CN111201024A - 经化学修饰的寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

在一些方面中，本公开内容涉及用于产生免疫原性组合物的方法和组合物。在一些实施方案中，本公开内容提供了已经用能够控制和/或降低宿主细胞分化的一种或更多种寡核苷酸试剂离体处理的宿主细胞。在一些实施方案中，本公开内容所描述的组合物和方法可用作用于治疗癌症的免疫原性调节剂。

Description

经化学修饰的寡核苷酸
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2017年8月7日提交的标题为“IMMUNOTHERAPYOF CANCER UTILIZING CHEMICALLY MODIFIED OLIGONUCLEOTIDES”的美国临时申请序列号62/542,043和于2017年9月13日提交的标题为“CONTROL OF DIFFERENTIATION UTILIZINGCHEMICALLY MODIFIED OLIGONUCLEOTIDES IN IMMUNOTHERAPY”的美国临时申请序列号62/558,183(其各自的全部公开内容通过引用整体并入本文)的申请日的权益。
技术领域
在一些方面中，本公开内容涉及免疫原性组合物和制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括使用寡核苷酸来调节参与细胞分化和代谢的基因靶标以改善治疗性免疫细胞的群(population)或亚群(subset)。本公开内容还涉及使用免疫原性组合物用于治疗细胞增生性病症或感染性疾病的方法，所述细胞增生性病症或感染性疾病包括例如癌症和自身免疫病。
背景技术
免疫系统的生理功能是识别和消除肿瘤细胞。因此，肿瘤进展的一个方面是免疫抗性机制的发生。这些抗性机制一旦发生，不仅会阻止天然免疫系统影响肿瘤的生长，还会限制任何免疫治疗方法对癌症的效力。免疫抗性机制涉及有时称为免疫检查点的免疫抑制途径。免疫抑制途径在肿瘤细胞与CD8+细胞毒性T淋巴细胞之间的相互作用中发挥特别重要的作用，所述免疫抑制途径包括过继细胞转移(Adoptive Cell Transfer，ACT)治疗剂。
过继细胞转移(ACT)的多种方法涉及对从患者的样品(例如血液或肿瘤材料)中收集的细胞进行离体处理。基于细胞的处理的准备中涉及的常见步骤是从原始来源(例如，外周血)中分离细胞、基因编辑(例如，使嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)T细胞或经工程化的T细胞受体(T-cell receptor，TCR)细胞工程化)、活化和扩增。
在离体处理期间，细胞经历某些表型改变，所述改变可影响细胞的治疗特性，例如向肿瘤的运输、体内增殖能力和寿命，以及它们在免疫抑制环境中的效力等。例如，T细胞分化和成熟的状态通常通过以下亚型的顺序进行：初始T细胞(TN)-干细胞记忆T细胞(TSCM)-中枢记忆T细胞(TCM)-效应记忆T细胞(TEM)-终末分化的效应T细胞(TEFF)。已经观察到，CD8+T细胞中的早期记忆T细胞(TSCM/TCM)的表型属性和功能属性显示出比更分化的效应细胞(例如，TEM、TEFF等)优异的体内扩增、持久性和抗肿瘤效力。
在临床实践中，癌症的免疫治疗已变得越来越重要。被设计为引起或增强免疫应答的免疫治疗可被分类为激活免疫治疗，而降低或抑制免疫应答的免疫治疗可被分类为抑制免疫治疗。对抗(combat)癌症免疫抗性机制的一种激活免疫治疗策略是抑制免疫检查点(例如，通过使用靶向检查点的单克隆抗体)，以刺激或维持宿主免疫应答。
然而，将癌症免疫治疗剂与检查点抑制剂组合使用存在许多缺点。例如，免疫检查点阻断可导致免疫自身耐受性的破坏，从而诱导自身免疫/自身炎性副作用的新综合征，所述综合征被称为“免疫相关不良事件”。此外，据报道，检查点抑制剂的毒性谱与所报道的其他类型肿瘤药剂(oncologic agent)的毒性谱(toxicity profile)不同，并且可在包括皮肤、胃肠、内分泌、肺、肝、眼和神经系统在内的多个器官系统中诱导炎性事件。
发明概述
在一些方面中，本公开内容涉及用于在产生免疫原性组合物期间控制T细胞的分化过程以增强期望的治疗性T细胞亚型(例如，TSCM和TCM)的水平的组合物和方法。本公开内容部分地基于包含宿主细胞的免疫调节(例如，免疫原性)组合物以及产生这样的组合物的方法，所述宿主细胞包含靶向与信号转导/转录因子靶标、表观遗传靶标、代谢和共抑制/阴性调节靶标相关的基因的寡核苷酸分子。在一些方面中，本公开内容提供了用于产生免疫原性组合物的方法中的经化学修饰的寡核苷酸(chemically-modified oligonucleotide)分子。在一些实施方案中，本公开内容所描述的方法和组合物可用于制备免疫原性组合物和用于治疗患有增生性或感染性疾病的对象。
因此，在一些方面中，本公开内容提供了经化学修饰的双链核酸分子，其靶向以下物质(例如，针对编码以下物质的基因)：蛋白激酶B(Protein Kinase B，PKB，也称为AKT)、细胞程序性死亡蛋白1(PD1，也称为PDCD1)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、肿瘤蛋白p53(Tumor protein p53，TP53，也称为p53、细胞肿瘤抗原、磷蛋白p53、肿瘤抑制剂p53、抗原NY-CO-13或转化相关蛋白53(transformation-related protein 53，TRP53))、E3泛素蛋白连接酶Cbl-b(Cbl-b)、Tet甲基胞嘧啶双加氧酶2(TET2，也称为KIAA1546、Tet癌基因家庭成员2、可能的甲基胞嘧啶双加氧酶TET2、甲基胞嘧啶双加氧酶TET2)、PR/SET结构域1(Blimp-1，也称为具有ZNF结构域的含PR结构域的1、PR结构域1、PRDM1、PRDI-BF1、β-干扰素基因正调节结构域I结合因子、正调节结构域I结合因子1、B淋巴细胞诱导的成熟蛋白1、PR结构域锌指蛋白1、包含PR结构域的蛋白1、PRDI结合因子1)、T-Box 21(TBX21，也称为T细胞特异性T-Box转录因子T-Bet、转录因子TBLYM、T-Box蛋白21、TBLYM、TBET、T-Box转录因子TBX21、T细胞中表达的T-Box、T-PET、T-Bet)、DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶3A(DNA(cytosine-5)-methyltransferase3A，DNMT3A)、非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶6(PTPN6，也称为SHP-1)或己糖激酶2(HK2，也称为肌形式己糖激酶)。
在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子针对包含选自表3至13内序列之序列的至少12个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子是自递送RNA(例如，sd-rxRNA)。在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子(例如，sd-rxRNA)包含表3至13中所示序列或其片段，或者由表3至13中所示序列或其片段组成，或者靶向或针对表3至13中所示序列或其片段。
在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子包含至少一个2’-O-甲基修饰和/或至少一个2’-氟修饰，以及至少一个硫代磷酸酯修饰。在一些实施方案中，第一核苷酸相对于引导链的5’端具有2’-O-甲基修饰。在一些实施方案中，2’-O-甲基修饰是5P-2’O-甲基U修饰或5’乙烯基膦酸酯2’-O-甲基U修饰。
在一些实施方案中，sd-rxRNA是经疏水性修饰的。在一些实施方案中，sd-rxRNA与一个或更多个疏水性缀合物连接。在一些实施方案中，疏水性缀合物是胆固醇。
在一些方面中，本公开内容提供了针对编码TIGIT、DNMT3A、PTPN6、PDCD1、AKT、P53、Cbl-b、Tet2、Blimp-1、T-Box21或HK2的基因的sd-rxRNA。在一些实施方案中，sd-rxRNA包含选自表3至13内序列之序列的至少12个连续核苷酸。
在一些方面中，本公开内容提供了经化学修饰的双链核酸分子，其靶向具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)或细胞程序性死亡蛋白1(PD1)。
在一些方面中，本公开内容提供了针对编码TIGIT的基因的经化学修饰的双链核酸分子。在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子针对包含选自表5内之序列的至少12个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，sd-rxRNA包含具有SEQ ID NO：100(TIGIT 21有义链)中所示序列的有义链和/或具有SEQ ID NO：101(TIGIT 21反义链)中所示序列的反义链。在一些实施方案中，sd-rxRNA包含具有SEQ ID NO：100(TIGIT 21有义链)中所示序列的有义链和具有SEQ ID NO：101(TIGIT 21反义链)中所示序列的反义链。
在一些实施方案中，本公开内容提供了针对PD1的经化学修饰的双链核酸。在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子针对包含选自表3或表6内之序列的至少12个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子包含表6中所示序列。在一些实施方案中，sd-rxRNA包含具有SEQ ID NO：112(PD 26有义链)中所示序列的有义链和/或具有SEQ ID NO：113(PD 26反义链)中所示序列的反义链。在一些实施方案中，sd-rxRNA包含具有SEQ ID NO：112(PD 26有义链)中所示序列的有义链和具有SEQ ID NO：113(PD 26反义链)中所示序列的反义链。
在一些实施方案中，本公开内容提供了针对Cb1-b的经化学修饰的双链核酸。在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子针对包含选自表4和表8内之序列的至少12个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子包含表8中所示序列。在一些实施方案中，如本文中所述的经化学修饰的双链核酸分子或sd-rxRNA包含CB 23有义或反义链(SEQ ID NO：236或237)或者CB 29有义或反义链(SEQ ID NO：248或249)中所示序列，或者由其组成。
在一些实施方案中，如本文中所述的经化学修饰的双链核酸分子或sd-rxRNA包含具有CB 23有义链(SEQ ID NO：236)中所示序列的有义链和/或具有CB 23反义链(SEQ IDNO：237)中所示序列的反义链，或者由其组成。在一些实施方案中，如本文中所述的经化学修饰的双链核酸分子或sd-rxRNA包含具有CB 29有义链(SEQ ID NO：248)中所示序列的有义链和/或具有CB 29反义链(SEQ ID NO：249)中所示序列的反义链，或者由其组成。
在一些实施方案中，本公开内容提供了针对HK2的经化学修饰的双链核酸。在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子针对包含选自表7内之序列的至少12个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子包含表7中所示序列。
在一些实施方案中，本公开内容提供了针对DNMT3A的经化学修饰的双链核酸。在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子针对包含选自表9内之序列的至少12个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子包含表9中所示序列。
在一些实施方案中，本公开内容提供了针对PRDM1的经化学修饰的双链核酸。在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子针对包含选自表10内之序列的至少12个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子包含表10中所示序列。
在一些实施方案中，本公开内容提供了针对PTPN6的经化学修饰的双链核酸。在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子针对包含选自表11内之序列的至少12个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子包含表11中所示序列。
在一些实施方案中，本公开内容提供了针对TET2的经化学修饰的双链核酸。在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子针对包含选自表11内之序列的至少12个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子包含表11中所示序列。
在一些实施方案中，本公开内容提供了针对Tbox21的经化学修饰的双链核酸。在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子针对包含选自表13内之序列的至少12个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子包含表13中所示序列。
在一些方面中，本公开内容提供了组合物，其包含如本文中所述的经化学修饰的双链核酸分子或sd-rxRNA以及可药用赋形剂。
在一些方面中，本公开内容提供了组合物(例如，免疫原性组合物)，其包含如本公开内容所述的(例如，靶向表3至13中的任一个中所示序列的)经化学修饰的双链核酸分子或如本公开内容所述的(例如，如表3至13中示出的)sd-rxRNA以及可药用赋形剂。在一些实施方案中，经化学修饰的核酸分子包含选自PD 21至PD 37(SEQ ID NO：102至135)、TIGIT 1(SEQ ID NO：60)、TIGIT 6(SEQ ID NO：65)和TIGIT 21(SEQ ID NO：100至101)的序列。
在一些方面中，本公开内容涉及包含宿主细胞(例如，一个或更多个宿主细胞，或宿主细胞群)的免疫原性组合物，所述宿主细胞包含一种或更多种如本文中所述的经化学修饰的双链核酸分子。宿主细胞的一些实例包括但不限于：T细胞、NK细胞、抗原呈递细胞(antigen-presenting cell，APC)、树突细胞(dendritic cell，DC)、干细胞(stem cell，SC)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)和干中枢记忆T细胞。
在一些方面中，本公开内容提供了免疫原性组合物，其包含宿主细胞，所述宿主细胞包含针对TIGIT序列的经化学修饰的双链核酸分子，所述TIGIT序列包含选自表5内序列之序列的至少12个连续核苷酸。
在一些方面中，本公开内容提供了免疫原性组合物，其包含宿主细胞，所述宿主细胞包含针对编码PD1的基因的sd-rxRNA，其中所述sd-rxRNA包含选自表3内序列之序列的至少12个连续核苷酸。在一些实施方案中，sd-rxRNA包含表6中所示序列。
在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子或sd-rxRNA在宿主细胞中诱导对PDCD1或TIGIT的至少50％抑制。
在一些方面中，本公开内容提供了免疫原性组合物，其包含宿主细胞，所述宿主细胞包含针对编码Cb1-b的基因的sd-rxRNA，其中所述sd-rxRNA包含选自表4内序列之序列的至少12个连续核苷酸。在一些实施方案中，sd-rxRNA包含表8中所示序列。
在一些方面中，本公开内容提供了免疫原性组合物，其包含宿主细胞，所述宿主细胞包含针对编码HK2的基因的sd-rxRNA，其中所述sd-rxRNA靶向包含选自表7内序列之序列的至少12个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，sd-rxRNA包含表7中所示序列。
在一些方面中，本公开内容提供了免疫原性组合物，具包含宿主细胞，所述宿主细胞包含针对编码DNMT3A的基因的sd-rxRNA，其中所述sd-rxRNA靶向包含选自表9内序列之序列的至少12个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，sd-rxRNA包含表9中所示序列。
在一些方面中，本公开内容提供了免疫原性组合物，其包含宿主细胞，所述宿主细胞包含针对编码PRDM1的基因的sd-rxRNA，其中所述sd-rxRNA靶向包含选自表10内序列之序列的至少12个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，sd-rxRNA包含表10中所示序列。
在一些方面中，本公开内容提供了免疫原性组合物，其包含宿主细胞，所述宿主细胞包含针对编码PTPN6的基因的sd-rxRNA，其中所述sd-rxRNA靶向包含选自表11内序列之序列的至少12个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，sd-rxRNA包含表11中所示序列。
在一些方面中，本公开内容提供了免疫原性组合物，其包含宿主细胞，所述宿主细胞包含针对编码TET2的基因的sd-rxRNA，其中所述sd-rxRNA靶向包含选自表12内序列之序列的至少12个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，sd-rxRNA包含表12中所示序列。
在一些方面中，本公开内容提供了免疫原性组合物，其包含宿主细胞，所述宿主细胞包含针对编码Tbox21的基因的sd-rxRNA，其中所述sd-rxRNA靶向包含选自表13内序列之序列的至少12个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，sd-rxRNA包含表13中所示序列。
在一些方面中，本公开内容提供了免疫原性组合物，其包含宿主细胞(例如，免疫细胞，例如T细胞)，所述宿主细胞已经用经化学修饰的双链核酸分子离体处理以控制和/或降低宿主细胞(例如，T细胞)的分化水平，以使得能够产生用于在人中施用的特异性免疫细胞群(例如，针对特定T细胞亚型富集的群)。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含针对特定细胞类型(例如，T细胞亚型)富集的多种宿主细胞。例如，在一些实施方案中，免疫原性组合物包含至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％(例如，50％至100％之间的任何百分比，包括端值)的特定T细胞亚型的T细胞，例如TSCM或TCM细胞。
在一些实施方案中，免疫原性组合物包含宿主细胞，所述宿主细胞包含如本文中所述的经化学修饰的双链核酸分子(例如，针对编码DNMT3A、PTPN6、PDCD1、AKT、p53、Cbl-b、Tet2、Blimp-1、T-Box21或HK2的基因的经化学修饰的双链核酸分子或sd-rxRNA)，或者针对编码DNMT3A、PTPN6、PDCD1、AKT、p53、Cbl-b、Tet2、Blimp-1、T-Box21或HK2的一个或更多个基因的经化学修饰的双链核酸分子或sd-rxRNA的组合。在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子或sd-rxRNA针对包含选自表3至13内序列之序列的至少12个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子(例如，sd-rxRNA)包含表3至13中所示序列或其片段，或者由表3至13中所示序列或其片段组成，或者靶向或针对表3至13中所示序列或其片段。
在一些实施方案中，宿主细胞选自：T细胞、NK细胞、抗原呈递细胞(APC)、树突细胞(DC)、干细胞(SC)、诱导多能干细胞(iPSC)、干细胞记忆T细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)。在一些实施方案中，宿主细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，在引入经化学修饰的双链核酸或sd-rxRNA之后，T细胞分化成特定的T细胞亚型，例如TSCM或TCM T细胞。
在一些实施方案中，T细胞包含表达高亲和力T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)的一种或更多种转基因。
在一些实施方案中，宿主细胞来源于健康供体(例如，未患有或未被怀疑患有增生性疾病(例如癌症)或感染性疾病的供体)。
在一些方面中，本公开内容提供了用于产生免疫原性组合物的方法，所述方法包括将一种或更多种如本文中所述的经化学修饰的双链核酸分子或sd-rxRNA引入到细胞中。在一些实施方案中，将经化学修饰的双链核酸分子或sd-rxRNA离体引入到细胞中。
在本文中所述方法的一些实施方案中，细胞是T细胞、NK细胞、抗原呈递细胞(APC)、树突细胞(DC)、干细胞(SC)、诱导多能干细胞(iPSC)、干细胞记忆T细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)。
在一些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，在引入经化学修饰的双链核酸或sd-rxRNA之后，T细胞分化成特定的T细胞亚型，例如TSCM或TCM T细胞。在一些实施方案中，T细胞包含表达高亲和力T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)的一种或更多种转基因。在一些实施方案中，细胞来自健康供体。
在一些方面中，本公开内容提供了用于治疗患有增生性疾病或感染性疾病之对象的方法，所述方法包括向对象施用如本文中所述的免疫原性组合物。在一些实施方案中，增生性疾病是癌症。在一些实施方案中，感染性疾病是病原体感染，例如病毒感染、细菌感染或寄生虫感染。
本发明的每种限制都可涵盖本发明的多个实施方案。因此，预期涉及任何一个要素或要素的组合的本发明的每种限制都可包含在本发明的各个方面中。本发明的应用不限于在以下说明书中给出的或在附图中举例说明的成分之构造和布置的细节。本发明可以是其他实施方案并且以多种方式实践或实施。
附图简述
附图并未旨在按比例绘制。在附图中，不同的图中举例说明的每个相同或几乎相同的成分由相同的数字表示。为了清楚起见，并非每个图中都标示出每个成分。在附图中：
图1示出了在人原代T细胞中利用经化学优化的靶向PD-1的sd-rxRNA的PDCD1mRNA水平的降低。
图2示出了在人原代T细胞中靶向PDCD1的经化学优化的sd-rxRNA的剂量响应曲线。对于每种经化学优化的sd-rxRNA，从左到右的测试浓度为2μM、1μM、0.5μM、0.25μM、0.125μM和0.06μM。
图3示出了在人原代T细胞中靶向TIGIT的sd-rxRNA的剂量响应曲线。对于每种sd-rxRNA，从左到右的测试浓度为2μM、1μM、0.5μM、0.25μM、0.1μM和0.04μM。
图4示出了T细胞分化状态的进展的示意图。
