CN111201028A - 桑属植物的根提取物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及桑属植物(特别是白桑和黑桑)的根提取物，该根提取物富含选自以下的异戊二烯化的多酚：桑白皮素A、桑白皮素B、桑黄酮C、维替鲁明F和桑色呋喃T，本发明涉及制备这种提取物的方法，以及化妆品组合物和药物组合物或营养组合物，所述组合物包含作为活性剂的至少一种根据本发明的桑属植物的根提取物。

Description

桑属植物的根提取物及其用途

技术领域

本发明属于植物提取物领域，涉及富含异戊二烯化多酚的桑属(genus Morus)植物(特别是白桑(Morus alba)和黑桑(Morus nigra))的根提取物，涉及制备这类提取物的方法，以及化妆品组合物和药物组合物或营养组合物，所述组合物包含作为活性剂的至少一种根据本发明的桑属植物的根提取物。

现有技术

桑属植物，桑科乔木或灌木可能是具有有益活性的酚类化合物的来源(Thelatest review on the polyphenols and their bioactivities of Chinese Morusplants；Yang Y等人；J Asian Nat Prod Res.2014；16(6):690-702)。传统上，桑属植物特别是白桑的根皮、茎和叶被用作治疗糖尿病、关节炎或风湿病的中药。在它们的许多优点中，提取物因其降血压、抗炎和抗菌活性而闻名。已经显示出这些性质归因于它们的多酚含量，特别是白藜芦醇衍生物，例如桑皮苷A、Diels-Alder型加合物和桑白皮素或桑黄酮型的异戊二烯型黄酮。

酪氨酸酶是限制黑色素合成速率的酶，并且是抵抗色素沉着过度的主要靶点。从白桑、黑桑和鸡桑(Morus australis)的根、茎和叶中获得的提取物通常在化妆品行业用作皮肤美白剂。这些提取物包含抑制酪氨酸酶活性的化合物，例如黑桑根(Tyrosinaseinhibitory constituents from the roots of Morus nigra:a structure-activityrelationship study；Zheng ZP等人；J Agric Food Chem.2010May 12；58(9):5368-73)或白桑根皮(Prediction of tyrosinase inhibitory activities of Morus alba rootbark extracts from HPLC fingerprints；Kyo Bin Kang等人；Microchemical Daynal,2013,110,731–738)中鉴定出的桑白皮素A和桑白皮素B，或白桑叶中鉴定出的桑黄酮C(Characterization of Melanogenesis Inhibitory Constituents of Morus albaLeaves and Optimization of Extraction Conditions Using Response SurfaceMethodology Molecules；Jeong JY等人；Molecules 2015May 14；20(5):8730-41)。

维替鲁明F和桑色呋喃T是Diels-Alder型加合物(查尔酮和异戊二烯化的2-芳基苯并呋喃的加合物)。第一个加合物是从长穗桑(Morus wittiorum)的茎皮中分离出来的(维替鲁明A-F,antioxidant Diels-Alder-type adducts from Morus wittiorum；Tan YX等人；Planta Med.2009Feb；75(3):249-55)，第二个加合物是从白桑的愈伤组织中或在蒙桑(Morus mongolica)的根皮中分离出来的(Five new Diels-Alder type adducts fromthe stem and root bark of Morus mongolica；Kang J.等人；Planta Med.2006Jan；72(1):52-9)。申请WO 2013/181296描述了一种组合物，其包含查尔酮与异戊二烯基苯基化基团的Diels-Alder型加合物，以及至少一种其他的体重控制剂，用于治疗、预防或控制哺乳动物的体重增加。

为了满足化妆品和药物领域中日益增长的需求，对鉴定能够高效抑制酪氨酸酶活性的新型天然化合物方面有广泛关注。

为了满足该需求，本发明人现在已经开发了一种方法，该方法能够制备富含异戊二烯化多酚的桑属植物的根提取物。事实上，发明人已经表明，桑属植物，特别是白桑和黑桑在特定条件下的培养可以用于获得所述植物的根提取物，所述植物的根提取物富含异戊二烯化多酚，并存在维替鲁明F和桑色呋喃T。发明人首次证明了这后两种化合物对酪氨酸酶的亲和力。出人意料地，这种亲和力强于已知的抑制剂，例如桑白皮素A、桑白皮素B和桑黄酮C。根据有关亲和力的结果，维替鲁明F具有最佳的抑制活性，其次是桑黄酮C，然后是桑白皮素B和桑白皮素A。出人意料的是，根提取物中存在的桑白皮素A和桑白皮素B、桑黄酮C，维替鲁明F和桑色呋喃T也对胶原酶具有亲和力，这是通过提取物对胶原酶的强抑制作用所证实的。再次出人意料的是，根提取物中存在的桑白皮素A和桑白皮素B、桑黄酮C、维替鲁明F和桑色呋喃T对透明质酸酶也具有亲和力，这是通过提取物对透明质酸酶的强抑制作用，特别是桑白皮素A的强活性所证实的。

这种类型的方法也可以用于连续提取而不会破坏或改变植物的存活。

最后，发明人已经证明，根据本发明的根提取物除了具有美白功效或抗老化作用，例如对皮肤强度、紧实度、密度、弹性或实际上对光滑外观(抑制透明质酸酶和抑制胶原酶)的影响，还可作为用于促进皮肤愈合的药物，特别是在伤口闭合的情况下。

附图说明

图1A至图1C：根据实施例1，由未刺激(图1A)或刺激(图1B)的白桑根制备的提取物或由干燥的白桑根皮(图1C)制备的提取物的色谱图(265nm处的UV)，其在注射前稀释5倍。根据实施例1，峰1、峰2、峰3、峰4和峰5分别对应于桑白皮素B、桑黄酮C、桑白皮素A、维替鲁明F和桑色呋喃T。

图2：根据实施例2，直方图显示了酪氨酸酶的活性百分率与白桑未刺激根提取物的稀释因子的关系。评估了稀释因子150的中位抑制浓度(IC₅₀)，该浓度对应于由0.13mg干物质在1mL纯乙醇中制备的提取物。

图3A和图3B：使用专利申请FR 1670545中所述的称为Target

的方法，在评估非刺激白桑根提取物对酪氨酸酶的亲和力期间，参考样品(图3A)和根据实施例2.3获得的上清液(图3B)的色谱图(290nm处的UV)。在图3A中，编号的峰分别对应于以下化合物：桑白皮素B(1)、桑黄酮C(2)、桑白皮素A(3)、维替鲁明F(4)和桑色呋喃T(5)。

图4A和图4B：使用称为Target

的方法，在评估非刺激白桑根提取物对胶原酶的亲和力期间，参考样品(图4A)和根据实施例3.2获得的上清液(图4B)的色谱图(290nm处的UV)。在图4A中，编号的峰分别对应于以下化合物：桑白皮素B(1)、桑黄酮C(2)、桑白皮素A(3)、维替鲁明F(4)和桑色呋喃T(5)。

图5：直方图显示根据实施例5，在白桑的经刺激的根的提取物中，桑白皮素B的含量以及以桑白皮素B当量表示的桑白皮素A、桑黄酮C、维替鲁明F和桑色呋喃T的含量随根浸渍持续时间的变化。对于每种浸渍条件，从左到右分别显示了桑白皮素B、桑黄酮C(以桑白皮素B的当量计)、桑白皮素A(以桑白皮素B的当量计)、维替鲁明F(以桑白皮素B的当量计)、桑色呋喃T(以桑白皮素B的当量计)的各自浓度(mg/L)。

图6A和图6B：使用专利申请FR 1670545中所述的称为Target

的方法，在评估非刺激白桑根提取物对透明质酸酶的亲和力期间，参考样品(图6A)和根据实施例6.2获得的上清液(图6B)的色谱图(290nm处的UV)。在图6A和图6B中，编号的峰分别对应于以下化合物：桑白皮素B(1)、桑黄酮C(2)、桑白皮素A(3)、维替鲁明F(4)和桑色呋喃T(5)。

具体实施方式

本发明涉及桑属植物的根提取物，其特征在于：

·相对于干提取物的总重量，其包含至少2重量％，优选至少2.3重量％、至少3重量％、至少4重量％、至少5重量％、至少6重量％，更优选至少7重量％的桑白皮素B，

·相对于干提取物的总重量，其包含按桑白皮素B当量计至少0.05重量％，优选至少0.1重量％、至少0.5重量％、至少1重量％、至少1.5重量％，更优选至少2重量％的桑白皮素A，

·相对于干提取物的总重量，其包含按桑白皮素B当量计至少0.1重量％，优选至少0.5重量％、至少1重量％、至少1.5重量％、至少2重量％，更优选至少2.5重量％的桑黄酮C，并且

·其包含以下两种化合物中的至少一种：

-相对于干提取物的总重量，按桑白皮素B当量计至少0.1重量％，优选至少0.4重量％、至少0.5重量％、至少0.6重量％、至少0.7重量％，更优选至少0.8重量％的维替鲁明F，

-相对于干提取物的总重量，至少为0.1重量％，优选至少0.2重量％、至少0.3重量％、至少0.4重量％，更优选至少0.5重量％的桑色呋喃T。

术语“桑属植物的根提取物”是指通过从桑属植物的根中提取而获得的产物。所述提取可以通过本领域技术人员已知的任何方式进行，优选通过本专利申请中描述的方式之一进行。优选地，这是指通过从无土条件下，特别是气培条件下栽培的桑属植物的根中提取获得的产物。

术语“多酚的异戊二烯化衍生物”是指桑白皮素B、桑白皮素A、桑黄酮C、维替鲁明F和桑色呋喃T的系列化合物。

术语“桑白皮素B”(也称为桑黄酮G)是指具有以下通式(I)的化合物：C₄₀H₃₆O₁₁

术语“桑白皮素A”(也称为桑黄酮H或Albalin G)是指具有以下通式(II)的化合物：C₄₅H₄₄O₁₁

术语“桑黄酮C”是指具有以下通式(III)的化合物：C₂₅H₂₆O₆

术语“维替鲁明F”是指具有以下通式(IV)的化合物：C₃₉H₃₆O₉

术语“桑色呋喃T”是指具有以下通式(V)的化合物：C₄₄H₄₄O₉

术语“干提取物”是指通过进行包括根据本发明的方法的任何类型的提取方法，之后进行干燥该提取物的步骤而获得的提取物，干燥可使用本领域技术人员众所周知的任何方法进行，特别是在热的干燥气氛中处理提取物。

