CN102370592A - 金雀根提取方法及其提取物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及化妆品工业，尤其是一种金雀根提取方法及其提取物在化妆品中的应用。将由药用植物锦鸡儿的根或根皮进行机械研磨粉碎，制成粉末；再将粉末经过有机溶剂的多次回流萃取提取而成；溶剂萃取出的组分经色谱法或分馏法进一步纯化，分离得到金雀根提取物。提取物具有抑制胰蛋白酶Trypsin的活性，因此具有抗皮肤皱纹产生的功效，可作为天然植物添加物在日用化妆品中。
Description
技术领域
本发明涉及化妆品工业，尤其是一种金雀根提取方法及其提取物在化妆品中的应用。
背景技术
皮肤是维护人体生命和健康的重要部分，直接与外界接触，是机体的第一道屏障，极易受到环境因素的影响而导致损伤。除了年龄、激素水平等生理因素带来的老化因素外，应激反应，污染，阳光和紫外线的照射都是引起皮肤出现皱纹的重要原因。
皮肤衰老主要表现在两个方面，一是胶原蛋白在各种蛋白酶的作用下降解流失，皮肤失去弹性形成皱纹；二是皮肤表面黑色素细胞活化产生色素沉着，逐渐产生黄褐斑，老年斑等各种色斑。在皮肤的衰老过程中，胰蛋白酶和基质金属蛋白酶不但参与皮肤结构中的基质蛋白和胶原蛋白的降解，而且参与黑色素细胞的激活和黑色素向表皮的转运和沉着。胰蛋白酶和基质金属蛋白酶也能使皮肤内的胶原纤维交联和变性，失去弹性，当皮肤内水分不足时，胶原纤维断裂而形成皱纹。皮肤衰老的深层次原因还包括表皮角质形成细胞代谢的减慢，真皮成纤维细胞增殖分裂的速度降低。因此，能够抑制胰蛋白酶和基质金属蛋白酶，保护皮肤基质蛋白和胶原蛋白的天然化合物的发现，是化妆品行业对抗皮肤衰老一直以来追寻的目标。
胰蛋白酶（Trypsin）为蛋白酶的一种，在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。在胰脏是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的。作为胰液的成分而分泌，受肠激酶，或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。另外，胰蛋白在降解消化皮肤基质胶原蛋白方面也具有重要作用，皮肤胶原蛋白基质的降解不但可以引起皮肤弹性减少、皱纹产生，还可以引起黑色素细胞产生的黑色素沉着。胰蛋白酶抑制剂（TI）是具有胰蛋白酶抑制活性的小分子多肽或蛋白质，能与相应的蛋白水解酶形成一定的动态平衡，调节生物体内许多重要的生理活动。胰蛋白酶抑制剂广泛存在于动、植物和微生物体内，根据来源不同可以分为多种，从牛肺和牛胰中提取的抑肽酶（aprotinin），从人尿中提取的人尿胰蛋白酶（urinary trypsin inhibitor，UTI）、从大豆中提取的大豆胰蛋白酶抑制剂（soybean trypsin inhibitor，SBTI）以及从南瓜籽中提取的南瓜胰蛋白酶抑制剂（Cucurˉbita maxima trypsin inhibitor，CMTI）等。除此之外，还有很多人工合成的胰蛋白酶抑制剂。所以，实际上胰蛋白酶抑制剂是一个功能性概念，泛指具有胰蛋白酶抑制作用的一类物质。胰蛋白酶抑制剂在体内很多生理体系中起关键性的调控作用，是维持体内环境稳定的重要因素，不但已经运用于治疗疾病方面，天然产物来源的抑制剂也已用于开发抗皱增白化妆品中。
金雀根为药用植物锦鸡儿的根或根皮， 锦鸡儿 Caragana sinica ( Buc ' hoz) Rehd. 为豆科锦鸡儿属植物，落叶灌木，生于林绿、路旁灌丛中或材庄附近，广泛分布于河北、陕西、河南等省区。金雀根具有清肺益脾、活血通脉之功效，主治虚损劳热、咳嗽、高血压，妇女白带，血崩，关节痛风、跌打损伤。
