CN114181884B

CN114181884B - 一种调控植物体细胞胚胎发生的方法

Info

Publication number: CN114181884B
Application number: CN202111344539.5A
Authority: CN
Inventors: 陈金慧; 鲁路; 托马斯劳克斯; 施季森
Original assignee: Nanjing Forestry University; Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Current assignee: Nanjing Forestry University; Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Priority date: 2021-11-12
Filing date: 2021-11-12
Publication date: 2022-10-28
Anticipated expiration: 2041-11-12
Also published as: WO2023082486A1; CN114181884A

Abstract

本申请公开了一种调控植物体细胞胚胎发生的方法，以植物未成熟合子胚为外植体，通过控制茎尖分生组织干细胞调控因子miR394和WUS的共同表达，诱导体胚发生。本申请的试验结果显示WUS促进体胚发生具有剂量效应和阶段效应，并且miR394不仅可以促进WUS调控茎尖分生组织发育，同时也可以提高WUS对体胚发生的诱导效率，进而将不易体胚发生的Ler拟南芥转化为可高效进行体细胞胚胎发生的植物。本申请不仅可以有效调控植物体胚发生，而且对重要经济植物的快速育种具有重要意义。

Description

一种调控植物体细胞胚胎发生的方法

技术领域

本申请属于植物组培技术领域，具体涉及一种调控植物体细胞胚胎发生的方法。

背景技术

植物再生是植物体细胞在外源激素作用下进行重新编程，通过细胞分裂及分化发育成为一个独立植株或器官的过程。高等植物植株再生主要包括器官发生(Organogenesis)，组织修复(Tissue repair)及体胚发生(Somatic embryogenesis)，通过组织培养、扦插和嫁接等方式获得再生植株。器官从头发生是植物再生的重要方式之一，包括茎和根的从头发生，是离体或受伤的植物组织经诱导长出不定芽或者不定根的过程。与植物体细胞胚发生不同的是植物器官发生仅需诱导离体组织或者器官重新形成茎和根，而无需经过类似于植物胚胎发生过程。组织修复是植物器官或组织在受损或缺失后，可以通过修复或重新生长出能够代替原来器官或组织行使生物学功能的结构。体细胞胚发生是指已分化体细胞在一定条件下经过脱分化获得分生能力，通过再分化形成完整植株的过程，是细胞全能性的极致体现，也是有效地植物再生手段。

植物体细胞胚胎发生是在特定条件下，二倍体或单倍体体细胞未经性细胞融合，发生与合子胚发育相类似的途径，建立新植物个体形态的过程，包括体细胞转化成胚性细胞和胚性细胞再分化途径，在基因表达模式重新编程的作用下，实现体细胞到完整植株的转化。近年来，植物体细胞胚胎发生的研究取得了一系列突破性的进展，不仅对植物体胚发生中体细胞命运的转变有了初步认识，而且探索了调控植物体胚发生过程的分子机制。研究表明损伤信号、胁迫信号、激素、转录因子和表观遗传途径调控因子形成有序协作的调控通路，控制着体胚发生过程。体细胞胚胎发生不仅为研究胚发生提供的基础方法，而且在农业发展方面得到广泛的应用。

在植物中，利用体细胞诱导形成体细胞胚是研究较多的发育过程之一。然而，人们对体细胞胚胎发生控制的分子机制知之甚少。体胚发生过程中体细胞获得胚性的能力显然涉及基因表达的重新编程。此外，胚性细胞分化和胚的形态发生也依赖于适当的或连续的关键基因的表达。高通量测序技术的应用提高了发现参与体胚发生的基因数量。核酸测序技术的快速发展促进了对体胚发生转录组的研究，其中最常见的观察结果是转录因子的差异表达。在体胚发生过程中，有些转录因子通过诱导体细胞脱分化或增加体细胞胚胎的产量参与调控体细胞胚胎发生，如BABY-BOOM(BBM)和WUSHEL(WUS)的过表达足以诱导体细胞向胚性细胞的转化，促进体细胞胚胎发生[Somssich M，Je B I，Simon R，et al.CLAVATA-WUSCHEL signaling in the shoot meristem[J].Development，2016，143(18)：3238.]，[Zuo J，Niu Q W，Frugis G，et al.The WUSCHEL gene promotes vegetative-to-embryonic transition in Arabidopsis[J].Plant Journal，2010，30(3)：349-59.]。