图5示出了在离体培养中来自用靶向PD-1和TIGIT的sd-rxRNA处理的活化人原代T细胞的增强的T中枢记忆(T central memory，TCM)分化。将人初始T细胞用CD3/CD28Dynabead+IL-2活化，并用2μM NTC(non-targeting control，非靶向性对照)sd-rxRNA、2μM靶向PD1的sd-rxRNA和2μM靶向TIGIT的sd-rxRNA处理。四天之后，收获细胞并通过多色流式细胞术分析T细胞亚群。与对照相比，当PD-1和TIGIT抑制时，分化成TCM亚型的T细胞群分别增强了3.9倍和1.7倍。
图6示出了在HepG2细胞中靶向HK2的sd-rxRNA的两点剂量响应曲线。对于每种经化学优化的sd-rxRNA，测试浓度从左到右为1μM和0.02μM。
图7示出了在全T细胞(Pan-T cell)中靶向HK2的sd-rxRNA的六点剂量响应曲线。对于每种sd-rxRNA，从左到右的测试浓度为2μM、1μM、0.5μM、0.25μM、0.125μM和0.06μM。
图8示出了在T细胞中Cbl-b沉默的代表性数据。在右侧标题中所示的剂量响应实验中，对于每种sd-rxRNA，从左到右的测试浓度为2μM、1μM、0.5μM、0.25μM、0.1μM和0.04μM。
图9示出了在人原代NK细胞中靶向CBLB的sd-rxRNA的五点剂量响应。对于每种sd-rxRNA，从左到右的测试浓度为2μM、1μM、0.5μM、0.25μM和0.125μM。
图10示出了在HepG2细胞中靶向DMNT3A的sd-rxRNA的三点剂量响应。对于每种sd-rxRNA，从左到右的测试浓度为1μM、0.5μM和0.25μM。
图11示出了在全T细胞中靶向DMNT3A的sd-rxRNA的五点剂量响应曲线。对于每种sd-rxRNA，从左到右的测试浓度为2μM、1μM、0.5μM、0.25μM、0.125μM和0.06μM。
图12示出了在A549细胞中靶向PRDM1的sd-rxRNA的两点剂量响应。对于每种sd-rxRNA，测试的浓度为1μM(左)和0.2μM(右)。
图13示出了在A549细胞中靶向PRDM1的sd-rxRNA的六点剂量响应。对于剂量响应实验，对于每种sd-rxRNA，从左到右的测试浓度为1μM、0.5μM、0.1μM、0.05μM、0.025μM和0.01μM。
图14示出了在A549细胞中靶向PTPN6的sd-rxRNA的两点剂量响应。对于每种sd-rxRNA，测试的浓度为1μM(左)和0.2μM(右)。
图15示出了在A549细胞中靶向PTPN6的sd-rxRNA的六点剂量响应。对于剂量响应实验，对于每种sd-rxRNA，从左到右的测试浓度为1μM、0.5μM、0.1μM、0.05μM、0.025μM和0.01μM。
图16示出了在U2OS细胞中靶向TET2的sd-rxRNA的两点剂量响应。对于每种sd-rxRNA，测试的浓度为1μM(左)和0.2μM(右)。
图17示出了在U2OS细胞中靶向TET2的sd-rxRNA的六点剂量响应。对于剂量响应实验，对于每种sd-rxRNA，从左到右的测试浓度为1μM、0.5μM、0.1μM、0.05μM、0.025μM和0.01μM。
图18示出了在全T细胞中靶向TBX21的sd-rxRNA的两点剂量响应。对于每种sd-rxRNA，测试的浓度为1μM(左)和0.2μM(右)。
图19示出了在人原代NK细胞中靶向TIGIT的sd-rxRNA的三点剂量响应。对于每种sd-rxRNA，测试的浓度为2μM(左)、1μM(中)和0.5μM(右)。
图20示出了在人原代T细胞中靶向AKT1的sd-rxRNA的六点剂量响应曲线。对于每种sd-rxRNA，从左到右的测试浓度为2μM、1μM、0.5μM、0.25μM、0.125μM和0.06μM。
发明详述
在一些方面中，本公开内容涉及用于免疫治疗的组合物和方法。本公开内容部分地基于经化学修饰的双链核酸分子(例如，sd-rxRNA)，其靶向与控制T细胞的分化过程和/或调节T细胞的表达或活性的相关的基因，例如AKT、PD1、TIGIT、p53、Cbl-b、Tet2、Blimp-1、T-Box 21或HK2、DNMT3A、PTPN6等。sd-rxRNA技术特别适用于控制细胞(包括T-细胞)的分化过程以及富含期望的亚型(TSCM/TCM)的治疗性细胞的产生。sd-rxRNA的数个优点包括：(i)sd-rxRNA可在短的时间期间内被开发出来，并且可使几乎任何靶标沉默，所述靶标包括“非可被药物靶向的(non-druggable)”靶标，例如难以被小分子(例如，转录因子)抑制的那些靶标；(ii)与替代的离体siRNA转染技术(例如，脂质介导的转染或电穿孔)相比，sd-rxRNA可转染多种细胞类型，包括具有高的转染效力、保持高的细胞生存力的T细胞；(iii)当在早期扩增阶段添加至细胞培养基时，sd-rxRNA化合物在8至10个分裂周期期间提供目的靶标的瞬时沉默，从而使沉默作用到最终细胞群重新输注到患者中的时候在最终细胞群中消失；(iv)sd-rxRNA可组合使用以使多个靶标同时沉默，从而为在不同类型的细胞治疗方案中使用提供极大的灵活性。
本文中描述了针对参与T细胞分化的特定靶标的sd-rxRNA，以及这样的sd-rxRNA在离体扩增之后对T细胞表型的有益作用。还提出了可用于鉴定适用于特定细胞产生方案的sd-rxRNA或sd-rxRNA的组合的筛选方法。
本文中使用的“核酸分子”包括但不限于：sd-rxRNA、rxRNAori、寡核苷酸、ASO、siRNA、shRNA、miRNA、ncRNA、cp-lasiRNA、aiRNA、单链核酸分子、双链核酸分子、RNA和DNA。在一些实施方案中，核酸分子是经化学修饰的核酸分子，例如经化学修饰的寡核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子是双链的。在一些实施方案中，如本文中所述的经化学修饰的双链核酸分子是sd-rxRNA分子。
sd-rxRNA分子
本发明的一些方面涉及sd-rxRNA分子，其靶向与控制T细胞的分化过程和/或调节T细胞的表达或活性相关的基因，例如DNMT3A、PTPN6、PDCD1、TIGIT、AKT、p53、Cbl-b、Tet2、T-Box 21、Blimp-1和HK2。在一些实施方案中，本公开内容提供了靶向选自以下的基因的sd-rxRNA：PDCD1、AKT、p53、Cbl-b、Tet2、T-Box 21、Blimp-1、DNMT3A、PTPN6和HK2。在一些实施方案中，本文中所述的sd-rxRNA包含表3至13中所示序列或其片段，或者由表3至13中所示序列或其片段组成，或者靶向或针对表3至13中所示序列或其片段。
本文中使用的“sd-rxRNA”或“sd-rxRNA分子”是指自递送RNA分子(self-delivering RNA molecule)，例如通过引用并入的以下专利中描述那些：2014年8月5日授权的标题为“REDUCED SIZE SELF-DELIVERING RNAI COMPOUNDS”的美国专利No.8,796,443，2015年11月3日授权的标题为“REDUCED SIZE SELF-DELIVERING RNAI COMPOUNDS”的美国专利No.9,175,289和2009年9月22日提交的标题为“REDUCED SIZE SELF-DELIVERINGRNAI COMPOUNDS”的PCT公开No.WO2010/033247(申请No.PCT/US2009/005247)。简言之，sd-rxRNA(也称为sd-rxRNAnano)是分离的不对称双链核酸分子，其包含最小长度为16个核苷酸的引导链和长度为8至18个核苷酸的随从链，其中所述双链核酸分子具有双链区和单链区，单链区长度为4至12个核苷酸，并且具有至少三个核苷酸骨架修饰。在一些优选实施方案中，双链核酸分子具有一个平末端，或者包含一个或两个核苷酸的单链突出端(overhang)。可通过化学修饰，并且在一些情况下，通过附接疏水性缀合物对sd-rxRNA分子进行优化。上面引用的专利和出版物各自通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，sd-rxRNA包含分离的双链核酸分子，所述双链核酸分子包含引导链和随从链，其中分子双链区的长度为8至15个核苷酸，其中引导链包含长度为4至12个核苷酸的单链区，其中引导链的单链区包含3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个硫代磷酸酯修饰，并且其中双链核酸的至少40％核苷酸是经修饰的。
本发明的核酸分子在本文中是指本发明的分离的双链或双链体核酸、寡核苷酸或多核苷酸、纳米分子、纳米RNA、sd-rxRNAnano、sd-rxRNA或RNA分子。
与常规siRNA相比，sd-rxRNA有效得多地被细胞摄取。这些分子在使靶基因表达沉默方面非常高效，并且相对于之前描述的RNAi分子提供了显著的优点，包括在血清存在下的高活性、高效的自递送、与广泛多种接头的相容性、以及与毒性相关的化学修饰的存在降低或完全不存在。
与单链多核苷酸相比，双链体多核苷酸传统上难以递送至细胞，因为其具有刚性结构和大量负电荷，这使得膜转移变得困难。然而，尽管sd-rxRNA是部分双链的，但是被认为在体内是单链的，因此能够高效地被递送穿过细胞膜。因此，本发明的多核苷酸在许多情况下能够自递送。因此，本发明的多核苷酸可以以类似于常规RNAi试剂的方式配制，或者其可单独(或者与非递送类型的载体一起)递送至细胞或对象并且允许自递送。在本发明的一个实施方案中，提供了自递送不对称双链RNA分子，其中分子的一部分与常规RNA双链体类似，并且分子的第二部分是单链的。
在一些方面中，本发明的寡核苷酸具有不对称结构的组合，包括5个核苷酸或更长的双链区和单链区，特定的化学修饰模式，并且与亲脂性或疏水性分子缀合。在一些实施方案中，这一类RNAi样化合物具有优秀的体外和体内效力。认为刚性双链体区尺寸的减小与应用于单链区的硫代磷酸酯修饰的组合导致了所观察到的优秀效力。
在一个优选的实施方案中，本发明的RNAi化合物包含不对称化合物，所述不对称化合物包含双链体区(高效RISC进入所需，8至15个碱基长)和4至12个核苷酸长的单链区。在一些实施方案中，双链体区为13或14个核苷酸长。在一些实施方案中，6或7个核苷酸的单链区是优选的。新RNAi化合物的单链区还包含2至12个硫代磷酸酯核苷酸间键联(称为硫代磷酸酯修饰)。在一些实施方案中，6至8个硫代磷酸酯核苷酸间键联是优选的。此外，本发明的RNAi化合物还包含独特的化学修饰模式，其提供稳定性并且与RISC进入相容。在一些实施方案中，这些要素的组合已产生对于体外和体内递送RNAi试剂非常有用的预料不到的特性。
提供稳定性并且与RISC进入相容的化学修饰模式包括对有义链或随从链以及反义链或引导链的修饰。例如，随从链可被赋予稳定性并且不干扰活性的任何化学实体修饰。这样的修饰包括2’核糖修饰(O-甲基、2’F、2脱氧等)和骨架修饰，例如硫代磷酸酯修饰。随从链中优选的化学修饰模式包括随从链内C和U核苷酸的O-甲基修饰，或者替代地随从链可完全是O-甲基修饰的。
引导链例如也可被赋予稳定性并且不干扰RISC进入的任何化学修饰所修饰。引导链中优选的化学修饰模式包括，大部分C和U核苷酸是2’F修饰的，并且5’端被磷酸化。引导链中的另一种优选的化学修饰模式包括第1位的2’O-甲基修饰和第11至18位中C/U以及5’端化学磷酸化。引导链中的另一种优选的化学修饰模式包括第1位的2’O-甲基修饰和第11至18位中C/U和5’端化学磷酸化，以及第2至10位中C/U的2’F修饰。在一些实施方案中，随从链和/或引导链包含至少一个5-甲基C或U修饰。
在一些实施方案中，sd-rxRNA中至少30％的核苷酸是经修饰的。例如，sd-rxRNA中至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸是经修饰的。在一些实施方案中，sd-rxRNA中100％的核苷酸是经修饰的。
本发明寡核苷酸的上述化学修饰模式是良好耐受的并且实际上改善了不对称RNAi化合物的效力。在一些实施方案中，消除任一种所述要素(component)(引导链稳定、硫代磷酸酯区段(strench)、有义链稳定和疏水性缀合物)或增大尺寸在一些情况下导致次优的效力，并且在一些情况下导致完全失去效力。要素的组合导致开发了在被动递送至细胞(例如HeLa细胞或T细胞)之后完全活化的化合物。
在一些情况下，可通过使用新化学物质类型改善化合物的疏水性来进一步改进sd-rxRNA。例如，一种化学物质涉及使用疏水性碱基修饰。任何位置的任何碱基都可被修饰，只要修饰导致碱基的分配系数提高即可。修饰化学物质的优选位置是嘧啶的4位和5位。这些位置的主要优点是：(a)易于合成，和(b)不干扰碱基配对以及A型螺旋的形成，这对于RISC复合物装载和靶标识别是必须的。在一些实施方案中，使用这样的sd-rxRNA化合物：其中存在多个脱氧尿嘧啶而不干扰总体化合物效力。另外，通过优化疏水性缀合物的结构，可获得组织分布和细胞摄取中大的改进。在一些优选实施方案中，固醇的结构被修饰以改变(提高/降低)C17附接的链。这种类型的修饰导致细胞摄取的显著提高和体内组织摄取特性的改善。
在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子是经疏水性修饰的siRNA-反义杂交分子，其包含约13至22个碱基对的双链区，具有或不具有每条有义链和反义链上的3’-单链突出端，以及约2至9个核苷酸的反义链上的3’单链尾部。在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子包含至少一个2’-O-甲基修饰、至少一个2’-氟修饰，以及至少一个硫代磷酸酯修饰，以及选自以下的至少一个疏水性修饰：固醇、胆固醇、维生素D、萘基、异丁基、苄基、吲哚、色氨酸、苯基等疏水性修饰剂。在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子包含多个这样的修饰。
在一些方面中，本公开内容涉及经化学修饰的双链核酸分子，其靶向编码与细胞分化(例如，T细胞分化)相关的靶标的基因，所述靶标例如信号转导/转录因子靶标、表观遗传靶标、代谢和共抑制/阴性调节靶标。信号转导/转录因子的一些实例包括但不限于AKT、Blimp-1和T-Box21。表观遗传蛋白的一些实例包括但不限于Tet2。代谢靶标的一些实例包括但不限于HK2。共抑制/阴性调节靶标的一些实例包括但不限于Cbl-b、p53、TIGIT和PD1。
在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸靶向编码DNMT3A、PTPN6、PDCD1、TIGIT、AKT、p53、Tet2、Blimp-1、TBox21或HK2的基因。
在一些方面中，本公开内容涉及靶向编码免疫检查点蛋白的基因的经化学修饰的双链核酸分子。通常来说，免疫检查点蛋白是调节宿主免疫应答(例如，通过刺激或抑制T细胞功能来调节)的蛋白质。刺激性免疫检查点蛋白的一些实例包括但不限于CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)和诱导性T细胞共刺激分子(ICOS)。抑制性免疫检查点蛋白的一些实例包括但不限于腺苷A2A受体(A2AR)、B7-H3、B7-H4、B和T淋巴细胞弱化子(B and T Lymphocyte Attenuator，BTLA)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、淋巴细胞活化基因3(Lymphocyte Activation Gene-3，LAG3)、细胞程序性死亡蛋白1(PD1)、T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域3(TIM3)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)和T细胞活化V结构域Ig抑制剂(V-domain Ig suppressor of T-cellActivation，VISTA)。在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸靶向编码PDCD1或TIGIT的基因。
本文中使用的“PDCD1”或“PD1”是指细胞程序性死亡蛋白1，其是细胞表面受体，其功能是通过抑制T细胞介导的炎性活性来下调免疫系统并促进免疫自身耐受。在一些实施方案中，PDCD1由NCBI参考序列号NM_005018.2所示核酸序列编码。
本文中使用的“TIGIT”是指具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体，其是这样的免疫受体：经由CD226/TIGIT-PVR途径例如通过提高白介素10(IL-10)的产生来下调T细胞介导的免疫。在一些实施方案中，TIGIT由NCBI参考序列号NM_177999.3所示核酸序列编码。
本文中使用的“AKT”是指蛋白激酶B，其是在葡萄糖代谢、细胞增殖、凋亡和转录中发挥关键作用的丝氨酸/苏氨酸特异性激酶。在一些实施方案中，AKT由NCBI参考序列号NM_005163所示核酸序列编码。
本文中使用的“p53”是指肿瘤蛋白p53(也称为细胞肿瘤抗原p53、磷蛋白p53、肿瘤抑制剂p53、抗原NY-CO-13和转化相关蛋白53)，其作为与分化和发育途径的调节相关的肿瘤抑制剂发挥作用。在一些实施方案中，p53由NCBI参考序列号NM_001276761、NM_000546、NM_001126112、NM_001126113、NM_001126114、NM_001127233或NM_011640所示核酸序列编码。
本文中使用的“Cbl-b”是指E3泛素蛋白连接酶Cbl-b，其是用作T细胞活化的负调节剂的E3-连接酶。在一些实施方案中，Cbl-b由NCBI参考序列号NM_170662所示核酸序列编码。
本文中使用的“Tet2”是指Tet甲基胞嘧啶双加氧酶2，其是Tet家族的成员，Tet家族是提高5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)的细胞水平的甲基胞嘧啶双加氧酶基因的一个系列。在一些实施方案中，Tet2由NCBI参考序列号NM_001127208所示核酸序列编码。
本文中使用的“Blimp-1”是指PR/SET结构域1(PRDM1)，其编码充当β-干扰素基因表达的阻遏物的蛋白质。在一些实施方案中，Blimp-1由NCBI参考序列号NM_001198所示核酸序列编码。
本文中使用的“T-Box 21”是指T-box转录因子TBX21，其是共有称为T-box的共同DNA结合结构域的基因的保守家族成员。在一些实施方案中，T-Box 21由NCBI参考序列号NM_013351所示核酸序列编码。
本文中使用的“HK2”是指己糖激酶2，其是参与葡萄糖的磷酸化以产生葡糖-6-磷酸的酶。在一些实施方案中，HK2由NCBI参考序列号NM_000189所示核酸序列编码。
本文中使用的“DNMT3A”是指DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶3A，其是催化甲基向DNA中特定的CpG结构转移的酶(例如，DNA甲基转移酶)。在一些实施方案中，DNMT3A由NCBI参考序列号NM_175629.2所示核酸序列编码。
本文中使用的“PTPN6”是指非受体型酪氨酸蛋白磷酸酶6，其也被称为含Src同源区2结构域的磷酸酶1(SHP-1)。在一些实施方案中，PTPN6由NCBI参考序列号NM_002831.5所示核酸序列编码。
表3至4中列出了可被本公开内容的经化学修饰的双链核酸分子靶向的PDCD1和Cbl-b序列的一些非限制性实例。
在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子包含表3至13内之序列的至少12个核苷酸。在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子包含表3至4内至少一个序列(例如，包含含有表3至4的任一个中所示序列的有义链或反义链)。在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子(例如，sd-rxRNA)包含表3至13中所示序列或其片段，或者由表3至13中所示序列或其片段组成，或者靶向或针对表3至13中所示序列或其片段。
在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子(例如，sd-rxRNA)包含具有PD 26有义链(SEQ ID NO：112)中所示序列的有义链和/或具有PD 26反义链(SEQ ID NO：113)中所示序列的反义链。在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子(例如，sd-rxRNA)包含具有CB 29有义链(SEQ ID NO：248)中所示序列的有义链和/或具有CB 29反义链(SEQ IDNO：249)中所示序列的反义链。在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子(例如，sd-rxRNA)包含具有CB 23有义链(SEQ ID NO：236)中所示序列的有义链和/或具有CB 23反义链(SEQ ID NO：237)中所示序列的反义链。
在一些实施方案中，根据本发明配制的dsRNA为rxRNAori。rxRNAori是指通过引用并入的以下专利中描述的一类RNA分子：2009年2月11日提交的标题为“MODIFIED RNAIPOLYNUCLEOTIDES AND USES THEREOF”的PCT公开No.WO2009/102427(申请No.PCT/US2009/000852)，以及2010年11月1日提交的标题为“MODIFIED RNAI POLYNUCLEOTIDES AND USESTHEREOF”的美国专利公开No.US 2011/0039914。
在一些实施方案中，rxRNAori分子包含用于抑制靶基因表达的长度为12至35个核苷酸的双链RNA(dsRNA)构建体，其包含：具有5’端和3’端的有义链，其中所述有义链被2’-修饰的核糖高度修饰，并且其中有义链中央部分的3至6个核苷酸未被2’-修饰的核糖修饰；以及具有5’端和3’端的反义链，所述反义链与所述有义链以及靶基因的mRNA杂交，其中所述dsRNA以序列依赖性方式抑制靶基因的表达。
rxRNAori可包含本文中描述的任一种修饰。在一些实施方案中，rxRNAori中至少30％的核苷酸是经修饰的。例如，rxRNAori中至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸是经修饰的。在一些实施方案中，sd-RNAori中100％的核苷酸是经修饰的。在一些实施方案中，仅rxRNAori的随从链包含修饰。
本发明的应用不限于在以下说明书中给出的或在附图中示出的成分之构造和布置的细节。本发明可以是其他实施方案并且以多种方式实践或实施。另外，本文中使用的词组和术语是为了描述的目的并且不应被解释为限制。本文中使用“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“包含(involving)”意指涵盖后面列出的项目及其等同物以及额外的项目。