因此，根据一个优选的方面，“干提取物”是通过实施根据本发明的方法，随后进行干燥该提取物的步骤而获得的提取物。

通过测量在用于所述根提取物的HPLC分析的色谱图上对应于所述化合物的峰的面积来确定选自以下的化合物在根提取物中的浓度：桑白皮素A、桑黄酮C、维替鲁明F和桑色呋喃T，所述峰的面积与色谱图上桑白皮素B对应的峰的面积有关，用于HPLC分析的标准溶液包含100mg/L桑白皮素B；因此，“桑白皮素B的当量”等于：

为了获得根提取物，当判断根部充分发育时，使它们与溶剂接触，任选地通过浸入，或优选通过浸渍使它们接触，然后回收并处理所述溶剂以从中提取由所述植物的根释放的目标化合物。这种方法适应性改编自Plant Advanced Technologies(PAT)开发的名为“PAT Plantesà

”[Plant

]的方法，并在国际申请WO 01/33942中进行了描述。

根据一个优选的方面，根据本发明的桑属植物的根提取物是选自白桑和黑桑的桑属植物的根提取物。更优选地，其是白桑的根提取物。根据特定的方面，根据本发明的桑属植物的根提取物是选自无土条件下，特别是气培条件下栽培的白桑和黑桑的桑属植物的根提取物。

在第二方面，本发明涉及一种用于制备根据本发明的桑属植物的根提取物的方法，该方法包括：

a)在无土条件下，优选气培条件下栽培桑属植物的步骤，

b)任选地，刺激植物根部的步骤，

c)根的固/液提取步骤，任选地根在步骤b)中进行刺激，和

d)回收在步骤c)中获得的提取物。

在本发明的上下文中，术语“在无土条件下栽培植物”是指其中植物的根不在土里的任何培养方式。更准确地说，无土栽培是指植物的根部位于与土地不连接的重组培养基中的栽培。定期用适合栽培植物的营养液灌溉该培养基。

存在不同的无土栽培技术，例如需要富含氧的营养液的无底物系统和带有底物的系统。可以列举的无底物系统是水培，其中营养液不循环并容纳在培养池中；营养膜技术或N.F.T.，其中营养液通过与空气交换而在其置换过程中富含溶解的氧，以及气培。具有底物的系统包括地下灌溉(其中营养液在其下部渗透到底物中)和渗滤，其中营养液通过不连续灌溉分配在系统的上表面，然后向底物的底部渗滤。可以是无机或有机的底物是中性和惰性的，例如沙子、黏土或岩棉。该底物也可以是工业来源的。

术语“气培植物培养”是指无土壤的培养模式，其中植物的根既不与固体培养基接触，也不与液体培养基接触。根据具体的实施方案，通过使用雾化器将营养液在封闭的介质中雾化而获得的营养雾来给植物施肥。

通常，在根据本发明的方法中，可以将植物放置在平板上，使植物在空中的部分在平板上方，根部在下方，将平板放在形成固定区域的桌子上，以收集散布到植物上的多余液体，然后将平板转移到带有多个工作站的桌子上。

在步骤a)中，通过根部喷洒必需的矿物质盐(氮-N，磷-P，钾-K)的营养液来对气培的植物施肥，以在不改变植物存活的情况下获得最大程度的根部发育和最大浓度的目标化合物。本领域技术人员借助其常识将知道如何调整各种无机盐的比例和浓度，以优化根部发育和目标化合物的浓度。在这种情况下，营养溶液中无机盐的浓度包括在电导率范围内，该范围有利地为0.8mS/cm至1.6mS/cm，优选1mS/cm至1.2mS/cm，以使植物最大程度地生长，具有更高的根生物质产量，并有利于获得提取物中异戊二烯化多酚的更高含量。

在根据本发明的方法的步骤c)中，术语“固/液提取”是指任何溶剂提取技术，其由提取存在于固体中并且可溶于所述溶剂的化学物质组成。可以列举的提取技术是浸渍、浸没、渗出、浸入、煎煮、使用索氏提取器和熊川提取器进行提取、微波辅助提取、超声辅助提取、酶促提取、使用超临界流体(CO₂+二丙二醇)进行提取。通过使浸出液或溶剂与在特定溶剂中的切碎的根接触，并持续适当的时间，提取可回收植物的任一部分，尤其是根系中所含的代谢物。

根据特别的方面，在根据本发明的方法中，对任选在步骤b)期间刺激的根进行固/液提取的步骤c)，通过浸渍的方式进行。

根据一个特别的方面，在根据本发明的方法中，对任选在步骤b)期间刺激的根进行固/液提取的步骤c)包括将根切碎。

通常，将植物置于板上，植物在空中的部分在板上，根部在板下面。将植物的根部部分切碎的切碎步骤意味着可以获得切碎的根。可以从切碎的根中提取物质。

根据另一个优选的方面，在新切碎的根上进行根的浸渍，即在少于24小时切碎，并且优选在切碎后尽快、理想地是在切碎后立即进行浸渍。特别地，根浸渍可以通过以下步骤进行：将新鲜切碎的根在合适的溶剂中在合适的pH下浸渍合适的时间。

优选地，根的浸渍在切碎的根上进行，切碎的根也可以任选地被干燥。根据非常具体的方面，根的浸渍在任选被干燥的切碎的根上进行，然后粉碎。可以通过进行本领域技术人员已知的任何合适的干燥方法来干燥根，特别是通过将根在30℃至50℃的温度下放置4小时至72小时，优选在干燥环境中进行干燥。根特别可以在通风炉中干燥。可以通过进行本领域技术人员已知的任何合适的粉碎方法来粉碎根部，特别是通过将根部放置在球磨机、切割机或圆筒粉碎机中。例如，可以将干燥的根粉碎直到获得粉末。

更具体地，根据本发明的方法的步骤c)包括使根部置于存在选自以下的溶剂之处：醇、二醇和低共熔溶剂。所述醇优选地选自乙醇和甲醇，其以纯的或以醇的水溶液形式使用，其包含10％至99.9％，更特别地40％至90％，还更特别地50％至85％的醇。所述二醇是其中两个羟基在不同碳原子上的二醇，选自二丙二醇、1,3-丙二醇、1,2-丙二醇和丁二醇，以纯的或以二醇水溶液的形式使用，其包含10％至99.9％，更特别地40％至90％，还更特别地50％至85％的二醇。所述低共熔溶剂由两种或两种以上组分组成，其可以是固体或液体，并且在特定的组成中，其显示出熔融温度显著降低，从而使混合物呈液体。天然的低共熔溶剂主要由氨基酸、有机酸、糖和胆碱衍生物组成。水可能形成溶剂的一部分，但在这种情况下，它会牢固地保留在液体中并且无法蒸发。构成所述低共熔溶剂的组分的特定组合特别但非穷举地选自氯化胆碱-葡萄糖(比例1：1)、氯化胆碱-柠檬酸(比例1：1)、氯化胆碱-柠檬酸(比例2：1)、氯化胆碱-蔗糖(比例4：1)、氯化胆碱-蔗糖(比例1：1)、氯化胆碱-酒石酸(比例2：1)、氯化胆碱-木糖(比例2：1)、氯化胆碱–木糖(比例3：1)、柠檬酸–蔗糖(比例1：1)、柠檬酸–葡萄糖(比例1：1)、葡萄糖–酒石酸(比例1：1)、氯化胆碱–尿素(比例1：2)、氯化胆碱-木糖醇-水(2：1：3)和乳酸-葡萄糖-水(5：1：3)。

术语“丁二醇”是指1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、2,3-丁二醇和1,4-丁二醇。

这些溶剂，尤其是乙醇、丁二醇、1,3-丙二醇和1,2-丙二醇，可用于促进大量异戊二烯化多酚的提取。

对于至少两种根提取物的混合物，所述至少两种提取物的溶剂可以相同或不同。

根据本发明的特定方面，溶剂的特征在于微酸性的pH，特别是在固/液萃取步骤中使用时。根据特定方面，在固/液萃取步骤中使用的所述醇或所述二醇的特征在于pH为3.5至6.5，优选pH大于或等于4且小于或等于6.5，更优选pH大于或等于4且小于或等于6，还更优选pH为4至4.5。具有酸性至弱酸性pH，即大于或等于3.5且小于或等于6.5的溶剂的使用促进了目标化合物在所述溶剂中的溶解。

根据其他特定方面，根据本发明的提取后的植物提取物的特征在于pH为5至7，优选5.5至6.5。弱酸性至中性的pH限制了提取后异戊二烯化多酚的化学降解或酶促降解。

用于调节溶剂或提取物的pH的酸优选为乳酸、磷酸、柠檬酸或盐酸。

更特别地，所述二醇选自：丁二醇、1,3-丙二醇和1,2-丙二醇。

1,3-丙二醇或三亚甲基二醇可以使用本领域技术人员已知并在文献中描述的技术通过化学合成来制备；其也可以商购获得。所述1,3-丙二醇还可以通过在适合于活生物体，特别是大肠杆菌的基因修饰菌株的条件下进行发酵过程来制备。以这种方式获得的1,3-丙二醇被命名为“生物来源的1,3-丙二醇”；制备这种类型的产物，然后如特别在国际申请WO 2004/101479中描述的那样进行纯化，并以商品名

出售。所述1,3-丙二醇也可以具有生物认证，例如COSMOS类型。

更特别地，在根据本发明的方法中，用于固/液提取的步骤c)包括使根置于存在1,2-丙二醇或1,3-丙二醇，特别是生物来源的和/或生物认证的1,3-丙二醇之处。

根浸渍时长的选择应以能促进大量目标化合物的提取的方式进行。

根据特定方面，根据本发明的方法的步骤c)包括使根在溶剂的存在下持续5分钟至3小时的时间段以浸渍干燥的根并且持续15分钟至96小时，特别是24小时至72小时，更特别是24小时至48小时的时间段，以浸渍新鲜的根。

对于新鲜根的根浸渍，新鲜根的量与溶剂的量之比为0.2kg根/L溶剂至1kg根/L溶剂。

根据其他特定方面，根据本发明的方法包括在使所述根浸渍的步骤之前干燥新鲜切碎的根的步骤，所述浸渍通过使干燥的根置于存在溶剂之处进行。对于根浸渍，干燥根的量与溶剂的量之比为0.01kg根/L溶剂至0.1kg根/L溶剂。