转录组学信息表明参与体细胞胚胎发生的基因分为应激相关基因、生长调节相关基因和转录因子。植物基因组包含大量(6-10％)的转录因子编码基因。其中一些转录因子是各种植物种类共有的。在不同种类体细胞胚胎诱导过程中，发现差异表达的转录因子包括ABAINSENSITIVE3(ABI3)，AGAMOUS LIKE(AGL)，BBM，CUP SHAPED COTYLEDON(CUC)，FUSCA3(FUS3)，LEC，WOUND INDUCED DEDIFFERENTIATION(WIND)，LEAFY COTYLEDON LIKE(LIL)，SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTORLIKE KINASE1(SERK1)，RWP-RK DOMAIN-CONTAINING4(RKD4)/GROUNDED(GRD)，VIVIPAROUS1(VP1)，和WUS等。在针叶树中，一些重要转录因子的同源物也参与体细胞胚胎发生，如SERK1、LEC1，和WOX2等，但它们呈现出的功能表达模式是否与被子植物相似还不清楚[Chu Z，Chen J，Sun J，et al.De novo assemblyand comparative analysis of the transcriptome of embryogenic callus formationin bread wheat(Triticum aestivum L.)[J].Bmc Plant Biology，2017，17(1)：244.]，[Riechmann J，Heard J，Martin G，et al.Arabidopsis transcription factors：genome-wide comparative analysis among eukaryotes[J].Science，2000，290(5499)：2105-10.]。

WUS基因作为干细胞的核心调控因子，对植物茎尖分生组织和花分生组织的发育具有中心调控作用[Knauer S，Holt A L，Rubio-Somoza I，et al.A protodermalmiR394signal defines a region of stem cell competence in the Arabidopsisshoot meristem[J].Developmental Cell，2013，24(2)：125-32.]。早期研究已发现，WUS功能缺失突变导致拟南芥在几片叶子形成后茎尖分生组织的发育提前终止，其突变体花分生组织终止而不形成雌蕊。除了参与调控胚发育过程，WUS基因对体细胞胚胎发生也具有重要作用。研究表明，WUS基因在体外培养过程中，与体细胞到胚性细胞的转变或维持胚性细胞特性密切相关，其过表达可在没有植物激素作用下促进自发体细胞胚胎产生。

目前，体细胞胚胎发生已经被认为是植物界的普遍现象。作为模式植物，拟南芥体胚发生研究可以为非模式植物体胚发生的研究提供参考体系。尽管体胚发生在植物繁殖和商业应用方面具有巨大的潜力，然而因不同植物种类体胚发生能力各不相同，可以自发形成体细胞胚胎的植物种类极少，许多重要的植物难以体胚发生或诱导体细胞胚形成效率低，包括椰子棕、不同基因型大麦和大多数针叶树等。基因型、外植体以及各类生长调节剂等都会影响到体胚发生的效率。但这些发现背后的机制仍然难以捉摸，因此大多数植物还要靠经验性实验探索合适的体系以提高体胚发生效率。

