出下调HAM的分子，从而用于调控植物性状。所述的干扰分子可通过转基因技术被输送到植物体内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到植物体内。

作为本发明的一种优选实施方式，利用以HAM的编码基因或其转录本为抑制或沉默靶标的微小RNA来下调HAM，从而提高植物再生能力。该微小RNA为miR171。本发明也包括miR171同源基因，也包括miRNA171或其同源基因的编码基因或前体基因。本发明也包括miR171的类似物或衍生物，以及它们的编码基因或前体基因。

如本文所用，miRNA171的“同源基因”包括在多个物种中miRNA171的同源基因，它们与拟南芥中的miRNA171的序列相同、基本相同或具有同源性，并且它们也具有靶向HAM的性能。同时，这些“同源基因”的编码基因或前体基因也涵盖在本发明中。

根据本发明所提供的信息，可设计出在被导入后可被加工成可提高相应的miRNA171或其同源基因表达的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的miRNA171或其同源基因的量。例如，制备一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被植物细胞转录成前体miRNA171，所述的前体miRNA171可被宿主(如植物细胞)剪切且表达成所述的miRNA171。

通常，所述的多核苷酸构建位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的miRNA171，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起始点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

本发明还涉及利用HAM和/或miRNA171作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用HAM和/或miRNA171作为一种分子标记，通过检测植物中HAM和/或miRNA171的表达情况，确定植物的再生能力。

应理解，虽然本发明的HAM和/或miRNA171优选获自拟南芥，但是获自其它植物的与拟南芥HAM和/或miRNA171高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

在得知了miR171靶向于HAM后，通过已知HAM促进植物再生能力及其分子机制以后，可基于该新发现来筛选通过调节HAM和/或miR171，从而定向调控植物再生能力的物质或潜在物质。

因此，本发明提供了一种筛选提高植物再生能力的试剂的方法，所述方法包括：(1)将候选物质加入到含有HAM的体系中；(2)观测(1)的体系中HAM的表达或活性；若所述候选物质抑制HAM的表达或活性，则表明该候选物质是提高植物再生能力的试剂；所述的HAM包括其同源物。

本发明还提供了一种筛选提高植物再生能力的试剂的方法，所述方法包括：(1)将候选物质加入到含有miR171或其同源基因、或它们的前体的体系中；(2)观测(1)的体系中miR171或其同源基因、或它们的前体的表达或活性；若所述候选物质提高miR171或其同源基因、或它们的前体的表达或活性，则表明该候选物质是提高植物再生能力的试剂。

以蛋白或其上特定的区域作为靶点，来筛选作用于该靶点的物质的方法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列等。根据待筛选的物质的种类，本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

1、植物材料与载体构建

拟南芥Col-0生态型用作拟南芥野生型。

ham1(FLAG_239F03)ham2(SALK_150134)ham3(CS100299))三突变体材料参见Wanget al.，Mol Plant，2010(vol3)。

拟南芥miR171a成熟序列：TTGAGCCGCGCCAATATCTCA(SEQ ID NO:7)；

拟南芥miR171b或miR171c成熟序列：TTGAGCCGTGCCAATATCACG(SEQ ID NO:8)。

mir171a，mir171b和mir171a mir171b双突变体材料的构建：CRISPR/cas9系统(Mao et al.，Plant Biotech J，2016(vol 2)，同时靶标miR171a，miR171b，miR171c成熟序列对应的颈环序列，目的是删除相对应的颈环序列，破坏成熟miRNA的功能。最后只得到mir171a mir171b双突变体材料，连续回交两次，最终得到mir171a，mir171b和mir171amir171b突变体材料。

pHB-MIR171C载体构建：用PCR扩增拟南芥MIR171C的片段，克隆到pBSK载体的BamHI和Xba I位点之间。测序确认序列无误后，将MIR171C的片段用BamH I和Xba I切出，克隆到双元载体pHB载体中。该载体带有2x35S启动子。MIR171C的片段的基因序列如SEQ ID NO:9(其中第497～517位为miR171c成熟序列相应位点)。

p35S-MIR171A载体构建：用PCR扩增拟南芥MIR171A的片段，使用同源重组酶克隆到双元载体JW807表达载体Kpn I和Spe I之间，测序确认序列无误后用于后续实验。MIR171A的片段的基因序列如SEQ ID NO:10(其中第591～611位为miR171a成熟序列相应位点)。

p35S-MIR171B载体构建：用PCR扩增拟南芥MIR171B的片段，使用同源重组酶克隆到双元载体JW807表达载体(Tian-Qi,Zhang et al,The Plant Cell,Vol 27:349-360,Feb,2015)Kpn I和Spe I之间，测序确认序列无误后用于后续实验。MIR171B的片段的基因序列如SEQ ID NO:11(其中第522～542位为miR171b成熟序列相应位点)。

pER8-MIR171C载体构建：用PCR扩增拟南芥MIR171C的片段，克隆到pBSK载体的XhoI和Spe I位点之间。测序确认序列无误后，将MIR171C的片段用Xho I和Spe I切出，克隆到pER8载体(Zuo et al.，Plant J，2000(Volume 24,Issue 2))。pHB-MIR171A或pHB-MIR171B载体的构建也类同。

pHB-GFP-rHAM1和pHB-GFP-rHAM3载体的构建：用PCR扩增获得GFP的全长序列，克隆入pBSK载体的Pst I和Spe I位点之间，得到中间载体命名为pBS-GFP。rHAM1和rHAM3是抗miR171的突变体形式，在其编码区的miR171识别位点进行定点突变，保持编码的氨基酸序列不变，构建方法采用融合PCR的方法。将rHAM1(SEQ ID NO:12)和rHAM3(如SEQ ID NO:13)全长序列克隆入pBSK的Spe I和Xba I位点之间，获得pBSK-GFP-rHAM1和pBSK-GFP-rHAM3载体；将经测序后，GFP-rHAM1和GFP-rHAM3片段载体用PstI和Xba I切出，克隆到pHB载体的PstI和Xba I位点之间，最终获得pHB-GFP-rHAM1和pHB-GFP-rHAM3表达载体。

2、拟南芥转化和筛选

(1)转化之前需要提前种植植物至开花，长日照条件大约生长30天。

(2)挑取1-2个农杆菌至5mL抗性LB中，28℃摇菌过夜。

(3)取700μL农杆菌加入300μL 50％甘油，-80℃保存菌种。按1:100比例大摇菌农杆菌，28℃过夜培养。

(4)一般菌液颜色呈现橘黄色，表明农杆菌菌量已适宜转化。

(5)收集菌液，4000rpm，室温离心15min。同时配制农杆菌转化溶液(InfiltrationBuffer)：1L体系加入50g蔗糖和300μL silwet-77。

(6)弃上清，用Infiltration Buffer悬浮沉淀菌体。

(7)将拟南芥花序完全浸润在Infiltration Buffer中，大约1min之后，用吸水纸尽量吸干花序之外的菌液。

(8)温室，黑暗放置一天、第二天扶正植物即可。

(9)植物转基因的筛选一般有Basta，Kan和Hygro三种抗性标记，Basta的T0植物用1‰的Agrose悬浮之后，均匀种植在0.05％Basta土壤中。而Kan和Hygro的T0植物，无菌处理之后，涂布在含有50μg/mL Kan或40μg/mL Hygro抗性1/2MS培养基上。基因表达分析。

3、拟南芥再生芽再生实验

(1)：用20％漂水(加入一滴Triton)溶液无菌化处理种子，4℃低温处理2天。

(2)：将灭菌种子，点在含1/2MS培养基的方皿上。22℃黑暗条件下培养下胚轴7天。

(3)：配制CIM培养基，MS固体培养基中含2.2μM 2,4-dichlorophenoxyaceticacid(2,4-D)，0.2μM kinetin。

(4)：截取下胚轴组织，并置于CIM培养基中，22℃培养7天。

(5)：配制SIM培养基，MS固体培养基中含5.0μM 2-isopentenyladenine(2-IP)，0.9μM indole-3-acetic acid(IAA)。

(6)：将CIM培养7天的外植体愈伤组织移植到SIM培养基中，22℃诱导芽的分化，一般7-10天开始可见，21-30天统计再生能力。

4、拟南芥根再生实验

(1)用20％漂水(加入一滴Triton)溶液无菌化处理种子，4℃低温处理2天。

(2)将灭菌种子点在含1/2MS培养基的圆皿上。长日照条件生长16天。

(3)剪取第一片莲座叶，放置(伤口方向一致)于含B5培养基的方皿，光下垂直(伤口朝下)培养16天，每隔2天统计不定根再生事件。

5、拟南芥体细胞胚发生实验

(1)选取拟南芥后期果荚适量，加入1ml消毒液(2％次氯酸钠，0.1％Triton X-100)慢速旋转18min，无菌水冲洗5次。

(2)用1ml带针头注射器剖取子叶期绿色不成熟胚，置于含E5培养基(0.8％agar，5μM 2,4-D)的培养皿，每皿大约放置12个胚，光下培养15天。

(3)将经过E5培养基诱导的胚转移至MS培养基，光下培养10天，显微镜下考察体细胞胚发生数量，或者培养20天左右，统计小苗数量。

6、甜菜、烟草的遗传转化

(1)转基因甜菜的制备

70s::tDT表达载体构建：以70s启动子替换JW807表达载体中的35S启动子，将报告基因tDT(WO2019134884A1)插入到70s启动子之后，使用70s启动子驱动报告基因tDT的表达。