优选地，在搅拌下进行将根置于存在溶剂之处以浸渍根的步骤。

根据特定方面，在切碎根的步骤之后，按照步骤a)将植物进行气培1周至8周，并任选进行步骤b)刺激1天至8周，以恢复其根的发育并促进根产生次生代谢产物。

根据优选的方面，根据本发明的方法是制备白桑或黑桑物种的植物，更优选在无土条件，特别是气培条件下的白桑或黑桑物种的植物的根提取物的方法。

根据优选的实施方案，本发明还提供一种用于制备根据本发明的桑属植物的根提取物的方法，该方法包括：

a)在无土条件下，特别是气培条件下栽培桑属植物的步骤，

b)刺激植物根部的步骤，

c)对在步骤b)中刺激的根的固/液提取步骤，和

d)回收在步骤c)中获得的提取物。

根据另一个特定方面，在根据本发明的方法中，用于刺激植物根的步骤b)包括：

·诱导步骤，其中将根置于存在溶液之处，该溶液包含至少一种选自以下的试剂：盐、表面活性剂、溶剂、真菌、植物或细菌来源的引发剂、茉莉酸的衍生物，特别是茉莉酸甲酯、水杨酸、乙烯发生剂、Coronalone、几丁质、壳聚糖和/或它们的混合物，和/或

·将根置于存在贫氮溶液之处的步骤，即包含的氮的比例小于通常被认为对植物的生长最理想的氮的比例的溶液，有利地小于15％的氮，并且有利地不包含氮，所述步骤连续进行或同时进行。

也可以通过将植物置于存在贫氮营养液之处来刺激根。把植物置于存在贫氮营养液之处会引起“氮胁迫”，从而引起刺激。根据特定方面，根据本发明的贫氮溶液是包含小于15％的氮，优选小于10％的氮，有利地小于8％，更有利地小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％的氮，再更有利地为0％的氮。

步骤b)的刺激可用于显著增加根次生代谢产物的含量，从而促进代谢物的流动，使根留在所选择的提取溶剂中，实际上并没有完全丧失植物的活力，因此可以将其重新培养然后再利用。换句话说，刺激植物的步骤可用于促进目标化合物的产生和分泌。

有利地，步骤b)的根刺激通过用选自水杨酸、Coronalone和壳聚糖的引发剂溶液对植物进行喷雾或浸渍来进行，或者通过向植物施用贫氮N/P/K营养液，并蒸发到根上来进行。

根据本发明的一个特定实施方案，步骤b)通过用选自以下的溶液喷雾或浸渍植物来进行：

·浓度为0.1μM至200μM，有利地为1μM至100μM的Corolanone溶液，

·浓度为1μM至500μM，有利地10μM至50μM的水杨酸溶液，

·浓度为0.002g/L至1g/L，有利地为0.05g/L至0.1g/L的壳聚糖溶液，以及

·N/P/K营养液，其包含少于6％的氮，优选将所述溶液蒸发到根。

此外，有利的是，用引发剂溶液刺激根的步骤b)持续1天至21天，优选1至7天。

根据一个特定方面，通过向植物施用贫氮营养N/P/K溶液，并蒸发到根上来刺激根的步骤b)有利地进行7天至8周，优选3周的时间段。

在步骤b)中，营养溶液中无机盐的浓度使电导率有利地为0.6mS/cm至0.9mS/cm，优选0.6mS/cm至0.8mS/cm，以促进提取物中有更多的异戊二烯化多酚含量。

根据本发明的方法的特定方面，步骤b)在步骤a)之后进行。根据本发明方法的另一个特定方面，步骤b)和步骤a)同时进行；然后将刺激溶液掺入营养液或使用本领域技术人员已知的任何其他施用方式施用。

根据一种改进方案，在“切碎”根的步骤之前是洗涤步骤，其中朝向根分散的液体是净水。因此，这限制了在固/液提取步骤中营养溶液或任何刺激溶液中所含元素的添加。

有利地，本发明提供了一种用于制备桑属植物的根提取物的方法，该方法包括以下步骤：

a)在无土条件下，特别是气培条件下栽培桑属植物的步骤，

b)刺激植物根部的步骤，

c)将在步骤b)中刺激的根进行固/液提取的步骤，包括将所述根切碎，干燥并粉碎，然后将粉碎的根浸入溶剂中，

所述溶剂选自：醇、二醇和低共熔溶剂，并且以纯净形式或以醇、二醇或低共熔溶剂的水溶液形式使用，和

d)回收在步骤c)中获得的提取物。

根据特定方面，在根据本发明的方法中，溶剂的pH为3.5至6.5，优选3.5至6，优选3.5至5，更优选4至4.5。

根据本发明的方法有利地包括补充步骤，其用于重新调节提取物中溶剂的含量，以获得至少50％的有利含量，和/或调节提取物的pH以获得有利的为3至7，优选4至6.5的pH，以利于提取物的保存。

本发明的方法有利地包括至少一个补充步骤，用于纯化和/或处理根提取物；这种步骤特别选自：

·至少一种过滤，特别是纳米过滤和/或灭菌过滤和/或澄清过滤，

·液/固提取，

·纯化，

·浓缩和

·根提取物的脱色。

这样的纯化和/或处理方法是本领域技术人员众所周知的。该步骤可用于获得桑属，优选白桑或黑桑的最终提取物，其富含异戊二烯化多酚，特别是桑白皮素B、桑白皮素A、桑黄酮C、维替鲁明F和桑色呋喃T。

图5示出了随着本发明浸渍持续时间的变化，在白桑的根提取物中，桑白皮素B、桑白皮素A、桑黄酮C、维替鲁明F和桑色呋喃T的不同浓度。

本发明还提供了能够通过根据本发明的方法获得的根提取物。

本发明的第三个目的是提供一种化妆品组合物，其包含作为活性剂的至少一种根据本发明的根提取物或通过根据本发明的方法获得的根提取物，以及至少一种可用于化妆品的赋形剂。有利地，所述根提取物是桑属植物，优选白桑或黑桑的提取物。更优选地，其是白桑的根提取物。根据特定的方面，桑属植物的根提取物是选自无土栽培条件下，特别是气培条件下栽培的白桑或黑桑的桑属植物的根提取物。

根据本发明的化妆品组合物的施用方式、剂量和最佳盖伦剂型可以根据在开发适合于对象，例如皮肤类型的美容处理时通常考虑的标准来确定。

根据本发明的化妆品组合物有利地旨在用于局部应用。它可以特别地为霜、乳液、露、凝胶、精华、喷雾、泡沫、溶液、软膏、乳液、贴剂或面膜的形式。根据本发明的化妆品组合物包含至少一种化妆品可接受的赋形剂，所述赋形剂是根据期望的施用类型来选择的。根据本发明的化妆品组合物还可以包含至少一种本领域技术人员已知的佐剂，其选自增稠剂、防腐剂、香料、着色剂、化学或矿物过滤器、保湿剂、温泉水等。

可用于化妆品的赋形剂可以选自聚合物、硅酮化合物、表面活性剂、流变剂、保湿剂、渗透剂、油性成分、蜡、乳化剂、成膜剂、香料、电解质、pH调节剂、抗氧化剂、防腐剂、着色剂、珍珠母、颜料及其混合物。

根据本发明的化妆品组合物还可以包含至少一种其他化妆品活性剂，例如另一种抗老化剂、保湿剂、具有镇静、舒缓或放松活性的制剂、刺激皮肤微循环的制剂、用于油性皮肤护理的皮脂调节剂、清洁剂或净化剂、自由基清除剂、抗炎剂、化学或矿物防晒霜等。

有利地，根据本发明的化妆品组合物包含至少一种根据本发明的桑属的根提取物，特别是根据本发明的白桑或黑桑的根提取物，相对于组合物的总重量，其用量为0.01重量％至10重量％，特别是0.05重量％至5重量％，更特别是0.1重量％至2重量％。

特别地，通过抑制酪氨酸酶的活性，根据本发明的化妆品组合物可以特别地旨在对皮肤具有增白作用。

特别是通过抑制透明质酸酶的活性和/或通过抑制胶原酶的活性，根据本发明的化妆品组合物还可旨在具有抗老化作用。

在第四方面，本发明提供了根据本发明的根提取物、通过根据本发明的方法获得的根提取物或根据本发明的化妆品组合物，其用于通过刺激表皮的屏障功能和/或通过抑制透明质酸酶的活性，和/或通过抑制胶原酶的活性来预防或延缓皮肤老化作用的外观，和/或可对皮肤具有美白作用。

本发明还涉及根据本发明的提取物、通过根据本发明的方法获得的提取物用于制备化妆品组合物的用途，所述化妆品组合物旨在防止或延缓皮肤老化的效果和/或旨在为皮肤提供增白效果。

本发明还涉及一种用于皮肤美容护理的方法，该方法旨在通过刺激表皮的屏障功能和/或通过抑制透明质酸酶的活性，和/或通过抑制胶原酶的活性来预防或延缓皮肤老化作用的外观，和/或旨在向皮肤提供增白效果，所述方法的特征在于其包括将根据本发明的化妆品组合物施用于身体或脸部皮肤的至少一部分。

本发明的第五个目的是提供一种药物组合物，其包含作为活性剂的至少一种根据本发明的提取物或通过根据本发明的方法获得的提取物，以及至少一种药学上可接受的赋形剂。

本发明的第六个目的是提供一种营养学组合物，其包含作为活性剂的至少一种根据本发明的提取物或通过根据本发明的方法获得的提取物，以及至少一种营养学上可接受的赋形剂。

在本发明中，术语“药学上或营养学上可接受的”是指可用于制备药物组合物或营养组合物的任何成分，其通常是安全的、无毒的并且在生物学上或其他方面不是不期望的，并且对于兽医用途或人类应用是可接受的。

化合物的术语“药学上或营养学上可接受的盐”是指如上所定义的药学上或营养学上可接受的盐，并且具有母体化合物的期望药理活性。这种盐包括：

(1)水合物和溶剂化物，

(2)与药学上或营养学上可接受的无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或与药学上或营养学上可接受的有机酸，例如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、谷氨酸、乙醇酸、羟基萘甲酸、2-羟基乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘康酸、2-萘磺酸、丙酸、水杨酸、琥珀酸、二苯甲酰基-L-酒石酸、酒石酸、对甲苯磺酸、三甲基乙酸、三氟乙酸等形成的药学上或营养学上可接受的酸的加成盐，或