随着体胚诱导体系的不断完善和诱导效率的提升，通过体胚发生获得的植株再生方式常被应用于基因工程育种，苗木繁殖、种质资源保存、及人工种子制备等方面。并且，随着基因组编辑技术的快速发展，大多数物种迫切需要一个高效的遗传转化系统以获得基因编辑子代植株。尽管器官发生已广泛应用于体外繁殖和遗传转化，但体胚发生可源于单细胞的特性被认为是遗传转化的理想方式。除此之外，体细胞胚胎发生技术也被认为是具有优良遗传性状的经济植物的繁殖工具。同时，体细胞胚胎发生技术也被认为是快速生产具有种植林业所需特征的高价值苗木成本最低的方法。除此之外，体细胞胚胎发生研究对于合子胚发育的研究也具有参考意义。在合子胚发育早期，胚体较小且被周围母体细胞包围，因此难以接近。且合子胚与其周围细胞存在相互作用，给合子胚发育的研究带来了诸多闲难，导致其研究进展相对缓慢。体细胞胚胎发育是在离体条件下培养完成的，与合子胚形态发生高度相似，因此利用体细胞胚胎发生过程可以重现合子胚发育的整个过程，在一定程度上克服了研究合子胚发育的困难。此外，体细胞发生过程可实时跟踪，还可以很好地控制条件，且取材不受限制，方便研究。所以，研究体细胞胚胎发生的机理对于揭示合子胚的发育机理具有实践意义。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本申请所要解决的技术问题是提供一种调控植物体细胞胚胎发生的方法，可有效实现调控体胚发生。

为了解决上述技术问题，本申请采用的技术方案为：

一种调控植物体细胞胚胎发生的方法，以植物未成熟合子胚为外植体，通过调控miR394(其前体基因ID：AT1G76135)和WUS(基因ID：AT2G17950)的共同表达量，来诱导体胚发生。

所述的调控植物体细胞胚胎发生的方法，miR394通过协同浓度梯度DEX诱导的WUS-GR蛋白促进体细胞胚的形成。

所述的调控植物体细胞胚胎发生的方法，DEX浓度为不大于10μM。

所述的调控植物体细胞胚胎发生的方法，DEX浓度为0.1nM～0.1μM。

所述的调控植物体细胞胚胎发生的方法，DEX浓度为1nM。

所述的调控植物体细胞胚胎发生的方法，在体胚发生的早期阶段，通过调控miR394和WUS的共同表达量，促进体细胞胚的形成。

miR394在调控植物体胚发生中的应用。

miR394协同WUS的表达在调控植物体胚发生中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本申请试验结果表明：

(1)WUS蛋白对体胚发生的调控具有剂量效应，适量WUS蛋白是调控体胚发生的重要影响因素。适量WUS蛋白促进体细胞胚的形成，起始难获得体细胞胚的Ler进行体胚发生；过量WUS蛋白诱导愈伤组织的形成。

(3)WUS蛋白对体胚发生的调控具有阶段效应。试验结果表明，WUS调控体胚发生早期阶段，对体胚发生的效率有促进作用；相反地，应用WUS调控体胚发生后期，不能有效起始Ler进行体胚发生。

(4)miR394可以协同WUS进一步促进体细胞胚的形成，miR394功能缺失抑制WUS对Ler体胚形成的促进作用，且降低Col拟南芥体胚发生的效率，由此证明miR394对体胚发生的重要调控作用。

综上，本申请的试验结果显示WUS促进体胚发生具有剂量效应和阶段效应，并且miR394不仅可以促进WUS调控茎尖分生组织发育，同时也可以提高WUS对体胚发生的诱导效率，进而将不易体胚发生的Ler拟南芥转化为可高效进行体细胞胚胎发生的植物。本申请不仅可以有效调控植物体胚发生，而且对重要经济植物的快速育种具有重要意义。

附图说明

图1是浓度梯度DEX调控WUS-GR诱导体胚发生第一阶段表型结果图；图中，在Mock，1nM，10nM和10μM DEX处理下Ler对照组(A-D)，p35S：WUS-GR(E-H)，p35S：MIR394B/p35S：WUS-GR(I-L)以及pRPS5A：MIM394/p35S：WUS-GR(M-P)体胚发生第一阶段诱导结果；箭头表示细胞明显增殖部位；比例尺：0.05cm；