70s::miR171C表达载体构建：以70s启动子替换JW807表达载体中的35S启动子，使用70s启动子驱动miR171C(拟南芥来源，SEQ ID NO:9)的表达。

通过农杆菌侵染甜菜愈伤组织，通过愈伤组织芽从头再生的方式再生出转基因植株。甜菜转化及测定方法还可参见WO2019134884A1。

(2)转基因烟草的制备

构建载体35s::AtrHAM1-3xFLAG(用于过表达rHAM1)，其中AtrHAM1序列如SEQ IDNO:12。

将上述片段插入到JW807表达载体的35S启动子之后，获得35s::AtrHAM1-3xFLAG。

构建载体pRIBO::MIM171a(用于沉默miR171)：

AtIPS1(SEQ ID NO:14；MIM171a序列包含其中)：

caaacaccacaaaaacaaaagaaaaatggccatcccctagctaggtgaagaagaatgaaaacctctaatttatctagaggttattcatcttttaggggatggcctaaatacaaaatgaaaactctctagttaagtggttttgtgttcatgtaaggaaagcgttttaagatatggagcaatgaagactgcagaaggctgattcagactgcgagttttgtttatctccctctagaaagatattggcgtaaaggctcaatcaagcttcggttcccctcggaatcagcagattatgtatctttaattttgtaatactctctctcttctctatgctttgtttttcttcattatgtttgggttgtacccactcccgcgcgttgtgtgttctttgtgtgaggaataaaaaaatattcggatttgagaactaaaactagagtagttttattgatattcttgtttttcatttagtatctaataagtttggagaatagtcagaccagtgcatgtaaatttgcttccgattctctttatagtgaattcctctt

以RIBO启动子替换JW807表达载体中的35S启动子，将上述片段插入到的pRIBO启动子之后，获得pRIBO::MIM171a。RIBO启动子序列如下(SEQ ID NO:15)：cgtaggcattaacccgtttgtggtttttttctttgctaaatttattagtcattttctcttttaaatattttgttgtagttggggtggggtgggagactttttccctcaagtcaacgtaaaatgttgatcgatgatcttgagaggattagctagttaacttctaaaactttattggttaagatcaatcaagaatcctcaatagttttggtggtttgtgctaacgatgtttatgtgttatcatcgttcgagttaaaatccgcgtaatatataatgttgttttataaaaaaaattagtacatgaatggtccaacaattcataactcacgttcttaacctaatttgtgactaagactaactaatcatgtgtaaacagctttctatttcttcgaaaaatttagaattacaaagacatagtttcgtatgacaaagtatcacggtgtccatcatttgacaaaagtaatgatagaaatattacttagcatctttataaaagtaatactttctcttttactaagatacaggttacgagattaatcataaaacactcgagtcataaaacaatttgttttgttttctttcaacacaaaagttttgctatacgtgtattcaatatttatttgtcggtgtgtcaatcaccgtaatttgactcatttccttttacatgtagacgtagcaagtagtatttcaaaagattttatgtgtatatatcaattatattgagtcagatttttgtgatggatcattatggtcctaccaaccagagtccctacatatacttgtatctgtgcgaatttatagttgttacctaagctacaaaaaaaattgaagagatcttccgtaatatagatgaactaatttgatgtcccattatgtttctcgtaaaagaagaaatacatgtgtatttgacaagatggtacatagaccgctaaaccatcatgtcctaacaaagtagattggtatcatttgcaaaatatgtcacttaacattaatgttcttcattccttaataccagtctacttgatgagtctctcctctttttgatgagctagtctcgcactttttttcatctctaacttttgtattttatgaaatgttcatagactttattcaaggcacattactatcatatatctggatttaaattgccataccgtattcacgagacaatttatatgtaataacaatttaaaaaatgcattgtctgctcagaagctagcttgcccatattgtgtgttcttctaacaattttttattgtttcttctgagggtttttgcattaaatatgttattgttgacatcatagatgctagtggatatatcatcgacgacgaactcgagttgcttaataattatttccagtttcatacatcatcatcatattatagaacatatacctttatcatatgtatctcaaaaatctataatcagcttgatattaacttattctaaagttcaaatcagttttaacttttaagaaaatattatgagttttctaatttgattcggttttcgccgggttaacctgaaatcggaatctggattggacaaagtacaaaccgtgggttagtattagtaacatccaatttgggcttgcccgtatttgtctgctcagaagctagcttgcccatattatgtgttctccaaagaattgtttattgttattttggagagggtttttgcattaaatatgttcttgtgttgacattattgattattagatgctagtgatataccatcaccaaaattagaattgcattatcatcattttatatatcaatctatatatttatcatatgactcagactatcatgagacgcattttttttaagtattatgaataatataccacttgttcacgttttaacgtttgaaaaacatgattttgctactttttacgattcaaagtatttattaagaatttacgttcttgaaaagtgattatactgtatatataactataagtaaataaaacttttttcgacgaaatttctgatgataaataaaaggtcggatatatttgactttttttttttttttaattattttttgacgataaatttttcgttgaaaaatcatcgaaattttcgacggattccaatgatcaaaaattcgtcaataatttccaacgatattctgactaaactaaatctgatgaaatatttttgacggctttccaaccaaaatatttcgttgtgacttgtcaaaaatccgttagaatactaagcaacttttcgacagattttcagcaaaaatattcggtaatataacgtgttaaaaatatgataaaaaaaaaaacttgatgaatctactaaaactaaattttcaatcatatatatctattattcatatatttcattcattttattatttttctcttaacaattatttagttattctggtatcgtgtaattatattcatatgatttattctgatattgattcggttagcatccggataaatctgggttgggctttttaacttggtttttctaagaaaaattctaatatgatttggttagcatccggattagtctagtttggtaggcctgcctttgtgattcttaactcggtcttttgtatgggtttgaacaattactacaccatttagattcttctgacccatatcaaataaagatccacttaggcccattagggttagaacaaacatgaggttgcagaataaaaagggttcattttcctcactctcaagttggatctcaaaaccctaatatctgaacttcgccgtcgagagcatcc

构建载体35s::AtMIR171B(用于上调miR171)：

将MIR171B(SEQ ID NO:11，拟南芥来源，即AtMIR171B)插入到JW807表达载体的35S启动子之后，获得35s::AtMIR171B。

载体构建完成后，利用烟草叶盘法转基因，拿到T2转基因植株。

6、再生率的统计分析

拟南芥的芽再生率：由每个处理组合中再生芽的总数除以外植体数目表征。

拟南芥的不定根再生率：由每个处理组合中再生出的不定根的总数除以外植体数目表征。

拟南芥的体细胞胚发生能力：由每个外植体(胚性愈伤组织)所再生出的体细胞胚数目表征。

实施例1、miR171及其靶基因HAM在所有植物中都保守

miR171的靶标基因是GRAS类转录因子，在拟南芥基因组中包括三个基因，分别是HAM1、HAM2和HAM3。

进化分析表明，miR171在所有陆生植物中保守，广泛存在于苔藓植物、蕨类植物、裸子植物和被子植物中，如图1。

同时，本发明人利用NCBI网站蛋白质序列“blast”功能(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastp&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome)，检索拟南芥中HAM3的全长蛋白序列，得到若干不同物种中与拟南芥HAM3蛋白序列高度同源的蛋白质序列，将得到的序列信息通过MAFFT软件(https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/)分析后得到了同源性信息，后截取了部分同源性信息展示如图2，其中图中黑框突出显示不同物种植物中被miR171所识别并剪切的核苷酸位点所对应的蛋白质序列，可以看到蛋白质高度保守。而且可以在这些物种中找到miR171的靶向序列。以上各图分别展示了不同植物中HAM同源蛋白部分序列的比对信息。综上可以得出结论，HAM在大部分陆生植物中都存在同源蛋白，而且被miR171所识别的位点高度保守。也即，miR171靶向于HAM这一机制在植物中高度保守。

实施例2、miR171调控拟南芥芽再生能力

拟南芥基因组中miR171共有三个编码基因，MIR171A、MIR171B、MIR171C；它们的编码产物即成熟序列分别为miR171a、miR171b、miR171c，其中miR171b与miR171c成熟序列相同。本发明人分别制备了mir171a，mir171b和mir171ab突变体，考察突变体的芽再生能力。

结果如图3所示，mir171b和mir171a b芽再生能力显著降低，提示miR171主要参与了芽再生能力的调控。

实施例3、过量表达miR171或失活突变HAM显著提高拟南芥的再生率

HAM为miR171在植物体内的唯一靶点，且其或其同源基因在各种植物中均保守存在。根据已有的数据显示，miR171可以剪切它的靶基因HAM1，HAM2和HAM3。所以在过表达miR171的植物中，HAM1，HAM2和HAM3的mRNA水平会显著的降低(Wang et al.，Mol Plant，2010vol3.和Llave,C.et al.，Science，2002.vol 297)。根据前述实施例2可见miR171通过靶向其唯一靶点HAM发挥了调控再生的功能。本发明人进一步研究过量表达miR171以及下调HAM的拟南芥的芽再生情况。

本发明人构建了拟南芥MIR171C过量表达植物(MIR171C-OX，将pHB-MIR171C载体转入拟南芥Col-0生态型而获得)，ham1 ham2 ham3三突变体和过量表达HAM1和HAM3的植物(35S::rHAM1和35S::rHAM3)。以下胚轴为外植体测试芽再生率。