(3)当母体化合物中存在的质子酸被金属离子例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子替代或与药学上或营养学上可接受的有机碱或无机碱配位时形成的药学上或营养学上可接受的碱的加成盐。可接受的有机碱包括二乙醇胺、乙醇胺、N-甲基葡糖胺、三乙醇胺、氨丁三醇等。可接受的无机碱包括氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠和氢氧化钠。

根据本发明的药物组合物的给药方式、剂量和最佳盖仑剂型可以根据在开发适合于对象的药物治疗时通常考虑的标准来确定，例如，患者的年龄或体重、病情的严重性、对治疗的耐受性、已知的副作用、皮肤类型。取决于所需的给药类型，根据本发明的药物组合物还可包含至少一种药学上可接受的赋形剂。根据本发明的药物组合物还可包含至少一种本领域技术人员已知的药物佐剂，其选自增稠剂、防腐剂、香料、着色剂、化学或矿物质过滤器、保湿剂、温泉水等。

有利地，所述药物组合物包含至少一种根据本发明的提取物，其量相对于组合物的总重量为0.01重量％至10重量％，特别是0.05重量％至5重量％，更特别是0.1重量％至2重量％。

药物组合物特别适合于经口、经鼻、经皮、肠胃外、局部、直肠和黏膜施用。它可以是干燥形式，例如：软胶囊、胶囊剂、片剂、冻干剂、粉剂、颗粒剂或贴剂，也可以是液体形式，例如：溶液剂、悬浮剂、喷雾剂、霜剂或凝胶剂。

药学上可接受的赋形剂是本领域技术人员已知的，并且根据药物组合物的给药方式进行选择。举例来说，药学上可接受的赋形剂可以选自稀释剂、黏合剂、崩解剂、着色剂、润滑剂、增溶剂、吸收促进剂、成膜剂、胶凝剂及其混合物。

根据本发明的药物组合物还可以包含至少一种选自以下的化合物：润肤剂、保湿剂、角蛋白合成活化剂、角质调节剂、角质层分离剂、重组皮肤屏障的试剂(皮肤脂质合成活化剂、PPAR或过氧化物酶体增殖物活化受体激动剂)、角质形成细胞分化活化剂(类维生素A、

钙)、抗生素、抗菌剂、抗真菌化合物、抗病毒剂、皮脂调节剂、免疫调节剂，例如他克莫司、吡美莫司、

唑啉，防腐剂、抗刺激剂、舒缓剂、防晒霜和过滤剂、抗氧化剂、生长因子、治愈剂或富营养化分子、抗炎药和制剂以及抗阿尔茨海默病的药物和制剂

本发明的第七目的是提供根据本发明的提取物或根据本发明的药物组合物，其用作药物。

更具体地，本发明还涉及根据本发明的提取物、通过根据本发明的方法获得的提取物或根据本发明的药物组合物，其用作药物以促进皮肤愈合，特别是在伤口闭合的情况下促进皮肤愈合。所述提取物将有利地与适合于皮肤的药学上可接受的赋形剂缔合，并且所述药物组合物将有利地包含适合于皮肤的药学上可接受的赋形剂。

更具体地，本发明还涉及根据本发明的提取物、使用根据本发明的方法获得的提取物或根据本发明的药物组合物，其用作药物以刺激和/或改善皮肤的紧致度、密度、强度、光滑外观和/或弹性。所述提取物将有利地与适合于皮肤的药学上可接受的赋形剂缔合，并且所述药物组合物将有利地包含适合于皮肤的药学上可接受的赋形剂。

皮肤的紧致度、密度、强度、光滑外观和/或弹性的刺激和/或改善特别是由于透明质酸酶活性的抑制和/或胶原酶活性的抑制。

本发明还涉及一种用于皮肤的治疗护理的方法，以在需要其的对象中刺激和/或改善皮肤的紧致度、密度、强度、光滑外观和/或弹性和/或促进皮肤愈合，特别是在伤口闭合的情况下，其包括向对象施用治疗有效量的根据本发明的营养组合物或根据本发明的药物组合物。

本发明还涉及一种用于皮肤美容护理的方法，以促进皮肤的美白和/或预防或延缓老化作用的外观(抗老化作用)，该方法包括向对象施用化妆品有效量的根据本发明的化妆品组合物。

下面的实施例1至实施例7和图1至图6旨在说明本发明，但不限制其范围。

实施例

白桑的根提取物是从2012年至2015年从法国供应商(Les Semences du Puy)购买种子的植物中制备的。黑桑的根提取物是从2016年从法国供应商(NaudetPépinières)购买种子的植物中制备的。自2016年以来，申请人在玻璃下保存和繁殖了白桑和黑桑的植物。

实施例1：白桑和黑桑的根提取物刺激前后的植物化学特性

用15/10/30(N/P/K)培养基和1.0mS/cm至1.2mS/cm的电导率将白桑植物气培8周，然后用对应于0/15/40的N/P/K组合物和0.6mS/cm至0.8mS/cm电导率的营养液培养3周。

在更换培养基之前收获根，它们对应于未刺激的根。

贫氮刺激前后切碎和收获的根在通风炉中于40℃干燥48小时，并借助珠磨机(WWRStar Beater)以每秒15次的速度粉碎4分钟。在环境温度下搅拌(使用涡旋混合器)将20mg粉碎成粉末的根浸入1mL纯乙醇中，浸泡30分钟。将样品以21000g离心10分钟以分离出固体物质。回收上清液，并在注射用纯乙醇中稀释5倍。

用于分析步骤的仪器是使用Kinetex EVO C18色谱柱反相操作的UPLC ShimadzuNexera X2(LC-30AD泵，SIL-30AC自动进样器，CTO-20A烤箱，SPD-M20A光电二极管阵列检测器；日本京都)，使用Kinetex EVO C18色谱柱(00F-4725-AN，Phenomenex，Torrance，CA，美国)，尺寸为150mm×2.1mm，2.6μm。流动相由溶剂A(Mili-Q超纯水，Merck Millipore+0.1％甲酸，Carlo Erba，法国Val-de-Reuil)和溶剂B(乙腈，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Steinheim，德国)组成，其中梯度的模式如下：B相(％)5-72.5％(0-22分钟)；72.5-90％(22-22.1分钟)；90％(22.1-23.9分钟)，90-5％(23.9-24分钟)，5％(24-26分钟)。分析的流速为0.5mL/min，烤箱温度为40℃。在色谱柱的出口处，光电二极管阵列检测器记录了220至370nm的UV光谱。将该仪器与质谱仪(Shimadzu LCMS-2020)耦合，该质谱仪以负模式在200至1000的m/z范围内以电喷雾电离(4.5kV)运行。使用LabSolutions(版本5.60SP2)软件来操作系统。

通过测量申请人从白桑的根提取物中获得的桑白皮素B标准品的峰面积进行桑白皮素B的定量，该提取物是将500g新鲜根浸入1升70/30(乙醇/水-体积/体积)乙醇水溶液处理48小时获得的。简而言之，通过相分离方法和之后的制备型HPLC获得了桑白皮素B的纯化级分。接下来，通过HPLC和之后的NMR表征级分。在DMSO/水混合物中以70/30的比例制备浓度为100mg/L的桑白皮素B标准品，并用盐酸酸化至pH为4。其他化合物的含量(桑白皮素A、桑黄酮C、维替鲁明F和桑色呋喃T)以每份提取物中的桑白皮素B的当量表示。使用以下公式计算化合物的含量：

桑白皮素B用作各种化合物(桑白皮素A、桑白皮素B、桑黄酮C、维替鲁明F和桑色呋喃T)的定量标准，因为这些各种化合物属于同一分子家族。

图1A、图1B和图1C显示了注射前未刺激(图1A)或刺激(图1B)并稀释5倍的由白桑根制备的提取物的色谱图。对于从刺激的根获得的白桑提取物，干提取物含量(DE)经评估为2.6g/L，对于从未刺激的根获得的白桑提取物的干燥提取物含量(DE)评估为2.3g/L。

化合物的含量示于下表1中。

表1

在本示例中，氮缺乏对白桑根的刺激导致根提取物含量增加(以mg/L计)：

-136％的桑白皮素B

-2358％的桑黄酮C

-159％的桑白皮素A

-26％的维替鲁明F

-39％的桑色呋喃T。

为了验证根据本发明的白桑的根提取物富含异戊二烯化多酚，即与从市售的桑属植物的根皮中获得的相应提取物相比，根据本发明的根提取物包含大量的桑白皮素B、桑白皮素A、桑黄酮C、维替鲁明F和桑色呋喃T，产生了白桑干根皮(也称为Cortex Mori AlbaeRadicis或Sang Bai Pi)提取物的植物化学特征。这种皮(来源于中国，由申请人于2015年订购)呈厚的浅黄色碎屑形式。使用球磨机(WWR Star Beater)将树皮粉碎成粉末状，以每秒20次的速度粉碎5分钟，然后以每秒30次的速度粉碎5分钟。在环境温度下搅拌(使用涡旋混合器)下，将20mg粉碎的桑白皮浸入1mL纯乙醇中，浸渍30分钟。将样品以21000g离心10分钟以分离出固体物质。回收上清液，并在注射用纯乙醇中稀释5倍。图1C显示了从皮制备的提取物的色谱图。提取物中干提取物(DE)的含量经评估为0.63g/L。

异戊二烯化多酚的定量使用以下所述的方法进行，其值在下表2中列出：

表2

根据本发明的提取物的特征在于存在在市售皮提取物中未检测到的维替鲁明F和桑色呋喃T，以及特征在于被刺激的根中具有非常高的桑白皮素A和桑白皮素B含量以及高的桑黄酮C含量。

在按照用于获得白桑提取物的相同方案制备的黑桑根提取物中证实了维替鲁明F和桑色呋喃T的存在，并且在本实施例中进行了描述。对于从刺激4周的根制备的黑桑的提取物，干提取物(DE)的含量评估为2.67g/L，对于从未刺激的根制备的黑桑提取物，干燥提取物(DE)的含量为3.16g/L。