图2是浓度梯度DEX调控WUS-GR蛋白诱导体胚发生第二阶段表型结果图；图中，在Mock，1nM，10nM和10μM DEX处理下Ler对照组(A-D)，p35S：WUS-GR(E-H)，p35S：MIR394B/p35S：WUS-GR(I-L)以及pRPS5A：MIM394/p35S：WUS-GR(M-P)体胚发生第二阶段的诱导结果。箭头表示未成熟体胚；比例尺：0.1cm；

图3是愈伤组织诱导阶段miR394协同WUS调控未成熟体细胞胚形成的统计数据结果图；“*”表示p＜0.05，“**”表示p＜0.01，“***”表示p＜0.001；

图4是miR394协同浓度梯度DEX诱导的浓度梯度WUS-GR蛋白调控体细胞胚胎形成结果图；图中，Ler对照组(A-D)，p35S：WUS-GR(E-H)，p35S：MIR394B/p35S：WUS-GR(I-L)以及pRPS5A：MIM394/p35S：WUS-GR(M-P)外植体诱导获得的体胚形成结果；箭头表示体细胞胚；比例尺：0.1cm；

图5是miR394促进浓度梯度DEX诱导的浓度梯度WUS-GR蛋白调控体细胞胚胎形成数量统计数据结果图；“*”表示p＜0.05，“**”表示p＜0.01，“***”表示p＜0.001；

图6是CLV3：GUS在体胚形成材料中的表达模式结果图；图中，不同浓度DEX处理WUS-GR后，pCLV3：GUS在Ler对照组(A-D)，p35S：WUS-GR(E-H)，p35S：MIR394B/p35S：WUS-GR(I-L)以及pRPS5A：MIM394/p35S：WUS-GR(M-P)外植体诱导的体胚形成材料中的表达模式；蓝色表示CLV3：GUS染色区域；比例尺：0.1cm；

图7是DEX诱导WUS-GR作用于体胚发生第一二阶段获得的体胚结果图；图中，Ler对照组(A-D)，p35S：WUS-GR(E-H)，p35S：MIR394B/p35S：WUS-GR(I-L)以及pRPS5A：MIM394/p35S：WUS-GR(M-P)外植体在DEX作用与体胚发生第一二阶段诱导获得的体胚形成结果；比例尺：0.1cm；

图8是DEX诱导WUS-GR作用于体胚发生第一二阶段获得的体胚效率统计结果图；“*”表示p＜0.05，“**”表示p＜0.01，“***”表示p＜0.001；

图9是1nM DEX诱导WUS-GR蛋白作用于体胚发生不同阶段后获得体细胞胚数量统计结果图；“**”表示p＜0.01，“***”表示p＜0.001；

图10是内源MIR394B功能缺失突变导致体胚诱导效率下降结果图；图中，(A)Col野生型和(B)mir394b-1突变体外植体诱导体胚形成表型；(C)Col野生型和mir394b-1体胚形成数量统计。数据分析使用one-way ANOVA test，“*”表示p＜0.05。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本申请做进一步的说明。以下实施例中未做详细说明的操作步骤和条件，均可以采用本领域的常规操作或试剂盒说明进行。

实施例1

本实施例所使用的植物材料与培养条件为：

Ler拟南芥背景下实验材料：

(1)p35S：WUS-GR，pCLV3：GUS；

(2)p35S：MIR394B，p35S：WUS-GR，pCLV3：GUS；

(3)pRPS5A：MIM394，p35S：WUS-GR，pCLV3：GUS.