因此，本发明的一些方面涉及包含引导(反义)链和随从(有义)链的分离的双链核酸分子。本文中使用的术语“双链”是指一种或更多种核酸分子，其中核苷酸单体(nucleomonomer)的至少一部分是互补的并且是氢键以形成双链区。在一些实施方案中，引导链的长度为16至29个核苷酸长。在某些实施方案中，引导链为16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个核苷酸长。引导链与靶基因具有互补性。引导链和靶基因之间的互补性可存在于引导链的任意部分上。本文中使用的互补性可以是完全互补性或不完全互补性，只要引导链与其介导RNAi的靶标足够互补即可。在一些实施方案中，互补性是指引导链和靶标之间小于25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的错配。完全互补性是指100％互补性。在一些实施方案中，还已发现相对于靶序列具有插入、缺失和单点突变的siRNA序列对于抑制有效。另外，并非siRNA的所有位置对于靶标识别具有相同贡献。siRNA中央的错配是最严重的，并且基本上消除了靶RNA切割。参考反义链的中央上游或切割位点上游的错配是可耐受的，但是显著降低靶RNA切割。参考反义链中央或切割位点下游的错配，优选位于反义链3’端附近，例如，距离反义链的3’端1、2、3、4、5或6个核苷酸的错配是可耐受的，并且仅稍微降低靶RNA切割。
尽管不希望受到任何特定理论的限制，但在本文中所述的双链核酸分子的一些实施方案中，引导链为至少16个核苷酸长并且将Argonaute蛋白锚定在RISC中。在一些实施方案中，当引导链装载到RISC中时，其具有限定的种子区(seed region)，并且靶mRNA切割发生在引导链10至11位的对面。在一些实施方案中，引导链的5’端被磷酸化或能够被磷酸化。本文中所述的核酸分子可被称为最小触发RNA(minimum trigger RNA)。
在本文中所述的双链核酸分子的一些实施方案中，随从链的长度为8至15个核苷酸长。在某些实施方案中，随从链为8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸长。随从链与引导链有互补性。随从链与引导链之间的互补性可存在于随从链或引导链的任意部分上。在一些实施方案中，在分子双链区内引导链和随从链之间存在100％的互补性。
本发明的一些方面涉及具有最小双链区的双链核酸分子。在一些实施方案中，所述分子的双链区为8至15个核苷酸长。在某些实施方案中，所述分子的双链区为8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸长。在某些实施方案中，双链区为13或14个核苷酸长。在一些实施方案中，所述分子的双链区为13至22个核苷酸长。在某些实施方案中，所述分子的双链区为16、17、18、19、20、21或22个核苷酸长。
引导链和随从链之间可存在100％的互补性，或者引导链和随从链之间可存在一个或更多个错配。在一些实施方案中，在双链分子的一端，分子是平末端或具有一个核苷酸的单链突出端。在一些实施方案中，分子的单链区为4至12个核苷酸长。例如，单链区可以为4、5、6、7、8、9、10、11或12个核苷酸长。然而，在某些实施方案中，单链区也可以是小于4或大于12个核苷酸长。在某些实施方案中，单链区为至少6个或至少7个核苷酸长。在一些实施方案中，单链区为2至9个核苷酸长，包括2或3个核苷酸长。
与本发明相关的RNAi构建体的热力学稳定性(ΔG)可小于-13kkal/mol。在一些实施方案中，热力学稳定性(ΔG)小于-20kkal/mol。在一些实施方案中，当(ΔG)低于-21kkal/mol时，存在效力损失。在一些实施方案中，高于-13kkal/mol的(ΔG)值与本发明的一些方面兼容。不希望受到任何理论的约束，在一些实施方案中，具有相对较高(ΔG)值的分子可在相对较高的浓度下变得有活性，而具有相对较低(ΔG)值的分子可在相对较低的浓度下变得有活性。在一些实施方案中，(ΔG)值可高于-9kkcal/mol。由与本发明相关的包含最小双链区的RNAi构建体介导的基因沉默作用是出乎意料的，因为已经示出了几乎相同设计但热力学稳定性较低的分子是无活性的(Rana et al 2004)。
不希望受到任何理论的约束，本文中所述的结果表明8至10bp的dsRNA或dsDNA区段将被RISC的蛋白质组分或RISC的辅因子在结构上识别。另外，对于触发化合物，存在自由能需求，所述化合物可被蛋白质组分感测和/或足够稳定以与这样的组分相互作用，使得其可被装载到Argonaute蛋白中。如果存在最佳热力学并且存在优选为至少8个核苷酸的双链部分，那么双链体将被识别并且装载到RNAi机器(machinery)中。
在一些实施方案中，通过使用LNA碱基来提高热力学稳定性。在一些实施方案中，引入另外的化学修饰。化学修饰的数种非限制性实例包括：5’磷酸酯(5’Phosphate)、2’-O-甲基、2’-O-乙基、2’-氟、胸腺嘧啶核糖核苷(ribothymidine)、C-5丙炔基-dC(pdC)和C-5丙炔基-dU(pdU)；C-5丙炔基-C(pC)和C-5丙炔基-U(pU)；5-甲基C、5-甲基U、5-甲基dC、5-甲基dU甲氧基、(2，6-二氨基嘌呤)，5’-二甲氧基三苯甲基-N4-乙基-2’-脱氧胞苷和MGB(小沟结合物)。应理解的是，同一分子内可组合多于一种化学修饰。
优化与本发明相关的分子以提高效力和/或降低毒性。例如，在一些方面中，引导链和/或随从链的核苷酸长度，和/或引导链和/或随从链中硫代磷酸酯修饰的数目可影响RNA分子的效力，而在一些方面中，将2’-氟(2’F)修饰替换成2’-O-甲基(2’OMe)修饰可影响分子的毒性。特别地，预期降低分子的2’F含量将降低分子的毒性。另外，RNA分子中硫代磷酸酯修饰的数目可影响分子进入到细胞中的摄取，例如分子被被动摄取到细胞中的效率。本文中所述分子的一些优选实施方案不具有2’F修饰并且还以在细胞摄取和组织渗透性方面相等的效力为特征。这样的分子相对于现有技术(例如Accell和Wolfrum描述的用广泛使用的2’F大量修饰的分子)表现出显著改进。
在一些实施方案中，引导链的长度为约18至19个核苷酸并且具有约2至14个磷酸酯修饰。例如，引导链可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或多于14个磷酸酯修饰的核苷酸。引导链可包含一个或更多个赋予提高的稳定性而不干扰RISC进入的修饰。磷酸酯修饰的核苷酸，例如硫代磷酸酯修饰的核苷酸可在引导链的3’端、5’端或遍布引导链。在一些实施方案中，引导链3’端的10个核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个硫代磷酸酯修饰的核苷酸。引导链还可包含2’F和/或2’OMe修饰，其可位于整个分子中。在一些实施方案中，引导链第1位的核苷酸(引导链最5’位置的核苷酸)是2’OMe修饰的和/或磷酸化的。引导链内的C和U核苷酸可以是2’F修饰的。例如，19nt引导链的第2至10位(或者不同长度的引导链的相应位置)的C和U核苷酸可以是2’F修饰的。引导链中的C和U核苷酸还可以是2’OMe修饰的。例如，19nt引导链的第11至18位(或者不同长度的引导链的相应位置)的C和U核苷酸可以是2’OMe修饰的。在一些实施方案中，引导链最3’端的核苷酸是未经修饰的。在某些实施方案中，引导链内的大部分C和U是2’F修饰的，并且引导链5’端是磷酸化的。在另一些实施方案中，第11至18位的C或U以及第1位是2’OMe修饰的，并且引导链的5’端是磷酸化的。在另一些实施方案中，第11至18位的C或U以及第1位是2’OMe修饰的，并且引导链的5’端是磷酸化的，并且第2至10位的C或U是2’F修饰的。
在一些方面中，最佳随从链的长度为约11至14个核苷酸。随从链可包含赋予提高的稳定性的修饰。随从链中的一个或更多个核苷酸可以是2’OMe修饰的。在一些实施方案中，随从链中的一个或更多个C和/或U核苷酸是2’OMe修饰的，或者随从链中的所有C和U核苷酸均是2’OMe修饰的。在某些实施方案中，随从链中的所有核苷酸均是2’OMe修饰的。随从链上的一个或更多个核苷酸还可以是磷酸酯修饰的，例如硫代磷酸酯修饰的。随从链还可包含2’核糖、2’氟和2脱氧修饰或者上述修饰的任意组合。引导链和随从链二者上的化学修饰模式可良好耐受，并且化学修饰的组合可导致提高的RNA分子的效力和自递送。
本发明的一些方面涉及RNAi构建体，与之前用于RNAi的分子相比，其具有相对于双链区延长的单链区。可对该分子的单链区进行修饰以促进细胞摄取或基因沉默。在一些实施方案中，单链区的硫代磷酸酯修饰影响细胞摄取和/或基因沉默。引导链的硫代磷酸酯修饰的区域可包含分子的单链区和双链区二者内的核苷酸。在一些实施方案中，单链区包含2至12个硫代磷酸酯修饰。例如，单链区可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个硫代磷酸酯修饰。在一些情况下，单链区包含6至8个硫代磷酸酯修饰。
还对与本发明相关的分子进行优化用于细胞摄取。在本文中所述的RNA分子中，引导链和/或随从链可与缀合物连接。在某些实施方案中，缀合物是疏水性的。疏水性缀合物可以是分配系数大于10的小分子。缀合物可以是固醇型分子(例如胆固醇)或者具有与C17连接的延长聚碳链的分子，并且缀合物的存在可在具有或不具有脂质转染试剂的情况下影响细胞摄取RNA分子的能力。缀合物可通过疏水性接头与随从链或引导链连接。在一些实施方案中，疏水性接头的长度为5至12C，和/或是基于羟基吡咯烷的。在一些实施方案中，疏水性缀合物与随从链连接，并且随从链和/或引导链的CU残基是经修饰的。在一些实施方案中，随从链和/或引导链上的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的CU残基是经修饰的。在一些方面中，与本发明相关的分子是自递送(self-delivering，sd)的。本文中使用的“自递送”是指分子不需要额外递送载剂(例如转染试剂)而被递送到细胞中的能力。
本发明的一些方面涉及选择用于RNAi的分子。在一些实施方案中，可选择具有8至15个核苷酸的双链区的分子来用于RNAi。在一些实施方案中，基于分子的热力学稳定性(ΔG)选择分子。在一些实施方案中，选择(ΔG)小于-13kkal/mol的分子。例如，(ΔG)值可为-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-21、-22或者小于-22kkal/mol。在另一些实施方案中，(ΔG)值可大于-13kkal/mol。例如，(ΔG)值可为-12、-11、-10、-9、-8、-7或者大于-7kkal/mol。应理解的是，可使用本领域中已知的任何方法计算ΔG。在一些实施方案中，使用可通过Mfold网站(mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/ma-forml.cgi)获得的Mfold计算ΔG。用于计算ΔG的方法描述在通过引用并入的以下参考文献中：Zuker，M.(2003)Nucleic AcidsRes.，31(13)：3406-15；Mathews，D.H.，Sabina，J.，Zuker，M.and Turner，D.H.(1999)J.Mol.Biol.288：911-940；Mathews，D.H.，Disney，M.D.，Childs，J.L，Schroeder，S.J.，Zuker，M.，and Turner，D.H.(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.101：7287-7292；Duan，S.，Mathews，D.H.，and Turner，D.H.(2006)Biochemistry 45：9819-9832；Wuchty，S.，Fontana，W.，Hotacker，I.L.，and Schuster，P.(1999)Biopolymers 49：145-165。
在某些实施方案中，多核苷酸包含5’和/或3’端的单链突出端。在多核苷酸一端上的单链核苷酸突出端的数目和/或序列可与多核苷酸另一端的相同或不同。在某些实施方案中，一个或更多个单链突出端核苷酸可包含化学修饰，例如硫代磷酸酯修饰或2’-OMe修饰。
在某些实施方案中，多核苷酸是未经修饰的。在另一些实施方案中，至少一个核苷酸是经修饰的。在另一些实施方案中，修饰包括在从引导序列的5’端开始的第二个核苷酸处的2’-H或2’-修饰的核糖。“第二个核苷酸”被定义为从多核苷酸的5’-端开始的第二个核苷酸。
本文中使用的“2’-修饰的核糖”包括不具有2’-OH基团的那些核糖。“2’-修饰的核糖”不包括2’-脱氧核糖(见于未经修饰的典型DNA核苷酸中)。例如，2’-修饰的核糖可以是2’-O-烷基核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-脱氧核苷酸，或其组合。
在某些实施方案中，2’-修饰的核苷酸是嘧啶核苷酸(例如，C/U)。2’-O-烷基核苷酸的一些实例包括2’-O-甲基核苷酸或2’-O-烯丙基核苷酸。
在某些实施方案中，具有上文提及的5’端修饰的本发明的sd-rxRNA多核苷酸当与不具有特定5’端修饰的类似构建体相比时表现出显著更低(例如，降低至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更多)的“脱靶”基因沉默，因此极大改进了RNAi试剂或治疗剂的整体特异性。
本文中使用的“脱靶”基因沉默是指由于例如反义(引导)序列和非预期靶mRNA序列之间的假序列同源性而导致的非预期的基因沉默。
根据本发明的这个方面，某些引导链修饰进一步提高核酸酶稳定性，和/或降低干扰素诱导，而不显著降低RNAi活性(或者根本不降低RNAi活性)。
修饰的某些组合可导致另一些意料之外的优点，如通过增强的抑制靶基因表达的能力、增强的血清稳定性和/或提高的靶标特异性等部分表现出的。
在某些实施方案中，引导链在引导链5’端上的第二个核苷酸处包含2’-O-甲基修饰的核苷酸，并且没有其他经修饰的核苷酸。
在另一些方面中，本发明的经化学修饰的双链核酸分子结构通过微小RNA机制介导序列依赖性基因沉默。本文中使用的术语“微小RNA”(“miRNA”)在本领域中也称为“小时序RNA”(“small temporal RNA，stRNA”)，其是指(例如，通过病毒、哺乳动物或植物基因组)遗传编码的并且能够指导或介导RNA沉默的小(10至50个核苷酸)RNA。“miRNA病症”应指以miRNA的异常的表达或活性为特征的疾病或病症。
微小RNA参与下调小鼠、蠕虫和哺乳动物中的关键途径(例如发育和癌症)中的靶基因。经由微小RNA机制的基因沉默通过miRNA与其靶信使RNA(mRNA)的具有特异性但不完全的碱基配对实现。多种机制可用于微小RNA介导的靶mRNA表达的下调。
miRNA是约22个核苷酸的非编码RNA，其可在植物和动物发育期间在转录后水平或翻译水平调节基因表达。miRNA的一个普遍特征是其全部从被称为前miRNA(pre-miRNA)的约70个核苷酸的前体RNA茎-环上切离，可能是通过Dicer(III型核糖核酸酶)或其同源物切离。天然存在的miRNA在体内由内源基因表达，并且通过Dicer或其他核糖核酸酶由发夹或茎-环前体(前miRNA或pri-miRNA)加工。miRNA在体内可短暂地作为双链的双链体存在，但是仅一条链被RISC复合物摄取以指导基因沉默。
在一些实施方案中，描述了在细胞摄取和抑制miRNA活性中有效的经化学修饰的双链核酸化合物形式。基本上，化合物类似于RISC进入形式，但是主要链化学修饰模式以阻断切割的方式进行优化并且充当有效的RISC作用抑制剂。例如，化合物可完全或大部分是O-甲基修饰的，其具有前述硫代磷酸酯含量。在一些实施方案中，对于这些化合物类型，5’磷酸化不是必要的。双链区的存在是优选的，因为其促进细胞摄取和高效的RISC装载。
使用小RNA作为序列特异性调节剂的另一种途径是RNA干扰(RNAi)途径，其是进化保守的，响应于细胞中双链RNA(dsRNA)的存在。dsRNA被Dicer切割成约20个碱基对(basepair，bp)的小干扰RNA(siRNA)双链体。这些小RNA装配成被称为RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complexe，RISC)的多蛋白效应子复合物。然后siRNA指导具有完全互补性的靶mRNA的切割。
siRNA途径与miRNA途径之间共享生物发生、蛋白质复合物和功能的一些方面。单链多核苷酸可模拟siRNA机制中的dsRNA，或者miRNA机制中的微小RNA。
在某些实施方案中，与具有相同序列的未经修饰的RNAi构建体相比，经修饰的RNAi构建体在血清和/或脑脊髓液中可具有提高的稳定性。
在某些实施方案中，在原代细胞，例如哺乳动物原代细胞(包括来自人、小鼠和其他啮齿类动物以及其他非人哺乳动物的原代细胞)中，RNAi构建体的结构不诱导干扰素响应。在某些实施方案中，RNAi构建体还可用于抑制无脊椎生物体中靶基因的表达。
为了进一步提高本发明构建体的体内稳定性，可通过保护基封闭所述结构的3’端。例如，可使用保护基例如反向核苷酸、反向无碱基(abasic)部分或氨基端修饰的核苷酸。反向核苷酸可包含反向脱氧核苷酸。反向无碱基部分可包含反向脱氧无碱基部分，例如3’，3’-连接的或5’，5’-连接的脱氧无碱基部分。
本发明的RNAi构建体能够抑制靶基因编码的任何靶蛋白的合成。本发明包括抑制体外或体内细胞中靶基因表达的方法。因此，本发明的RNAi构建体可用于治疗患有以过表达靶基因为特征的疾病的患者。
靶基因对于细胞而言可以是内源的或者外源的(例如，通过病毒或使用重组DNA技术引入到细胞中)。这样的方法可包括以足以抑制靶基因表达的量将RNA引入到细胞中。例如，这样的RNA分子可具有与靶基因的核苷酸序列互补的引导链，使得组合物抑制靶基因的表达。
本发明还涉及表达本发明核酸的载体，以及包含这样的载体或核酸的细胞。细胞可以是体内的或培养的哺乳动物细胞，例如人细胞。
本发明还涉及包含本发明RNAi构建体和可药用载体或稀释剂的组合物。
所述方法可在体外、离体或体内进行，例如在培养的哺乳动物细胞(例如培养的人细胞)中进行。
可在递送试剂例如脂质(例如，阳离子脂质)或脂质体的存在下接触靶细胞(例如，哺乳动物细胞)。
本发明的另一个方面提供了抑制哺乳动物细胞中靶基因的表达的方法，其包括使哺乳动物细胞与表达本发明RNAi构建体的载体接触。
在本发明的一个方面中，提供了更长的双链体多核苷酸，其包含：尺寸为约16至约30个核苷酸的第一多核苷酸；尺寸为约26至约46个核苷酸的第二多核苷酸，其中第一多核苷酸(反义链)与第二多核苷酸(有义链)和靶基因二者互补，并且其中两个多核苷酸形成双链体，并且其中第一多核苷酸包含长度大于6个碱基的单链区，并且被交替化学修饰模式修饰，和/或包含有助于细胞递送的缀合物部分。在该实施方案中，随从链的约40％至约90％核苷酸、引导链的约40％至约90％核苷酸、以及第一多核苷酸的单链区的约40％至约90％核苷酸是经化学修饰的核苷酸。
在一个实施方案中，多核苷酸双链体中经化学修饰的核苷酸可以是本领域中已知的任何经化学修饰的核苷酸，例如上文详细讨论的那些。在一个特定实施方案中，经化学修饰的核苷酸选自2’F修饰的核苷酸、2’-O-甲基修饰的核苷酸和2’脱氧核苷酸。在另一个特定实施方案中，经化学修饰的核苷酸由核苷酸碱基的“疏水性修饰”导致。在另一个特定实施方案中，经化学修饰的核苷酸是硫代磷酸酯。在另一个特定实施方案中，经化学修饰的核苷酸是硫代磷酸酯、2’-O-甲基、2’脱氧、疏水性修饰和硫代磷酸酯的组合。因为这些修饰分组是指核糖环、骨架和核苷酸的修饰，所以可能的是一些修饰的核苷酸具有所有三种修饰类型的组合。
在另一个实施方案中，化学修饰在双链体的多个区域间是不同的。在一个具体实施方案中，第一多核苷酸(随从链)在多个位置具有大量不同的化学修饰。对于这种多核苷酸，多至90％的核苷酸可以是经化学修饰的和/或具有引入的错配。
在另一个实施方案中，第一或第二多核苷酸的化学修饰包括但不限于尿嘧啶和胞嘧啶的5’位修饰(4-吡啶基、2-吡啶基、吲哚基、苯基(C6H5OH)；色氨酰基(C8H6N)CH2CH(NH2)CO)、异丁基、丁基、氨基苄基；苯基；萘基等)，其中化学修饰可改变核苷酸的碱基配对能力。对于引导链，本发明这个方面的重要特征在于化学修饰相对于反义链序列的5’端的位置。例如，引导链5’端的化学磷酸化通常有利于效力。有义链种子区(相对于5’端的2位至7位)中的O-甲基修饰通常不能良好耐受，而2’F和脱氧良好耐受。引导链的中部和引导链的3’端更容忍所应用的化学修饰类型。引导链的3’端处不耐受脱氧修饰。
本发明这个方面的独特特征包括在碱基上使用疏水性修饰。在一个实施方案中，疏水性修饰优选地位于引导链的5’端附近，在另一些实施方案中，疏水性修饰位于引导链中部，在另一些实施方案中，疏水性修饰位于引导链的3’端，而在另一些实施方案中，疏水性修饰分布在多核苷酸的整个长度上。相同类型的模式适用于双链体的随从链。
分子的其他部分是单链区。预期所述单链区为7至40个核苷酸。
在一个实施方案中，第一多核苷酸的单链区包含选自以下的修饰：40％至90％的疏水性碱基修饰，40％至90％的硫代磷酸酯，40％至90％的核糖部分的修饰，以及前述修饰的任意组合。
由于大量修饰的多核苷酸可改变引导链(第一多核苷酸)装载到RISC复合物中的效率，因此在一个实施方案中，双链体多核苷酸包含引导链(第一多核苷酸)上第9、11、12、13或14位核苷酸与有义链(第二多核苷酸)上的对侧核苷酸之间的错配，以促进高效的引导链装载。
以下部分中描述了本发明一些更详细的方面。
双链体特征
本发明的双链寡核苷酸可通过两个分开的互补核酸链形成。双链体形成可发生在含有靶基因的细胞的内部或外部。
本文中使用的术语“双链体”包含与互补序列通过氢键键合的双链核酸分子的区域。本发明的双链寡核苷酸可包含相对于靶基因有义的核苷酸序列和相对于靶基因反义的互补序列。对应于靶基因序列的有义和反义核苷酸序列，例如相同或充分相同以实现对靶基因序列的靶基因抑制(例如，约至少约98％相同、96％相同、94％、90％相同、85％相同或80％相同)。
在某些实施方案中，本发明的双链寡核苷酸在其整个长度上是双链的，即，在分子的任一端没有突出的单链序列，即，是平末端。在另一些实施方案中，独立核酸分子可具有不同长度。换句话说，本发明的双链寡核苷酸并非在其整个长度上是双链。例如，当使用两个分开的核酸分子时，一个分子(例如，包含反义序列的第一分子)可比与其杂交的第二分子更长(保留分子的一部分为单链)。同样地，当使用单个核酸分子时，分子在任一端的一部分可保持单链。
在一个实施方案中，本发明的双链寡核苷酸包含错配和/或环或凸起(bulge)，但是在寡核苷酸的至少约70％的长度上是双链的。在另一个实施方案中，本发明的双链寡核苷酸在寡核苷酸的至少约80％的长度上是双链的。在另一个实施方案中，本发明的双链寡核苷酸在寡核苷酸的至少约90％至95％的长度上是双链的。在另一个实施方案中，本发明的双链寡核苷酸在寡核苷酸的至少约96％至98％的长度上是双链的。在某些实施方案中，本发明的双链寡核苷酸包含至少或多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个错配。
修饰
本发明的核苷酸可在多个位置进行修饰，所述位置包括在糖部分、磷酸二酯键联和/或碱基。
在一些实施方案中，核苷的碱基部分可以是经修饰的。例如，可在嘧啶环的2、3、4、5和/或6位修饰嘧啶碱基。在一些实施方案中，胞嘧啶的环外胺基可以是经修饰的。嘌呤碱基也可以是经修饰的。例如，可在1、2、3、6、7或8位修饰嘌呤碱基。在一些实施方案中，腺嘌呤的环外胺基可以是经修饰的。在一些情况下，碱基部分的环中的氮原子可被另外的原子(例如碳)取代。碱基部分的修饰可以是任何合适的修饰。修饰的实例是本领域普通技术人员已知的。在一些实施方案中，碱基修饰包括烷基化的嘌呤或嘧啶、酰基化的嘌呤或嘧啶、或者其他杂环。
在一些实施方案中，嘧啶可在5位被修饰。例如，嘧啶的5位可被烷基、炔基、烯基、酰基或者其经取代的衍生物修饰。在另一些实例中，嘧啶的5位可被羟基或烷氧基或其经取代的衍生物修饰。另外，嘧啶的N4位可被烷基化。在另一些实施方案中，嘧啶5-6键可以是饱和的，嘧啶环内的氮原子可被碳原子取代，和/或O2和O4原子可被硫原子取代。应理解的是，其他修饰也是可能的。