金雀根中主要的化学有效成分为生物碱、甙类、皂甙。近年来的研究表明，金雀根提取物中还含有异黄酮，二苯乙烯类等类植物激素样化合物，能较强的抑制NF-kB的激活作用。因此，其生理作用和生物活性是多样的。经生物活性筛选发现，金雀根的醋酸乙醋部位具有较强的剌激成骨细胞增殖的活性，预示金雀根中的某些成分有可能在促进骨髓生长、调节骨代谢、预防骨质疏松方面具有潜在意义。现代药理研究证明金雀根提取物具有免疫抑制和抗炎及降压、降黏和平喘之功效。毒理研究证明金雀根无毒，小鼠腹腔注射金雀根醇提物的半数致死量（LD50）为10.4g／kg，相当于生药309.7g／kg。另有报道，甲醇提取物50g／kg灌服对小鼠未引起死亡。
现有文献未见有金雀根提取物及其衍生物、类似物具有抑制胰蛋白酶Trypsin活性的报道。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种金雀根提取物的提取方法，是将由药用植物锦鸡儿的根或根皮进行机械研磨粉碎，制成粉末；再将粉末经过有机溶剂的多次回流萃取提取而成；溶剂萃取出的组分经色谱法或分馏法进一步纯化，分离得到金雀根提取物。
所述金雀根的粉碎粒度为100um-5000um; 采用30-90%的乙醇水溶液加热回流提取；金雀根粉末与溶剂的比例为1：10；萃取温度保持在20-90℃之间；提取时间在8-24小时之间；乙醇提取液经1-40%活性炭脱色后浓缩，干燥。
本发明的另一目的是提供一种金雀根提取物在化妆品中的应用，是将金雀根提取物作为植物添加剂添加到化妆品当中，作为抗皱、皮肤衰老及色素沉着防治中的天然植物添加剂。
上述作为添加剂的量为0.01%-30%重量百分比。
上述的化妆品为软膏，乳霜，护肤霜，护肤乳液，粉底霜，眼霜，精华素，洗面奶，化妆水，面膜或防晒霜。
本发明所涉及到的最新研究表明，金雀根乙醇提取物具有抑制皮肤弹性纤维蛋白降解所需的胰蛋白酶Trypsin的活性，在0.1%-3%的浓度范围内呈剂量依赖关系，具备了作为一种高效，安全，经济的植物组分进一步开发成抗皱纹产生及减缓皮肤弹性降低的外用护肤化妆品的充分和必要条件。
附图说明
图1是本发明的金雀根干燥药材提取工艺流程图。
图2是金雀根提取物抑制胰蛋白酶Trypsin活性的试验研究。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明做进一步说明，阐述金雀根乙醇提取工艺及其在抑制胰蛋白酶活性的作用，及在对抗皱纹产生，美白祛斑防治中的有益效果。
实施例1 金雀根干燥药材提取工艺
本发明中提及的金雀根提取物是由药用植物锦鸡儿的根或根皮中经过有机溶剂的多次回流萃取提取而成。溶剂萃取出的组分经过色普法或分馏法进一步纯化，分离得到产品。所述金雀根的粉碎粒度为100um-5000um; 采用30-90%的乙醇水溶液加热回流提取；金雀根粉末与溶剂的比例为1：10；萃取温度保持在20-90℃之间；提取时间在8-24小时之间；乙醇提取液经1-40%活性炭脱色后浓缩，干燥，备用。工艺流程如图1所示。
样品药液经过进一步浓缩，干燥，制得金雀根乙醇提取物。产品外观为棕色粉末（也可以以溶液或浸膏的形式存在），主要成分为Flavonoids：10~35%；Polyphenols: 1~5 %; 5~10%；Pigment: 2~5%; Moisture:1~5%; Others: <50%；金雀根提取物的鉴别参考文献鉴别方法，制订如下：