如图4，结果显示，与野生型相比，MIR171C-OX和ham1 ham2 ham3三突变体的芽再生能力显著增强，而35S::rHAM1和35S::rHAM3的芽再生能力显著降低。提示HAM是植物细胞全能性的抑制因子，负调控芽再生率。

植物的愈伤组织可以来源于不同的植物器官和组织。常用的有植物的下胚轴、子叶、根和叶片。本发明人进一步研究miR171过量表达是否可以提高其它来源外植体的再生率，考察野生型(Col-0生态型)和MIR171C-OX植物材料根和叶片来源的愈伤组织再生芽的能力。结果如图5所示，两种植物材料根来源的愈伤再生芽能力都很强，而野生型叶片来源的愈伤芽再生能力远远低于MIR171C-OX材料叶片来源的愈伤。

实施例4、miR171-HAM途径促进芽再生标志基因的表达

1、WUS和CLV3在野生型和过量表达miR171植物中的表达模式

为了在分子水平验证miR171过量表达可以提高芽再生率，选取野生型和MIR171C-OX为材料，在SIM培养基上培养2小时至96小时的时间段内，用定量PCR的方法考察WUS和CLV3的表达量。

结果显示，与野生型相比，WUS和CLV3的表达均提前，这与MIR171C-OX芽再生能力提高相吻合，如图6所示。

2、靶向HAM放大芽建立的标志基因CUC信号途径

本发明人分析了拟南芥野生型Col-0及MIR171C-OX材料在芽从头再生过程中，芽再生标志基因CUC1和CUC2的表达量变化趋势。结果如图12，显示过量表达miR171可以通过靶向下调HAM，直接或间接放大芽建立的标志基因CUC信号途径。

实施例5、诱导表达miR171显著下调HAM的表达水平

为了考察miR171c诱导表达的作用，本发明人构建了诱导表达型载体PER8-MIR171C。该载体中miR171c可以被雌二醇(Estradiol，ES)诱导表达。将PER8-MIR171C转入拟南芥，获得转基因植株。

将获得的转基因PER8-MIR171C植物在SIM培养基上培养，以5微摩尔雌二醇/DMSO诱导处理该植物材料后，定量PCR分析pri-mir171c和HAM2的表达量变化；结果如图13，显示PER8-MIR171C植物中HAM2的mRNA水平被显著降低。

实施例6、诱导表达miR171同样能够提高植物芽再生率

为了考察miR171c在CIM时期的作用，取诱导表达型转基因PER8-MIR171C植物的外植体(下胚轴)分别置于CIM(10μM ES)和CIM(10μM DMSO)上培养7天，后转移至不含有ES的SIM上培养24天，考察芽从头再生能力。如图7所示，在CIM时期诱导表达MIR171C就可以显著促进拟南芥芽从头再生能力。

一般而言，拟南芥中外植体通过愈伤组织培养，可以大大提高细胞全能性和芽再生率，不经历愈伤组织培养阶段的外植体芽再生率极低。那么miR171高表达是否可以绕过愈伤组织培养阶段直接提高外植体的芽再生率呢？为此，本发明人选取在1/2MS上垂直培养7天的拟南芥幼苗根作为外植体，将PER8-MIR171C与野生型(WT)的根为外植体(1cm长)，直接置于含有DMSO(20μM，对照组)或ES(20μM，实验组)的SIM培养基上，考察芽再生能力。如图8所示，在SIM上诱导表达MIR171C可以直接显著增强外植体的芽再生能力，且外植体不需要再经历愈伤组织培养阶段。

实施例7、诱导表达miR171能够提高植物体细胞胚再生率

利用PER8-MIR171C材料进一步考察MIR171C对拟南芥体细胞胚发生能力的作用。

拟南芥体细胞胚发生实验结果如图9所示，诱导表达MIR171C可以提高拟南芥体细胞胚发生的能力。

实施例8、过量或诱导表达miR171能够提高植物根再生率

考察miR171c在不定根发生过程中的作用，使用野生型(Col-0)，MIR171C-OX(组成型表达)和PER8-MIR171C(诱导型表达)材料在1/2MS上生长12天后取第一片莲座叶分别转移到B5和含有20μM DMSO或20μM ES的B5培养基上，培养16天考察不定根发生能力。

结果如图10所示，诱导MIR171C高表达后不定根从头发生能力得以增强，且不定根发生速率较快。

实施例9、miR171-HAM途径促进高细胞分裂素条件下的再生

为了考察生长素和细胞分裂素在miR171c促进再生过程中的作用，本发明人分析了拟南芥野生型Col-0及MIR171C-OX材料在高生长素条件下(CIM)或高细胞分裂素条件下(SIM)，芽再生标志基因WUS和CLV3的表达量变化。结果如图11，在高细胞分裂素条件下(SIM)，MIR171C-OX植物中的WUS和CLV3基因表达量显著增加，提示miR171-HAM途径促进高细胞分裂素条件下的再生。

高等植物的再生一般通过两种途径：体细胞发生和器官从头再生。双子叶植物的再生一般选取幼苗的各个组织，例如子叶、根或下胚轴。这些外植体在高细胞分裂素的条件下通过器官从头再生通路实现再生。与双子叶植物不同，单子叶植物在胚后再生能力丧失，因此单子叶植物一般都选取幼胚作为外植体，通过体细胞胚通路实现再生，在此过程中高浓度的生长素是至关重要的。

上述实验结果表明，miR171-HAM途径在高细胞分裂素介导的器官从头再生过程中发挥作用，起到提高再生率的效果。因此可以推断，miR171-HAM途径可有效促进双子叶植物的再生。

实施例10、过量表达miR171可以提高甜菜和烟草的再生率

1、过表达miR171C提高甜菜的转基因效率

本发明人测定了miR171C(拟南芥来源)对双子叶经济作物甜菜(Sugar beet)进行农杆菌介导的转基因效率的影响。利用甜菜中遍在表达启动子驱动miR171C或tDT的质粒进行农杆菌介导的愈伤组织转化实验，或者混合两种菌液进行共转化，随后进行植物抗性筛选，获得阳性转基因植株，统计转化效率(Transformation rate)。测定方法参见WO2019134884A1。

甜菜的转化操作是通过农杆菌侵染甜菜愈伤组织(即转基因)，通过愈伤组织芽从头再生的方式再生出转基因植株。由于农杆菌侵染的效率非常高，而芽再生率相对很低，是转化的限制性因素，因此最终的转化效率即直接反映了再生率，亦即愈伤组织的再生能力。

结果如图14，与对照相比，转化过表达miR171C的质粒或者共转过表达miR171C的质粒，可以显著提高甜菜的转化效率，即提高了甜菜的再生效率，说明过表达miR171C可以提高甜菜的再生能力。

2、过表达HAM、miR171C或下调表达miR171C对于双子叶植物烟草的作用

利用烟草叶盘法转基因，本发明获得了T2代烟草转基因植株，剪取叶片为小块(0.5cm×0.5cm)，放置MS0培养2天，随后转移至MS1培养，等待芽长出后，统计每块外植体再生芽的数量，并与野生型烟草进行比较。结果发现，过表达MIR171A/B可以提高转基因烟草的芽再生数目，而过表达rHAM1和过表达MIM171a会减少转基因烟草的芽再生数目。

实施例11、筛选方法

设置：

测试组：拟南芥细胞系(其中内源表达HAM)，并给予候选物质；

对照组：拟南芥细胞系(其中内源表达HAM)，不给予候选物质。

分别检测测试组和对照组中HAM的表达情况，并进行比较。如果测试组中HAM的表达在统计学上低于(如低30％以上)对照组，则表明该候选物质是提高植物再生能力的试剂。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 提高植物再生能力的靶基因、调控分子及其应用

<130> 187448Z1

<150> 201811440852.7

<151> 2018-11-29

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 640

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

Met Pro Leu Ser Phe Glu Arg Phe Gln Gly Glu Gly Val Phe Gly Leu

1 5 10 15

Ser Ser Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Ser Gln Lys Ile Trp Ser Asn Gln

20 25 30

Asp Lys Thr Glu Ala Lys Gln Glu Asp Leu Gly Tyr Val Val Gly Gly

35 40 45

Phe Leu Pro Glu Pro Thr Ser Val Leu Asp Ala Leu Arg Ser Pro Ser

50 55 60

Pro Leu Ala Ser Tyr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Leu Ser Ser Ser His

65 70 75 80

Gly Gly Gly Gly Thr Thr Val Thr Asn Thr Thr Val Thr Ala Gly Asp

85 90 95

Asp Asn Asn Asn Asn Lys Cys Ser Gln Met Gly Leu Asp Asp Leu Asp

100 105 110

Gly Val Leu Ser Ala Ser Ser Pro Gly Gln Glu Gln Ser Ile Leu Arg

115 120 125

Leu Ile Met Asp Pro Gly Ser Ala Phe Gly Val Phe Asp Pro Gly Phe

130 135 140

Gly Phe Gly Ser Gly Ser Gly Pro Val Ser Ala Pro Val Ser Asp Asn

145 150 155 160

Ser Asn Leu Leu Cys Asn Phe Pro Phe Gln Glu Ile Thr Asn Pro Ala

165 170 175

Glu Ala Leu Ile Asn Pro Ser Asn His Cys Leu Phe Tyr Asn Pro Pro

180 185 190

Leu Ser Pro Pro Ala Lys Arg Phe Asn Ser Gly Ser Leu His Gln Pro

195 200 205

Val Phe Pro Leu Ser Asp Pro Asp Pro Gly His Asp Pro Val Arg Arg

210 215 220

Gln His Gln Phe Gln Phe Pro Phe Tyr His Asn Asn Gln Gln Gln Gln

225 230 235 240

Phe Pro Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ala Val Ala Met Val Pro Val Pro