转基因株系由德国弗莱堡大学Thomas Laux教授实验室提供。

Col拟南芥背景下实验材料：

(1)mir394b-1突变体植株；

将上述株系以及野生型拟南芥种子种于营养土中，置于4℃黑暗环境春化处理3-4天后，然后置于光照环境16h光照/8h黑暗的光照培养箱中待其萌发，培养环境温度22℃-23℃。每周浇水2-3次，维持拟南芥正常生长。

2、本实施例所使用的实验方法

(1)阳性植株鉴定：

待植株长大后，取叶片提取DNA，PCR检测阳性植株。结果显示，实验中使用的转基因植株无性状分离出现，即所用转基因植株均为阳性纯合转基因植株。

Ler背景下阳性转基因植株鉴定引物：

表1基因分型检测引物

mir394b-1突变体检测引物及方法：

表2 mir394b-1突变体鉴定引物

PCR反应获得目的大小PCR产物(155bp)后，用Msel酶切4h，凝胶电泳显示突变体条带大小为127bp+28bp；若酶切后条带大小没有变化，则为非mir394b-1突变体。

(2)以未成熟胚为起始材料的体胚发生诱导

取拟南芥弯鱼雷胚时期荚果进行灭菌处理，具体操作：取拟南芥荚果于三角瓶中，1％次氯酸钠溶液处理12-15min，倒掉溶液；无菌水清洗荚果3-5次备用。

解剖镜下取出拐杖胚置于培养基上进行体胚发生诱导，Col背景拟南芥体胚诱导步骤及培养条件：B5+4.5μM 2.4-D固体培养基，16h光照/8h黑暗环境，温度为22℃，培养10天；B5+9μM 2.4-D固体培养基，黑暗环境，温度为22℃，培养14天；B5+0μM 2.4-D固体培养基，黑暗环境，温度为22℃，培养10天。

Ler背景下拟南芥体胚诱导增加了DEX处理：B5+4.5μM 2.4-D固体培养基+Mock或者DEX，16h光照/8h黑暗环境，温度为22℃，培养10天；B5+9μM 2.4-D固体培养基+Mock或者DEX，黑暗环境，温度为22℃，培养14天；B5+0μM 2.4-D固体培养基+Mock或者DEX，黑暗环境，温度为22℃，培养10天。

在使用DEX/GR诱导体系调控WUS-GR诱导体胚发生的试验中，DEX使用浓度为：0μM，0.1nM，1nM，10nM，0.1μM，1μM和10μM。

(3)体胚发生不同阶段添加DEX处理诱导WUS-GR，具体阶段如表3所示。

表3体胚发生不同阶段添加1nM DEX(或者Mock)诱导WUS-GR

T1

T2

T3

T4

T5

T6

T7

第一阶段

+

第二阶段

+

第三阶段

+

注：T1-T7为不同阶段添加1nM DEX处理方式；“+”指添加DEX处理阶段。

(4)体胚诱导材料GUS染色及显微观察

取每个阶段诱导材料于2mL离心管中进行GUS染色(GUS溶液：0.2％Triton-X-100、50mM NaPO4(pH 7.2)、2mM Ferro-K、2mM Ferri-K、2mM X-Gluc)，具体操作步骤：(1)用置于冰上的90％丙酮收集植物组织；(2)置于室温孵育20-30min；(3)移除丙酮，并用不含X-Gluc的染液漂洗植物组织；(4)去除漂洗液，加入含有X-Gluc的染液进行GUS染色；(5)将浸泡GUS染液的植物组织抽真空处理30min；(6)真空处理后，将植物组织置于37℃暗环境孵育，随时观察GUS染色程度，避免过程染色；(7)染色完成后，移除染液，然后加入70％乙醇溶液终止染色；(8)移除70％乙醇溶液，加入100％乙醇；(9)去除100％乙醇，依次加入10％，20％，30％……100％的乙醇溶液，进行固色；(10)取出组织，去除表面酒精后置于添加透明液的载玻片上，透明处理2h-4h后，取材料于体视显微镜下进行观察拍照。