取本品粉末1g，加95％乙醇50m1，超声处理30 min，滤过，滤液减压蒸干，残渣加甲醇2m1使溶解，作为供试品药材溶液。另取蒿草酚A、葡蔓素对照品加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2010版附录VIB）试验，吸取上述两种溶液各5μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-三氯甲烷-乙酸乙酯（1:1:7）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点。
实施例2 金雀根提取物抑制胰蛋白酶Trypsin活性的试验研究
试验材料：
1. 胰蛋白酶（Trypsin from bovine pancreas，美国Sigma公司，货号：T-8802）
2. L-BAPA（美国Sigma公司，货号：B3133）
3. 己脒定二(羟乙基磺酸)盐
4. 96孔板（美国Corning公司，货号：3599）
5. 384孔板（德国Greiner公司，货号：781101）
6. 其他试剂：三羟甲基氨基甲烷（Tris），氯化钙（分析纯，CaCl2），36%盐酸（分析纯），二甲基亚砜（DMSO）
试剂制备
1. 缓冲液：将6.05g Tris和2.22g CaCl2溶于1L蒸馏水中，用6N的盐酸调节PH值到8.2，4℃保存；
2. 酶：胰蛋白酶
1）母液（1mM）：将50mg胰蛋白酶溶解于2.17mL蒸馏水中；
2）30uL每管分装，- 20℃保存；
3） 工作液（100 nM）：将2uL母液稀释于20mL缓冲液中，放于冰上，实验当天配制；
3. 底物：L-BAPA
1）母液(100 mM)：350mg底物溶解于8mL DMSO中；
2）2.3mL每管分装，- 20℃保存；
3）工作液（1.37mM）：将2.19mL母液稀释于158mL缓冲液中，实验当天配制；
4. 阳性对照：己脒定二(羟乙基磺酸)盐
1) 母液（100 mM）：将10mg阳性对照溶解于164.7uL DMSO中；
2) 10uL每管分装，- 20℃保存；
3) 工作液(5mM)：将10uL母液用190uL缓冲液稀释，实验当天配制；
5. 植物提取物供试品
1）称取相应重量提取物，加PBS溶解配成提取物母液（3mg/mL）
2） 取5uL提取物母液稀释于45uL缓冲液中，制备工作液(300 ug/mL)，实验当天配制；
6. 30%DMSO(v/v)： 用缓冲液以3:10稀释100%DMSO。
实验方法：
1. 准备两块96孔板，一块标记“plate A”，用于植物提取物的酶抑制活性测试。另一块标记“plate B”，用于测试提取物的本底信号；
2. Plate A：C1-C11每孔加125uL酶，C12加125uL缓冲液；Plate B：每孔加125uL缓冲液；
3. Plate A：C1-C10每孔加2uL化合物，C11加2uL阳性对照，C12每孔加2uL 30%DMSO；Plate B：每孔加2uL化合物；
4. 用移液器吹打混匀后，于25℃孵育15~30分钟；
5. 两块板的每孔加75uL底物，于25℃孵育30分钟；
6. 酶标仪与OD405测量培养板各孔溶液吸光度，数据如下处理。
7. 计算：
抑制率（%）=100－（样本-空白（s））/（对照-空白（c））??100%
样本=含酶/底物/提取物的孔的OD405均值（n=2）
对照=含酶/底物/DMSO的孔的OD405均值（n=4）
空白（s）=含提取物和底物的孔OD405（n=1）
空白（c）=含DMSO和底物的孔OD405（n=4）
实验结果：
表1
表1和图2的实验表明，金雀根乙醇提取物明显抑制胰蛋白酶Trypsin活性，且抑制呈剂量依赖关系， 采用XLFIT数理统计软件计算半数抑制浓度（IC50）为10.84ug/mL。