245 250 255

Ser Pro Gly Met Ala Gly Asp Asp Gln Ser Val Ile Ile Glu Gln Leu

260 265 270

Phe Asn Ala Ala Glu Leu Ile Gly Thr Thr Gly Asn Asn Asn Gly Asp

275 280 285

His Thr Val Leu Ala Gln Gly Ile Leu Ala Arg Leu Asn His His Leu

290 295 300

Asn Thr Ser Ser Asn His Lys Ser Pro Phe Gln Arg Ala Ala Ser His

305 310 315 320

Ile Ala Glu Ala Leu Leu Ser Leu Ile His Asn Glu Ser Ser Pro Pro

325 330 335

Leu Ile Thr Pro Glu Asn Leu Ile Leu Arg Ile Ala Ala Tyr Arg Ser

340 345 350

Phe Ser Glu Thr Ser Pro Phe Leu Gln Phe Val Asn Phe Thr Ala Asn

355 360 365

Gln Ser Ile Leu Glu Ser Cys Asn Glu Ser Gly Phe Asp Arg Ile His

370 375 380

Ile Ile Asp Phe Asp Val Gly Tyr Gly Gly Gln Trp Ser Ser Leu Met

385 390 395 400

Gln Glu Leu Ala Ser Gly Val Gly Gly Arg Arg Arg Asn Arg Ala Ser

405 410 415

Ser Leu Lys Leu Thr Val Phe Ala Pro Pro Pro Ser Thr Val Ser Asp

420 425 430

Glu Phe Glu Leu Arg Phe Thr Glu Glu Asn Leu Lys Thr Phe Ala Gly

435 440 445

Glu Val Lys Ile Pro Phe Glu Ile Glu Leu Leu Ser Val Glu Leu Leu

450 455 460

Leu Asn Pro Ala Tyr Trp Pro Leu Ser Leu Arg Ser Ser Glu Lys Glu

465 470 475 480

Ala Ile Ala Val Asn Leu Pro Val Asn Ser Val Ala Ser Gly Tyr Leu

485 490 495

Pro Leu Ile Leu Arg Phe Leu Lys Gln Leu Ser Pro Asn Ile Val Val

500 505 510

Cys Ser Asp Arg Gly Cys Asp Arg Asn Asp Ala Pro Phe Pro Asn Ala

515 520 525

Val Ile His Ser Leu Gln Tyr His Thr Ser Leu Leu Glu Ser Leu Asp

530 535 540

Ala Asn Gln Asn Gln Asp Asp Ser Ser Ile Glu Arg Phe Trp Val Gln

545 550 555 560

Pro Ser Ile Glu Lys Leu Leu Met Lys Arg His Arg Trp Ile Glu Arg

565 570 575

Ser Pro Pro Trp Arg Ile Leu Phe Thr Gln Cys Gly Phe Ser Pro Ala

580 585 590

Ser Leu Ser Gln Met Ala Glu Ala Gln Ala Glu Cys Leu Leu Gln Arg

595 600 605

Asn Pro Val Arg Gly Phe His Val Glu Lys Arg Gln Ser Ser Leu Val

610 615 620

Met Cys Trp Gln Arg Lys Glu Leu Val Thr Val Ser Ala Trp Lys Cys

625 630 635 640

<210> 2

<211> 1923

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 2

atgcccttat cctttgaaag gtttcaaggg gagggggtgt ttggtttatc ttcttcttct 60

ttctattcag attctcagaa aatctggtcc aatcaagaca aaaccgaagc aaaacaagaa 120

gatcttggtt atgttgtcgg tggtttttta ccggagccga cgtctgttct cgacgctcta 180

agaagtccta gtcctctcgc ttcttattct tctaccacca ccacgctgtc ttcctctcac 240

ggcggcggtg gtaccaccgt caccaacacc accgtaaccg ccggtgatga taacaataac 300

aataaatgta gtcagatggg tttggatgat cttgacggtg ttctctctgc ttcttctcct 360

ggtcaagagc agagtatctt gagacttatc atggacccgg gttctgcctt cggtgttttc 420

gacccgggtt tcggattcgg gtctggttcc gggcctgtgt ctgctccggt gagtgataat 480

tcgaatcttc tgtgtaactt cccgtttcaa gagattacga atccagcaga agctttgatc 540

aatccttcaa atcattgcct gttctataat cctccgttat ctccaccggc taaacggttt 600

aattccggat ctcttcatca acccgttttc cctttatcgg atccggatcc gggtcacgac 660

ccggttcgtc gtcaacatca gtttcagttt ccgttttatc acaacaacca gcaacaacaa 720

ttcccgtcgt cttcttcttc cacggcggtg gctatggttc cggttccgtc gccgggaatg 780

gccggcgatg accagtcagt catcatcgag cagctgttca acgcggcgga gctaatcgga 840

accaccggaa acaacaacgg cgaccacacc gttctcgcgc aagggatatt ggcgcggctc 900

aatcaccatc tcaacactag tagtaaccac aagtctccgt ttcaaagagc agcttctcac 960

atcgctgaag ctctcctctc actcatccac aacgaatcat caccaccgtt aatcacgccg 1020

gagaatctga ttctccgaat cgccgcttac agatccttct ccgaaacctc gccgtttctc 1080

caattcgtta acttcacagc gaatcaatcg attcttgagt cctgcaacga atcagggttt 1140

gatcggatcc acattatcga tttcgacgtt ggatatggag gacaatggtc gtctctaatg 1200

caagaactcg cttccggagt tggaggaaga agaagaaaca gagcatcgtc tctgaaatta 1260

acagtctttg ctcctccacc ttctacagtc tccgacgagt tcgagcttcg tttcacagag 1320

gaaaatctca aaacattcgc cggagaagtc aagattcctt tcgaaatcga gttactaagc 1380

gtagagcttc ttctaaaccc agcttattgg ccactctctc tacgttcatc ggaaaaagaa 1440

gcaatcgcag tgaatcttcc agtaaactcc gtcgcctccg gttaccttcc gttaatcctc 1500

cgattcctta aacaactatc accaaacatc gtcgtttgct cagacagagg atgtgaccgt 1560

aacgacgcgc cgtttccaaa cgcagtgatt cattcgcttc aataccacac ttctctgctt 1620

gagtctcttg atgctaatca gaaccaggac gattcgagta tcgagaggtt ttgggttcaa 1680

ccatcgatag agaagctgtt gatgaaacga caccgttgga ttgaaagatc tccaccgtgg 1740

agaatcttgt ttacacaatg tgggttttct ccggcgagtt tgagtcagat ggcggaagct 1800

caggcggagt gtttgttgca gagaaatccg gtgagagggt ttcacgttga gaaaaggcag 1860

tcttcacttg tcatgtgttg gcaaaggaaa gaacttgtta ctgtctctgc ttggaaatgt 1920

tag 1923

<210> 3

<211> 623

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 3

Met Pro Leu Pro Phe Glu Gln Phe Gln Gly Lys Gly Val Leu Gly Phe

1 5 10 15

Leu Asp Ser Ser Ser Ser Pro Gly Tyr Lys Ile Trp Ala Asn Pro Glu

20 25 30

Lys Leu His Gly Arg Val Glu Glu Asp Leu Cys Phe Val Val Asn Asn

35 40 45

Gly Gly Phe Ser Glu Pro Thr Ser Val Leu Asp Ser Val Arg Ser Pro

50 55 60

Ser Pro Phe Val Ser Ser Ser Thr Thr Thr Leu Ser Ser Ser His Gly

65 70 75 80

Gly Pro Ser Gly Gly Gly Ala Ala Ala Ala Thr Phe Ser Gly Ala Asp

85 90 95

Gly Lys Cys Asp Gln Met Gly Phe Glu Asp Leu Asp Gly Val Leu Ser

100 105 110

Gly Gly Ser Pro Gly Gln Glu Gln Ser Ile Phe Arg Leu Ile Met Ala

115 120 125

Gly Asp Val Val Asp Pro Gly Ser Glu Phe Val Gly Phe Asp Ile Gly

130 135 140

Ser Gly Ser Asp Pro Val Ile Asp Asn Pro Asn Pro Leu Phe Gly Tyr

145 150 155 160

Gly Phe Pro Phe Gln Asn Ala Pro Glu Glu Glu Lys Phe Gln Ile Ser

165 170 175

Ile Asn Pro Asn Pro Gly Phe Phe Ser Asp Pro Pro Ser Ser Pro Pro

180 185 190

Ala Lys Arg Leu Asn Ser Gly Gln Pro Gly Ser Gln His Leu Gln Trp

195 200 205

Val Phe Pro Phe Ser Asp Pro Gly His Glu Ser His Asp Pro Phe Leu

210 215 220

Thr Pro Pro Lys Ile Ala Gly Glu Asp Gln Asn Asp Gln Asp Gln Ser

225 230 235 240

Ala Val Ile Ile Asp Gln Leu Phe Ser Ala Ala Ala Glu Leu Thr Thr

245 250 255

Asn Gly Gly Asp Asn Asn Pro Val Leu Ala Gln Gly Ile Leu Ala Arg

260 265 270

Leu Asn His Asn Leu Asn Asn Asn Asn Asp Asp Thr Asn Asn Asn Pro

275 280 285

Lys Pro Pro Phe His Arg Ala Ala Ser Tyr Ile Thr Glu Ala Leu His

290 295 300

Ser Leu Leu Gln Asp Ser Ser Leu Ser Pro Pro Ser Leu Ser Pro Pro

305 310 315 320

Gln Asn Leu Ile Phe Arg Ile Ala Ala Tyr Arg Ala Phe Ser Glu Thr

325 330 335

Ser Pro Phe Leu Gln Phe Val Asn Phe Thr Ala Asn Gln Thr Ile Leu

340 345 350

Glu Ser Phe Glu Gly Phe Asp Arg Ile His Ile Val Asp Phe Asp Ile

355 360 365

Gly Tyr Gly Gly Gln Trp Ala Ser Leu Ile Gln Glu Leu Ala Gly Lys

370 375 380

Arg Asn Arg Ser Ser Ser Ala Pro Ser Leu Lys Ile Thr Ala Phe Ala

385 390 395 400