3、miR394提高适量WUS蛋白诱导体胚发生的效率

体胚发生第一阶段诱导结果显示，在1nm DEX处理时，WUS单独过表达(p35S：WUS-GR)可诱导未成熟胚在茎尖分生组织及下胚轴区域形成类似于愈伤组织的结构(图1F)，随着DEX浓度的增加，形成愈伤组织的区域扩大，10nM DEX处理时，整个茎尖分生组织和下胚轴被愈伤组织覆盖(图1G)，10μM DEX处理时，未成熟胚的子叶，茎尖分生组织以及整个下胚轴区域都有愈伤组织形成(图1H)。同样地，在MIR394B和WUS共过表达(p35S：MIR394B/p35S：WUS-GR)时，1nM DEX处理，未成熟胚在下胚轴和茎尖分生组织形成愈伤组织，10nM DEX处理时，未成熟胚除了在茎尖分生组织和下胚轴形成愈伤组织外，在子叶部位也可以观察到少量愈伤组织的形成，10μM DEX处理时，除了子叶顶部，整个未成熟胚都有愈伤组织覆盖。另外，MIM394和WUS共过表达(pRPSSA：MIM394/p35S：WUS-GR)时，在浓度梯度的DEX处理下，未成熟胚形成愈伤组织的范围主要集中在茎尖分生组织和下胚轴区域(图1M-P)。然而，在体胚发生第一阶段，野生型Ler对照组在尖分生组织周围可观察到细胞增殖(图1A-D)，其胚根端没有发生明显的表型变化，与转基因植株在胚根端形成类似愈伤组织的结构差异较大。

在体胚发生第二阶段，9μM 2，4-D诱导愈伤组织形成结果显示，包括Ler野生型在内的所有试验植株外植体均形成愈伤组织(图2)。但是，在浓度梯度的DEX处理下，WUS单独过表达(p35S：WUS-GR)诱导获得的愈伤组织随着DEX浓度的增加逐渐增加；1nM DEX处理时，WUS单独过表达诱导形成白色愈伤组织和少量未成熟胚；10nM DEX处理时，WUS单独过表达诱导外植体平均形成2.57个未成熟胚；10μM DEX处理时，WUS单独过表达诱导形成淡黄色愈伤组织，而且愈伤组织的细胞增殖明显大于1nM DEX处理时WUS蛋白诱导的结果(图2F-H)。同样地，miR394和WUS共同过表达(p35S：MIR394B/p35S：WUS-GR)植株中，10μM高浓度DEX诱导淡黄色愈伤组织的形成(图2L)，而1nM DEX和10nM DEX处理时，除诱导形成愈伤组织外，分别诱导外植体平均形成9.68和5.55个未成熟体胚(图2J、图2K和图3)，并且未成熟体胚数量显著性高于仅WUS过表达(p35S：WUS-GR)时诱导获得的未成熟体胚的数量(图3)。然而，在愈伤组织诱导阶段，MIM394和WUS共同过表达(pRPSSA：MIM394/p35S：WUS-GR)植株外植体在使用的各浓度DEX处理条件下，均只有诱导愈伤组织形成，没有未成熟体胚形成，而且愈伤组织体积随DEX浓度增加而逐渐增加(图2M-P和图3)。

在体胚发生第三阶段，将愈伤组织转移至无生长素的B5培养基上，进行体胚诱导培养。结果显示，浓度梯度的DEX处理WUS-GR诱导不同效率的体胚发生。三个转基因植株：WUS单独过表达(p35S：WUS-GR)植株，miR394和WUS共过表达(p35S：MIR394B/p35S：WUS-GR)植株，MIM394和WUS共过表达(pRPS5A：MIM394/p35S：WUS-GR)植株，其外植体诱导获得的体胚数量均随DEX浓度的升高先增加后减少，且均在10nM DEX处理后获得的体胚数量最高，其中WUS单独过表达可诱导外植体平均获得3.98体胚(图4G和图5)；miR394和WUS共过表达诱导外植体平均10.4个体胚，其体胚数量较WUS单独过表达诱导的体胚数量显著性增加(图4K和图5)；与之相反，MIM394和WUS共过表达诱导获得体胚数量较WUS单独过表达诱导的体胚数量减少(图4O)，其外植体平均获得2.19个体胚(图5)。