异戊二烯化多酚的定量根据以下所述的方案进行，值(n＝1)示于下表3中：

表3

在本示例中，氮缺乏对黑桑的刺激导致根提取物含量增加(以mg/L计)：

-212％的维替鲁明F

-160％的桑色呋喃T。

实施例2：白桑根提取物的抗酪氨酸酶抑制活性。

2.1未刺激的白桑根的抗酪氨酸酶抑制活性

将白桑植物用15/10/30(N/P/K)培养基和1.0mS/cm至1.2mS/cm的电导率气培8周。根据实施例1中所述的方法，将根切碎，干燥，粉碎并浸入纯乙醇，比例为1mL乙醇比20mg干物质。将样品以21000g离心10分钟以分离出固体物质。使用L-酪氨酸作为底物测量上清液的抗酪氨酸酶抑制活性。酪氨酸酶催化L-酪氨酸向多巴醌的转化，多巴醌可自发转化为多巴色素。后者在电磁光谱的可见光范围内(在475nm处)强烈吸收。酪氨酸酶的活性通过在酶标仪的辅助下将无色的L-酪氨酸酶促转化为橙色的多巴色素来测量。

通过混合以下成分来测量上清液的抗酪氨酸酶活性：150μL L-酪氨酸(1.5mM)在50mM磷酸钠缓冲液中的溶液，pH 6.8；测试了在乙醇中稀释2倍至800倍的40μL上清液作为抑制剂溶液。通过添加一定体积的10μL真菌酪氨酸酶(在50mM磷酸钠缓冲液中的0.2mg/mL，pH 6.8)来初始化酶促转化。以相同方式进行“对照”实验，用纯乙醇替换上清液。

图2显示了酪氨酸酶活性百分比与上清液稀释因子的关系。对于2至16范围的稀释液，观察到几乎完全抑制了活性。评估稀释因子为150的中位抑制浓度IC₅₀，该稀释因子对应于从0.133mg干物质在1mL纯乙醇中制备的提取物。从表1中的数据(实施例1，未刺激的白桑根)开始，计算在1L乙醇中由133mg的白桑干燥根制成的提取物中所含的5种异戊二烯化多酚，以桑白皮素B的当量含量(mg/L)计，即：

·0.36mg/L的桑白皮素B；

·0.02mg/L的桑黄酮C，以桑白皮素B的当量表示；

·0.19mg/L的桑白皮素A，以桑白皮素B的当量表示；

·0.12mg/L的维替鲁明F，以桑白皮素B的当量表示；

·0.06mg/L的桑色呋喃T，以桑白皮素B的当量表示。

2.2对比未受氮缺乏刺激和经氮缺乏刺激的白桑根部的抗酪氨酸酶抑制活性。

根据实施例1中所述的方案制备了白桑的两种根提取物。抗酪氨酸酶抑制活性的测定根据实施例2.1中所述的方案，用40μL在纯乙醇中稀释100倍或200倍的两种提取物中的每种提取物进行。

下表4显示了每种根提取物的酪氨酸酶活性抑制百分比。

表4

由氮缺乏刺激的根制备的提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用(86％和77％)明显强于未经刺激的根提取物(70％和49％)。

2.3评估白桑根提取物中存在的化合物对酪氨酸酶靶标的亲和力：Target

的亲和力测试

根据实施例2.1中所述的方案制备白桑的根提取物。

专利申请FR 1 670 545中描述的Target

方法对应于确定配体与靶标之间的亲和力的方法。它基于使配体和靶标在液相中接触的原理，以使与靶标具有最大亲和力的配体与其结合，消除未固定的配体，分离复合物以回收已固定的配体，然后对其进行定量。

在该方法的第一步中，将提取物和目标物混合。提取物中的化合物竞争进入目标物的结合位点。最强的化合物取代最弱的化合物，并被目标物更有效地保留。

随后，进行以下步骤：

i)从混合物中分离配体-目标复合物；

ii)除去尚未结合的化合物；

iii)使配体-靶标复合物变性以释放配体；

iv)通过沉淀和离心消除变性的目标物；

v)上清液的分析：将上清液的配体的分析信号与样品的配体的分析信号进行比较。

通过将冻干的酶粉溶解在pH 7.0的50mM乙酸铵中来制备目标物，即1.5mg/mL的真菌酪氨酸酶溶液。待分析的样品对应于根据实施例2.1获得的根提取物的上清液。可以任选在使用前将其以21000g的速度再次离心15分钟，以除去所有痕量的固体颗粒。还通过在水和四分之一体积的乙腈的溶液中将待分析样品稀释10倍来制备参考样品。

该方法的步骤如下：

1.预处理步骤–将带有滤膜的孔用500μL的85％乙酸铵溶液和15％乙醇溶液进行预处理，并通过14000g离心60秒使其通过膜。

2.结合步骤–将酪氨酸酶制剂(1.5mg/mL，92.5μL)与7.5μL待分析样品混合，在塑料离心管中混合5分钟。

3.洗涤步骤–将酶和待分析样品的混合物沉积在已经在预处理步骤中进行了预处理的孔中，然后在14000g下进行离心，直到除去了大部分溶剂为止。酶-配体复合物保留在滤膜表面上，然后重悬于相同体积的85％乙酸铵溶液和15％乙醇的100μL溶液中，并在14000g下离心直至除去溶剂。将该过程重复三遍，并除去所有未与酶结合的化合物。

4.分离步骤–将保留在过滤器中的酶-配体复合物重新悬浮在10μL的超纯水中，然后与40μL乙腈混合，以使酶变性和沉淀，并同时释放配体。将混合物以21000g离心10分钟以将沉淀物与上清液分离。

5.分析步骤–通过液相色谱仪和质谱仪联用(也称为UPLC-MS)分析所述上清液。还使用相同的分析条件，以相同的方式分析了参考样品。

根据实施例1中所述的方案进行UPLC-MS分析。

所获得的色谱图如图3A和图3B所示，其表示信号强度与色谱柱中保留时间的关系。信号显示强度可变的各种峰。每个峰均与分析提取物中存在的一种配体相关。与每个配体相关的数量对应于峰的面积。

参考样品的色谱图(图3A)能够鉴定根提取物中存在的主要化合物，即：

1-桑白皮素B；

2-桑黄酮C；

3-桑白皮素A；

4–维替鲁明F；

5–桑色呋喃T。

比较待分析的样品化合物与酪氨酸酶结合后获得的图3B色谱图峰面积，可以粗略评估根据实施例2.1的根提取物的化合物对酪氨酸酶的亲和力的顺序：桑色呋喃T和维替鲁明F的峰面积更高，表明这两种化合物的亲和力更高。

为了验证该结果，使用专利申请FR 1 670 545中描述的方法计算了相对亲和力。

对于每个配体，亲和力比RACEi计算如下：

其中：

和

其中：

NF是归一化因子；

IS_eq,CEi是参考样品中配体CEi的分析信号强度；

IS_eq,REF是参考样品中参考配体REF(此处为桑白皮素B)的分析信号强度；

IS_TB,CEi是分离的配体在经处理的溶液(步骤2-4后待分析的样品，用于配体的结合和分离)中配体CEi的分析信号强度；

IS_TB,REF是分离的配体在经处理的溶液(步骤2-4后待分析的样品，用于配体的结合和分离)中参考配体REF(此处为桑白皮素B)的分析信号强度；

RA_CEi是相对亲和力比(RA)，代表配体CEi对靶标的亲和力。该比例的值随亲和力增加。

表5：根据实施例2.1，存在于白桑根提取物中的桑白皮素B(被认为是参考配体)、桑白皮素A、桑黄酮C、维替鲁明F和桑色呋喃T对于酪氨酸酶的相对亲和力。

相对亲和力证实了基于峰面积评估的结果，即与所评估的其他化合物相比，桑色呋喃T和维替鲁明F对酪氨酸酶的亲和力更高。

实施例3：白桑根提取物的抗胶原酶抑制活性。

3.1未经氮缺乏刺激和经氮缺乏刺激的白桑根部的抗胶原酶抑制活性比较。

根据实施例1中所述的方案制备了白桑的两种根提取物。根据以下方案进行抗胶原酶抑制活性的测定。使用FALGPA(N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰基]-Leu-Gly-Pro-Ala)作为底物，测量了两种提取物的抗胶原酶抑制活性。胶原酶催化FALGPA转化为FAL(N-(3[2-呋喃基]丙烯酰基)-Leu)和Gly-Pro-Ala。FALGPA的降解是导致反应混合物在345nm处吸收减少的原因。通过在UV-VIS分光光度计的帮助下将FALGPA酶促转化为FAL+Gly-Pro-Ala来测量胶原酶的活性。

反应混合物如下：510μL FALGPA(1.5mM)在50mM Tris-HCl缓冲液、10mM CaCl₂、400mM NaCl中的溶液，pH 7.5；测试了两种提取物中每种提取物30μL(在纯乙醇中稀释5倍)作为抑制剂溶液。通过添加从溶组织梭状芽胞杆菌(Clostridium Histolyticum)(0.8mg/mL在50mM Tris-HCl缓冲液、10mM CaCl₂、400mM NaCl、pH 7.5)获得的10μL体积的胶原酶来初始化酶促转化。以相同方式进行“对照”实验，用纯乙醇替换上清液。

经氮缺乏刺激的根提取物对胶原酶活性的抑制作用(94％)比未经刺激的根提取物对抑制胶原酶活性的作用更强(83％)。

3.2评估白桑根提取物中存在的化合物对目标胶原酶的亲和力：

的亲和力测试

根据实施例2.1中所述的方案制备白桑的根提取物。所用的

方法是专利申请FR 1 670 545中描述的实施例2.3的方法。

实验方案如下：

通过将冻干的酶粉溶于pH 7.5的50mM盐水磷酸盐缓冲液中来制备目标物，即从组织溶梭菌获得的6.25mg/mL的胶原酶溶液。待分析的样品对应于根据实施例2.1获得的根提取物的上清液。可以在使用前以21000g再次离心15分钟，以除去任何痕量的固体颗粒。还通过在水和四分之一体积的乙腈的溶液中将待分析样品稀释10倍来制备参考样品。

该方法的步骤如下：

1.2.样品的分析

1.预处理步骤–将带有滤膜的孔用500μL磷酸盐缓冲液进行预处理，将其通过以14000g离心60秒通过膜。

2.结合步骤–在塑料微量离心管(Eppendorf tube)中，将92.5μL的预处理步骤所得溶液与7.5μL的待测样品混合10分钟。

3.洗涤步骤–将酶和待分析样品的混合物沉积在已在预处理步骤中进行过预处理的孔中，然后以14000g进行离心，直到除去了大部分溶剂。酶-配体复合物保留在滤膜表面，然后重悬于100μL相同的磷酸盐缓冲液中，并以14000g离心，直至除去溶剂。将该过程重复三遍，并除去所有未与酶结合的化合物。