Ser Pro Ser Thr Val Ser Asp Glu Phe Glu Leu Arg Phe Thr Glu Glu

405 410 415

Asn Leu Arg Ser Phe Ala Gly Glu Thr Gly Val Ser Phe Glu Ile Glu

420 425 430

Leu Leu Asn Met Glu Ile Leu Leu Asn Pro Thr Tyr Trp Pro Leu Ser

435 440 445

Leu Phe Arg Ser Ser Glu Lys Glu Ala Ile Ala Val Asn Leu Pro Ile

450 455 460

Ser Ser Met Val Ser Gly Tyr Leu Pro Leu Ile Leu Arg Phe Leu Lys

465 470 475 480

Gln Ile Ser Pro Asn Val Val Val Cys Ser Asp Arg Ser Cys Asp Arg

485 490 495

Asn Asn Asp Ala Pro Phe Pro Asn Gly Val Ile Asn Ala Leu Gln Tyr

500 505 510

Tyr Thr Ser Leu Leu Glu Ser Leu Asp Ser Gly Asn Leu Asn Asn Ala

515 520 525

Glu Ala Ala Thr Ser Ile Glu Arg Phe Cys Val Gln Pro Ser Ile Gln

530 535 540

Lys Leu Leu Thr Asn Arg Tyr Arg Trp Met Glu Arg Ser Pro Pro Trp

545 550 555 560

Arg Ser Leu Phe Gly Gln Cys Gly Phe Thr Pro Val Thr Leu Ser Gln

565 570 575

Thr Ala Glu Thr Gln Ala Glu Tyr Leu Leu Gln Arg Asn Pro Met Arg

580 585 590

Gly Phe His Leu Glu Lys Arg Gln Ser Ser Ser Pro Ser Leu Val Leu

595 600 605

Cys Trp Gln Arg Lys Glu Leu Val Thr Val Ser Ala Trp Lys Cys

610 615 620

<210> 4

<211> 1872

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 4

atgcccctgc cctttgagca atttcaaggg aagggggttc tgggtttctt agattcttct 60

tcttctccgg gatacaaaat ctgggctaat ccagagaagc tccatggacg agtagaagaa 120

gatctctgct ttgttgtcaa caatggtggt ttctcggagc cgacgtctgt tttagactct 180

gttagaagtc caagcccttt cgtctcttct tcaaccacca cgctgtcttc ttctcacggt 240

ggtcccagcg gcggcggcgc tgctgctgct actttttccg gcgccgatgg gaaatgcgac 300

caaatgggtt tcgaggatct cgatggtgtt ctctccggtg gctcgccggg acaagaacag 360

agtattttta gattaatcat ggctggcgat gtagtggatc cgggttcgga gtttgtgggt 420

ttcgacatcg gttctggatc cgacccggtt attgataatc ctaatccact ctttggatat 480

ggcttccctt ttcaaaacgc accggaagaa gaaaagtttc agatttcaat aaacccaaat 540

ccgggtttct tctcggatcc tccgtcgtct cctcctgcga aacggctcaa ttcgggtcaa 600

cccggatctc aacacctcca gtgggttttc ccgttctcgg atccgggtca cgaatctcac 660

gacccgtttc tcacaccgcc aaagatagcc ggagaagacc aaaacgacca agaccagtca 720

gcggtaatca tcgaccagct attctctgcg gcggcggagc tcaccacaaa cggcggagat 780

aacaatcccg ttctcgcgca agggatattg gcgcggctca atcacaacct taacaacaac 840

aacgacgaca ctaacaacaa tcctaaacct ccgttccaca gagcagcttc gtatataaca 900

gaagctcttc actctctcct tcaagactca tcattatcac caccgtctct ctcacctcct 960

caaaacctaa tctttcggat cgcagcttac agagctttct cagaaacgtc accgtttctt 1020

caattcgtca acttcacagc aaaccaaacg attctcgagt cattcgaagg gtttgatcgg 1080

atccacattg tcgatttcga tatcggttat ggaggtcaat gggcgtctct gattcaagag 1140

ctcgccggaa aaagaaacag atcttcatca gctccgtcgc taaagattac agctttcgct 1200

tctccttcaa ctgtctccga cgaattcgag ctccgattca ctgaagaaaa tctcagaagc 1260

ttcgccggcg aaacaggtgt ctccttcgaa atcgagctct taaacatgga gattctcttg 1320

aatccaactt attggccact gtctttattc cgatcatcgg agaaagaagc aatcgctgtg 1380

aatctcccaa tcagctccat ggtctccggt tacctcccat tgatacttcg tttcctcaag 1440

caaatctcac caaacgtcgt cgtttgctca gacagaagct gcgaccgtaa caacgacgcg 1500

ccgttcccta acggtgtgat taacgcgctt cagtactaca catctctgct cgagtctctc 1560

gactctggga atctgaataa tgcggaagct gctacgagta ttgagaggtt ttgtgtgcaa 1620

ccgtcgatac agaaactgtt gacgaatcgt taccgttgga tggagagatc accgccgtgg 1680

agaagcttat ttgggcaatg tgggtttact cctgtgacgc tgagtcagac ggcggagaca 1740

caagcggagt atttgttgca gaggaatcca atgagagggt ttcacttgga gaagagacag 1800

tcttcgtcgc cttcacttgt cttgtgttgg cagaggaaag aacttgttac tgtctcagct 1860

tggaaatgtt aa 1872

<210> 5

<211> 558

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 5

Met Pro Leu Pro Phe Glu Glu Phe Gln Gly Lys Gly Ile Ser Cys Phe

1 5 10 15

Ser Ser Phe Ser Ser Ser Phe Pro Gln Pro Pro Ser Ser Pro Leu Leu

20 25 30

Ser His Arg Lys Ala Arg Gly Gly Glu Glu Glu Glu Glu Glu Val Pro

35 40 45

Ala Ala Glu Pro Thr Ser Val Leu Asp Ser Leu Ile Ser Pro Thr Ser

50 55 60

Ser Ser Thr Val Ser Ser Ser His Gly Gly Asn Ser Ala Val Gly Gly

65 70 75 80

Gly Gly Asp Ala Thr Thr Asp Glu Gln Cys Gly Ala Ile Gly Leu Gly

85 90 95

Asp Trp Glu Glu Gln Val Pro His Asp His Glu Gln Ser Ile Leu Gly

100 105 110

Leu Ile Met Gly Asp Ser Thr Asp Pro Ser Leu Glu Leu Asn Ser Ile

115 120 125

Leu Gln Thr Ser Pro Thr Phe His Asp Ser Asp Tyr Ser Ser Pro Gly

130 135 140

Phe Gly Val Val Asp Thr Gly Phe Gly Leu Asp His His Ser Val Pro

145 150 155 160

Pro Ser His Val Ser Gly Leu Leu Ile Asn Gln Ser Gln Thr His Tyr

165 170 175

Thr Gln Asn Pro Ala Ala Ile Phe Tyr Gly His His His His Thr Pro

180 185 190

Pro Pro Ala Lys Arg Leu Asn Pro Gly Pro Val Gly Ile Thr Glu Gln

195 200 205

Leu Val Lys Ala Ala Glu Val Ile Glu Ser Asp Thr Cys Leu Ala Gln

210 215 220

Gly Ile Leu Ala Arg Leu Asn Gln Gln Leu Ser Ser Pro Val Gly Lys

225 230 235 240

Pro Leu Glu Arg Ala Ala Phe Tyr Phe Lys Glu Ala Leu Asn Asn Leu

245 250 255

Leu His Asn Val Ser Gln Thr Leu Asn Pro Tyr Ser Leu Ile Phe Lys

260 265 270

Ile Ala Ala Tyr Lys Ser Phe Ser Glu Ile Ser Pro Val Leu Gln Phe

275 280 285

Ala Asn Phe Thr Ser Asn Gln Ala Leu Leu Glu Ser Phe His Gly Phe

290 295 300

His Arg Leu His Ile Ile Asp Phe Asp Ile Gly Tyr Gly Gly Gln Trp

305 310 315 320

Ala Ser Leu Met Gln Glu Leu Val Leu Arg Asp Asn Ala Ala Pro Leu

325 330 335

Ser Leu Lys Ile Thr Val Phe Ala Ser Pro Ala Asn His Asp Gln Leu

340 345 350

Glu Leu Gly Phe Thr Gln Asp Asn Leu Lys His Phe Ala Ser Glu Ile

355 360 365

Asn Ile Ser Leu Asp Ile Gln Val Leu Ser Leu Asp Leu Leu Gly Ser

370 375 380

Ile Ser Trp Pro Asn Ser Ser Glu Lys Glu Ala Val Ala Val Asn Ile

385 390 395 400

Ser Ala Ala Ser Phe Ser His Leu Pro Leu Val Leu Arg Phe Val Lys

405 410 415

His Leu Ser Pro Thr Ile Ile Val Cys Ser Asp Arg Gly Cys Glu Arg

420 425 430

Thr Asp Leu Pro Phe Ser Gln Gln Leu Ala His Ser Leu His Ser His

435 440 445

Thr Ala Leu Phe Glu Ser Leu Asp Ala Val Asn Ala Asn Leu Asp Ala

450 455 460

Met Gln Lys Ile Glu Arg Phe Leu Ile Gln Pro Glu Ile Glu Lys Leu

465 470 475 480

Val Leu Asp Arg Ser Arg Pro Ile Glu Arg Pro Met Met Thr Trp Gln

485 490 495

Ala Met Phe Leu Gln Met Gly Phe Ser Pro Val Thr His Ser Asn Phe

500 505 510

Thr Glu Ser Gln Ala Glu Cys Leu Val Gln Arg Thr Pro Val Arg Gly

515 520 525

Phe His Val Glu Lys Lys His Asn Ser Leu Leu Leu Cys Trp Gln Arg

530 535 540

Thr Glu Leu Val Gly Val Ser Ala Trp Arg Cys Arg Ser Ser

545 550 555

<210> 6

<211> 1677

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 6