在另一些实例中，嘌呤的N7位和/或N2和/或N3位可被烷基或其经取代的衍生物修饰。在另一些实例中，第三个环可与嘌呤双环体系稠合，和/或嘌呤环体系内的氮原子可被碳原子取代。应理解的是，其他修饰也是可能的。
在5位被修饰的嘧啶的一些非限制性实例公开在美国专利5591843、美国专利7,205,297、美国专利6,432,963和美国专利6,020,483中；在N4位被修饰的嘧啶的一些非限制性实例公开在美国专利5,580,731中；在8位被修饰的嘌呤的一些非限制性实例公开在美国专利6,355,787和美国专利5,580,972中；在N6位被修饰的嘌呤的一些非限制性实例公开在美国专利4,853,386、美国专利5,789,416和美国专利7,041,824中；以及在2位被修饰的嘌呤的一些非限制性实例公开在美国专利4,201,860和美国专利5,587,469中，其全部通过引用并入本文。
经修饰碱基的一些非限制性实例包括N4，N4-桥亚乙基胞嘧啶(N4，N4-ethanocytosine)、7-脱氮黄苷(7-deazaxanthosine)、7-脱氮鸟苷、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基-腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、假尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、2-硫胞嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。在一些实施方案中，碱基部分可以是嘌呤或嘧啶以外的杂环碱基。杂环碱基可以是任选地经修饰的和/或被取代的。
糖部分包括天然未修饰的糖，例如单糖(例如，戊糖，例如核糖、脱氧核糖)，经修饰的糖和糖类似物。通常来说，核苷酸单体的可能的修饰，特别是糖部分的可能的修饰包括例如将一个或更多个羟基替换成卤素、杂原子、脂族基团，或者将羟基官能化为醚、胺、硫醇等。
经修饰的核苷酸单体的一个特别有用的基团是2’-O-甲基核苷酸。这样的2’-O-甲基核苷酸可被称为“甲基化的”，并且相应的核苷酸可由未甲基化的核苷酸然后进行烷基化来制备，或者直接由甲基化的核苷酸试剂来制备。经修饰核苷酸单体可与未经修饰的核苷酸单体组合使用。例如，本发明的寡核苷酸可包含甲基化和未甲基化的核苷酸单体二者。
一些示例性经修饰的核苷酸单体包括糖或骨架被修饰的核糖核苷酸。经修饰的核糖核苷酸可含有非天然存在的碱基(代表天然存在的碱基)，例如在5’-位被修饰的尿苷或胞苷，例如5’-(2-氨基)丙基尿苷和5’-溴尿苷；在8位被修饰的腺苷和鸟苷，例如8-溴鸟苷；脱氮核苷酸，例如7-脱氮-腺苷；以及N-烷基化的核苷酸，例如N6-甲基腺苷。另外，糖被修饰的核糖核苷酸可将2’-OH基团替换成H、烷氧基(或OR)、R或烷基、卤素、SH、SR、氨基(例如NH2、NHR、NR2)或CN基团，其中R是低级烷基、烯基或炔基。
经修饰的核糖核苷酸还可将与相邻核糖核苷酸连接的磷酸二酯基团替换成经修饰的基团，例如硫代磷酸酯基团。更普遍地，多种核苷酸修饰可组合。
尽管反义(引导)链可与靶基因(或多个靶基因)的至少一部分基本上相同，但是至少对于碱基配对特性来说，序列不必完全相同才可用于例如抑制靶基因表型的表达。通常来说，更高同源性可用于弥补较短反义基因的使用。在一些情况下，反义链通常与靶基因基本上相同(尽管是以反义取向)。
在期望使细胞应激响应最小化的情况下，使用2’-O-甲基修饰的RNA也可以是有益的。具有2’-O-甲基核苷酸单体的RNA可能不被认为是识别未经修饰的RNA的细胞机器识别。2’-O-甲基化的或部分2’-O-甲基化的RNA的使用可避免对于双链核酸的干扰素响应，同时保持靶RNA抑制。这可用于例如在诱导干扰素响应的短RNAi(例如，siRNA)序列和可能诱导干扰素响应的更长RNAi序列两种情况下避免干扰素或其他细胞应激响应。
总体上，经修饰的糖可包括D-核糖、2’-O-烷基(包括2’-O-甲基和2’-O-乙基)，即2’-烷氧基、2’-氨基、2’-S-烷基、2’-卤素(包括2’-氟)、2’-甲氧基乙氧基、2’-烯丙氧基(-OCH2CH＝CH2)、2’-炔丙基、2’-丙基、乙炔基、乙烯基、丙烯基和氰基等。在一个实施方案中，如所描述的，糖部分可以是己糖并且并入到寡核苷酸中(Augustyns，K.，et al.，Nucl.Acids.Res.18：4711(1992))。一些示例性核苷酸单体可见于例如美国专利No.5,849,902，其通过引用并入本文。
下文更加详细地描述了特定官能团和化学术语的定义。出于本发明的目的，化学元素是根据以下鉴定的：元素周期表，CAS版，Handbook of Chemistry and Physics，第75版，内封面，并且特定官能团如本文中所述一般定义。另外，有机化学的一般原则以及特定官能部分和反应性描述在Organic Chemistry，Thomas Sorrell，University ScienceBooks，Sausalito：1999中，其全部内容通过引用并入本文。
本发明的某些化合物可以以特定几何或立体异构形式存在。本发明预期所有这样的化合物(包括顺式和反式异构体，R-和S-对映体、非对映体、(D)-异构体、(L)-异构体，其外消旋混合物及其其他混合物)落入本发明范围内。取代基例如烷基中可存在额外的不对称碳原子。所有这样的异构体及其混合物预期包含在本发明内。
可根据本发明使用包含多种异构体比例的任一种的异构混合物。例如，在仅两种异构体组合的情况下，包含50∶50、60∶40、70∶30、80∶20、90∶10、95∶5、96∶4、97∶3、98∶2、99∶1或100∶0异构体比例的混合物均被本发明所预期。本领域技术人员将容易理解，预期到类似比例用于更复杂的异构体混合物。
例如，如果期望的是本发明化合物的特定对映体，可通过不对称合成或者通过用手性助剂进行的衍生(derivation)来制备，其中将所得的非对映体混合物分离并且切割辅助基团以提供纯的期望的对映体。或者，在分子包含碱性官能团例如氨基，或者酸性官能团例如羧基的情况下，用合适的光学活性酸或碱形成非对映体盐，然后通过本领域中公知的分级结晶或色谱手段来拆分如此形成的非对映体，并随后回收纯对映体。
在某些实施方案中，本发明寡核苷酸包含3’和5’端(环形寡核苷酸除外)。在一个实施方案中，寡核苷酸的3’和5’端可基本上被保护免受核酸酶影响，例如通过修饰3’或5’键联(例如，美国专利No.5,849,902和WO 98/13526)。例如，可通过纳入“阻断基团”使寡核苷酸有抗性。本文中使用的术语“阻断基团”是指可连接到寡核苷酸或核苷酸单体作为保护基或用于合成的偶联基团的取代基(例如，除了OH基团)(例如，FITC、丙基(CH2-CH2-CH3)、乙二醇基(-O-CH2-CH2-O-)、磷酸根(PO3 2-)、磷酸氢根(hydrogen phosphonate)或亚磷酰胺)。“阻断基团”还包括保护寡核苷酸的5’和3’端的“末端阻断基团”或“外切酶阻断基团”，包括经修饰的核苷酸和非核苷酸外切酶抗性结构。
一些示例性末端阻断基团(end-blocking group)包括帽结构(例如，7-甲基鸟苷帽)、反向核苷酸单体，例如具有3’-3’或5’-5’端反向(参见，例如Ortiagao etal.1992.Antisense Res.Dev.2：129、甲基膦酸酯、亚磷酰胺、非核苷酸基团(例如，非核苷酸接头、氨基接头、缀合物)等。3’端核苷酸单体可包含经修饰的糖部分。3’端核苷酸单体包含3’-O，其可任选地被阻止寡核苷酸的3’-外切酶降解的阻断基团取代。例如，3’-羟基可通过3’→3’核苷酸间键联与核苷酸酯化。例如，烷氧基基团可以是甲氧基、乙氧基或异丙氧基，并且优选乙氧基。任选地，3’端的3’→3’连接的核苷酸可通过替代键联(substitutelinkage)来连接。为了降低核酸酶降解，最5’的3’→5’键联可以是经修饰的键联，例如硫代磷酸酯或P-烷氧基磷酸三酯键联。优选地，两个最5’的3’→5’键联是经修饰的键联。任选地，5’端羟基部分可用含磷的部分酯化，例如磷酸酯、硫代磷酸酯或P-乙氧基磷酸酯。
本领域普通技术人员将理解，本文中所述的合成方法使用多种保护基。本文中使用的术语“保护基”意指特定官能部分(例如，O、S或N)被临时阻断，使得反应可选择性发生在多官能化合物的另一反应位点。在某些实施方案中，保护基以良好产率选择性反应，以得到对于预计的反应稳定的经保护物质；保护基应可通过不攻击其他官能团的容易获得的、优选无毒的试剂以良好产收率选择性地移除；保护基形成容易分离的衍生物(更优选地不产生新立体中心)；并且保护基具有最小的额外官能性，以避免另外的反应位点。如本文中详细描述的，可使用氧、硫、氮和碳保护基。羟基保护基包括甲基、甲氧基甲基(methoxylmethyl，MOM)、甲硫基甲基(methylthiomethyl，MTM)、叔丁硫基甲基、(苯基二甲基甲硅烷基)甲氧基甲基(SMOM)、苄氧基甲基(benzyloxymethyl，BOM)、对甲氧基苄氧基甲基(p-methoxybenzyloxymethyl，PMBM)、(4-甲氧基苯氧基)甲基(p-AOM)、愈创木酚甲基(guaiacolmethyl，GUM)、叔丁氧基甲基、4-戊烯氧基甲基(POM)、甲硅烷氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基(MEM)、2，2，2-三氯乙氧基甲基、双(2-氯乙氧基)甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基(SEMOR)、四氢吡喃基(THP)、3-溴四氢吡喃基、四氢硫代吡喃基、1-甲氧基环己基、4-甲氧基四氢吡喃基(MTHP)、4-甲氧基四氢硫代吡喃基、4-甲氧基四氢硫代吡喃基S，S-二氧化物、1-[(2-氯-4-甲基)苯基]-4-甲氧基哌啶-4-基(CTMP)、1，4-二
Figure BPA0000286473200000321
烷-2-基、四氢呋喃基、四氢硫代呋喃基、2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢-7，8，8-三甲基-4，7-亚甲基苯并呋喃-2-基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、1-甲基-1-甲氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基-2-氟乙基、2，2，2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、2-(苯基氢硒基)乙基(2-(phenylselenyl)ethyl)、叔丁基、烯丙基、对氯苯基、对甲氧基苯基、2，4-二硝基苯基、苄基、对甲氧基苄基、3，4-二甲氧基苄基、邻硝基苄基、对硝基苄基、对卤代苄基、2，6-二氯苄基、对氰基苄基、对苯基苄基、2-吡啶甲基、4-吡啶甲基、3-甲基-2-吡啶甲基N-氧、二苯基甲基、p，p’-二硝基二苯甲基(p，p’-dinitrobenzhydryl)、5-二苯并环庚基、三苯基甲基、α-萘基二苯基甲基、对甲氧基苯基二苯基甲基、二(对甲氧基苯基)苯基甲基、三(对甲氧基苯基)甲基、4-(4’-溴苯甲酰甲基氧基苯基)二苯基甲基、4，4’，4”-三(4，5-二氯邻苯二甲酰亚氨基苯基)甲基、4，4’，4”-三(乙酰丙酰基氧基苯基)甲基(4，4’，4”-tris(levulinoyloxyphenyl)methyl)、4，4’，4”-三(苯甲酰基氧基苯基)甲基、3-(咪唑-1-基)双(4’，4”-二甲氧基苯基)甲基、1，1-双(4-甲氧基苯基)-1’-芘基甲基、9-蒽基、9-(9-苯基)呫吨基、9-(9-苯基-10-氧代)蒽基、1，3-苯并二噻吩-2-基、S，S-二氧苯并异噻唑基、三甲基甲硅烷基(trimethylsilyl，TMS)、三乙基甲硅烷基(triethylsilyl，TES)、三异丙基甲硅烷基(triisopropylsilyl，TIPS)、二甲基异丙基甲硅烷基(IPDMS)、二乙基异丙基甲硅烷基(DEIPS)、二甲基己基甲硅烷基(dimethylthexylsilyl)、叔丁基二甲基甲硅烷基(t-butyldimethylsilyl，TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(t-butyldiphenylsilyl，TBDPS)、三苄基甲硅烷基、三-对二甲苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基甲基甲硅烷基(diphenylmethylsilyl，DPMS)、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基(t-butylmethoxyphenylsilyl，TBMPS)、甲酸酯、苯甲酰基甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、对氯苯氧基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、4-氧戊酸酯(乙酰丙酸酯)、4，4-(乙二硫基)戊酸酯(乙酰丙酰基二硫缩醛)、新戊酸酯、adamantoate、巴豆酸酯、4-甲氧基巴豆酸酯、苯甲酸酯、对苯基苯甲酸酯、2，4，6-三甲基苯甲酸酯(mesitoate)、烷基甲基碳酸酯、9-芴基甲基碳酸酯(Fmoc)、烷基乙基碳酸酯、烷基2，2，2-三氯乙基碳酸酯(Troc)、2-(三甲基甲硅烷基)乙基碳酸酯(2-(trimethylsilyl)ethyl carbonate，TMSEC)、2-(苯基磺酸基)乙基碳酸酯(2-(phenylsulfonyl)ethyl carbonate，Psec)、2-(三苯基磷
Figure BPA0000286473200000331
基)乙基碳酸酯(Peoc)、烷基异丁基碳酸酯、烷基乙烯基碳酸酯、烷基烯丙基碳酸酯、烷基对硝基苯基碳酸酯、烷基苄基碳酸酯、烷基对甲氧基苄基碳酸酯、烷基3，4-二甲氧基苄基碳酸酯、烷基邻硝基苄基碳酸酯、烷基对硝基苄基碳酸酯、烷基S-苄基硫代碳酸酯、4-乙氧基-1-萘基碳酸酯、甲基二硫代碳酸酯、2-碘代苯甲酸酯、4-叠氮基丁酸酯、4-硝基-4-甲基戊酸酯、邻-(二溴甲基)苯甲酸酯、2-甲酰基苯磺酸酯、2-(甲基硫甲氧基)乙基、4-(甲硫基甲氧基)丁酸酯、2-(甲硫基甲氧基甲基)苯甲酸酯、2，6-二氯-4-甲基苯氧基乙酸酯、2，6-二氯-4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯氧基乙酸酯、2，4-双(1，1-二甲基丙基)苯氧基乙酸酯、氯二苯基乙酸酯、异丁酸酯、单琥珀酸酯、(E)-2-甲基-2-丁烯酸酯、邻-(甲氧基羰基)苯甲酸酯、α-萘甲酸酯、硝酸酯、烷基N，N，N’，N’-四甲基二氨基磷酸酯、烷基N-苯基氨基甲酸酯、硼酸酯、二甲基硫膦基、烷基2，4-二硝基苯基次磺酸酯、硫酸酯、甲磺酸酯(mesylate)、苄基磺酸酯和甲苯磺酸酯(tosylate，Ts)。为了保护1，2-或1，3-二醇，保护基包括亚甲基缩醛、亚乙基缩醛、1-叔丁基亚乙基缩酮、1-苯基亚乙基缩酮、(4-甲氧基苯基)亚乙基缩醛、2，2，2-三氯亚乙基缩醛、丙酮化合物、亚环戊基缩酮、亚环己基缩酮、亚环庚基缩酮、亚苄基缩醛、对甲氧基亚苄基缩醛、2，4-二甲氧基亚苄基缩酮、3，4-二甲氧基亚苄基缩醛、2-硝基亚苄基缩醛、甲氧基亚甲基缩醛、乙氧基亚甲基缩醛、二甲氧基亚甲基原酸酯、1-甲氧基亚乙基原酸酯、1-乙氧基亚乙基原酸酯、1，2-二甲氧基亚乙基原酸酯、α-甲氧基亚苄基原酸酯、1-(N，N-二甲基氨基)亚乙基衍生物、α-(N，N’-二甲基氨基)亚苄基衍生物、2-氧杂亚环戊基原酸酯、二叔丁基亚甲硅烷基(di-t-butylsilylene group，DTBS)、1，3-(1，1，3，3-四异丙基二硅亚
Figure BPA0000286473200000332
烷基)衍生物(TIPDS)、四叔丁氧基二硅氧烷-1，3-亚二基衍生物(TBDS)、环状碳酸酯、环状硼酸酯、硼酸乙酯和硼酸苯酯。氨基保护基包括氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、9-芴基甲基氨基甲酸酯(9-fluorenylmethyl carbamate，Fmoc)、9-(2-磺基)芴基甲基氨基甲酸酯、9-(2，7-二溴)芴基甲基氨基甲酸酯、2，7-二叔丁基-[9-(10，10-二氧代-10，10，10，10-四氢噻吨基)]甲基氨基甲酸酯(DBD-Tmoc)、4-甲氧基苯甲酰甲基氨基甲酸酯(Phenoc)、2，2，2-三氯乙基氨基甲酸酯(Troc)、2-三甲基甲硅烷基乙基氨基甲酸酯(Teoc)、2-苯基乙基氨基甲酸酯(hZ)、1-(1-金刚烷基)-1-甲基乙基氨基甲酸酯(Adpoc)、1，1-二甲基-2-卤代乙基氨基甲酸酯、1，1-二甲基-2，2-二溴乙基氨基甲酸酯(DB-t-BOC)、1，1-二甲基-2，2，2-三氯乙基氨基甲酸酯(TCBOC)、1-甲基-1-(4-联苯基)乙基氨基甲酸酯(Bpoc)、1-(3，5-二叔丁基苯基)-1-甲基乙基氨基甲酸酯(t-Bumeoc)、2-(2’-和4’-吡啶基)乙基氨基甲酸酯(Pyoc)、2-(N，N-二环己基甲酰胺)乙基氨基甲酸酯、叔丁基氨基甲酸(BOC)、1-金刚烷基氨基甲酸酯(Adoc)、乙烯基氨基甲酰酯(Voc)、烯丙基氨基甲酸酯(Alloc)、1-异丙基烯丙基氨基甲酸酯(Ipaoc)、肉桂基氨基甲酸酯(Coc)、4-硝基肉桂基氨基甲酸酯(Noc)、8-喹啉基氨基甲酸酯、N-羟基哌啶基氨基甲酸酯、烷基二硫基氨基甲酸酯、苄基氨基甲酸酯(Cbz)、对甲氧基苄基氨基甲酸酯(Moz)、对硝基苄基氨基甲酸酯、对溴苄基氨基甲酸酯、对氯苄基氨基甲酸酯、2，4-二氯苄基氨基甲酸酯、4-甲基亚磺酰基苄基氨基甲酸酯(Msz)、9-蒽基甲基氨基甲酸酯、二苯基甲基氨基甲酸酯、2-甲硫基乙基氨基甲酸酯、2-甲基磺酰基乙基氨基甲酸酯、2-(对甲苯磺酰基)乙基氨基甲酸酯、[2-(1，3-二thianyl)]甲基氨基甲酸酯(Dmoc)、4-甲硫基苯基氨基甲酸酯(Mtpc)、2，4-二甲硫基苯基氨基甲酸酯(Bmpc)、2-磷
Figure BPA0000286473200000341
基乙基氨基甲酸酯(Peoc)、2-三苯基磷
Figure BPA0000286473200000342
基异丙基氨基甲酸酯(Ppoc)、1，1-二甲基-2-氰基乙基氨基甲酸酯、间氯-对-酰氧基苄基氨基甲酸酯、对-(二羟基硼烷基)苄基氨基甲酸酯、5-苯并异
Figure BPA0000286473200000343
唑基甲基氨基甲酸酯、2-(三氟甲基)-6-色酮基甲基氨基甲酸酯(Tcroc)、间硝基苯基氨基甲酸酯、3，5-二甲氧基苄基氨基甲酸酯、邻硝基苄基氨基甲酸酯、3，4-二甲氧基-6-硝基苄基氨基甲酸酯、苯基(邻硝基苯基)甲基氨基甲酸酯、吩噻嗪基-(10)-羰基衍生物、N’-对甲苯磺酰基氨基羰基衍生物、N’-苯基氨基硫代羰基衍生物、叔戊基氨基甲酸酯、S-苄基硫代氨基甲酸酯、对氰基苄基氨基甲酸酯、环丁基氨基甲酸酯、环己基氨基甲酸酯、环戊基氨基甲酸酯、环丙基甲基氨基甲酸酯、对癸氧基苄基氨基甲酸酯、2，2-二甲氧基羰基乙烯基氨基甲酸酯、邻-(N，N-二甲基甲酰胺基)苄基氨基甲酸酯、1，1-二甲基-3-(N，N-二甲基甲酰胺基)丙基氨基甲酸酯、1，1-二甲基丙炔基氨基甲酸酯、二(2-吡啶基)甲基氨基甲酸酯、2-呋喃基甲基氨基甲酸酯、2-碘乙基氨基甲酸酯、异茨烷基氨基甲酸酯(isoborynl carbamate)、异丁基氨基甲酸酯、异烟酰基氨基甲酸酯、对-(p’-甲氧基苯基偶氮)苄基氨基甲酸酯、1-甲基环丁基氨基甲酸酯、1-甲基环己基氨基甲酸酯、1-甲基-1-环丙基甲基氨基甲酸酯、1-甲基-1-(3，5-二甲氧基苯基)乙基氨基甲酸酯、1-甲基-1-(对苯基偶氮苯基)乙基氨基甲酸酯、1-甲基-1-苯基乙基氨基甲酸酯、1-甲基-1-(4-吡啶基)乙基氨基甲酸酯、苯基氨基甲酸酯、对-(苯基偶氮)苄基氨基甲酸酯、2，4，6-三叔丁基苯基氨基甲酸酯、4-(三甲基铵)苄基氨基甲酸酯、2，4，6-三甲基苄基氨基甲酸酯、甲酰胺、乙酰胺、氯乙酰胺、三氯乙酰胺、三氟乙酰胺、苯基乙酰胺、3-苯基丙酰胺、吡啶酰胺、3-吡啶基甲酰胺、N-苯甲酰基苯基丙酰胺衍生物、苯甲酰胺、对苯基苯甲酰胺、邻硝基苯基乙酰胺、邻硝基苯氧基乙酰胺、乙酰乙酰胺、(N’-二硫代苄氧基羰基氨基)乙酰胺、3-(对羟基苯基)丙酰胺、3-(邻硝基苯基)丙酰胺、2-甲基-2-(邻硝基苯氧基)丙酰胺、2-甲基-2-(邻苯基偶氮苯氧基)丙酰胺、4-氯丁酰胺、3-甲基-3-硝基丁酰胺、邻硝基肉桂酰胺、N-乙酰基甲硫氨酸衍生物、邻硝基苯甲酰胺、邻-(苯甲酰氧基甲基)苯甲酰胺、4，5-二苯基-3-唑啉-2-酮、N-邻苯二甲酰亚胺、N-二硫杂琥珀酰亚胺(Dts)、N-2，3-二苯基马来酰亚胺、N-2，5-二甲基吡咯、N-1，1，4，4-四甲基二甲硅烷基氮杂环戊烷加合物(STABASE)、5-取代的1，3-二甲基-1，3，5-三氮杂环己-2-酮、5-取代的1，3-二苄基-1，3，5-三氮杂环己-2-酮、1-取代的3，5-二硝基-4-吡啶酮、N-甲胺、N-丙烯胺、N-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲胺(SEM)、N-3-乙酰氧基丙胺、N-(1-异丙基-4-硝基-2-氧代-3-吡咯啉-3-基)胺、季铵盐、N-苄胺、N-二(4-甲氧基苯基)甲胺、N-5-二苯并环庚胺、N-三苯基甲胺(Tr)、N-[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基]胺(MMTr)、N-9-苯基芴基胺(PhF)、N-2，7-二氯-9-芴基亚甲基胺、N-二茂铁基甲胺(Fcm)、N-2-吡啶甲基氨基N’-氧化物、N-1，1-二甲硫基亚甲基胺、N-亚苄基胺、N-对甲氧基亚苄基胺、N-二苯基亚甲基胺、N-[(2-吡啶基)
Figure BPA0000286473200000351
基]亚甲基胺、N-(N’，N’-二甲基氨基亚甲基)胺、NN’-异亚丙基二胺、N-对硝基亚苄基胺、N-亚水杨基胺、N-5-氯亚水杨基胺、N-(5-氯-2-羟基苯基)苯基亚甲基胺、N-亚环己基胺、N-(5，5-二甲基-3-氧代-1-环己烯基)胺、N-硼烷衍生物、N-二苯基硼酸衍生物、N-[苯基(五羰基铬或钨)羰基]胺、N-铜螯合物、N-锌螯合物、N-硝胺、N-亚硝胺(N-nitrosoamine)、胺N-氧化物、二苯基次膦酰胺(diphenylphosphinamide，Dpp)、二甲基硫代次膦酰胺(Mpt)、二苯基硫代次膦酰胺(Ppt)、二烷基氨基磷酸酯(dialkyl phosphoramidate)、二苄基氨基磷酸酯、二苯基氨基磷酸酯、苯亚磺酰胺(benzenesulfenamide)、邻硝基苯亚磺酰胺(Nps)、2，4-二硝基苯亚磺酰胺、五氯苯亚磺酰胺、2-硝基-4-甲氧基苯亚磺酰胺、三苯基甲基亚磺酰胺、3-硝基吡啶亚磺酰胺(Npys)、对甲苯磺酰胺(Ts)、苯磺酰胺、2，3，6，-三甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Mtr)、2，4，6-三甲氧基苯磺酰胺(Mtb)、2，6-二甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Pme)、2，3，5，6-四甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Mte)、4-甲氧基苯磺酰胺(Mbs)、2，4，6-三甲基苯磺酰胺(Mts)、2，6-二甲氧基-4-甲基苯磺酰胺(iMds)、2，2，5，7，8-五甲基色满-6-磺酰胺(Pmc)、甲磺酰胺(Ms)、β-三甲基甲硅烷基乙磺酰胺(SES)、9-蒽磺酰胺、4-(4’，8’-二甲氧基萘基甲基)苯磺酰胺(DNMBS)、苄基磺酰胺、三氟甲磺酰胺和苯甲酰甲基磺酰胺。本文中详细描述了示例性的保护基。然而，应理解的是，本发明并未旨在限于这些保护基；相反，使用上述标准可容易鉴定多种另外的等效保护基并且用于本发明的方法。另外，多种保护基描述在Protective Groups inOrganic Synthesis，Third Ed.Greene，T.W.and Wuts，P.G.，Eds.，John Wiley&Sons，NewYork：1999中，其全部内容通过引用整体并入本文。