4.分离步骤–将保留在过滤器中的酶-配体复合物重新悬浮在10μL的超纯水中，然后与30μL乙腈混合，以使酶变性和沉淀，并同时释放配体。将混合物以21000g离心10分钟以将沉淀物与上清液分离。

5.分析步骤–通过液相色谱仪和质谱仪分析所述上清液。还使用相同的分析条件，以相同的方式分析了参考样品。

根据实施例1中所述的方案进行UPLC-MS分析。

参考样品的色谱图(图4A)使得能够鉴定根据实施例2.1的根提取物中存在的主要化合物，即：

1-桑白皮素B；

2-桑黄酮C；

3-桑白皮素A；

4–维替鲁明F；

5–桑色呋喃T。

将提取物的化合物与胶原酶结合后，图4B的色谱图峰面积的大小可用于证明桑色呋喃T、维替鲁明F和桑白皮素A和桑白皮素B对胶原酶具有相似的亲和力。

为了验证此结果，根据实例2.3的方法计算了相对亲和力，并在专利申请FR 1 670545中进行了描述。

表6：存在于白桑根提取物中的桑白皮素B(被认为是参考配体)、桑白皮素A、桑黄酮C、维替鲁明F和桑色呋喃T对于胶原酶的相对亲和力。

5种化合物对胶原酶的相对亲和力相似。

实施例4：白桑和黑桑根提纯的分子的抗酪氨酸酶抑制活性

维替鲁明F是从气培的黑桑的根提取物中纯化得到的，然后使用无氮营养培养基(0/15/40培养基)的氮压力刺激2周至6周。将500g新鲜根浸入1升70/30乙醇水溶液(乙醇/水-体积/体积)中48小时。未调节浸渍介质的pH。简而言之，通过制备型HPLC获得了维替鲁明F的纯化级分，并通过NMR进行了表征。

根据实施例1中所述的方案，从白桑的根提取物中纯化出桑白皮素A、桑白皮素B和桑黄酮C。

抗酪氨酸酶抑制活性的测定按照实施例2.1中记载的方法进行。

测试了3种浓度下4种化合物对酪氨酸酶的抑制活性，结果列于下表：

表7：浓度为2.5μM、5μM和20μM时，4种化合物对酪氨酸酶的抑制活性百分比。

维替鲁明F具有最佳的抑制活性，其次是桑黄酮C，然后是桑白皮素B和桑白皮素A。这一结果与实施例2.3一致，与3种异戊二烯基类黄酮相比，维替鲁明F对靶标酪氨酸酶的亲和力更高。

在实施例2.1中，测量从133mg白桑的干燥根在1L纯乙醇中制备的提取物中酪氨酸酶的中位抑制浓度IC₅₀，对应于桑白皮素B和桑白皮素A、桑黄酮C和维替鲁明F的总量为0.69mg/L，以桑白皮素B的当量表示。对于最具抑制作用的维替鲁明F，在3.2mg/L的浓度下抑制率为52.9％。该比较表明根提取物的抑制活性比分离的化合物的抑制活性大。

实施例5：由乙醇酸化溶剂制备的白桑的根提取物。

使用以下方法获得富含异戊二烯化多酚的白桑根提取物：

·用限定的营养液气培白桑，N/P/K组成对应于15/10/30，电导率为1.0mS/cm至1.2mS/cm，

·通过使用N/P/K营养液，通过氮压力刺激植物2周至4周，该营养液包含：少于6％的氮、15％的磷和40％的钾，电导率为0.6mS/cm至0.8mS/cm，

·在环境温度和pH值3.5至4.5下，在比例为85/15至70/30的1,3-丙二醇/水混合物中浸渍经切碎、干燥并用行星式球磨机(Fritsch-PULVERISETTE 6)压碎的根5分钟至3小时，以提取目标化合物。在室温和搅拌下进行浸渍。用于浸渍的干物质(DM)/溶剂比为50gDM/L溶剂。浸渍是在30mL体积的溶剂中进行的。

根据实施例1中所述的方法评估的白桑根提取物中的桑白皮素B以及以桑白皮素B的当量表示的桑白皮素A、桑黄酮C、维替鲁明F和桑色呋喃T的含量与浸渍时间的关系如图5所示。

由此获得的提取物具有以下特征：

·干提取物含量：7.1g/L至10.2g/L；

·桑白皮素B含量：446mg/L至512mg/L(即干提取物的4.9％至6.3％)；

·桑白皮素A含量，以桑白皮素B的当量表示：162mg/L至182mg/L(即干提取物的1.7％至2.3％)；

·桑黄酮C含量，以桑白皮素B的当量表示：184mg/L至196mg/L(即干提取物的1.8％至2.7％)；

·维替鲁明F含量，以桑白皮素B的当量表示：34mg/L至44.5mg/L(即干提取物的0.4％至0.5％)；

·桑色呋喃T含量，以桑白皮素B的当量表示：27mg/L至29mg/L(即干提取物的0.38％至0.41％)；

·pH:6+/-1。

使用以下方法获得了另外两个富含异戊二烯化多酚的白桑根提取物：

根据上述本实施例1中所述的方案进行培养和刺激白桑的步骤。

在环境温度和pH值为4或未调节的pH值下，通过将切碎(使用切割式研磨机)、干燥和粉碎的根在比例为85/15至70/30的1,3-丙二醇/水混合物中浸渍2小时，以提取目标化合物。浸渍在环境温度下进行，借助于行星式搅拌器进行搅拌。用于浸渍的干物质(DM)/溶剂比为50g DM/L溶剂。浸渍是在500mL体积的溶剂中进行的。

根据实施例1中所述的方法评估桑白皮素B以及桑白皮素A、桑黄酮C、维替鲁明F和桑色呋喃T的含量，列于下表8中：

表8：干提取物，桑白皮素A以及桑白皮素B、桑黄酮C、维替鲁明F和桑色呋喃T的含量，以桑白皮素B当量计，以mg/L表示，或者为pH值4或未调节的pH浸渍两小时后得到的白桑的两种根提取物的干提取物(DE)的百分比。

实施例6：白桑根提取物的抗透明质酸酶抑制活性。

透明质酸(HA)是形成细胞外基质的糖胺聚糖。它由透明质酸合成酶(HAS)产生，并填充皮肤的细胞间空间，以维持组织内聚力并通过保留水分子来确保其水合作用。透明质酸酶催化HA的水解。随着年龄的增长或在反复暴露于紫外线后，该酶的表达增加，从而导致皮肤中透明质酸的数量减少。因此，为了防止或延缓老化作用(抗老化作用)的外观，对于抑制这种酶存在切实的关注。

6.1经刺激的白桑根的抗透明质酸酶抑制活性的测试

根据实施例5中所述的方案制备白桑的根提取物。透明质酸酶催化透明质酸水解成单糖、二糖和短寡糖。抗透明质酸酶抑制活性的测量是使用透明质酸(HA)作为底物进行的，以跟踪其在酶促反应过程中的还原反应，反应过程中HA浓度降低的斜率与酶促活性成比例。

根据以下原理测量HA的浓度：在牛血清白蛋白的酸性溶液的存在下，HA沉淀。因此，在存在HA的情况下，形成沉淀，而在HA完全水解的情况下，未观察到沉淀。因此，沉淀量与HA含量成正比。

反应混合物(RM)如下：透明质酸[0.03％(重量/体积)]在300mM磷酸盐缓冲液中的溶液，pH 5.35：187.5μL；50mM磷酸盐缓冲液，pH 7：52.5μL；含有提取物或溶剂的溶液(白色)：10μL。通过向50mM磷酸盐缓冲液(pH 7)(20μg/mL，活性为15U/mL至60U/mL)中加入250μL体积的源自牛睾丸的透明质酸酶(IV-S型)来开始酶促转化。在整个酶促反应过程中，在搅拌下(使用涡旋混合器)将该混合物在37℃下孵育。

为了跟踪HA的酶促降解，每15分钟除去50μl的RM，并与250μL的酸性BSA溶液(牛血清白蛋白的酸性溶液：然后在室温下将24mM乙酸钠，79mM乙酸和0.1％(重量/体积)牛血清白蛋白(pH 3.75))混合，然后孵育10分钟。然后使用酶标仪(在600nm处的光扩散)测量形成的沉淀量。

根据实施例5制备的白桑的根提取物强烈抑制透明质酸酶的活性：对于1％(体积/体积)的提取物，观察到100％的抑制作用；在提取物为0.5％(体积/体积)时，观察到抑制率为55.5％；在提取物为0.1％(体积/体积)时，观察到抑制率为34.5％。

根据与实施例5相同的方案，测定桑白皮素A的抗透明质酸酶抑制活性。

浓度为10μM时，观察到抑制率为55.1％。桑白皮素A的这种抑制活性比已知的透明质酸酶抑制剂槲皮素更强(在10μM的浓度下抑制率为15.6％)。

6.2评估未经刺激的白桑根提取物中存在的化合物对目标透明质酸酶的亲和力：

的亲和力测试

根据实施例2.1中所述的方案制备白桑的根提取物。所用的

方法是专利申请FR 1 670 545中描述的实施例2.3的方法。实验方案如下：通过将粉末状冻干酶溶解在pH值为7.0的50mM磷酸钠中来制备透明质酸酶5mg/mL的目标溶液。提取物对应于根据实施例2.1获得的上清液。可以选择在使用前将其以21000g再次离心15分钟，以消除使用前的固体颗粒。还通过在水和四分之一体积的乙腈的溶液中将样品稀释10倍来制备参考样品。

该方法的步骤如下：

1.预处理步骤–用500μL体积的50mM磷酸钠溶液在pH值为7.0的条件下对装有滤膜的孔进行预处理，在14000g下离心60秒使其通过膜。

2.结合步骤–将透明质酸酶制剂(5mg/mL)与7.5μL根提取物在塑料微量离心管中混合5分钟。

3.洗涤步骤–将酶和根提取物的混合物沉积在已在预处理步骤中进行过预处理的孔中，然后以14000g进行离心，直至除去了大部分溶剂。酶-配体复合物保留在滤膜表面，然后重悬于100μL的相同的50mM磷酸钠溶液中，pH值为7.0，并在14000g离心直至除去溶剂。将该过程重复三遍，并除去所有未与酶结合的化合物。

4.分离步骤–将保留在过滤器中的酶-配体复合物重新悬浮在10μL体积的超纯水中，然后与40μL乙腈混合，以使酶变性和沉淀，并同时释放配体。将混合物以21000g离心10分钟以将沉淀物与上清液分离。