atgcccttac cctttgaaga gtttcaaggg aaggggattt cttgtttctc ttctttctcg 60

tcttccttcc cccaaccacc gtcgtctccg cttttgagcc accgcaaagc aagaggcggc 120

gaagaagaag aggaagaagt tcccgcggcg gagcctacct ctgttctgga ctccctcata 180

agcccaacct cttcctccac ggtgtcttcc tctcacggcg gaaacagcgc cgtcggaggc 240

ggcggcgacg ccaccaccga tgagcaatgc ggagccattg ggttgggtga ttgggaggag 300

caagttcctc atgaccacga acagagcatt ctcggactca tcatgggaga ttccacagat 360

ccctctcttg aactcaacag cattctccaa acatctccca ccttccacga ctctgactac 420

tcatcacccg gtttcggagt cgtcgacacc ggcttcggtt tagaccacca ctctgttccg 480

ccgtcacatg tttccggtct tctgatcaac caaagtcaaa cccactacac acagaatcct 540

gcggctatct tctacggcca ccaccaccat acacctccgc cggcaaagcg gctcaaccct 600

ggtcccgtgg ggataacaga gcagctggtt aaggcagcag aggtcataga gagcgacacg 660

tgtctagctc aggggatatt ggcgcggctc aatcaacagc tctcttctcc cgtcgggaag 720

ccattagaaa gagcagcttt ttacttcaaa gaagctctca ataatctcct tcacaacgtc 780

tcccaaaccc taaaccctta ttccctcatc ttcaagatcg ctgcttacaa atccttctca 840

gagatctctc ccgttcttca gttcgccaac tttacctcca accaagccct cttagagtcc 900

ttccatggct tccaccgtct ccacatcatc gacttcgata tcggctacgg tggccaatgg 960

gcttccctca tgcaagagct tgttctccgc gacaacgccg ctcctctctc cctcaagatc 1020

accgttttcg cttctccggc gaaccacgac cagctcgaac ttggcttcac tcaagacaac 1080

ctcaagcact tcgcctctga gatcaacatc tcccttgaca tccaagtttt gagcttagac 1140

ctcctcggct ccatctcgtg gcctaactcg tcggagaaag aagctgtcgc cgttaacatc 1200

tccgccgcgt ccttctcgca cctccctttg gtcctccgtt tcgtgaagca tctatctccg 1260

acgatcatcg tctgctccga cagaggatgc gagaggacgg atctgccctt ctctcaacag 1320

ctcgcccact cgctgcactc acacaccgct ctcttcgaat ccctcgacgc cgtcaacgcc 1380

aacctcgacg caatgcagaa gatcgagagg tttcttatac agccggagat agagaagctg 1440

gtgttggatc gtagccgtcc gatagaaagg ccgatgatga cgtggcaagc gatgtttcta 1500

cagatgggtt tctcaccggt gacgcacagt aacttcacgg agtctcaagc cgagtgttta 1560

gtccaacgga cgccagtgag aggctttcac gtcgagaaga aacataactc acttctccta 1620

tgttggcaaa ggacagaact cgtcggagtt tcagcatgga gatgtcgctc ctcctga 1677

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 7

ttgagccgcg ccaatatctc a 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 8

ttgagccgtg ccaatatcac g 21

<210> 9

<211> 1018

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 9

tgtttgatat ttattatttc gaaaagtatt tcactatttc ttaaacaaac atatttttca 60

aatttaatac aaccaacttc ctttttgttg tgggggttgt tggcctaatt caatgcttgt 120

tttcctctgt catttcttca tcaccctctt cgtatttata tctccttcac tctgcaaacc 180

caagaaaaaa cattgaaata gctcatgttg tctctttctc attttcatat ctgctaaaaa 240

aagaaccgtg ttttctaaac tggtttaacg gtaagtacct gtctctagta acttacctat 300

caatttgttc caatcattta cttgctttga cttatttggt ttccttttgt tttgtttttc 360

tttaatatgt ggatggagtt tggtgtaata agcaactgaa gagtcgatga gcgcactatc 420

ggacatcaaa tacgagatat tggtgcggtt caatcagaaa accgtactct tttgttttaa 480

agatcggttt atttgattga gccgtgccaa tatcacgcgt ttaaatagtt taaagattct 540

atgttagttg atgtgatcaa tcaaggtatg aatctatatc aattctctta tgcatagttt 600

tatatttaca gagatgaggt attatcaatg tctatcgtcg aggatcacgc tcttacttat 660

gttatatttc tatataattt tattaattag ttttctaaaa gagaaggaca atttaaaatt 720

attttaaaga gtttttttta agtagttttg ttttcatgtt tatcttctgc aggctctgaa 780

gttaggatag taacaagaaa aaagacagaa aaaaagaaga aaattcatat acattcgtga 840

gaagatacta ctattagcga taatgaattc attacaaaaa actgtagccc aatgttataa 900

agggtagttt cttctctctt ttttgtatag atgatttatg tcactcactc actcattaat 960

gtaaagatgt ctgactgaat tgtttataat attgtgtata ttctgaactt ttaattaa 1018

<210> 10

<211> 1102

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 10

actattaaat gttgcaggca ggtccagcca gtgtcccctc tcttctgcga gattccctca 60

aaatttatta caaagcatct tcatcgatgt tcttttaatt cttcctcaaa atcttttctc 120

tttttttggt tatatatatt tgaattttga tttatgaacc tcctcaagaa ggaaagacag 180

aggaggagac aaagaagtat aggttcacat tgcatagcca gtttagtttt gaaggatgga 240

tatatgaaaa aaatatgaag agagagaaga gagaagaaga ggaggattaa agagggtgag 300

gccagctttt gtgctttggt agtagatgag gtttaaatgc tccatacctt ccatttcctt 360

ctctcttacc ctaatttaat tcttcctctc ctttataact ccccacagac attctcactt 420

ctcctcctca cacttcacat caacacttct ttcttgtttt ttcattttac aatgtttcct 480

ttgatatccg cactttaagc atgagagagt ccctttgata ttggcctggt tcactcagat 540

cttacctgac cacacacgta gatatacatt attctctcta gattatctga ttgagccgcg 600

ccaatatctc agtactctct cgtctctatt ttggactttg tggtcttgta gatcgatttg 660

tatgtgtgtg ttgaaatgga gacaagtact tgtaacttct ttgttgttat attgtttacc 720

tataggctga tgtcataaac tcttttgatc ttgtttctaa cttccagatt cttgaaaaat 780

caagtcgtgt gtgtgtctcc atggaagcct tttccatttc ttcttttcca aggtatcccc 840

ttaatcagct tccttgccaa gtataaatct gttgtagggt tttgcttcaa ataatctata 900

tggatccttt tagaatgcat attgtgttga taccaatttt gagacagaat gtgtcagcga 960

aactgatctt gtttattagt acaaatgcag gatgttagag agttagctaa taacatatac 1020

aacaaaatca caaaaccggt gaagcaatgt aaaatgtcac aatcacaaga tgtttttttc 1080

aaaaacaggg gaaaaagcag ag 1102

<210> 11

<211> 1135

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 11

aaactgacat gtttactttt ttcactaaac tagaaatatt ataatttgat ttgtcacaaa 60

catacttccg gaaatgtgga ccgacttgat gaaatttcat agatttaacc ttatctgata 120

gaataagtcc aaaaacagac ttcctcgttt tcgttagatt aacaacaaca agcgaataaa 180

catatacact tttctttaaa taacaaataa gataaatcat tccacagcta acttatggac 240

aaaagtttca gatagtaatt acaaatgttt tacgttcttg ttagtacttt tactccctta 300

aatacttgct aaaaatagaa ctgcaaatcg cagttgtact tggattttgg gttttgtgtt 360

gcttgtcccc tctaaggcta ccgatcgagt gcctgtagag taaaaacatt ataaaaaaaa 420

aatgaaatat caaagccatt aatcaaaatt gaaacaataa aacgataatg atacatacct 480

ttaaggttat aataactatc tttgccattt ttggtttacc gcgtgatatt ggcacggctc 540

aatcgaacaa caccgttctc catgagttaa gaggacgact atttgattga accgcactaa 600

tatctcgcgt taccttgcat aaaaccactc ttgttcgact ataatctcca cttagctcca 660

gaaaaccaat aaacaaaaca aaaagtgaaa taaaaatatg tataaatgac tattgacact 720

aaaatgttaa tttaccggag agaaccatcg gatcctggag aaactcttac tgtctaaaaa 780

ttttagggac gtcagaaacc aaagtacgaa ttagaagaat cgaaggagaa aatagaaatg 840

cggccagtag caaagtttat gagtatgcat agtgaagaag aagatataaa tacgaagatg 900

gttgaagaag agaggcaagc aagagacaag cattaaatta gaccaacaac cccataccaa 960

aaaggaggtt ggtttattaa atttgaattg tttctatgaa aaactttttt caaaagataa 1020

taatatttgt ttatacttta tacattagta atgtaacatt acatattcgt ttttacaacc 1080

gatgatatca aattatcagg tatactctca aatgaatttt caagaacaag agttt 1135

<210> 12

<211> 1923

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1923)