根据上述的实例，本发明可以有许多的改良和变更。因此，应当明白，在所附权利要求的范围内，除这里的描述之外，本发明也可以用其他方法实施。
实施例3：制备护肤霜 (按重量比例计)
金雀根乙醇提取物 0.1-3%
甘油 3-8 %
辛酸/癸酸/三甘油酯 3-8 %
棕榈酸异辛酯 3-8 %
十六醇/十八醇 3-5 %
C12-20 烷基葡糖苷 1-3 %
鲸蜡硬脂醇聚醚-25 1-3 %
聚二甲基硅氧烷 1-3 %
矿油 3-8 %
羟苯甲酯 0.1-0.5%
苯氧乙醇 0.3-0.5%
香精 适量
去离子水 加之100％
制备方法:将去粒子水和水相的甘油、羟苯甲酯加热至80℃，同时将油相的棕榈酸异辛酯、辛酸/癸酸/三甘油酯、十六醇/十八醇、C12-20 烷基葡糖苷、鲸蜡硬脂醇聚醚-25、聚二甲基硅氧烷、苯氧乙醇加热至80℃，将油相溶液搅拌下缓缓加入水相溶液中，均质搅拌2-5分钟，开启真空，搅拌保温15分钟后搅拌降温，降温至50℃时加入金雀根乙醇提取物和适量香精，搅拌均匀即配成护肤霜。
实施例4：制备护肤水 (按重量比例计)
金雀根乙醇提取物 0.1-3%
甘油 3-8 %
海藻糖 0.1-1 %
柠檬酸 0.05-1 %
柠檬酸钠 0.2-2 %
PEG-60氢化蓖麻油 0.2-2 %
丁二醇/水/DMDM 乙内酰脲/碘丙炔醇丁基氨甲酸酯溶液 0.2-0.5%
乙醇 5－10％
香精 适量
去离子水 加之100％
制备方法：将去离子水、甘油、海藻糖加热至80℃后保温15分钟，后搅拌降温，降温至50℃时加入金雀根乙醇提取物和乙醇预溶液、PEG-60氢化蓖麻油和香精的预溶液以及丁二醇/水/DMDM 乙内酰脲/碘丙炔醇丁基氨甲酸酯溶液，再用柠檬酸和柠檬酸钠的缓冲溶液调节pH至5.5－6.5以内，搅拌均匀即配成护肤水。
综上，本发明提出了将干燥的金雀根经过提取，纯化得到的一种提取物。提取物具有抑制胰蛋白酶Trypsin的活性，因此具有抗皮肤皱纹产生的功效，可作为天然植物添加物在日用化妆品中。
Claims (5)
1.一种金雀根提取物的提取方法，是将由药用植物锦鸡儿的根或根皮进行机械研磨粉碎，制成粉末；再将粉末经过有机溶剂的多次回流萃取提取而成；溶剂萃取出的组分经色谱法或分馏法进一步纯化，分离得到金雀根提取物。
2.根据权利要求1所述的金雀根提取物的提取方法，其特征在于，所述金雀根的粉碎粒度为100um-5000um; 采用30-90%的乙醇水溶液加热回流提取；金雀根粉末与溶剂的比例为1：10；萃取温度保持在20-90℃之间；提取时间在8-24小时之间；乙醇提取液经1-40%活性炭脱色后浓缩，干燥。
3.一种金雀根提取物在化妆品中的应用，是将金雀根提取物作为植物添加剂添加到化妆品当中，作为抗皱、皮肤衰老及色素沉着防治中的天然植物添加剂。
4.根据权利要求3所述金雀根提取物在化妆品中的应用，其特征在于，所述作为添加剂的量为0.01%-30%重量百分比。
5.根据权利要求3所述金雀根提取物在化妆品中的应用，其特征在于，所述化妆品为软膏，乳霜，护肤霜，护肤乳液，粉底霜，眼霜，精华素，洗面奶，化妆水，面膜或防晒霜。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN106501381A (zh) * | 2015-09-06 | 2017-03-15 | 复旦大学 | 一种含金雀根提取物药物的质量控制方法 |
| CN113876829A (zh) * | 2021-11-20 | 2022-01-04 | 卢当雪 | 一种治疗心脏扩大的金雀根药物及其应用 |
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