5.分析步骤–通过液相色谱仪和质谱仪联用(也称为缩写UPLC-MS)分析所述上清液。还使用相同的分析条件，以相同的方式分析了参考样品。

根据实施例1中所述的方案进行UPLC-MS分析。

参考样品的色谱图(图6A)可用于鉴定实施例2.1中根提取物中的主要化合物，即：

1-桑白皮素B；

2-桑黄酮C；

3-桑白皮素A；

4–维替鲁明F；

5–桑色呋喃T。

将提取物的化合物与胶原酶结合后获得的图6B色谱图峰面积的大小可用于证明桑色呋喃T、维替鲁明F和桑白皮素A和桑白皮素B对透明质酸酶具有相似的亲和力。

为了验证此结果，根据实例2.3的方法计算了相对亲和力，并在专利申请FR 1 670545中进行了描述。

表9：存在于白桑根提取物中的桑白皮素B(被认为是参考配体)、桑白皮素A、桑黄酮C、维替鲁明F和桑色呋喃T对于透明质酸酶的相对亲和力。

对于5种化合物，透明质酸酶的相对亲和力相似。

实施例7：白桑根提取物对皮肤的益处的表征-通过在TaqMan探针上的QRT-PCR对基因表达的修饰分析鉴定目标物

这项研究组成为一方面通过qRT-PCR测量白桑根提取物对微流控TaqMan探针的影响，另一方面涉及涉及真皮生物学的94种基因的表达，结膜组织重塑和老化(由StratiCELL定义的“Dermal Benefits”探针)，另一方面，涉及表皮关键功能的94个基因的表达，例如直接与水合作用的屏障功能，抗氧化反应或实际上由黑素细胞产生的色素沉着有关(StratiCELL定义为“Epidermal Benefits”卡)。

该方案组成为将白桑的根提取物作为单层和黑色素化的重组人表皮(RHE/MEL/001)添加到NHDF(正常人真皮成纤维细胞)的培养基中，并在24小时后分析各种RNA群体，以通过qRT-PCR鉴定差异表达的基因。

先前的细胞毒性研究使白桑根提取物的工作浓度能够确定用于基因表达研究。

为了验证测试系统和分析方法，使用TGF-β1(转化生长因子-β-1)和维生素D3(1α,25-二羟基维生素D3)作为参考分子，将其作用记录在文献中。

7.1方法和装置

·提取物

在0/15/40培养基中，在氮缺乏的刺激下，气培白桑植物。将新鲜的根切碎，然后在70/30乙醇水溶液(乙醇/水-体积/体积)中以每升溶剂500根的比例在pH值未调节的条件下在环境温度下浸渍48小时。接下来，将提取物过滤。使用旋转蒸发仪除去溶剂，并将粉末在干燥器中干燥。根据申请人在实施例1中所述的方案，使用由申请人纯化的三个系列4个点的桑白皮素B测定提取物中的桑白皮素B。在70％DMSO中制得1mM溶液，然后稀释至至多16μM。对这些系列进行了UPLC分析。然后将提取物中对应于桑白皮素B的峰面积与该系列的峰面积进行比较。提取物中桑白皮素B的含量相当于干提取物的4％。

·细胞培养

研究的第一部分是在含有抗生素(青霉素/链霉素，Invitrogen，15140-122)但不含血清的DMEM培养基(Invitrogen，31885-049)中的单层培养的人类皮肤成纤维细胞NHDF(ATCC，CRL-2522，来源：包皮)上进行的。将它们保持在37℃，含5％CO₂的潮湿气氛中。

研究的第二部分是在包含或不包含原代人黑素细胞，NHEM(正常人表皮黑素细胞)的重组表皮(

RHE/MEL/001)上进行，该原代人黑素细胞来自具有深色光型(phototype)(IV型至V型)的供体(Invitrogen，C2025C，批号439684)。在合适的培养基中，在37℃，含5％CO₂的潮湿气氛下，在气-液界面处将组织培养14天。

·通过初步的细胞毒性研究确定用于研究白桑根提取物的浓度范围

为了确定分析白桑根提取物的最佳浓度，对NHDF成纤维细胞，NHEM人黑素细胞和重组表皮进行了初步实验。

NHDF成纤维细胞进行了30.1和30.7的种群倍增，并且在施用活性剂前24小时将NHEM黑素细胞接种到24孔板中。

在用提取物处理之前，将重组的表皮(RHE/001；批次CB0314/2)转移到12孔板中。

将提取物在培养基中稀释，然后在没有事先过滤的情况下，添加到不含血清的用于NHDF人成纤维细胞的培养基中，添加到NHEM原代人黑素细胞中，或添加到分化表皮的培养基中。

这项研究组成为在添加白桑根提取物后24小时，评估细胞和表皮对MTS(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基-甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑)(Promega，G3581)的活力，对NHDF成纤维细胞和NHEM黑素细胞进行5次浓缩和3次重复(n＝3)，对重组表皮进行2次浓缩和3次重复(n＝3)。根据获得的NHEM黑素细胞的细胞毒性结果选择2种浓度的重组表皮。

SDS(十二烷基硫酸钠)对细胞有毒性，并用作阳性对照以验证实验。

在该实验结束时，已经确定了无细胞毒性的浓度，以进行对目标基因表达的修饰的测量。

测试了以下浓度(以微克干提取物/毫升计)：

-NHDF成纤维细胞和NHEM黑色素细胞：0.16μg/mL、0.8μg/mL、4μg/mL、20μg/mL、100μg/mL；

-重组表皮：20μg DE/mL和4μg DE/mL。

·基因表达修饰分析

将提取物以选定的浓度在没有血清的情况下添加到人NHDF成纤维细胞的培养基中(进行了30.5和30.8的种群倍增)，或添加到黑色素化分化表皮的培养基中(RHE/MEL/001，批次CB0314/3和CB0314/4)，在与细胞/表皮接触之前不进行过滤。

同时研究了参考分子，即NHDF成纤维细胞的TGF-β1和重组表皮的维生素D3(VD3)。

·总RNA提取

借助于RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，74106)进行总RNA的提取。加入提取物后24小时，将细胞用PBS冲洗并溶解在专用裂解缓冲液中，而表皮则直接浸入该缓冲液中(每种条件一式三份进行培养)。然后按照供应商的说明进行RNA的提取和纯化。然后将总RNA保存在-80℃。

·分光光度法和毛细管电泳鉴定RNA

总RNA的浓度通过分光光度法测定。然后通过毛细管电泳(Agilent Bioanalyzer2100平台-Agilent RNA 6000Nano试剂盒，5067-1511)验证RNA的质量和完整性。

-通过分光光度法测量对RNA进行定量：将每个RNA的等分试样在无核糖核酸酶的水中稀释，并借助Ultrospec 1100Pro分光光度计(Amersham)测定其浓度。

-在Agilent Bioanalyzer上通过毛细管电泳测定RNA完整性：通过查看与核糖体RNA对应的电泳峰，可以评估总RNA的完整性。对于高级真核生物的总RNA，核糖体条带的大小对于18S-RNA必须为1.9kb，对于28S-RNA必须为4.7kb。对应于28S-RNA的条带强度必须高于对应于18S-RNA的条带强度。可能存在代表较低分子量RNA(tRNA和5S核糖体RNA)的小扩散带。当RNA降解时，观察到核糖体RNA的条带扩展，以及具有较高分子量的RNA的背景噪声。

·互补DNA或cDNA的合成

借助“高容量RNA至cDNA试剂盒”(Applied Biosystems，4387406)进行逆转录(RT)。为了合成cDNA，按照供应商的说明制备混合物，其中含有2μg总RNA，试剂盒中提供的专用缓冲液和酶，逆转录酶。该反应在37℃下进行1小时，然后在95℃下进行5分钟，最后将cDNA样品置于冰上并在-20℃下保存。

·测试系统的验证–借助荧光TaqMan型探针进行实时定量PCR

实时定量PCR方法用于量化从用TGF-β1(20ng/mL)处理的NHDF成纤维细胞以及用维生素D3(100nM)和溶剂乙醇(EtOH 0.1％)处理过的黑色素化表皮获得的RNA群体中各种特定靶标的表达，所述溶剂用于溶解VD3。

使用“TaqMan基因表达分析”(Applied Biosystems)，通过PCR扩增目标基因的目标序列。这些试剂盒包含TaqMan探针和2种特异性引物，每种引物的预混合浓度为18μM，探针预混合的浓度为5μM。将该混合物浓缩20倍。TaqMan探针在序列的5'末端接枝了荧光团(FAM)，在3'末端接枝了荧光“猝灭剂”。

PCR在7900HT快速实时PCR系统(Applied Biosystems)的帮助下进行。反应以20μL的体积进行。反应混合物包含10μL的TaqMan快速通用预混液(Applied Biosystems)，1μL的TaqMan基因表达测定法和5μL无核糖核酸酶的水。

在96孔微孔板的每个孔中加入16μL混合物和4μLcDNA(4ng)。为了标准化，还用相同的cDNA样品制备了反应混合物，其中探针和引物分别对应于成纤维细胞的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和黑色素化的表皮的β2-微球蛋白(B2M)。没有cDNA的对照充当阴性扩增对照。热循环的模式是在50℃孵育2分钟，然后是在95℃变性10分钟的第一步。PCR扩增方案在95℃继续进行15秒的40个循环，然后在60℃进行1分钟。

使用从以下描述的ΔΔCt的计算(Pfaffl，实时RT-PCR中相对定量的新数学模型，Nucleic Acids Res，29(9)，2001，2002-2007；Livak和Schmittgen，使用实时定量PCR和2-ΔCt方法分析相对基因表达数据，Methods，25(4)，2001，402-408)得出的用于计算相对于管家基因(2^-ΔCt)的相对表达的方法对表达水平进行定量：

转录物的相对定量使用一种计算方法进行，该方法在于将TGF-β1(20ng/mL)和VD3(100nM)条件下的对照值(Ct)的平均值与相应的对照条件下(未经处理的CTL和CTL乙醇0.1％)进行比较。这些Cts代表检测阈值，从该阈值可以检测到DNA的数量，从而可以将信号与背景噪声区分开来。相对于管家基因，即对于DFDF的甘油三磷酸甘油醛-磷酸脱氢酶(GAPDH)和对于黑色素化的重组表皮的β2-微球蛋白(B2M)，对Ct的平均值进行了归一化。因此，可以使用下式获得表达水平(RQ)的差异：