<223> 突变体rHAM1

<400> 12

atgcccttat cctttgaaag gtttcaaggg gagggggtgt ttggtttatc ttcttcttct 60

ttctattcag attctcagaa aatctggtcc aatcaagaca aaaccgaagc aaaacaagaa 120

gatcttggtt atgttgtcgg tggtttttta ccggagccga cgtctgttct cgacgctcta 180

agaagtccta gtcctctcgc ttcttattct tctaccacca ccacgctgtc ttcctctcac 240

ggcggcggtg gtaccaccgt caccaacacc accgtaaccg ccggtgatga taacaataac 300

aataaatgta gtcagatggg tttggatgat cttgacggtg ttctctctgc ttcttctcct 360

ggtcaagagc agagtatctt gagacttatc atggacccgg gttctgcctt cggtgttttc 420

gacccgggtt tcggattcgg gtctggttcc gggcctgtgt ctgctccggt gagtgataat 480

tcgaatcttc tgtgtaactt cccgtttcaa gagattacga atccagcaga agctttgatc 540

aatccttcaa atcattgcct gttctataat cctccgttat ctccaccggc taaacggttt 600

aattccggat ctcttcatca acccgttttc cctttatcgg atccggatcc gggtcacgac 660

ccggttcgtc gtcaacatca gtttcagttt ccgttttatc acaacaacca gcaacaacaa 720

ttcccgtcgt cttcttcttc cacggcggtg gctatggttc cggttccgtc gccgggaatg 780

gccggcgatg accagtcagt catcatcgag cagctgttca acgcggcgga gctaatcgga 840

accaccggaa acaacaacgg cgaccacacc gttctcgcgc aaggaatatt ggctagatta 900

aaccaccatc tcaacacaag tagtaaccac aagtctccgt ttcaaagagc agcttctcac 960

atcgctgaag ctctcctctc actcatccac aacgaatcat caccaccgtt aatcacgccg 1020

gagaatctga ttctccgaat cgccgcttac agatccttct ccgaaacctc gccgtttctc 1080

caattcgtta acttcacagc gaatcaatcg attcttgagt cctgcaacga atcagggttt 1140

gatcggatcc acattatcga tttcgacgtt ggatatggag gacaatggtc gtctctaatg 1200

caagaactcg cttccggagt tggaggaaga agaagaaaca gagcatcgtc tctgaaatta 1260

acagtctttg ctcctccacc ttctacagtc tccgacgagt tcgagcttcg tttcacagag 1320

gaaaatctca aaacattcgc cggagaagtc aagattcctt tcgaaatcga gttactaagc 1380

gtagagcttc ttctaaaccc agcttattgg ccactctctc tacgttcatc ggaaaaagaa 1440

gcaatcgcag tgaatcttcc agtaaactcc gtcgcctccg gttaccttcc gttaatcctc 1500

cgattcctta aacaactatc accaaacatc gtcgtttgct cagacagagg atgtgaccgt 1560

aacgacgcgc cgtttccaaa cgcagtgatt cattcgcttc aataccacac ttctctgctt 1620

gagtctcttg atgctaatca gaaccaggac gattcgagta tcgagaggtt ttgggttcaa 1680

ccatcgatag agaagctgtt gatgaaacga caccgttgga ttgaaagatc tccaccgtgg 1740

agaatcttgt ttacacaatg tgggttttct ccggcgagtt tgagtcagat ggcggaagct 1800

caggcggagt gtttgttgca gagaaatccg gtgagagggt ttcacgttga gaaaaggcag 1860

tcttcacttg tcatgtgttg gcaaaggaaa gaacttgtta ctgtctctgc ttggaaatgt 1920

tag 1923

<210> 13

<211> 1677

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1677)

<223> 突变体rHAM3

<400> 13

atgcccttac cctttgaaga gtttcaaggg aaggggattt cttgtttctc ttctttctcg 60

tcttccttcc cccaaccacc gtcgtctccg cttttgagcc accgcaaagc aagaggcggc 120

gaagaagaag aggaagaagt tcccgcggcg gagcctacct ctgttctgga ctccctcata 180

agcccaacct cttcctccac ggtgtcttcc tctcacggcg gaaacagcgc cgtcggaggc 240

ggcggcgacg ccaccaccga tgagcaatgc ggagccattg ggttgggtga ttgggaggag 300

caagttcctc atgaccacga acagagcatt ctcggactca tcatgggaga ttccacagat 360

ccctctcttg aactcaacag cattctccaa acatctccca ccttccacga ctctgactac 420

tcatcacccg gtttcggagt cgtcgacacc ggcttcggtt tagaccacca ctctgttccg 480

ccgtcacatg tttccggtct tctgatcaac caaagtcaaa cccactacac acagaatcct 540

gcggctatct tctacggcca ccaccaccat acacctccgc cggcaaagcg gctcaaccct 600

ggtcccgtgg ggataacaga gcagctggtt aaggcagcag aggtcataga gagcgacacg 660

tgtctagctc agggaatatt ggctagatta aaccaacagc tctcttctcc cgtcgggaag 720

ccattagaaa gagcagcttt ttacttcaaa gaagctctca ataatctcct tcacaacgtc 780

tcccaaaccc taaaccctta ttccctcatc ttcaagatcg ctgcttacaa atccttctca 840

gagatctctc ccgttcttca gttcgccaac tttacctcca accaagccct cttagagtcc 900

ttccatggct tccaccgtct ccacatcatc gacttcgata tcggctacgg tggccaatgg 960

gcttccctca tgcaagagct tgttctccgc gacaacgccg ctcctctctc cctcaagatc 1020

accgttttcg cttctccggc gaaccacgac cagctcgaac ttggcttcac tcaagacaac 1080

ctcaagcact tcgcctctga gatcaacatc tcccttgaca tccaagtttt gagcttagac 1140

ctcctcggct ccatctcgtg gcctaactcg tcggagaaag aagctgtcgc cgttaacatc 1200

tccgccgcgt ccttctcgca cctccctttg gtcctccgtt tcgtgaagca tctatctccg 1260

acgatcatcg tctgctccga cagaggatgc gagaggacgg atctgccctt ctctcaacag 1320

ctcgcccact cgctgcactc acacaccgct ctcttcgaat ccctcgacgc cgtcaacgcc 1380

aacctcgacg caatgcagaa gatcgagagg tttcttatac agccggagat agagaagctg 1440

gtgttggatc gtagccgtcc gatagaaagg ccgatgatga cgtggcaagc gatgtttcta 1500

cagatgggtt tctcaccggt gacgcacagt aacttcacgg agtctcaagc cgagtgttta 1560

gtccaacgga cgccagtgag aggctttcac gtcgagaaga aacataactc acttctccta 1620

tgttggcaaa ggacagaact cgtcggagtt tcagcatgga gatgtcgctc ctcctga 1677

<210> 14

<211> 542

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(542)

<223> AtIPS1

<400> 14

caaacaccac aaaaacaaaa gaaaaatggc catcccctag ctaggtgaag aagaatgaaa 60

acctctaatt tatctagagg ttattcatct tttaggggat ggcctaaata caaaatgaaa 120

actctctagt taagtggttt tgtgttcatg taaggaaagc gttttaagat atggagcaat 180

gaagactgca gaaggctgat tcagactgcg agttttgttt atctccctct agaaagatat 240

tggcgtaaag gctcaatcaa gcttcggttc ccctcggaat cagcagatta tgtatcttta 300

attttgtaat actctctctc ttctctatgc tttgtttttc ttcattatgt ttgggttgta 360

cccactcccg cgcgttgtgt gttctttgtg tgaggaataa aaaaatattc ggatttgaga 420

actaaaacta gagtagtttt attgatattc ttgtttttca tttagtatct aataagtttg 480

gagaatagtc agaccagtgc atgtaaattt gcttccgatt ctctttatag tgaattcctc 540

tt 542

<210> 15

<211> 2757

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2757)