此外，miR394和WUS的共同过表达在使用的各DEX浓度下诱导获得的体胚数量均比WUS单独过表达时诱导的体胚数量高，MIM394和WUS的共同过表达诱导的体胚数量均比WUS单独过表达时诱导的体胚数量低(图5)，而野生型Ler外植体诱导获得体胚数量相对于转基因植株而言数量极低，外植体平均诱导获得体胚数量最多为0.028个，大部分的外植体仅诱导获得由毛状结构覆盖的愈伤组织(图4A-D和图5)。

本实施例通过GUS染色检测pCLV3：GUS，分析WUS蛋白靶基因CLV3在体胚发生第三阶段的表达量。从CLV3：GUS表达模式来看，WUS单独过表达(p35S：WUS-GR)植株，miR394和WUS共过表达(p35S：MIR394B/p35S：WUS-GR)植株和MIM394和WUS共过表达(pRPS5A：MIM394/p35S：WUS-GR)植株外植体诱导材料中的CLV3：GUS均随DEX的浓度增加而表达量逐渐上升(图6)。与体胚发生第二阶段诱导结果相似，WUS单独过表达诱导CLV3表达量比MIM394和WUS共同过表达诱导CLV3的表达量高。

综上所述，浓度梯度的DEX处理WUS-GR致使WUS蛋白诱导由CLV3表征的愈伤组织逐渐增多，但诱导获得的体胚数量先增加后减少，MIM394抑制WUS诱导体胚的形成，相反地，miR394促进WUS诱导体胚的形成。这些结果说明，WUS蛋白诱导体胚形成具有剂量效应，WUS过量表达的确可以促进胚性愈伤组织的形成，但只有相对适量浓度的WUS蛋白可诱导体细胞胚胎的形成，而且miR394可以促进适量WUS调控体胚形成的作用。

4、WUS作用于拟南芥体胚发生早期调控体胚形成

首先，在体胚发生的前两个阶段，用浓度梯度DEX处理，第三阶段不添加DEX，其结果如图7和图8所示，在用10nM DEX处理后，WUS单独过表达(p35S：WUS-GR)外植体诱导获得体胚均值是4.29，在10μM DEX作用下，诱导获得的体胚数量比低浓度DEX诱导获得的体胚数量显著性减少(图7H)，其均值是2.69(图8)；同样地，在10nM DEX作用下，miR394和WUS共过表达(p35S：MIR394B/p35S：WUS-GR)植株外植体诱导获得体胚数量均值是10.21，显著性高于相同条件下WUS单独过表达植株外植体的诱导结果(图8)，但在10μM DEX作用下，miR394和WUS共过表达诱导的体胚数量也显著性减少，外植体平均诱导获得的体胚数量是2.46，与相同条件下WUS单独过表达植株外植体的诱导结果差异不明显(图8)。然而，在使用的各个浓度DEX处理下，MIM394和WUS共过表达(p35S：WUS-GR/p35S：MIM394)诱导获得的主要是愈伤组织，仅有少量体胚的形成；在1nM DEX处理下，MIM394和WUS共过表达诱导获得体胚数量均值最高，外植体平均获得1.77个体胚(图7J-I和图8)，低于使用的各个DEX浓度下WUS单独过表达诱导的体胚数量，显著性低于miR394和WUS共同过表达诱导获得的体胚数量(图8)。

另外，数据统计分析结果显示，在DEX仅作用于体胚发生第一二阶段的处理方式下，三个转基因植株外植体诱导获得的体胚效率与DEX作用整个体胚发生阶段的诱导结果相近，这两种DEX处理方式下诱导获得的体胚数量无差异显著性(图8和图5)。这些结果说明，第三阶段有无DEX诱导WUS-GR调控体胚发生对体细胞胚的形成影响较小。