RQ＝2^{-(ΔCt处理条件-ΔCt参考条件)}

其中，ΔCt＝Ct(目标基因)-同一cDNA样本中的Ct(管家基因)。

·Taqman微流探针的制备，定量PCR和Ct分析

根据Applied Biosystems Micro Fluidic探针入门指南中的详细说明，制备了Applied Biosystems按订单生产的TaqMan微流探针上PCR的反应混合物。总之，将100ngcDNA添加到用于PCR的特定混合物(Taqman Universal PCR Master Mix，4364338，AppliedBiosystems)中，然后注入探针中并通过毛细作用分散。离心探针后，将其密封，然后使用

7900序列检测系统软件SDS2.4，通过Applied Biosystems的7900HT系统进行定量PCR和分析。

获得探针上代表的并由NHDF成纤维细胞和黑色素化重建表皮表达的所有基因的阈值循环(Ct)。

使用SDS RQ Manager软件(v1.2.1,Applied Biosystems)从实时qPCR仪器中导出结果，并借助Data Assist软件(V3.0.,Applied Biosystems)进行表达修饰的分析，该软件设计为使用上文所述的Ct比较方法(ΔΔCt)(Pfaffl，2001年；Livak和Shmittgen，2001年)和统计分析的组合来对基因表达进行相对定量。如上所述，计算ΔΔCt的方法组成为将针对由提取物处理的条件获得的Ct值与参考条件进行比较(DMSO对照)。这些Ct值本身已针对NHDF成纤维细胞的管家基因GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)和黑色素重建表皮的管家基因B2M(β-2微球蛋白)进行了标准化。用作检测阈值的Ct的最大容许值固定为36个循环。

7.2结果

7.2.1通过细胞毒性研究确定用于分析提取物的浓度

先前对NHDF成纤维细胞、人NHEM黑素细胞和重组表皮的细胞毒性研究允许为基因表达研究确定工作浓度(在DMSO中制备)。同时测试提取物中存在的溶剂。为了验证实验效果，将0.08％(对于NHDF)和0.05％(对于NHEM)的SDS用作阳性细胞毒性对照。根据这些结果(数据未显示)，为其余研究选择了以下浓度：对于NHDF成纤维细胞，干提取物为20μg/mL，对于黑色素化的重组表皮，干提取物为20μg/mL。

7.2.2通过毛细管电泳鉴定RNA

各种RNA群体都很好地显示了对应于18S和28S核糖体RNA的窄峰的存在，和两个峰之间的平衡比例。RNA降解产物的特征为没有中间峰和宽峰，这证明了各种种群的完整性(数据未显示)。已经证明了RNA提取物的品质和完整性，然后将其用于方案的其余部分，并参与合成互补DNA的反应。

7.2.3提取物对NHDF成纤维细胞94个目标基因的影响

将提取物添加到用于NHDF成纤维细胞的培养基中(n＝3)。还分析了仅用1％DMSO溶剂处理的对照(提取物的载体)。同时，TGF-β1(20ng/mL)作为验证对照进行了研究。培养NHDF成纤维细胞24小时后，提取总RNA群体，通过毛细管电泳分析其完整性，并借助针对96孔TaqMan探针的针对真皮的关键功能的qRT-PCR分析基因表达的差异。

之后，观察到的与这些假设相关的规定记录如下：基因的符号，基因的名称，相对于1％DMSO载体的相对表达(RQ)(RQ>1：增加)和p的值(p值)。

·细胞外基质(ECM)的结构和体内稳态

白桑的根提取物诱导COL3A1基因的表达，该基因编码III型胶原的α-1亚基(X1.5，p＝0.0172)。迄今为止，原纤维胶原蛋白是皮肤中最丰富的蛋白质，占其干重的90％以上。I型胶原蛋白占真皮和皮下胶原蛋白的60％至80％，而III型胶原蛋白(COL3A1)占15％至25％，V型胶原蛋白占2％至5％。I型、III型和V型胶原蛋白会自组装为较粗的纤维，以在整个真皮厚度范围内形成三维网络。因此，胶原蛋白III(COL3A1)在ECM的结构方面起作用，从而在真皮的强度和弹性方面起作用。出于抗老化策略的考虑，提取物诱导COL3A1基因可能是令人感兴趣的，以允许随着年龄的增长减少真皮退化。

白桑的根提取物诱导金属蛋白酶-1、MMP-1的基因表达降低(X 0.66，p值＝0.0066)。成纤维细胞分泌胶原酶(或MMP，金属蛋白酶)和基质蛋白酶的抑制剂，以降解细胞外基质，使其更新并重新组织。金属蛋白酶1(MMP1)启动皮肤中I型和III型胶原原纤维的切割。

在这种情况下，提取物被证明在减少真皮随年龄的降解方面是令人感兴趣的。实际上，它促进了III型胶原蛋白的表达，同时降低了MMP-1的表达。

·皮肤愈合

白桑的根提取物诱导编码肌动蛋白的ACTA2基因表达(X 1.17，p值＝0.04)，并且在愈合过程中在成纤维细胞分化为成肌纤维细胞中起重要作用。

7.2.4提取物对黑色素化重建表皮中94个目标基因的影响(RHE/MEL/001)

将20μg DE/mL提取物用于重组表皮24小时。还分析了仅用0.2％DMSO溶剂处理过的对照(提取物的载体)。给出了基因符号，基因名称，相对于0.2％DMSO媒介的相对表达(RQ)(RQ>1：增加；RQ<1：减少)和p值。

·表皮的屏障功能

根提取物是HRNR基因(霍纳林)表达的诱导物，幅度为3.9(p值＝0.0011)。角蛋白是存在于表皮的角质层和颗粒层中的蛋白质。它是角质层机械强度中必不可少的蛋白质。由于其对角质层和表皮颗粒层必不可少的角质素的表达具有积极作用，因此该提取物在表皮屏障功能的完整性和有效性中起着积极作用。

·皮肤愈合

白桑的根提取物以2.1的幅度诱导金属蛋白酶-1(MMP-1)基因的表达(p值＝0.0289)。MMP是金属蛋白酶，其能够裂解ECM的大部分成分，并能够通过蛋白水解修饰对皮肤愈合重要的大量分子。特别地，MMP1在角质形成细胞的上皮再生中起主要作用。MMP1促进ECM的组装，细胞的伸长和迁移，肌动蛋白细胞骨架的重组，并诱导ERK激酶(细胞外信号调节激酶)的活化，这对于上皮细胞的运动性和侵袭能力是必需的。此外，已经表明，MMP1蛋白响应皮肤伤口在表皮中过表达。

白桑的根提取物在表皮中过表达MMP-1基因意味着它作为一种可能促进皮肤愈合特别是在伤口闭合水平上的活性剂发挥作用。

·脱色作用

反过来，重新启动POMC基因(X 0.3，p值＝0.0175)。它编码阿黑皮素原，这是几种垂体激素的前体蛋白，包括已知刺激黑素生成的α-MSH(α黑素细胞刺激激素)。通过减少POMC的表达，白桑的根提取物因此可以对表皮产生脱色作用。

7.3结论

总之，白桑的根提取物显然在化妆品中起着抗老化的作用，即预防或延缓与减少真皮退化有关的老化作用的外观，这与对表皮屏障功能的完整性和有效性的积极作用有关。

此外，白桑的根提取物可能对表皮有脱色作用。

最后，白桑的根提取物可以用作促进皮肤愈合特别是在伤口闭合情况下的活性剂。

Claims (10)

1.一种桑属植物的根提取物，其特征在于：

·相对于干提取物的总重量，其包含至少2重量％，优选至少2.3重量％，更优选至少4重量％的桑白皮素B，

·相对于干提取物的总重量，其包含按桑白皮素B当量计至少0.05重量％，优选至少0.5重量％，更优选至少2重量％的桑白皮素A，

·相对于干提取物的总重量，其包含按桑白皮素B当量计至少0.1重量％，优选至少0.5重量％，更优选至少1重量％的桑黄酮C，和

·其包含以下两种化合物中的至少一种：

-相对于干提取物的总重量，按桑白皮素B当量计至少0.1重量％，优选至少0.4重量％，更优选至少0.5重量％的维替鲁明F，

-相对于干提取物的总重量，至少0.1重量％，优选至少0.3重量％，更优选至少0.4重量％的桑色呋喃T。

2.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于，所述桑属植物选自白桑和黑桑。

3.一种用于制备根据权利要求1或2所述的桑属植物的根提取物的方法，其包括：

a)在无土条件下，优选气培条件下栽培桑属植物的步骤，

b)任选地，刺激植物根的步骤，

c)任选地在步骤b)中进行刺激的根的固/液提取步骤，和

d)回收在步骤c)中获得的提取物。

4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤c)包括将所述根切碎、干燥并粉碎，然后将粉碎的根浸入溶剂中，所述溶剂选自醇、二醇和低共熔溶剂，并且以纯净的醇、二醇或低共熔溶剂或以醇、二醇或低共熔溶剂的水溶液形式使用。

5.一种化妆品组合物，其包含作为活性剂的至少一种根据权利要求1或2所述的提取物或通过根据权利要求3或4所述的方法获得的提取物，以及至少一种可用于化妆品的赋形剂。

6.根据权利要求1或2所述的提取物、通过权利要求3或4所述的方法获得的提取物或根据权利要求5所述的化妆品组合物，其用于防止或延缓皮肤老化作用的外观和/或对皮肤具有增白作用。

7.一种药物组合物，其包含作为活性剂的至少一种根据权利要求1或2所述的提取物或通过根据权利要求3或4所述的方法获得的提取物，以及至少一种药学上可接受的赋形剂。

8.一种营养组合物，其包含作为活性剂的至少一种根据权利要求1或2所述的提取物或通过根据权利要求3或4所述的方法获得的提取物，以及至少一种营养学上可接受的赋形剂。

9.根据权利要求1或2所述的提取物、通过权利要求3或4所述的方法获得的提取物、根据权利要求7所述的药物组合物或根据权利要求8所述的营养组合物，其用作药物以促进皮肤愈合，特别是在伤口闭合的情况下促进皮肤愈合。

10.权利要求1或2所述的提取物或通过权利要求3或4所述的方法获得的提取物在制备化妆品组合物中的用途，所述化妆品组合物旨在防止或延缓皮肤老化作用的外观和/或旨在对皮肤具有增白作用。

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