应理解的是，本文中所述化合物可被任何数目的取代基或官能部分取代。通常来说，无论前面是否有术语“任选地”的术语“取代”以及在本发明的式中所含的取代基，是指将给定结构中的氢基团替换成指定取代基的基团。当任意给定结构中多于一个的位置可被选自特定组的多于一个取代基取代时，每个位置的取代基可以是相同的或不同的。本文中使用的术语“取代”预期包括有机化合物的所有可能的取代基。广义来讲，允许的取代基包括有化合物的无环和环形的、支链和无支链的碳环和杂环、芳族和非芳族取代基。杂原子例如氮可具有氢取代基和/或任何可能的本文中所述的满足杂原子化合价的有机化合物取代基。此外，本发明并未旨在以任何方式限制有机化合物的可能的取代基。本发明预期的取代基和变量的组合优选地是导致形成可用于治疗例如感染性疾病或增生性疾病的稳定化合物的那些。本文中使用的术语“稳定的”优选地是指这样的化合物：具有足以允许制备的稳定性，并且保持化合物的完整性持续充分的一段时间以便检测，以及优选地持续充分的一段时间以用于本文中详细描述的目的。
本文中使用的术语“脂族(aliphatic)”包括饱和和不饱和的直链(即，无支链)、支链、无环、环形或多环脂族烃，其任选地被一个或更多个官能团取代。本领域普通技术人员将理解，“脂族”在本文中旨在包括但不限于烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基和环炔基部分。因此，本文中使用的术语“烷基”包括直链、支链和环形烷基。类似的约定适用于其他通用术语，例如“烯基”、“炔基”等。另外，本文中使用的术语“烷基”、“烯基”、“炔基”等涵盖经取代的和未经取代的基团二者。在某些实施方案中，本文中使用的“低级烷基”用于指示具有1至6个碳原子的那些烷基(环形、无环、经取代的、未经取代的、支链或无支链的)。
在某些实施方案中，本发明中使用的烷基、烯基和炔基含有1至20个脂族碳原子。在某些另外的实施方案中，本发明中使用的烷基、烯基和炔基含有1至10个脂族碳原子。在另一些实施方案中，本发明中使用的烷基、烯基和炔基含有1至8个脂族碳原子。在又一些实施方案中，本发明中使用的烷基、烯基和炔基含有1至6个脂族碳原子。在另一些实施方案中，本发明中使用的烷基、烯基和炔基含有1至4个碳原子。因此，示例性脂族基团包括但不限于例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、-CH2-环丙基、乙烯基、烯丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、环丁基、-CH2-环丁基、正戊基、仲戊基、异戊基、叔戊基、环戊基、-CH2-环戊基、正己基、仲己基、环己基、-CH2-环己基部分等，再一次，其可具有一个或更多个取代基。烯基包括但不限于例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基等。一些代表性炔基包括但不限于乙炔基、2-丙炔基(炔丙基)、1-丙炔基等。
本发明化合物的上述脂族(及其他)部分的取代基的一些实例包括但不限于：脂族、杂脂族、芳基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、烷氧基、芳氧基、杂烷氧基、杂芳氧基、烷硫基、芳硫基、杂烷硫基、杂芳硫基、-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-NO2、-CN、-CF3、-CH2CF3、-CHCl2、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH2NH2、-CH2SO2CH3、-C(O)Rx、-CO2(Rx)、-CON(Rx)2、-OC(O)Rx、-OCO2Rx、-OCON(Rx)2、-N(Rx)2、-S(O)2Rx、-NRx(CO)Rx，其中每次出现的Rx独立地包括但不限于脂族、杂脂族、芳基、杂芳基、芳基烷基或杂芳基烷基，其中上文以及本文中所述的脂族、杂脂族、芳基烷基或杂芳基烷基取代基中的任一种可以是经取代或未经取代的、支链或无支链的、环形或无环的，并且其中上文以及本文中所述的芳基或杂芳基取代基中的任一种可以是经取代的或未经取代的。一般适用的取代基的一些附加实例通过本文中描述的具体实施方案来举例说明。
本文中使用的术语“杂脂族(heteroaliphatic)”是指含有一个或更多个例如替代碳原子的氧、硫、氮、磷或硅原子的脂族部分。杂脂族部分可以是支链、无支链、环形或无环的，并且包括饱和和不饱和的杂环，例如吗啉基、吡咯烷基等。在某些实施方案中，杂脂族部分通过将其上的一个或更多个氢原子独立地替换成一个或更多个包括但不限于以下的部分而被取代：脂族、杂脂族、芳基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、烷氧基、芳氧基、杂烷氧基、杂芳氧基、烷硫基、芳硫基、杂烷硫基、杂芳硫基、-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-NO2、-CN、-CF3、-CH2CF3、-CHCl2、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH2NH2、-CH2SO2CH3、-C(O)Rx、-CO2(Rx)、-CON(Rx)2、-OC(O)Rx、-OCO2Rx、-OCON(Rx)2、-N(Rx)2、-S(O)2Rx、-NRx(CO)Rx，其中每次出现的Rx独立地包括但不限于脂族、杂脂族、芳基、杂芳基、芳基烷基或杂芳基烷基，其中上文以及本文中所述的脂族、杂脂族、芳基烷基或杂芳基烷基取代基中的任一种可以是经取代或未经取代的、支链或无支链的、环形或无环的，并且其中上文以及本文中所述的芳基或杂芳基取代基中的任一种可以是经取代的或未经取代的。一般适用的取代基的一些附加实例通过本文中描述的具体实施方案来举例说明。
本文中使用的术语“卤代”和“卤素”是指选自氟、氯、溴和碘的原子。
术语“烷基”包括饱和的脂族基团，包括直链烷基(例如，甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等)、支链烷基(异丙基、叔丁基、异丁基等)、环烷基(脂环族)基团(环丙基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基)、烷基取代的环烷基以及环烷基取代的烷基。在某些实施方案中，直链或支链烷基在其骨架中具有6或更少个碳原子(例如，直链为C1-C6，支链为C3-C6)，并且更优选地4个或更少个。同样地，优选的环烷基在其环结构中具有3至8个碳原子，并且更优选的在环结构中具有5或6个碳原子。术语C1-C6包括含有1至6个碳原子的烷基。
另外，除非另有说明，否则术语烷基包括“未经取代的烷基”和“经取代的烷基”二者，后者是指具有独立选择的取代基的烷基部分，所述取代基替代烃骨架的一个或更多个碳原子上的氢。这样的取代基可包括例如烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷硫基羰基、烷氧基、磷酸酯、膦酸根基(phosphonato)、次膦酸根基(phosphinato)、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰胺基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亚磺酰基、磺酸根基(sulfonato)、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基、或者芳族或杂芳族部分。环烷基可进一步被例如上述取代基取代。“烷基芳基”或“芳基烷基”部分是芳基取代的烷基(例如，苯甲基(苄基))。术语“烷基”还包含天然和非天然氨基酸的侧链。术语“正烷基”意指直链(即，无支链)未经取代的烷基。
术语“烯基”包括在长度和可能的取代方面与上述烷基类似但是包含至少一个双键的不饱和脂族基团。例如，术语“烯基”包括直链烯基(例如，乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基等)、支链烯基、环烯基(脂环族)基团(环丙烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环辛烯基)、烷基或烯基取代的环烯基、以及环烷基或环烯基取代的炔基。在某些实施方案中，直链或支链烯基在其骨架中具有6个或更少的碳原子(例如，直链为C2-C6，支链为C3-C6)。同样地，环烯基在其环结构中可具有3至8个碳原子，并且更优选地在环结构中具有5或6个碳。术语C2-C6包括含有2至6个碳原子的烯基。
另外，除非另有说明，否则术语烯基包括“未经取代的烯基”和“经取代的烯基”二者，后者是指具有独立选择的取代基的烯基部分，所述取代基替代烃骨架的一个或更多个碳原子上的氢。这样的取代基可包括例如烷基、炔基、卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷硫基羰基、烷氧基、磷酸酯、膦酸根基、次膦酸根基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰胺基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亚磺酰基、磺酸根基、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基、或者芳族或杂芳族部分。
术语“炔基”包括在长度和可能的取代方面与上述烷基类似但是含有至少一个三键的不饱和脂族基团。例如，术语“炔基”包括直链炔基(例如，乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基、癸炔基等)、支链炔基、以及环烷基或环烯基取代的炔基。在某些实施方案中，直链或支链炔基在其骨架中具有6个或更少的碳原子(例如，直链为C2-C6，支链为C3-C6)。术语C2-C6包括含有2至6个碳原子的炔基。
另外，除非另有说明，否则术语炔基包括“未经取代的炔基”和“经取代的炔基”二者，后者是指具有独立选择的取代基的炔基部分，所述取代基替代烃骨架的一个或更多个碳原子上的氢。这样的取代基可包括例如烷基、炔基、卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷硫基羰基、烷氧基、磷酸酯、膦酸根基、次膦酸根基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰胺基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亚磺酰基、磺酸根基、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基、或者芳族或杂芳族部分。
除非另外说明碳的数目，否则本文中使用的“低级烷基”意指上文定义的、但是在其骨架结构中具有1至5个碳原子的烷基。“低级烯基”和“低级炔基”的链长为例如2至5个碳原子。
术语“烷氧基”包括与氧原子共价连接的经取代和未经取代的烷基、烯基和炔基。烷氧基的一些实例包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基、丙氧基、丁氧基和戊氧基。经取代的烷氧基的一些实例包括卤代烷氧基。烷氧基可被独立选择的基团取代，所述基团例如烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷硫基羰基、烷氧基、磷酸酯、膦酸根基、次膦酸根基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰胺基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亚磺酰基、磺酸根基、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基、或者芳族或杂芳族部分。卤素取代的烷氧基的一些实例包括但不限于氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、氯甲氧基、二氯甲氧基、三氯甲氧基等。
术语“杂原子”包括除碳或氢以外任何元素的原子。优选的杂原子是氮、氧、硫和磷。
术语“氢氧基”或“羟基”包括具有-OH或-O-(具有合适的抗衡离子)的基团。
术语“卤素”包括氟、溴、氯、碘等。术语“全卤化”通常是指其中所有氢被卤素原子取代的部分。
术语“经取代”包括独立选择的取代基，所述取代基可位于所述部分上并且允许分子执行其预期功能。取代基的一些实例包括烷基、烯基、炔基、芳基、(CR’R”)0-3NR’R”、(CR’R”)0-3CN、NO2、卤素、(CR’R”)0-3C(卤素)3、(CR’R”)0-3CH(卤素)2、(CR’R”)0-3CH2(卤素)、(CR’R”)0-3CONR’R”、(CR’R”)0-3S(O)1-2NR’R”、(CR’R”)0-3CHO、(CR’R”)0-3O(CR’R”)0-3H、(CR’R”)0- 3S(O)0-2R’、(CR’R”)0-3O(CR’R”)0-3H、(CR’R”)0-3COR’、(CR’R”)0-3CO2R’或(CR’R”)0-3OR’基团；其中每个R’和R”各自独立地为氢、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基或芳基，或者R’和R”一起为亚苄基或-(CH2)2O(CH2)2-基团。
术语“胺”或“氨基”包括其中氮原子与至少一个碳或杂原子共价键合的化合物或部分。术语“烷基氨基”包括其中氮与至少一个另外的烷基结合的基团和化合物。术语“二烷基氨基”包括其中氮原子与至少两个另外的烷基结合的基团。
术语“醚”包括含有与两个不同碳原子或杂原子键合的氧的化合物或部分。例如，术语“烷氧基烷基”是指与氧原子共价键合的烷基、烯基或炔基，所述氧与另一个烷基共价键合。
术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”和“寡核苷酸”是指两个或更多个核苷酸的聚合物。多核苷酸可以是DNA、RNA或其衍生物或经修饰形式。多核苷酸可以是单链的或双链的。多核苷酸可例如在碱基部分、糖部分或磷酸酯骨架上被修饰以改善分子的稳定性、其杂交参数等。多核苷酸可包含经修饰的碱基部分，所述经修饰的碱基部分选自包括但不限于以下的组：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。多核苷酸可包含经修饰的糖部分(例如，2’-氟核糖、核糖、2’-脱氧核糖、2’-O-甲基胞苷、阿拉伯糖和己糖)和/或经修饰的磷酸酯部分(例如，硫代磷酸酯和5’-N-亚磷酰胺键联)。核苷酸序列通常携带遗传信息，包括细胞机器用于产生蛋白质和酶的信息。这些术语包括双链和单链基因组和cDNA、RNA、任何合成和遗传操作的多核苷酸、以及有义和反义多核苷酸二者。这包括单链和双链分子，即DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA杂交体，以及通过碱基与氨基酸骨架缀合形成的“蛋白质核酸(protein nucleic acid，PNA)”。
术语“碱基”包括已知的嘌呤和嘧啶杂环碱基、脱氮嘌呤，及其类似物(包括杂环取代的类似物，例如氨基乙氧基吩
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嗪)、衍生物(例如，1-烷基-、1-烯基-、杂芳族-和1-炔基衍生物)及其互变异构体。嘌呤的一些实例包括腺嘌呤、鸟嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和黄嘌呤，及其类似物(例如，8-氧代-N6-甲基腺嘌呤或7-二氮杂黄嘌呤)和衍生物。嘧啶包括例如胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧啶，及其类似物(例如，5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(1-丙炔基)尿嘧啶、5-(1-丙炔基)胞嘧啶和4，4-桥亚乙基胞嘧啶)。合适的碱基的另一些实例包括非嘌呤基和非嘧啶基碱基，例如2-氨基吡啶和三嗪类。
在一个优选实施方案中，本发明的寡核苷酸的核苷酸单体是RNA核苷酸。在另一个优选实施方案中，本发明的寡核苷酸的核苷酸单体是经修饰的RNA核苷酸。因此，寡核苷酸包含经修饰的RNA核苷酸。
术语“核苷”包含与糖部分(优选核糖或脱氧核糖)共价连接的碱基。优选核苷的一些实例包括核糖核苷和脱氧核糖核苷。核苷还包括与氨基酸或氨基酸类似物连接的碱基，所述氨基酸或氨基酸类似物可包含游离羧基、游离氨基或保护基。合适的保护基是本领域中公知的(参见，P.G.M.Wuts and T.W Greene，“Protective Groups in OrganicSynthesis”，2nd Ed.，Wiley-Interscience，New York，1999)。
术语“核苷酸”包括进一步包含磷酸基团(phosphate group)或磷酸类似物的核苷。
核酸分子可与疏水性部分缔合用于将分子靶向和/或递送至细胞。在某些实施方案中，疏水性部分通过接头与核酸分子缔合。在某些实施方案中，缔合通过非共价相互作用。在另一些实施方案中，缔合通过共价键。本领域中已知的任何接头可用于使核酸与疏水性部分缔合。本领域中已知的接头描述在公开的国际PCT申请WO 92/03464、WO 95/23162、WO 2008/021157、WO 2009/021157、WO 2009/134487、WO 2009/126933、美国专利申请公开2005/0107325、美国专利5,414,077、美国专利5,419,966、美国专利5,512,667、美国专利5,646,126和美国专利5,652,359中，其通过引用并入本文。接头可像与多原子(multi-atom)接头共价键合那样简单。接头可以是环形的或无环的。接头可以是任选经取代的。在某些实施方案中，接头能够从核酸被切掉。在某些实施方案中，接头能够在生理条件下被水解。在某些实施方案中，接头能够通过酶(例如，酯酶或磷酸二酯酶)被切掉。在某些实施方案中，接头包含用于将核酸与疏水性部分分隔开的间隔元件。间隔元件可包含1至30个碳或杂原子。在某些实施方案中，接头和/或间隔元件包含可质子化的官能团。这样的可质子化的官能团可促进核酸分子的内体逃逸(endosomal escape)。可质子化的官能团还可有助于将核酸递送至细胞，例如中和分子的全部电荷。在另一些实施方案中，接头和/或间隔元件是生物学惰性的(即，不影响所得核酸分子的生物学活性或功能)。
在某些实施方案中，具有接头和疏水性部分的核酸分子是本文中所述的式。在某些实施方案中，核酸分子是下式：
Figure BPA0000286473200000431
其中：
X是N或CH；
A是键；经取代或未经取代的、环形或无环的、支链或无支链的脂族；或者经取代或未经取代的、环形或无环的、支链或无支链的杂脂族；
R1是疏水性部分；
R2是氢；氧保护基；环形或无环的、经取代或未经取代的、支链或无支链的脂族；环形或无环的、经取代或未经取代的、支链或无支链的杂脂族；经取代或未经取代的、支链或无支链的酰基；经取代或未经取代的、支链或无支链的芳基；经取代或未经取代的、支链或无支链的杂芳基；并且
R3是核酸。
在某些实施方案中，分子是下式：
Figure BPA0000286473200000441
在某些实施方案中，分子是下式：
Figure BPA0000286473200000442
在某些实施方案中，分子是下式：
Figure BPA0000286473200000443
在某些实施方案中，分子是下式：
Figure BPA0000286473200000451
在某些实施方案中，X是N。在某些实施方案中，X是CH。
在某些实施方案中，A是键。在某些实施方案中，A是经取代或未经取代的、环形或无环的、支链或无支链的脂族。在某些实施方案中，A是无环的、经取代或未经取代的、支链或无支链的脂族。在某些实施方案中，A是无环的、经取代的、支链或无支链的脂族。在某些实施方案中，A是无环的、经取代的、无支链的脂族。在某些实施方案中，A是无环的、经取代的、无支链的烷基。在某些实施方案中，A是无环的、经取代、无支链的C1-20烷基。在某些实施方案中，A是无环的、经取代的、无支链的C1-12烷基。在某些实施方案中，A是无环的、经取代的、无支链的C1-10烷基。在某些实施方案中，A是无环的、经取代的、无支链的C1-8烷基。在某些实施方案中，A是无环的、经取代的、无支链的C1-6烷基。在某些实施方案中，A是经取代或未经取代的、环形或无环的、支链或无支链的杂脂族。在某些实施方案中，A是无环的、经取代或未经取代的、支链或无支链的杂脂族。在某些实施方案中，A是无环的、经取代的、支链或无支链的杂脂族。在某些实施方案中，A是无环的、经取代的、无支链的杂脂族。
在某些实施方案中，A是下式：
Figure BPA0000286473200000452
在某些实施方案中，A是下式之一：
Figure BPA0000286473200000461
在某些实施方案中，A是下式之一：
Figure BPA0000286473200000462
在某些实施方案中，A是下式之一：
Figure BPA0000286473200000471
在某些实施方案中，A是下式：
Figure BPA0000286473200000472
在某些实施方案中，A是下式：
Figure BPA0000286473200000473
在某些实施方案中，A是下式：
Figure BPA0000286473200000474
其中：
每次出现的R独立地为天然或非天然氨基酸的侧链；并且
n是1至20的整数(包括端值)。在某些实施方案中，A是下式：
Figure BPA0000286473200000481
在某些实施方案中，每次出现的R独立地为天然氨基酸的侧链。在某些实施方案中，n是1至15的整数(包括端值)。在某些实施方案中，n是1至10的整数(包括端值)。在某些实施方案中，n是1至5的整数(包括端值)。
在某些实施方案中，A是下式：
Figure BPA0000286473200000482
其中n是1至20的整数(包括端值)。在某些实施方案中，A是下式：
Figure BPA0000286473200000483
在某些实施方案中，n是1至15的整数(包括端值)。在某些实施方案中，n是1至10的整数(包括端值)。在某些实施方案中，n是1至5的整数(包括端值)。
在某些实施方案中，A是下式：
Figure BPA0000286473200000491
其中n是1至20的整数(包括端值)。在某些实施方案中，A是下式：
Figure BPA0000286473200000492
在某些实施方案中，n是1至15的整数(包括端值)。在某些实施方案中，n是1至10的整数(包括端值)。在某些实施方案中，n是1至5的整数(包括端值)。
在某些实施方案中，分子是下式：
Figure BPA0000286473200000493
其中X、R1、R2和R3如本文中所定义；并且
A’是经取代或未经取代的、环形或无环的、支链或无支链的脂族；或者经取代或未经取代的、环形或无环的、支链或无支链的杂脂族。