在体胚发生不同阶段添加1nM DEX诱导WUS-GR蛋白，并统计其诱导的体胚形成效率。结果发现，仅在体胚发生第一阶段或第二阶段添加DEX，诱导获得的体胚数量比仅在第三阶段添加DEX诱导获得的体胚数量高(图9)；在体胚发生第一二阶段不添加时，即仅使用4.5μM和9μM 2，4-D的B5培养基诱导转基因植株及野生型Ler形成愈伤组织，在第三阶段用添加1nM DEX的B5基础培养基进行体胚诱导，结果显示转基因植株外植体形成体细胞胚的数量都很低，每个外植体平均仅诱导0.06-0.34个体胚形成，这些结果说明仅在体胚形成阶段使用DEX诱导WUS-GR不能有效起始Ler形成体细胞胚(图9)。

在第一阶段和第二阶段均添加DEX诱导WUS-GR的处理方式致使转基因植株体胚发生获得的体胚效率最高(图9)。而且，在1nM DEX处理不同体胚发生阶段的方式下，miR394和WUS共过表达的未成熟胚诱导获得的体胚效率均最高，MIM394和WUS共过表达的未成熟胚诱导获得的体胚数量最低。这些结果进一步证实miR394对WUS调控体胚发生的促进作用，相反地，MIM394抑制了WUS对体胚发生的促进作用。

综上所述，WUS过表达促进Ler进行体胚发生的关键阶段是体胚发生早期诱导阶段，即生长素作用诱导愈伤组织形成阶段，由此证明WUS调控体胚发生的阶段效应。而且，miR394可提高WUS蛋白作用于不同阶段后的体胚发生效率，促进WUS蛋白诱导的体细胞胚的形成。

5、内源MIR394B调控体胚发生效率

浓度梯度DEX诱导浓度梯度WUS蛋白调控体胚发生的试验结果表明，WUS促进体胚发生具有剂量效应，且miR394显著性地提高适量WUS诱导的体胚形成效率。然而，在Mock处理条件下，WUS-GR融合蛋白理论上位于细胞质，致使WUS蛋白无法发挥转录因子的调控作用，因此，此时miR394和WUS共同过表达植株p35S：MIR394B/p35S：WUS-GR中仅有MIR394B过表达并发挥作用。然而，结果显示，仅miR394过表达并没显著性地提高体细胞胚的形成(图4I和图5)。由此可知，仅miR394过表达无法起始野生型Ler进行体胚发生。但是，MIM394和WUS共同过表达诱导体胚发生的效率比WUS单独过表达诱导的体胚发生效率低(图5)，这个结果说明MIM394过表达起到抑制WUS促进体胚发生的作用，换而言之，WUS单独过表达促进体细胞胚胎的形成和内源miR394的作用相关。

将哥伦比亚(Col)野生型和mir394b-1突变体拟南芥用于体胚发生试验。与Ler体胚发生不同，在本试验使用的体胚发生方法下，Col野生型拟南芥可诱导获得一定量的体胚。结果显示，在体胚发生第一步和第二步诱导结束后，野生型Col和mir394b-1诱导状态无明显差别。但是，在体胚发生第三阶段，mir394b-1愈伤组织诱导产生的体细胞胚数量与野生型Col相比显著减少(图10A-C)，外植体平均诱导获得的体胚数量是1.21，显著性低于野生型Col外植体诱导获得体胚的数量2.61，由此说明内源性MIR394B的表达对体胚发生效率具有重要的调控作用。

Claims

1.一种调控植物体细胞胚胎发生的方法，其特征在于，以植物未成熟合子胚为外植体，通过调控miR394和WUS的共同表达量，来诱导体胚发生；其中，miR394通过协同浓度梯度DEX诱导的WUS-GR蛋白促进体细胞胚的形成；DEX浓度为1nM～10μM。

2.根据权利要求1所述的调控植物体细胞胚胎发生的方法，其特征在于，在体胚发生的第一阶段和第二阶段，通过调控miR394和WUS的共同表达量，促进体细胞胚的形成。