<223> RIBO启动子

<400> 15

cgtaggcatt aacccgtttg tggttttttt ctttgctaaa tttattagtc attttctctt 60

ttaaatattt tgttgtagtt ggggtggggt gggagacttt ttccctcaag tcaacgtaaa 120

atgttgatcg atgatcttga gaggattagc tagttaactt ctaaaacttt attggttaag 180

atcaatcaag aatcctcaat agttttggtg gtttgtgcta acgatgttta tgtgttatca 240

tcgttcgagt taaaatccgc gtaatatata atgttgtttt ataaaaaaaa ttagtacatg 300

aatggtccaa caattcataa ctcacgttct taacctaatt tgtgactaag actaactaat 360

catgtgtaaa cagctttcta tttcttcgaa aaatttagaa ttacaaagac atagtttcgt 420

atgacaaagt atcacggtgt ccatcatttg acaaaagtaa tgatagaaat attacttagc 480

atctttataa aagtaatact ttctctttta ctaagataca ggttacgaga ttaatcataa 540

aacactcgag tcataaaaca atttgttttg ttttctttca acacaaaagt tttgctatac 600

gtgtattcaa tatttatttg tcggtgtgtc aatcaccgta atttgactca tttcctttta 660

catgtagacg tagcaagtag tatttcaaaa gattttatgt gtatatatca attatattga 720

gtcagatttt tgtgatggat cattatggtc ctaccaacca gagtccctac atatacttgt 780

atctgtgcga atttatagtt gttacctaag ctacaaaaaa aattgaagag atcttccgta 840

atatagatga actaatttga tgtcccatta tgtttctcgt aaaagaagaa atacatgtgt 900

atttgacaag atggtacata gaccgctaaa ccatcatgtc ctaacaaagt agattggtat 960

catttgcaaa atatgtcact taacattaat gttcttcatt ccttaatacc agtctacttg 1020

atgagtctct cctctttttg atgagctagt ctcgcacttt ttttcatctc taacttttgt 1080

attttatgaa atgttcatag actttattca aggcacatta ctatcatata tctggattta 1140

aattgccata ccgtattcac gagacaattt atatgtaata acaatttaaa aaatgcattg 1200

tctgctcaga agctagcttg cccatattgt gtgttcttct aacaattttt tattgtttct 1260

tctgagggtt tttgcattaa atatgttatt gttgacatca tagatgctag tggatatatc 1320

atcgacgacg aactcgagtt gcttaataat tatttccagt ttcatacatc atcatcatat 1380

tatagaacat atacctttat catatgtatc tcaaaaatct ataatcagct tgatattaac 1440

ttattctaaa gttcaaatca gttttaactt ttaagaaaat attatgagtt ttctaatttg 1500

attcggtttt cgccgggtta acctgaaatc ggaatctgga ttggacaaag tacaaaccgt 1560

gggttagtat tagtaacatc caatttgggc ttgcccgtat ttgtctgctc agaagctagc 1620

ttgcccatat tatgtgttct ccaaagaatt gtttattgtt attttggaga gggtttttgc 1680

attaaatatg ttcttgtgtt gacattattg attattagat gctagtgata taccatcacc 1740

aaaattagaa ttgcattatc atcattttat atatcaatct atatatttat catatgactc 1800

agactatcat gagacgcatt ttttttaagt attatgaata atataccact tgttcacgtt 1860

ttaacgtttg aaaaacatga ttttgctact ttttacgatt caaagtattt attaagaatt 1920

tacgttcttg aaaagtgatt atactgtata tataactata agtaaataaa acttttttcg 1980

acgaaatttc tgatgataaa taaaaggtcg gatatatttg actttttttt tttttttaat 2040

tattttttga cgataaattt ttcgttgaaa aatcatcgaa attttcgacg gattccaatg 2100

atcaaaaatt cgtcaataat ttccaacgat attctgacta aactaaatct gatgaaatat 2160

ttttgacggc tttccaacca aaatatttcg ttgtgacttg tcaaaaatcc gttagaatac 2220

taagcaactt ttcgacagat tttcagcaaa aatattcggt aatataacgt gttaaaaata 2280

tgataaaaaa aaaaacttga tgaatctact aaaactaaat tttcaatcat atatatctat 2340

tattcatata tttcattcat tttattattt ttctcttaac aattatttag ttattctggt 2400

atcgtgtaat tatattcata tgatttattc tgatattgat tcggttagca tccggataaa 2460

tctgggttgg gctttttaac ttggtttttc taagaaaaat tctaatatga tttggttagc 2520

atccggatta gtctagtttg gtaggcctgc ctttgtgatt cttaactcgg tcttttgtat 2580

gggtttgaac aattactaca ccatttagat tcttctgacc catatcaaat aaagatccac 2640

ttaggcccat tagggttaga acaaacatga ggttgcagaa taaaaagggt tcattttcct 2700

cactctcaag ttggatctca aaaccctaat atctgaactt cgccgtcgag agcatcc 2757

Claims

1.一种提高植物再生能力的方法，其特征在于，所述方法包括下调植物中HAM；所述植物选自十字花科植物、藜科植物、茄科植物；所述下调为以特异性干扰HAM基因表达的干扰分子来沉默HAM；所述干扰分子是以HAM的编码基因或其转录本为抑制或沉默靶标的微小RNA，其是miR171；所述miR171的核苷酸序列如SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8所示；上调植物中miR171，从而下调HAM表达。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的提高植物再生能力的方法为转基因方法。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过miR171上调剂进行上调，包括选自下组的miR171上调剂：

(a)多核苷酸，所述的多核苷酸能被植物转录或加工成所述miR171；

(b)表达构建物，所述的表达构建物含有所述miR171、或(a)中所述的多核苷酸；

(c)所述miR171的激动剂。

4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，(a)所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNO: 9或SEQ ID NO: 10所示。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，将(a)～(c)任一所述的上调剂引入到植物中，从而实现所述的上调。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物再生包括：芽再生，根再生，细胞胚再生。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物再生包括：植物外植体为基础的再生，植物愈伤组织为基础的再生。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的植物外植体或愈伤组织包括来自下组植物组织的外植体或愈伤组织：下胚轴，子叶，根，叶片，胚胎，花器官。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物为十字花科拟南芥。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物为藜科甜菜。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物为茄科烟草。

12.一种HAM的用途，用于作为下调靶点，以提高植物再生能力；或用于筛选靶向于HAM从而提高植物再生率的试剂；所述植物选自十字花科植物、藜科植物、茄科植物。

13.一种HAM下调剂的用途，用于提高植物再生率；所述的HAM下调剂通过下调HAM，提高芽再生标志基因的表达；所述芽再生标志基因包括：WUS、CLV3、CUC1或CUC2；所述植物选自十字花科植物、藜科植物、茄科植物。

14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述的HAM下调剂包括：敲除或沉默HAM基因或抑制HAM蛋白活性的下调剂。

15.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述的HAM下调剂包括：特异性干扰HAM基因表达的干扰分子，敲除HAM基因的基因编辑试剂，基于同源重组的敲除HAM基因的试剂。

16.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述的干扰分子是以HAM的编码基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。

17. 如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述的干扰分子是以HAM的编码基因或其转录本为抑制或沉默靶标的miR171或miR171上调剂，所述miR171的核苷酸序列如SEQ IDNO: 7或SEQ ID NO: 8所示；所述miR171上调剂包括：

(a)多核苷酸，所述的多核苷酸能被植物转录或加工成miR171；

(b)表达构建物，所述的表达构建物含有miR171、或(a)中所述的多核苷酸；

(c)miR171的激动剂。

18. 如权利要求17所述的用途，其特征在于，(a)所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNO: 9或SEQ ID NO: 10所示。

19.如权利要求12～18任一所述的用途，其特征在于，所述的植物再生包括：芽再生，根再生，细胞胚再生。

20.如权利要求12～18任一所述的用途，其特征在于，所述的植物再生包括：植物外植体为基础的再生，植物愈伤组织为基础的再生。

21.如权利要求20所述的用途，其特征在于，所述的植物外植体或愈伤组织包括来自下组植物组织的外植体或愈伤组织：下胚轴，子叶，根，叶片，胚胎，花器官。

22.如权利要求12～18任一所述的用途，其特征在于，所述的植物选自：十字花科拟南芥，藜科甜菜，茄科烟草。

23.一种HAM的用途，用于作为鉴定植物再生能力的分子标记；所述植物选自十字花科植物、藜科植物、茄科植物。

24. 一种miR171的用途，用于作为鉴定植物再生能力的分子标记；所述miR171的核苷酸序列如SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8所示；所述植物选自十字花科植物、藜科植物、茄科植物。

25.一种定向选择再生能力增强的植物的方法，所述方法包括：鉴定待测植物中HAM的表达，若是该待测植物的HAM表达显著低于该类植物的HAM平均表达值，则其为再生能力增强的植物；所述植物选自十字花科植物、藜科植物、茄科植物。

26. 一种定向选择再生能力增强的植物的方法，所述方法包括：鉴定待测植物中miR171的表达，若是该待测植物的miR171的表达显著高于该类植物的平均表达值，则其为再生能力增强的植物；所述miR171的核苷酸序列如SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8所示；所述植物选自十字花科植物、藜科植物、茄科植物。

27. 一种筛选提高植物再生能力的试剂的方法，所述方法包括：(1) 将候选物质加入到含有HAM的体系中；(2)观测(1)的体系中HAM的表达或活性；若所述候选物质抑制HAM的表达或活性，则表明该候选物质是提高植物再生能力的试剂；所述植物选自十字花科植物、藜科植物、茄科植物。

28. 一种筛选提高植物再生能力的试剂的方法，所述方法包括：(1) 将候选物质加入到含有miR171的体系中；(2)观测(1)的体系中miR171的表达或活性；若所述候选物质提高miR171的表达或活性，则表明该候选物质是提高植物再生能力的试剂；所述miR171的核苷酸序列如SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8所示；所述植物选自十字花科植物、藜科植物、茄科植物。