在某些实施方案中，A’是下式之一：
Figure BPA0000286473200000501
在某些实施方案中，A是下式之一：
Figure BPA0000286473200000502
在某些实施方案中，A是下式之一：
Figure BPA0000286473200000511
在某些实施方案中，A是下式：
Figure BPA0000286473200000512
在某些实施方案中，A是下式：
Figure BPA0000286473200000513
在某些实施方案中，R1是类固醇。在某些实施方案中，R1是胆固醇。在某些实施方案中，R1是亲脂性维生素。在某些实施方案中，R1是维生素A。在某些实施方案中，R1是维生素E。
在某些实施方案中，R1是下式：
Figure BPA0000286473200000521
其中RA是经取代或未经取代的、环形或无环的、支链或无支链的脂族；或者经取代或未经取代的、环形或无环的、支链或无支链的杂脂族。
在某些实施方案中，R1是下式：
Figure BPA0000286473200000522
在某些实施方案中，R1是下式：
Figure BPA0000286473200000523
在某些实施方案中，R1是下式：
Figure BPA0000286473200000524
在某些实施方案中，R1是下式：
Figure BPA0000286473200000531
在某些实施方案中，R1是下式：
Figure BPA0000286473200000532
在某些实施方案中，核酸分子是下式：
Figure BPA0000286473200000533
其中：
X是N或CH；
A是键；经取代或未经取代的、环形或无环的、支链或无支链的脂族；或者经取代或未经取代的、环形或无环的、支链或无支链的杂脂族；
R1是疏水性部分；
R2是氢；氧保护基；环形或无环的、经取代或未经取代的、支链或无支链的脂族；环形或无环的、经取代或未经取代的、支链或无支链的杂脂族；经取代或未经取代的、支链或无支链的酰基；经取代或未经取代的、支链或无支链的芳基；经取代或未经取代的、支链或无支链的杂芳基；并且
R3是核酸。
在某些实施方案中，核酸分子是下式：
Figure BPA0000286473200000541
其中：
X是N或CH；
A是键；经取代或未经取代的、环形或无环的、支链或无支链的脂族；或者经取代或未经取代的、环形或无环的、支链或无支链的杂脂族；
R1是疏水性部分；
R2是氢；氧保护基；环形或无环的、经取代或未经取代的、支链或无支链的脂族；环形或无环的、经取代或未经取代的、支链或无支链的杂脂族；经取代或未经取代的、支链或无支链的酰基；经取代或未经取代的、支链或无支链的芳基；经取代或未经取代的、支链或无支链的杂芳基；并且
R3是核酸。
在某些实施方案中，核酸分子是下式：
Figure BPA0000286473200000542
其中：
X是N或CH；
A是键；经取代或未经取代的、环形或无环的、支链或无支链的脂族；或者经取代或未经取代的、环形或无环的、支链或无支链的杂脂族；
R1是疏水性部分；
R2是氢；氧保护基；环形或无环的、经取代或未经取代的、支链或无支链的脂族；环形或无环的、经取代或未经取代的、支链或无支链的杂脂族；经取代或未经取代的、支链或无支链的酰基；经取代或未经取代的、支链或无支链的芳基；经取代或未经取代的、支链或无支链的杂芳基；并且
R3是核酸。在某些实施方案中，核酸分子是下式：
Figure BPA0000286473200000551
在某些实施方案中，核酸分子是下式：
Figure BPA0000286473200000552
在某些实施方案中，核酸分子是下式：
Figure BPA0000286473200000553
其中R3是核酸。
在某些实施方案中，核酸分子是下式：
Figure BPA0000286473200000561
其中R3是核酸；并且
n是1至20的整数(包括端值)。
在某些实施方案中，核酸分子是下式：
Figure BPA0000286473200000562
在某些实施方案中，核酸分子是下式：
Figure BPA0000286473200000563
在某些实施方案中，核酸分子是下式：
Figure BPA0000286473200000571
在某些实施方案中，核酸分子是下式：
Figure BPA0000286473200000572
在某些实施方案中，核酸分子是下式：
Figure BPA0000286473200000573
本文中使用的术语“键联(linkage)”包括共价偶联相邻核苷酸单体的天然存在的未经修饰的磷酸二酯部分(-O-(PO2-)-O-)。本文中使用的术语“替代键联”包括共价偶联相邻核苷酸单体的天然磷酸二酯基团的任何类似物或衍生物。替代键联包括磷酸二酯类似物，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯，和P-乙氧基磷酸二酯、P-乙氧基磷酸二酯、P-烷氧基磷酸三酯、甲基膦酸酯以及不含磷的(nonphosphorus containing)键联，例如缩醛和酰胺。这样的替代键联是本领域中已知的(例如，Bjergarde et al.1991.Nucleic Acids Res.19：5843；Caruthers et al.1991.Nucleosides Nucleotides.10：47)。在某些实施方案中，优选不可水解的键联，例如硫氮磷酸酯键联。
在某些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含疏水性修饰的核苷酸或“疏水性修饰”。本文中使用的“疏水性修饰”是指经修饰以使得如下的碱基：(1)碱基的整体疏水性显著提高，和/或(2)碱基仍然能够形成接近常规的沃森-克里克相互作用。碱基修饰的数种非限制性实例包括5位尿苷和胞苷修饰，例如苯基、4-吡啶基、2-吡啶基、吲哚基和异丁基、苯基(C6H5OH)；色氨酰基((C8H6N)CH2CH(NH2)CO)、异丁基、丁基、氨基苄基；苯基；以及萘基。
可与经化学修饰的双链核酸分子的末端(3’或5’端)、环区域或任何其他部分连接的另一些类型的缀合物包括固醇、固醇型分子、肽、小分子、蛋白质等。在一些实施方案中，经化学修饰的双链核酸分子，例如sd-rxRNA可包含多于一种缀合物(化学性质相同或不同)。在一些实施方案中，缀合物是胆固醇。
在一些实施方案中，第一核苷酸相对于引导链的5’端具有2’-O-甲基修饰，任选地其中2’-O-甲基修饰是5P-2’O-甲基U修饰或5’乙烯基膦酸酯2’-O-甲基U修饰。提高靶基因特异性或者降低脱靶沉默作用的另一种方法是在对应于引导序列的第二个5’端核苷酸的位置处引入2’修饰(例如，2’-O甲基修饰)。本发明的反义(引导)序列可以是包含RNA样区域和DNA样区域的“嵌合寡核苷酸”。
专用语(language)“核糖核酸酶H激活区”包括能够募集核糖核酸酶H以切割寡核苷酸所结合的靶RNA链的寡核苷酸(例如，嵌合寡核苷酸)区域。通常来说，核糖核酸酶激活区包含DNA或DNA样核苷酸单体的最小核心(至少约3至5、通常约3至12、更通常约5至12、以及更优选约5至10个连续核苷酸单体)(参见，例如美国专利No.5,849,902)。优选地，核糖核酸酶H激活区包含约9个连续的含脱氧核糖的核苷酸单体。
专用语“非激活区”包括不能募集或激活核糖核酸酶H的反义序列(例如，嵌合寡核苷酸)区。优选地，非激活区不包含硫代磷酸酯DNA。本发明的寡核苷酸包含至少一个非激活区。在一个实施方案中，非激活区对于核酸酶可以是稳定的，或者可通过与靶标互补并与待与寡核苷酸结合的靶核酸分子形成氢键来提供针对靶标的特异性。
在一个实施方案中，连续多核苷酸的至少一部分通过替代键联(例如，硫代磷酸酯键联)进行连接。
在某些实施方案中，引导序列(2’-修饰的或未修饰的)以外的大部分或全部核苷酸通过硫代磷酸酯键联进行连接。由于对于血清蛋白质的更高亲和力，这样的构建体倾向于具有改善的药动学。一旦引导链装载到RISC中，多核苷酸的非引导序列部分中的硫代磷酸酯键联就通常不干扰引导链活性。在一些实施方案中，高水平的硫代磷酸酯修饰可实现改进的递送。在一些实施方案中，引导链和/或随从链是完全硫代磷酸酯化的。
本发明的反义(引导)序列可包含“吗啉代寡核苷酸”。吗啉代寡核苷酸是非离子的并且通过不依赖于核糖核酸酶H的机制起作用。吗啉代寡核苷酸的四种遗传碱基(腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶/尿嘧啶)中的每一种均与6元吗啉环连接。通过将4种不同的亚基类型经例如非离子的二氨基磷酸盐亚基间键联进行连接来制备吗啉代寡核苷酸。吗啉代寡核苷酸具有许多优点，包括：完全抗核酸酶(Antisense&Nucl.Acid Drug Dev.1996.6：267)；可预测的靶向性(Biochemica Biophysica Acta.1999.1489：141)；细胞中的可靠活性(Antisense&Nucl.Acid Drug Dev.1997.7：63)；优异序列特异性(Antisense&Nucl.AcidDrug Dev.1997.7：151)；最小非反义活性(Biochemica BiophysicaActa.1999.1489：141)；以及简单的渗透或刮擦递送(Antisense&Nucl.Acid Drug Dev.1997.7：291)。吗啉代寡核苷酸还由于其在高剂量时无毒性而成为优选的。关于吗啉代寡核苷酸的制备的讨论可见于Antisense&Nucl.Acid Drug Dev.1997.7：187中。
认为本文中所述的化学修饰促进单链多核苷酸装载到RISC中。已经表明单链多核苷酸在装载到RISC中时有活性并且诱导基因沉默。但是与双链体多核苷酸比较时，单链多核苷酸的活性水平看来低2至4个数量级。
本发明提供了对化学修饰模式的描述，其可(a)显著提高单链多核苷酸的稳定性，(b)促进多核苷酸高效装载到RISC复合物中，以及(c)提高细胞对单链核苷酸的摄取。化学修饰模式可包括核糖、骨架、疏水性核苷和缀合物类型的修饰的组合。另外，在一些实施方案中，单多核苷酸的5’端可以是化学磷酸化的。
在另一些实施方案中，本发明提供了对化学修饰模式的描述，其改善了RISC抑制多核苷酸的功能。已经表明单链多核苷酸通过底物竞争机制抑制预装载的RISC复合物的活性。对于这些类型的分子(通常称为拮抗剂)，活性通常需要高浓度，并且体内递送不是非常有效。本发明提供了对化学修饰模式的描述，其可(a)显著提高单链多核苷酸的稳定性，(b)促进作为底物的多核苷酸被RISC高效识别，和/或(c)提高细胞对单链核苷酸的摄取。化学修饰模式可包括核糖、骨架、疏水性核苷和缀合物类型的修饰的组合。
本发明提供的修饰适用于所有多核苷酸。这包括单链RISC进入多核苷酸、单链RISC抑制多核苷酸、可变长度(15至40bp)的常规双链体多核苷酸、不对称双链体多核苷酸等。多核苷酸可以以广泛多种的化学修饰模式进行修饰，包括5’端、核糖、骨架和疏水性核苷修饰。
合成
本发明的寡核苷酸可通过本领域中已知的任何方法合成，例如使用酶促合成和/或化学合成。寡核苷酸可在体外(例如，使用酶促合成和化学合成)或体内(使用本领域中公知的重组DNA技术)合成。
在一个优选实施方案中，将化学合成用于经修饰的多核苷酸。线性寡核苷酸的化学合成是本领域中公知的并且可通过溶液相或固相技术来实现。优选地，通过固相方法合成。可通过多种不同合成操作中的任一种来制备寡核苷酸，所述合成操作包括亚磷酰胺、亚磷酸三酯、H-膦酸酯和磷酸三酯方法，通常通过自动合成方法来制备寡核苷酸。
寡核苷酸合成方案是本领域中公知的，并且可见于例如：美国专利No.5,830,653；WO 98/13526；Stec et al.1984.J.Am.Chem.Soc.106：6077；Stec etal.1985.J.Org.Chem.50：3908；Stec et al.J.Chromatog.1985.326：263；LaPlanche etal.1986.Nucl.Acid.Res.1986.14：9081；FasmanG.D.，1989.Practical Handbook ofBiochemistry and Molecular Biology.1989.CRC Press，Boca Raton，Fla.；Lamone.1993.Biochem.Soc.Trans.21：1；美国专利No.5,013,830；美国专利No.5,214,135；美国专利No.5,525,719；Kawasaki et al.1993.J.Med.Chem.36：831；WO 92/03568；美国专利No.5,276,019；以及美国专利No.5,264,423。
所选择的合成方法可取决于期望的寡核苷酸长度，并且这样的选择在本领域一般技术人员能力之内。例如，亚磷酰胺和亚磷酸三酯方法可产生具有175或更多个核苷酸的寡核苷酸，而H-膦酸酯方法很好地用于小于100个核苷酸的寡核苷酸。如果向寡核苷酸中并入经修饰碱基，并且特别是如果使用经修饰磷酸二酯键联，则根据需要按照已知操作改变合成操作。在这一点上，Uhlmann et al.(1990，Chemical Reviews 90：543-584)提供了用于制备具有经修饰碱基和经修饰磷酸二酯键联的寡核苷酸的参考和概括操作。用于制备寡核苷酸的其他示例性方法在Sonveaux.1994.“Protecting Groups in OligonucleotideSynthesis”；Agrawal.Methods in Molecular Biology 26：1中教导。示例性合成方法还在“Oligonucleotide Synthesis-A Practical Approach”(Gait，M.J.IRL Press at OxfordUniversity Press.1984)中教导。另外，限定序列的线性寡核苷酸，包括具有经修饰核苷酸的一些序列，可从数种商业来源容易地获得。
寡核苷酸可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，或者通过多种色谱方法(包括凝胶色谱和高压液相色谱)中的任一种来纯化。为了确认核苷酸序列，尤其是未经修饰的核苷酸序列，可通过任一种已知的操作对寡核苷酸进行DNA测序，所述方法包括Maxam和Gilbert测序、Sanger测序、毛细管电泳测序、漂移斑点测序操作(wandering spot sequencingprocedure)，或者通过使用与Hybond纸结合的寡核苷酸的选择性化学降解。还可通过激光解吸质谱或通过快原子轰击来分析短寡核苷酸的序列(McNeal，et al.，1982，J.Am.Chem.Soc.104：976；Viari，et al.，1987，Biomed.Environ.Mass Spectrom.14：83；Grotjahn et al.，1982，Nuc.AcidRes.10：4671)。测序方法也适用于RNA寡核苷酸。
可通过毛细管电泳测试寡核苷酸和使用例如Bergot和Egan.1992.J.Chrom.599：35的方法的变性强阳离子HPLC(SAX-HPLC)来确认合成的寡核苷酸的质量。
其他示例性合成技术是本领域中公知的(参见，例如，Sambrook et al.，Molecular Cloning：a Laboratory Manual，Second Edition(1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(DN Glover Ed.1985)；Oligonucleotide Synthesis(M J Gait Ed，1984；Nucleic Acid Hybridisation(B D Hames and S J Higgins eds.1984)；APractical Guide to Molecular Cloning(1984)；或者Methods in Enzymology系列(Academic Press，Inc.))。
在某些实施方案中，本发明RNAi构建体或者其至少一部分转录自编码本发明构建体的表达载体。任何本领域识别的载体均可用于该目的。转录的RNAi构建体可被分离和纯化，之后进行期望的修饰(例如将未经修饰的有义链替换成经修饰的有义链等)。
递送/载体
不希望受到任何特定理论的限制，发明人认为，本文中所述的双链核酸分子(例如，sd-rxRNA)的随从链和引导链上的特定修饰模式有助于引导链进入到细胞核中，其中引导链介导基因沉默(例如，靶基因的沉默，所述靶基因例如AKT、p53、PDCD1、TIGIT、Cbl-b、Tet2、Blimp-1、T-Box21、DNMT3A、PTPN6和HK2)。
不希望受到任何理论的限制，数种潜在的行动机制可解释这一活性。例如，在一些实施方案中，核酸分子(例如，sd-rxRNA)的引导链(例如，反义链)可从随从链分离并作为单链进入细胞核。一旦进入细胞核中，单链引导链可与核糖核酸酶H或另一种核糖核酸酶缔合并切割靶标(例如，AKT、p53、PDCD1、TIGIT、Cbl-b、Tet2、Blimp-1、T-Box21、DNMT3A、PTPN6或HK2)(“反义作用机制”)。在一些实施方案中，核酸分子(例如，sd-rxRNA)的引导链(例如，反义链)可与细胞质中或细胞核外的Argonaute(Ago)蛋白缔合，从而形成负载的Ago复合物。该负载的Ago复合物可移位到细胞核中，并随后切割靶标(例如，AKT、p53、PDCD1、TIGIT、Cbl-b、Tet2、Blimp-1、T-Box21、DNMT3A、PTPN6和HK2)。在一些实施方案中，核酸分子(例如，sd-rxRNA)的两条链(例如，双链体)均可进入细胞核并且引导链可与核糖核酸酶H、Ago蛋白或另一核糖核酸酶缔合并切割靶标(例如，AKT、p53、PDCD1、TIGIT、Cbl-b、Tet2、Blimp-1、T-Box21、DNMT3A、PTPN6和HK2)。
本领域技术人员理解，本文中所述的双链分子的有义链(例如，sd-rxRNA有义链)不限于本文中所述的双链核酸分子的引导链的递送。相反，在一些实施方案中，出于将所述其他分子靶向细胞的细胞核的目的，将本文中所述的随从链与某些分子(例如，反义寡核苷酸，ASO)连接(例如，共价结合、非共价结合、缀合、通过互补区杂交等)。在一些实施方案中，与本文中所述的有义链连接的分子是合成的反义寡核苷酸(ASO)。在一些实施方案中，与反义寡核苷酸连接的有义链为8至15个核苷酸长、经化学修饰并且包含疏水性缀合物。
不希望受到任何特定理论的限制，ASO可通过氢键与互补的随从链连接。因此，在一些方面中，本公开内容提供了向细胞递送核酸分子的方法，所述方法包括向细胞施用分离的核酸分子，其中分离的核酸包含与反义寡核苷酸(ASO)互补的有义链，其中有义链为8至15个核苷酸长，包含至少两个硫代磷酸酯修饰，有义链中至少50％的嘧啶是经修饰的，并且其中所述分子包含疏水性缀合物。
细胞对寡核苷酸的摄取
寡核苷酸和寡核苷酸组合物与一个/种或更多个/种细胞或细胞裂解物接触(即，使其与一个/种或更多个/种细胞或细胞裂解物接触，在本文中也称为施用或递送至一个/种或更多个/种细胞或细胞裂解物)并且被其摄取。术语“细胞”包括原核细胞和真核细胞，优选脊椎动物细胞，并且更优选哺乳动物细胞。在一些实施方案中，使本发明的寡核苷酸组合物与细菌细胞接触。在一些实施方案中，使本发明的寡核苷酸组合物与真核细胞(例如，植物细胞、哺乳动物细胞、节肢动物细胞(例如，昆虫细胞))接触。在一些实施方案中，使本发明的寡核苷酸组合物与干细胞接触。在一些实施方案中，使本发明的寡核苷酸组合物与免疫细胞例如T细胞(例如，CD8+T细胞)接触。在一些实施方案中，T细胞是TSCM或TCM T细胞。在一个优选实施方案中，使本发明的寡核苷酸组合物与人细胞接触。
本发明的寡核苷酸组合物可在体外(例如，在试管或培养皿中)(并且可引入或可不引入到对象中)或者在体内(例如，在对象例如哺乳动物对象中)或者离体接触细胞。在一些实施方案中，局部或通过电穿孔施用寡核苷酸。细胞通过内吞作用以低的速度摄取寡核苷酸，但是内吞的寡核苷酸通常被隔绝并且不能用于例如与靶核酸分子杂交。在一个实施方案中，可通过电穿孔或磷酸钙沉淀促进细胞摄取。然而，这些操作仅可用于体外或离体实施方案，并且是不方便的，并且在一些情况下与细胞毒性相关。
在另一个实施方案中，可通过合适的本领域认可的方法来增强寡核苷酸向细胞的递送，所述方法包括磷酸钙、DMSO、甘油或右旋糖酐、电穿孔，或者通过例如使用阳离子、阴离子或中性脂质组合物或脂质体，使用本领域中已知方法进行的转染(参见，例如WO 90/14074；WO 91/16024；WO 91/17424；美国专利No.4,897,355；Bergan et al.1993.NucleicAcids Research.21：3567)。寡核苷酸的增强的递送也可使用载体(参见，例如Shi，Y2003.Trends Genet 2003Jan.19：9；Reichhart J M et al.Genesis.2002.34(1-2)：1604，Yu et al.2002.Proc.Natl.Acad Sci.USA 99：6047；Sui et al.2002.Proc.Natl.AcadSci.USA 99：5515)、病毒、多胺或聚阳离子缀合物，使用化合物例如多赖氨酸、鱼精蛋白或Ni，N12-双(乙基)精胺(参见，例如参见，例如Bartzatt，R.et al.1989.Biotechnol.Appl.Biochem.11：133；Wagner E.et al.1992.Proc.Natl.Acad.Sci.88：4255)来介导。
在某些实施方案中，本发明的经化学修饰的双链核酸分子可使用多种含β-葡聚糖的颗粒来递送，所述颗粒被称为GeRP(包封有葡聚糖的负载RNA的颗粒)，描述在通过引用并入的2010年3月4日提交的标题为“Formulations and Methods for Targeted Deliveryto Phagocyte Cells.”的美国临时申请No.61/310,611中。这样的颗粒还描述在通过引用并入的美国专利公开US 2005/0281781A1和US 2010/0040656以及PCT公开WO2006/007372和WO 2007/050643中。经化学修饰的双链核酸分子可以是疏水性修饰的并且任选地可与脂质和/或两亲性肽缔合。在某些实施方案中，β-葡聚糖颗粒来源于酵母。在某些实施方案中，有效负载捕获分子是聚合物，例如分子量为至少约1000Da、10,000Da、50,000Da、100kDa、500kDa等的那些。优选的聚合物包括(但不限于)阳离子聚合物、壳聚糖或PEI(聚乙烯亚胺)等。
葡聚糖颗粒可来源于真菌细胞壁(例如酵母细胞壁)的不溶性组分。在一些实施方案中，酵母是Baker’s酵母。酵母来源的葡聚糖分子可包含β-(1，3)-葡聚糖、β-(1，6)-葡聚糖、甘露聚糖和几丁质中的一种或更多种。在一些实施方案中，葡聚糖颗粒包含中空酵母细胞壁，从而使颗粒保持类似细胞的三维结构，其中其可复合(complex)或包封分子例如RNA分子。与使用酵母细胞壁颗粒相关的一些优点是组分的可用性、其生物可降解性质及其靶向吞噬细胞的能力。
在一些实施方案中，葡聚糖颗粒可通过从细胞壁中提取不溶性组分，例如通过用1M NaOH/pH 4.0H2O提取Baker’s酵母(Fleischmann’s)，随后进行洗涤并且干燥来制备。制备酵母细胞壁颗粒的方法在通过引用并入的以下专利中讨论：美国专利4,810,646、4,992,540、5,082,936、5,028,703、5,032,401、5,322,841、5,401,727、5,504,079、5,607,677、5,968,811、6,242,594、6,444,448、6,476,003，US专利公开2003/0216346、2004/0014715和2010/0040656，以及PCT公开申请WO02/12348。
用于制备葡聚糖颗粒的方案还描述在通过引用并入的以下参考文献中：Soto andOstroff(2008)，“Characterization of multilayered nanoparticles encapsulated inyeast cell wall particles for DNA delivery.”Bioconjug Chem19(4)：840-8；Sotoand Ostroff(2007)，“Oral Macrophage Mediated Gene Delivery System，”Nanotech，Volume 2，Chapter 5(“Drug Delivery”)，pages378-381；以及Li et al.(2007)，“Yeastglucan particles activate murine resident macrophages to secreteproinfiammatory cytokines via MyD88-and Syk kinase-dependent pathways.”Clinical Immunology 124(2)：170-181。
包含葡聚糖的颗粒(例如酵母细胞壁颗粒)还可商业地获得。数种非限制性实例包括：来自Biorigin的Nutricell MOS 55(Sao Paolo，Brazil)；SAF-Mannan(SAF Agri，Minneapolis，Minn.)；Nutrex(Sensient Technologies，Milwaukee，Wis.)；碱提取的颗粒，例如Nutricepts(Nutricepts Inc.，Bumsville，Minn.)和ASA Biotech生产的那些；来自Biopolymer Engineering的酸提取的WGP颗粒；以及有机溶剂提取的颗粒，例如来自Alpha-beta Technology，Inc.(Worcester，Mass.)的AdiuvaxTM以及来自Novogen(Stamford，Conn.)的微粒葡聚糖。
根据生产和/或提取方法，葡聚糖颗粒，例如酵母细胞壁颗粒可具有不同的纯度水平。在一些情况下，将颗粒碱提取、酸提取或有机溶剂提取以移除细胞内组分和/或细胞壁的外甘露糖蛋白层。这样的方案可产生葡聚糖(w/w)含量为50％至90％的颗粒。在一些情况下，可优选较低纯度(意味着较低的葡聚糖w/w含量)的颗粒，而在另一些实施方案中，可优选较高纯度(意味着较高的葡聚糖w/w含量)的颗粒。
葡聚糖颗粒，例如酵母细胞壁颗粒，可具有天然脂质含量。例如，颗粒可包含1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％或多于20％w/w的脂质。在一些情况下，天然脂质的存在可有助于RNA分子的复合(complexation)或捕获。
含葡聚糖的颗粒的直径通常为约2微米至4微米，但是直径小于2微米或大于4微米的颗粒也适用于本发明的一些方面。
待递送的RNA分子可复合或“捕获”在葡聚糖颗粒的壳内。可对颗粒的壳或RNA组分进行标记以用于可视化，如在通过引用并入的Soto and Ostroff(2008)Bioconjug Chem19：840中所描述的。下面将进一步讨论负载GeRP的方法。
用于摄取寡核苷酸的最佳方案取决于多种因素，最关键的是所使用的细胞的类型。对于摄取来说重要的其他因素包括但不限于寡核苷酸的性质和浓度、细胞的汇合、细胞所处的培养类型(例如，悬浮培养或平板)以及细胞生长的培养基的类型。
免疫原性组合物及其产生方法
在一些实施方案中，本文中所述的经化学修饰的双链核酸分子(例如，sd-rxRNA)可用于产生用于免疫原性组合物的特定细胞亚型或T细胞亚型。本文中使用的“免疫原性组合物”是包含宿主细胞的组合物，所述宿主细胞包含如本文中所述的经化学修饰的核酸分子，以及任选地一种或更多种可药用赋形剂或载体。不希望受到任何特定理论的约束，如本公开内容所述的免疫原性组合物的特征在于这样的免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、抗原呈递细胞(APC)、树突细胞(DC)、干细胞(SC)、诱导多能干细胞(iPSC)等)群：已被工程化以具有富集的特定细胞亚型(例如，T细胞亚型，例如TSCM或TCM T细胞)群和/或降低(例如，抑制)一种或更多种免疫检查点蛋白(例如，PDCD1、TIGIT等)的表达或活性；并且因此所述免疫原性组合物在一些实施方案中可用于调节(例如，刺激或抑制)对象的免疫应答。
本文中使用的“宿主细胞”是已向其引入了一种或更多种经化学修饰的双链核酸分子的细胞。通常来说，宿主细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、猪细胞等。然而，在一些实施方案中，宿主细胞是非哺乳动物细胞，例如原核细胞(例如，细菌细胞)、酵母细胞、昆虫细胞等。通常来说，宿主细胞来自供体，例如健康供体(例如，已向其引入了经化学修饰的双链核酸的细胞从供体例如健康供体取得)。例如，可从获自供体(例如健康供体)的生物样品例如骨髓或血液中分离一种或更多种细胞。本文中使用的“健康供体”是指未患有或未被怀疑患有增生性病症或感染性疾病(例如，细菌感染、病毒感染或寄生虫感染)的对象。然而，在一些实施方案中，例如在自体细胞治疗的背景下，宿主细胞来自患有(或被怀疑患有)增生性疾病或感染性疾病的对象。
在一些实施方案中，细胞(例如，宿主细胞)是免疫细胞，例如T细胞、B细胞、树突细胞(DC)、粒细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞等。在一些实施方案中，细胞(例如，宿主细胞)是能够分化成免疫细胞的细胞，例如干细胞(SC)或诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，细胞(例如，宿主细胞)是干细胞记忆T细胞，例如，如在通过引用并入的Gattinoni etal.(2017)Nature Medicine 23；18-27中所描述的。
在一些实施方案中，细胞(例如，宿主细胞)是T细胞，例如杀伤T细胞、辅助性T细胞或调节性T细胞。在一些实施方案中，T细胞是杀伤T细胞(例如，CD8+T细胞)。在一些实施方案中，T细胞是辅助性T细胞(例如，CD4+T细胞)。在一些实施方案中，T细胞是活化的T细胞(例如，已经被抗原呈递细胞上的II类MHC分子与肽抗原一起呈递的T细胞)。
在一些实施方案中，T细胞包含表达高亲和力T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗体受体(CAR)的一种或更多种转基因。
在一些方面中，本公开内容涉及以下发现：将本公开内容的一种或更多种经化学修饰的双链核酸分子引入至细胞(例如，获自供体的免疫细胞)以产生宿主细胞，从而导致免疫检查点蛋白(例如，TIGIT、PDCD1等)在宿主细胞中表达或活性的显著降低。在一些实施方案中，宿主细胞的特征在于，相对于不包含经化学修饰的双链核酸分子的细胞(例如，同一细胞类型的免疫细胞)，约5％至约50％降低的免疫检查点蛋白表达。在一些实施方案中，宿主细胞(例如，患有或被怀疑患有增生性疾病或感染性疾病之对象的免疫细胞)的特征在于，相对于不包含经化学修饰的双链核酸分子的细胞(例如，同一细胞类型的免疫细胞)，大于50％(例如，51％、52％、53％、54％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％，或者51％至100％之间的约任何百分比)降低的免疫检查点蛋白表达。
在一些方面中，本公开内容涉及以下发现：将本公开内容的一种或更多种经化学修饰的双链核酸分子(例如，一种或更多种sd-rxRNA)引入至细胞(例如，获自供体的免疫细胞)以产生特征在于以下的宿主细胞：一种或更多种信号转导/转录因子、表观遗传、代谢和/或共抑制/阴性调节蛋白(例如，AKT、p53、PDCD1、TIGIT、Cbl-b、Tet2、Blimp-1、T-Box21、HK2、DNMT3A、PTPN6等)在宿主细胞中表达或活性的显著降低。在一些实施方案中，宿主细胞的特征在于，相对于不包含经化学修饰的双链核酸分子的细胞(例如，同一细胞类型的免疫细胞)，约5％至约50％降低的免疫检查点蛋白表达。在一些实施方案中，宿主细胞(例如，患有或被怀疑患有增生性疾病或感染性疾病之对象的免疫细胞)的特征在于，相对于不包含经化学修饰的双链核酸分子的细胞(例如，同一细胞类型的免疫细胞)，大于50％(例如，51％、52％、53％、54％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％，或者51％至100％之间的任何百分比，包括介于之间的所有值)降低的分化相关靶标(例如信号传导分子、激酶/磷酸酶、转录因子、表观遗传调节剂、代谢和调节靶标)的表达。
在一些实施方案中，宿主细胞还包含靶向另外的分化相关靶标的一种或更多种另外的经化学修饰的双链核酸分子，所述另外的分化相关靶标例如，AKT、p53、PD1、TIGIT、Cbl-b、Tet2、Blimp-1、T-Box21、HK2、DNMT3A、PTPN6，其任意组合等。例如，在一些实施方案中，免疫原性组合物包含经工程化以具有降低的以下分化相关蛋白组合的表达的宿主细胞：
p53和PD1
p53和AKT
PD1和AKT
PD1和AKT和p53
Cbl-b和PD1
Clb-b和AKT
Clb-b和PD1和AKT
或其任意组合。
在一些实施方案中，宿主细胞还包含靶向另外的免疫检查点蛋白的一种或更多种另外的经化学修饰的双链核酸分子，所述另外的免疫检查点蛋白例如CTLA-4、BTLA、KIR、B7-H3、B7-H4、TGFβ2受体等。例如，在一些实施方案中，免疫原性组合物包含经工程化以具有降低的以下免疫检查点蛋白组合的表达的宿主细胞：
CTLA4和PD1
STAT3和p38
PD1和BaxPD1、CTLA4、Lag-1、ILM-3和TP53
PD1和Casp8
PD1和IL10R
PD1和TIGIT。
在一些实施方案中，如本公开内容所述的免疫原性组合物包含多个宿主细胞。在一些实施方案中，多个宿主细胞是每千克约10,000个宿主细胞、每千克约50,000个宿主细胞、每千克约100,000个宿主细胞、每千克约250,000个宿主细胞、每千克约500,000个宿主细胞、每千克约1×106个宿主细胞、每千克约5×106个宿主细胞、每千克约1×107个宿主细胞、每千克约1×108个宿主细胞、每千克约1×109个宿主细胞、或每千克多于1×109个宿主细胞。在一些实施方案中，多个宿主细胞为每千克约1×105个至1×1014个宿主细胞。
在一些方面中，本公开内容提供了用于产生如本公开内容所述的免疫原性组合物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将一种或更多种经化学修饰的双链核酸分子(例如，sd-rxRNA)引入到细胞中，其中所述一种或更多种经化学修饰的双链核酸分子靶向AKT、p53、PDCD1、TIGIT、Cbl-b、Tet2、Blimp-1、T-Box21、DNMT3A、PTPN6或HK2、或其任意组合，从而产生具有特定细胞亚型或T细胞亚型(例如，TSCM或TCM)的宿主细胞。
产生免疫原性组合物(例如，产生宿主细胞或宿主细胞群)的方法可在体外、离体或在体内在例如培养的哺乳动物细胞(例如培养的人细胞)中进行。在一些实施方案中，可在递送试剂例如脂质(例如阳离子脂质)或脂质体的存在下接触靶细胞(例如，获自供体的细胞)以促进经化学修饰的双链核酸分子进入到细胞中，如本公开内容中其他地方进一步详细描述的。
载体和复合剂(Complexing agent)
本公开内容还涉及包含如本文中所述的RNAi构建体以及可药用载体或稀释剂的组合物。在一些方面中，本公开内容涉及包含本文中所述的RNAi构建体以及可药用载体的免疫原性组合物。
本文中使用的“可药用载体”包括合适的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。这样的介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域中公知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则其可用于治疗组合物中。补充活性成分也可并入到组合物中。
例如，在一些实施方案中，可将寡核苷酸并入到脂质体或用聚乙二醇修饰的脂质体中，或者与阳离子脂质混合，用于肠胃外施用。将另外的物质(例如，针对在特定靶细胞上发现的膜蛋白具有反应性的抗体)并入到脂质体中可帮助将寡核苷酸靶向至特定的细胞类型(例如，免疫细胞，例如T细胞)。
包封剂将寡核苷酸截留到囊泡内。在本发明的另一个实施方案中，如本领域技术人员所理解的，寡核苷酸可与载体或载剂(例如，脂质体或胶束)缔合，但是可使用其他载体。脂质体是由脂双层构成的具有类似于生物膜的结构的囊泡。这样的载体可用于促进寡核苷酸的细胞摄取或靶向性，或者改善寡核苷酸的药动学或毒理学特性。
例如，本发明的寡核苷酸也可包封在脂质体、药物组合物中施用，其中活性成分被包含分散在或以不同方式存在于由黏附在脂质层上的水性同心层组成的小体(corpuscle)中。根据溶解性，寡核苷酸可存在于水性层和脂质层二者中，或者存在于通常被称为脂质体悬液的物质中。疏水性层(通常但不排他地)包含：磷脂，例如卵磷脂和鞘磷脂；类固醇，例如胆固醇；或多或少的离子表面活性剂，例如二乙酰基磷酸酯、十八胺或磷脂酸；或者其他疏水性物质。脂质体的直径通常为约15nm至约5微米。
使用脂质体作为药物递送载剂提供了数种优点。脂质体提高胞内稳定性、提高摄取效率并且改善生物活性。脂质体是由脂质构成的中空球状囊泡，所述脂质以类似于构成细胞膜的那些脂质的方式排列。脂质体具有用于截留水溶性化合物的内部水性空间，并且直径尺寸为0.05微米至数微米。数个研究已经表明，脂质体可向细胞递送核酸并且核酸保持生物活性。例如，最初被设计为研究工具的脂质递送载剂，例如Lipofectin或LIPOFECTAMINETM 2000可向细胞递送完整的核酸分子。
使用脂质体的具体优点包括以下：其为非毒性的并且在组成上生物可降解；其表现出长的循环半衰期；并且识别分子可容易地连接到其表面以用于靶向组织。最后，无论是在液体悬液还是在冻干产品中，制备基于脂质体的药物的成本效益已经示出了这种技术作为可接受的药物递送系统的可行性。
在一些方面中，可针对一类天然存在的或者化学合成或经修饰的饱和和不饱和脂肪酸残基选择与本发明相关的制剂。脂肪酸可以以甘油三酯、甘油二酯或独立脂肪酸的形式存在。在另一个实施方案中，可使用目前在药理学中使用的脂肪酸和/或脂肪乳剂的充分确认的混合物用于肠外营养的用途。
基于脂质体的制剂广泛用于寡核苷酸递送。然而，大部分市售脂质或脂质体制剂含有至少一种带正电荷的脂质(阳离子脂质)。这种带正电荷的脂质的存在被认为是获得高寡核苷酸负载度和增强脂质体融合特性所必需的。已经进行和公开了数种方法来鉴定最佳的带正电荷的脂质化学物质。然而，含有阳离子脂质的市售脂质体制剂以高的毒性水平为特征。体内有限的治疗指数已经揭示，在比实现RNA沉默所需浓度稍高的浓度下，含有带正电荷脂质的脂质体制剂与毒性(例如，肝酶升高)相关。
与本发明相关的核酸可以是经疏水性修饰的并且可包含在中性纳米运载体内。中性纳米运载体的进一步描述在通过引用并入的2009年9月22目提交的标题为“NeutralNanotransporters”的PCT申请PCT/US2009/005251中。这样的颗粒使得定量的寡核苷酸能够并入到不带电荷的脂质混合物中。在这样的中性纳米运载体中没有毒性水平的阳离子脂质是重要特征。
如PCT/US2009/005251中示出的，寡核苷酸可有效地并入到不含阳离子脂质的脂质混合物中，并且这样的组合物可以以功能性方式向细胞有效递送治疗性寡核苷酸。例如，当脂质混合物由磷脂酰胆碱碱基脂肪酸和固醇例如胆固醇构成时，观察到高的活性水平。例如，中性脂肪混合物的一种优选制剂由至少20％DOPC或DSPC以及至少20％固醇例如胆固醇构成。发现即使低至1∶5的脂质与寡核苷酸的比对于寡核苷酸在不带电荷的制剂中的完全包封也是足够的。
中性纳米运载体组合物能够将寡核苷酸有效负载到中性脂肪制剂中。所述组合物包含以一定方式修饰的寡核苷酸，以使得分子的疏水性提高(例如，将疏水性分子连接(共价或非共价)至寡核苷酸末端或非末端核苷酸、碱基、糖或骨架上的疏水性分子)，经修饰的寡核苷酸与中性脂肪制剂(例如，含有至少25％胆固醇和25％DOPC或其类似物)混合。货物分子，例如另外的脂质，也可包含在组合物中。这种组合物(其中制剂的一部分被构建到寡核苷酸本身中)能够将寡核苷酸高效包封到中性脂质颗粒中。
在一些方面中，在疏水性寡核苷酸与优选制剂复合后，可形成尺寸为50nm至140nm的稳定颗粒。制剂本身通常不形成小颗粒，而是形成团聚体(agglomerate)，其在添加经疏水性修饰的寡核苷酸后转化成稳定的50至120nm颗粒。
在一些实施方案中，中性纳米运载体组合物包含经疏水性修饰的多核苷酸、中性脂肪混合物和任选的货物分子。本文中使用的“经疏水性修饰的多核苷酸”是具有至少一个修饰的本发明的多核苷酸(例如，sd-rxRNA)，所述修饰使多核苷酸比修饰前的多核苷酸疏水性更高。可通过向多核苷酸连接(共价或非共价连接)疏水性分子来实现修饰。在一些情况下，疏水性分子是或包含亲脂性基团。
术语“亲脂性基团”意指对于脂质的亲和力比其对于水的亲和力更高的基团。亲脂性基团的一些实例包括但不限于：胆固醇、胆甾烯基或经修饰的胆甾烯基残基、金刚烷(adamantine)、双氢睾酮(dihydrotesterone)、长链烷基、长链烯基、长链炔基、油烯基-石胆酸(olely-lithocholic)、胆烯基(cholenic)、油酰基-胆烯基、棕榈基、十七基、肉豆蔻基、胆汁酸、胆酸或牛黄胆酸、脱氧胆酸盐、油烯基石胆酸、油酰基胆烯酸、糖脂、磷脂、鞘脂、类异戊二烯(例如类固醇)、维生素(例如维生素E)、饱和或不饱和脂肪酸、脂肪酸酯(例如甘油三酯)、芘、卟啉、得克萨卟啉(Texaphyrine)、金刚烷、吖啶、生物素、香豆素、荧光素、罗丹明、德克萨斯红(Texas-Red)、洋地黄毒苷、二甲氧基三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、花青染料(例如，Cy3或Cy5)、Hoechst33258染料、补骨脂素或布洛芬。胆固醇部分可以是还原的(例如，在胆甾烷中)或可以是取代的(例如，通过卤素)。一个分子中不同亲脂性基团的组合也是可能的。
疏水性分子可连接在多核苷酸的多个位置处。如上所述的，疏水性分子可与寡核苷酸的末端残基(例如多核苷酸的3’端或5’端)连接。或者，其可与多核苷酸的内部核苷酸或支链上的核苷酸连接。疏水性分子可与例如核苷酸的2’位置连接。疏水性分子也可与多核苷酸的核苷酸的杂环碱基、糖或骨架连接。
疏水性分子可通过接头部分与多核苷酸连接。任选地，接头部分是非核苷酸接头部分。非核苷酸接头是例如无碱基残基(dSpacer)；寡聚乙二醇(oligoethyleneglycol)，例如三乙二醇(间隔物9)或六乙二醇(间隔物18)；或烷烃二醇，例如丁二醇。间隔物单元优选地通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键连接。接头单元可在分子中仅出现一次，或者可并入数次，例如通过磷酸二酯、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯或酰胺键联。
通常缀合方案涉及在序列的一个或更多个位置处带有氨基接头的多核苷酸的合成，然而接头不是必须的。然后使用合适的偶联剂或激活剂使氨基与缀合的分子反应。缀合反应可在多核苷酸依然与固相支持物结合的情况下或者在溶液相中切割多核苷酸之后进行。通常通过HPLC纯化经修饰的多核苷酸，得到纯的物质。
在一些实施方案中，疏水性分子是固醇型缀合物、植物固醇(PhytoSterol)缀合物、胆固醇缀合物、具有改变的侧链长度的固醇型缀合物、脂肪酸缀合物、任何其他疏水性基团缀合物、和/或内部核苷的疏水性修饰，其提供足够的疏水性以并入到胶束中。
出于本发明的目的，术语“固醇”是指或类固醇醇类(steroid alcohols)是在A环的3位处具有羟基的类固醇亚组。其为通过HMG-CoA还原酶途径由乙酰辅酶A合成的两亲性脂质。整体分子是相当平的。A环上的羟基是极性的。脂族链的其余部分是非极性的。通常来说，固醇被认为在17位处具有8碳链。
出于本发明的目的，术语“固醇型分子”是指在结构上与固醇类似的类固醇醇类。主要差异是环的结构和21位连接的侧链中碳的数目。
出于本发明的目的，术语“植物固醇”(也称为植物甾醇)是植物中天然存在的一组类固醇醇类(植物化学物质)。有超过200种不同的已知植物固醇。
出于本发明的目的，术语“固醇侧链”是指连接在固醇型分子的17位处的侧链的化学组成。在标准定义中，固醇限于在17位处携带8碳链的4环结构。在本发明中，描述了具有比常规侧链更长和更短的侧链的固醇型分子。侧链可以是支链的或者包含双骨架。
因此，可用于本发明的固醇例如包括胆固醇，以及其中17位连接有2至7个碳或比9个碳更长的侧链的独特固醇。在一个具体实施方案中，聚碳尾部的长度为5至9个碳不等。这样的缀合物可具有显著更好的体内效力，特别是向肝递送。与和常规胆固醇缀合的寡核苷酸相比，预期这些分子类型以低5至9倍的浓度工作。
或者，多核苷酸可与作为疏水性分子的蛋白质、肽或带正电荷的化学物质结合。蛋白质可选自鱼精蛋白(protamine)、dsRNA结合结构域和富含精氨酸的肽。一些示例性的带正电荷的化学物质包括精氨、亚精胺、尸胺(cadaverine)和腐胺(putrescine)。
在另一个实施方案中，当疏水性分子缀合物与多核苷酸的最佳化学修饰模式(如本文中详细描述的)组合时，其可表现出甚至更高的效力，所述化学修饰包括但不限于疏水性修饰、硫代磷酸酯修饰和2’核糖修饰。
在另一个实施方案中，固醇型分子可以是天然存在的植物固醇。聚碳链可以是长于9个碳的，并且可以是直链的、支链的和/或含有双键。在向多种组织递送多核苷酸时，一些含有植物固醇的多核苷酸缀合物可显著更强效且更有活性。一些植物固醇可表现出组织偏向性，并因此用作向特定组织特异性递送RNAi的方法。
将疏水性修饰的多核苷酸与天然脂肪混合物混合以形成胶束。中性脂肪酸混合物是在生理pH下或生理pH附近为净中性或稍微带净负电荷的脂肪的混合物，其可与疏水性修饰的多核苷酸形成胶束。出于本发明的目的，术语“胶束”是指由不带电荷的脂肪酸与磷脂的混合物形成的小纳米粒。中性脂肪混合物可包含阳离子脂质，只要其以不引起毒性的量存在即可。在一些优选实施方案中，中性脂肪混合物不含阳离子脂质。不含阳离子脂质的混合物是其中小于1％、并且优选0％的总脂质为阳离子脂质的混合物。术语“阳离子脂质”包括在生理pH下或生理pH附近具有净正电荷的脂质和合成脂质。术语“阴离子脂质”包括在生理pH下或生理pH附近具有净负电荷的脂质和合成脂质。
中性脂肪通过强的但是非共价吸引力(例如，静电力、范德华力、π-堆叠等相互作用)与本发明寡核苷酸结合。
中性脂肪混合物可包括选自一类天然存在或化学合成或经修饰的饱和和不饱和脂肪酸残基的制剂。脂肪酸可以以甘油三酯、甘油二酯或独立脂肪酸的形式存在。在另一个实施方案中，可使用目前在药理学中使用的脂肪酸和/或脂肪乳剂的充分确认的混合物用于肠外营养的用途。
中性脂肪混合物优选为基于胆碱的脂肪酸和固醇的混合物。基于胆碱的脂肪酸包括例如合成的磷酸胆碱衍生物，例如DDPC、DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、POPC和DEPC。DOPC(化学品注册号4235-95-4)是二油酰基磷脂酰胆碱(也称为二反油酰基磷脂酰胆碱(dielaidoylphosphatidylcholine)、二油酰基-PC、二油酰基磷酸胆碱、二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、二油烯基磷脂酰胆碱)。DSPC(化学品注册号816-94-4)是二硬脂酰基磷脂酰胆碱(也称为1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)。
中性脂肪混合物中的固醇可以是例如胆固醇。中性脂肪混合物可完全由基于胆碱的脂肪酸和固醇构成，或者其可任选地包含货物分子。例如，中性脂肪混合物可具有至少20％或25％脂肪酸以及20％或25％固醇。
出于本发明的目的，术语“脂肪酸”涉及脂肪酸的常规描述。其可作为独立实体或者以甘油二酯和甘油三酯的形式存在。出于本发明的目的，术语“脂肪乳剂”是指向不能在其饮食中获得足够脂肪的对象皮下施用的安全的脂肪制剂。其为大豆油(或其他天然存在的油)和卵磷脂的乳剂。脂肪乳剂被用于一些不溶性麻醉剂的制剂。在本公开内容中，脂肪乳剂可以是市售制剂(例如英脱利匹特(Intralipid)、Liposyn(乐补欣)、Nutrilipid)、经修饰的市售制剂的一部分，其中其富含特定脂肪酸，或者是脂肪酸和磷脂的完全从头配制的组合。
在一个实施方案中，使待与本发明的寡核苷酸组合物接触的细胞与包含寡核苷酸的混合物和包含脂质(例如，上文所述脂质或脂质组合物之一)的混合物接触持续约12小时至约24小时。在另一个实施方案中，使待与寡核苷酸组合物接触的细胞与包含寡核苷酸的混合物和包含脂质(例如，上文所述脂质或脂质组合物之一)的混合物接触持续约1天至约五天。在一个实施方案中，使细胞与包含脂质和寡核苷酸的混合物接触持续约三天至长至约30天。在另一个实施方案中，使包含脂质的混合物与细胞保持接触持续至少约五天至约20天。在另一个实施方案中，使包含脂质的混合物与细胞保持接触持续至少约七天至约15天。
制剂的50％至60％可任选地是任何其他脂质或分子。这样的脂质或分子在本文中称作载货脂质(cargo lipid)或货物分子。货物分子包括但不限于英脱利匹特、小分子、融合肽或脂质或者可添加以改变细胞摄取、内体释放或组织分布特性的其他小分子。耐受货物分子的能力对于调节这些颗粒的特性很重要，如果期望这样的特性的话。例如，一些组织特异性代谢物的存在可彻底改变组织分布谱。例如，富含不同饱和度的较短或较长脂肪链的英脱利匹特型制剂的使用影响这些制剂类型的组织分布谱(及其负载)。
根据本发明有用的载货脂质的一个实例是融合脂质(fusogenic lipid)。例如，两性离子型脂质DOPE(化学品注册号4004-5-1，1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)是一个优选的载货脂质。
英脱利匹特可由以下组成构成：1000mL含有：纯化大豆油90g，纯化卵磷脂12g，无水甘油22g，注射用水适量加至1000mL。用氢氧化钠将pH调节至约8的pH。能量含量/L：4.6MJ(190kcal)。重量摩尔渗透压浓度(约)：300mOsm/kg水。在另一个实施方案中，脂肪乳剂是乐补欣，其含有注射用水中的5％红花油、5％大豆油、作为乳化剂添加的至多1.2％卵磷脂，以及2.5％甘油。其还可包含氢氧化钠用于pH调节。pH 8.0(6.0至9.0)。乐补欣的渗量(osmolarity)为276m Osmol/升(实际)。
载货脂质的特性(identity)、量和比例的不同影响这些化合物的细胞摄取和组织分布特性。例如，脂质尾部的长度和饱和度水平将影响肝、肺、脂肪和心肌细胞中的差异摄取。添加特定的疏水性分子例如维生素或不同形式的固醇可有利于分布到参与特定化合物的代谢的特定组织。在一些实施方案中，使用维生素A或E。在不同寡核苷酸浓度下形成复合物，浓度越高越有利于高效的复合物形成。
在另一个实施方案中，脂肪乳剂基于脂质的混合物。这样的脂质可包括天然化合物、化学合成的化合物、纯化的脂肪酸或者任何其他脂质。在另一个实施方案中，脂肪乳剂的组合物是完全人造的。在一个特定实施方案中，脂肪乳剂是多于70％亚油酸的。在另一个特定实施方案中，脂肪乳剂的至少1％是心磷脂。亚油酸(linoleic acid，LA)是不饱和的ω-6脂肪酸。其为由具有18碳的链和两个顺式双键的羧酸制造的无色流体。
在本发明的另一个实施方案中，脂肪乳剂的组成的改变用作改变经疏水性修饰的多核苷酸的组织分布的方法。这种方法提供了多核苷酸向特定组织的特异性递送。
在另一个实施方案中，货物分子的脂肪乳剂包含超过70％的亚油酸(C18H32O2)和/或心磷脂。
脂肪乳剂(例如英脱利匹特)之前已经用作一些非水溶性药物的递送制剂(例如，丙泊酚(Propofol)，复配(re-formulated)为得普利麻(Diprivan))。本发明的独特特征包括(a)将经修饰多核苷酸与疏水性化合物组合的理念，因此其可并入到脂肪胶束中，以及(b)将其与脂肪乳剂混合以提供可逆载体。在注射到血流中之后，胶束通常与血清蛋白质(包括白蛋白、HDL、LDL等)结合。这种结合是可逆的并且最终脂肪被细胞吸收。然后将作为胶束的一部分并入的多核苷酸紧密递送到细胞表面，在这之后，可通过不同机制发生细胞摄取，所述机制包括但不限于固醇型递送。
复合剂与本发明寡核苷酸通过强的非共价吸引力(例如，静电力、范德华力、π-堆叠等相互作用)结合。在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸可与复合剂复合以提高寡核苷酸的细胞摄取。复合剂的一个实例包括阳离子脂质。阳离子脂质可用于向细胞递送寡核苷酸。然而，如上文所讨论的，不含阳离子脂质的制剂在一些实施方案中是优选的。
术语“阳离子脂质”包括具有极性和非极性结构域的脂质和合成脂质，其能够在生理pH下或生理pH附近带正电荷，与聚阴离子(例如核酸)结合并且促进将核酸递送至细胞中。通常来说，阳离子脂质包括饱和和不饱和烷基醚和脂环族醚以及胺、酰胺的酯，或其衍生物。阳离子脂质的直链和支链烷基和烯基可包含例如1至约25个碳原子。优选的直链或支链烷基或烯基具有6个或更多个碳原子。脂环族基团包括胆固醇和其他类固醇基团。阳离子脂质可利用多种抗衡离子(阴离子)制备，所述抗衡离子(阴离子)包括例如Cl-、Br-、I-、F-、乙酸根、三氟乙酸根、硫酸根、亚硝酸根和硝酸根。
阳离子脂质的一些实例包括聚乙烯亚胺、聚酰胺基胺(polyamidoamine，PAMAM)星放射状树枝状分子、Lipofectin(DOTMA和DOPE的组合)、Lipofectase、LIPOFECTAMINETM(例如，LIPOFECTAMINETM 2000)、DOPE、Cytofectin(Gilead Sciences，Foster City，Calif.)和Eufectins(JBL，San Luis Obispo，Calif.)。一些示例性阳离子脂质体可由N-[1-(2，3-二油酰氧基)-丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N-[1-(2，3-二油酰氧基)-丙基]-N，N，N-三甲基胺硫酸甲酯(DOTAP)、3β-[N-(N’，N’-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、2，3，-二油酰氧基-N-[2(精胺羧酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐(DOSPA)、1，2-二肉豆蔻酰基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵；以及二甲基双十八烷基溴化铵(dimethyldioctadecylammonium bromide，DDAB)。发现例如阳离子脂质N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基三甲基氯化铵(DOTMA)使硫代磷酸酯寡核苷酸的反义作用提高1000倍(Vlassov et al.，1994，Biochimica et BiophysicaActa 1197：95-108)。寡核苷酸还可与例如聚(L-赖氨酸)或抗生素蛋白复合，并且这种混合物中可包含或可不包含脂质，例如甾醇基-聚(L-赖氨酸)。
阳离子脂质已经在本领域中用于向细胞递送寡核苷酸(参见，例如美国专利No.5,855,910；5,851,548；5,830,430；5,780,053；5,767,099；Lewis etal.1996.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：3176；Hope et al.1998.Molecular MembraneBiology 15∶1)。可用于促进本发明寡核苷酸摄取的其他脂质组合物可结合要求保护的方法使用。除了上文列出的那些外，其他脂质组合物也是本领域中已知的，并且包括例如以下专利中教导的那些：美国专利No.4,235,871；美国专利No.4,501,728；4,837,028；4,737,323。
在一个实施方案中，脂质组合物还可包含物质(例如，病毒蛋白质)以增强脂质介导的寡核苷酸转染(Kamata，et al.，1994.Nucl.Acids.Res.22：536)。在另一个实施方案中，使作为包含寡核苷酸、肽和脂质的组合物的一部分的寡核苷酸与细胞接触，如例如美国专利5,736,392中所教导的。已经描述了具有血清抗性的经改良脂质(Lewis，et al.，1996.Proc.Natl.Acad.Sci.93：3176)。阳离子脂质和其他复合剂用于提高通过内吞作用被携带进入到细胞中的寡核苷酸的数目。
在另一个实施方案中，N取代的甘氨酸寡核苷酸(拟肽)可用于优化寡核苷酸的摄取。拟肽已经被用于产生用于转染的阳离子脂质样化合物(Murphy，et al.，1998.Proc.Natl.Acad.Sci.95：1517)。拟肽可使用标准方法合成(例如，Zuckermann，R.N.，et al.1992.J.Am.Chem.Soc.114：10646；Zuckermann，R.N.，et al.1992.Int.J.PeptideProtein Res.40：497)。阳离子脂质和拟肽的组合(liptoid)也可用于优化本发明寡核苷酸的摄取(Hunag，et al.，1998.Chemistry andBiology.5：345)。Liptoid可通过阐述拟肽寡核苷酸并且将氨基末端亚单体通过其氨基与脂质偶联来合成(Hunag，et al.，1998.Chemistry and Biology.5：345)。
本领域中已知带正电荷的氨基酸可用于产生高活性阳离子脂质(Lewis et al.1996.Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.93：3176)。在一个实施方案中，用于递送本发明寡核苷酸的组合物包含与亲脂性部分连接的多个精氨酸、赖氨酸、组氨酸或鸟氨酸残基(参见，例如美国专利No.5,777,153)。
在另一个实施方案中，用于递送本发明寡核苷酸的组合物包含具有约一至约四个碱性残基的肽。这些碱性残基可负载在例如肽的氨基末端、C端或内部区域上。本领域中定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如，甘氨酸(也可认为是非极性的)、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分枝侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。除了碱性氨基酸以外，肽的大部分或全部其他残基可以选自非碱性氨基酸，例如除赖氨酸、精氨酸或组氨酸以外的氨基酸。优选地，主要使用具有长中性侧链的中性氨基酸。
在一个实施方案中，用于递送本发明寡核苷酸的组合物包含具有一个或更多个γ羧基谷氨酸残基或γ-Gla残基的天然或合成多肽。这些γ羧基谷氨酸残基能够使多肽彼此结合并且与膜表面结合。换言之，具有一系列γ-Gla的多肽可用作通用递送形式，其帮助RNAi构建体黏附在RNAi构建体将接触的无论什么样的膜上。这可至少减慢RNAi构建体从血流中的清除，并且提高其向靶标归巢(homing)的机会。
γ羧基谷氨酸残基可存在于天然蛋白质中(例如，凝血酶原具有10个γ-Gla残基)。或者，可使用例如维生素K依赖性羧化酶通过羧化将γ羧基谷氨酸残基引入到纯化的、重组产生的或化学合成的多肽中。γ羧基谷氨酸残基可以是连续的或不连续，可调节/微调多肽中这样的γ羧基谷氨酸残基的总数和位置以取得不同的多肽“黏性”水平。
在一个实施方案中，使待与本发明的寡核苷酸组合物接触的细胞与包含寡核苷酸的混合物和包含脂质(例如，上文所述脂质或脂质组合物之一)的混合物接触持续约12小时至约24小时。在另一个实施方案中，使待与寡核苷酸组合物接触的细胞与包含寡核苷酸的混合物和包含脂质(例如，上文所述脂质或脂质组合物之一)的混合物接触持续约1天至约五天。在一个实施方案中，使细胞与包含脂质和寡核苷酸的混合物接触持续约三天至长至约30天。在另一个实施方案中，使包含脂质的混合物与细胞保持接触持续至少约五天至约20天。在另一个实施方案中，使包含脂质的混合物与细胞保持接触持续至少约七天至约15天。
例如，在一个实施方案中，在脂质(例如细胞转染剂(cytofectin)CS或GSV(购自Glen Research；Sterling，Va.)、GS3815、GS2888)的存在下，寡核苷酸组合物可与细胞接触持续本文中所述的延长的孵育时间。
在一个实施方案中，用包含脂质和寡核苷酸组合物的混合物孵育细胞不降低细胞的生存力。优选地，在转染期之后，细胞基本是活的。在一个实施方案中，在转染之后，至少约70％至至少约100％的细胞是活的。在另一个实施方案中，至少约80％至至少约95％的细胞是活的。在另一个实施方案中，至少约85％至至少约90％的细胞是活的。
在一个实施方案中，通过连接向细胞中转运寡核苷酸的肽序列(在本文中称为“转运肽”)来对寡核苷酸进行修饰。在一个实施方案中，组合物包含与编码蛋白质的靶核酸分子互补的并且共价连接转运肽的寡核苷酸。
专用语“转运肽”包含有利于向细胞中转运寡核苷酸的氨基酸序列。有利于向细胞中转运其连接的部分的示例性肽是本领域中已知的，并且包括例如HIV TAT转录因子、乳铁蛋白、疱疹VP22蛋白和成纤维细胞生长因子2(Pooga et al.1998.NatureBiotechnology.16：857；以及Derossi et al.1998.Trends in Cell Biology.8：84；Elliott and O′Hare.1997.Cell 88：223)。
可使用已知技术使寡核苷酸与转运肽连接，例如(Prochiantz，A.1996.Curr.Opin.Neurobiol.6：629；Derossi et al.1998.Trends Cell Biol.8：84；Troy et al.1996.J.Neurosci.16：253，Vives et al.1997.J.Biol.Chem.272：16010)。例如，在一个实施方案中，带有激活的巯基的寡核苷酸通过该巯基与转运肽中存在的半胱氨酸连接(例如，与触角足同源结构域的第二与第三螺旋之间的β转角中存在的半胱氨酸连接，如在例如Derossi et al.1998.Trends Cell Biol.8：84；Prochiantz.1996.CurrentOpinion in Neurobiol.6：629；Allinquant et al.1995.J Cell Biol.128：919中所教导的)。在另一个实施方案中，Boc-Cys-(Npys)OH基团可与转运肽偶联作为最后的(N端)氨基酸，并且具有SH基团的寡核苷酸可与肽偶联(Troy et al.1996.J.Neurosci.16：253)。
在一个实施方案中，连接基团可与核苷酸单体连接，并且转运肽可与接头共价连接。在一个实施方案中，接头可用作转运肽的连接位点并且可提供针对核酸酶的稳定性。合适的接头的一些实例包括经取代的或未经取代的C1-C20烷基链、C2-C20烯基链、C2-C20炔基链、肽和杂原子(例如，S、O、NH等)。其他示例性接头包括双官能交联剂，例如磺基琥珀酰亚胺基-4-(马来酰亚胺基苯基)-丁酸酯(SMPB)(参见，例如Smith et al.Biochem J1991.276：417-2)。
在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸作为分子缀合物合成，所述分子缀合物使用受体介导的内吞机制将基因递送到细胞中(参见，例如Bunnell et al.1992.SomaticCell and Molecular Genetics.18：559，以及其中引用的参考文献)。
用于RNAi试剂的体外和/或体内递送的另一些载体是本领域中已知的，并且可用于递送本发明RNAi构建体(例如，递送至宿主细胞，例如T细胞)。参见，例如美国专利申请公开20080152661、20080112916、20080107694、20080038296、20070231392、20060240093、20060178327、20060008910、20050265957、20050064595、20050042227、20050037496、20050026286、20040162235、20040072785、20040063654、20030157030、WO 2008/036825、WO04/065601和AU2004206255B2，仅列出一些(均通过引用并入)。
治疗方法
在一些方面中，本公开内容提供了通过向对象(例如，患有或被怀疑患有增生性疾病或感染性疾病的对象)施用如本公开内容所述的免疫原性组合物(例如，包含特定细胞亚型或T细胞亚型的一种或更多种宿主细胞的免疫原性组合物)来治疗增生性疾病或感染性疾病的方法。在一些实施方案中，如本文中所述的免疫原性组合物的特征在于：免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、抗原呈递细胞(APC)、树突细胞(DC)、干细胞(SC)、诱导多能干细胞(iPSC)等)群具有与控制T细胞分化过程相关的一种或更多种基因(例如，AKT、p53、PD1、TIGIT、Cbl-b、Tet2、Blimp-1、T-Box21、HK2、DNMT3A、PTPN6等)的降低(例如，抑制)的表达或活性。不希望受到任何特定理论的限制，在一些实施方案中，本文中所述的免疫原性组合物的特征在于降低的免疫检查点蛋白表达，并且因此可用于刺激患有某些增生性疾病或感染性疾病之对象的免疫系统，所述疾病的特征在于提高的免疫检查点蛋白表达。
本文中使用的“增生性疾病”是指特征在于细胞的过度增殖和细胞基质的过度更新(turnover)的疾病和病症，包括癌症、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、银屑病、特发性肺纤维化、硬皮病、肝硬化等。癌症的一些实例包括但不限于小细胞肺癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、黑素瘤、骨癌(例如，骨肉瘤等)、血液系统恶性肿瘤，例如慢性髓性白血病(chronic myeloid leukemia，CML)等。
本文中使用的术语“感染性疾病”是指由对象受病原体感染引起的疾病和病症。人病原体的一些实例包括但不限于某些细菌(例如，大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌(Salmonella)的某些菌株等)、病毒(HIV、HCV、流感等)、寄生虫(原生动物、蠕虫、变形虫等)、酵母菌(例如，某些念珠菌(Candida)物种等)和真菌(例如，某些曲霉菌(Aspergillus)物种)。
对象的一些实例包括哺乳动物，例如人和其他灵长类动物；牛、猪、马和农业(农用)动物；狗、猫和其他家养宠物；小鼠、大鼠和转基因的非人动物。
在一些实施方案中，通过过继细胞转移(ACT)治疗方法将如本公开内容所述的免疫原性组合物施用于对象。ACT模式的一些实例包括但不限于自体细胞治疗(例如，取出对象自身的细胞，将其进行遗传修饰并返回至对象)和异源细胞治疗(例如，细胞从供体取出，进行遗传修饰，并置于接受者体内)。在一些实施方案中，可对在ACT治疗方法中使用的细胞进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体是经工程化的T细胞受体，其基于所选择的抗体部分显示出针对靶抗原的特异性。因此，在一些实施方案中，出于ACT治疗的目的，可使用本文中所述的方法用经化学修饰的双链核酸转染CAR T细胞(例如CART)。
对于体内应用，本发明的制剂可以以适合于所选施用途径(例如，肠胃外、经口或腹膜内施用)的多种形式向患者施用。优选的肠胃外施用包括通过以下途径施用：静脉内；肌内；间隙内(interstitially)；动脉内；皮下；眼内；滑膜内；经上皮(trans epithelial)，包括经皮(transdermal)；通过吸入的经肺部；眼部；舌下和经颊；表面，包括眼部；经皮肤；经眼；经直肠；以及通过吹入法的鼻吸入。
用于肠胃外施用的药物制剂包括水溶性或水分散性形式的活性化合物的水溶液。另外，可施用作为合适的油性注射混悬剂的活性化合物的混悬液。合适的亲脂性溶剂或载剂包括脂肪油(例如，芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如，油酸乙酯或甘油三酯)。水性注射混悬剂可包含提高混悬剂的黏度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或右旋糖酐，任选地，混悬剂还可包含稳定剂。本发明的寡核苷酸可配制在液体溶液中，优选地在生理相容性缓冲液(例如Hank’s溶液或林格液)中。另外，寡核苷酸可配制成固体形式，并且在临使用前再溶解或悬浮。冻干形式也包含在本发明内。
可选择药物递送载剂，例如用于体外施用、用于全身施用。这些载剂可设计成作为缓释储库或将其内容物直接递送到靶细胞。使用一些直接递送药物载剂的优点是每次摄取递送多个分子。已经表明这样的载剂提高药物的循环半衰期，否则的话所述药物将会被迅速从血流中清除。落入该分类中的这样的专用药物递送载剂的一些实例是脂质体、水凝胶、环糊精、生物可降解的纳米胶囊和生物黏附微球。
施用本发明寡核苷酸的有效量被定义为在取得期望结果必需的剂量和时间段方面有效的量。例如，寡核苷酸的有效量可根据以下因素变化，例如细胞类型；所使用的以及用于体内应用的寡核苷酸；个体的疾病状态、年龄、性别和体重；以及寡核苷酸在个体中引起期望应答的能力。细胞内寡核苷酸的治疗水平的确立取决于摄取速率和流出或降解速率。降解程度的降低延长了寡核苷酸的胞内半衰期。因此，经化学修饰的寡核苷酸(例如，具有磷酸酯骨架修饰)可能需要不同的给药。
免疫原性组合物的精确剂量和施用的剂量数目取决于通过实验和在临床试验中产生的数据。数种因素例如期望的效果、递送载剂、疾病指征和施用途径将影响剂量。本领域普通技术人员可容易地确定剂量并且将其配制成本发明药物组合物。优选地，治疗的持续时间将延伸至少贯穿疾病症状的进程。
可调节给药方案以提供最佳治疗响应。例如，免疫原性组合物可重复施用，例如如治疗情况的紧急状态所指示的，每天施用若干剂量或者按比例降低剂量。无论是向细胞还是向对象施用本发明经化学修饰的双链核酸分子或免疫原性组合物，本领域普通技术人员将能够容易地确定其施用的合适剂量和方案。
可通过测试给药方案来优化免疫原性组合物的施用，例如通过皮内注射或皮下递送。在一些实施方案中，单次施用是足够的。为了进一步延长所施用的免疫原性组合物的作用，如本领域普通技术人员所熟悉的，可在缓释制剂或装置中施用组合物。
在另一些实施方案中，多次施用经化学修饰的双链核酸分子或免疫原性组合物。在一些情况下，以如下频率施用：每天、每周两次、每周、每两周、每三周、每月、每两个月、每三个月、每四个月、每五个月、每六个月或者比每六个月更低的频率。在一些情况下，其每天多次、每周多次、每月多次和/或每年多次施用。例如，其可约每小时、每2小时、每3小时、每4小时、每5小时、每6小时、每7小时、每8小时、每9小时、每10小时、每12小时或每超过12小时施用。其可每天施用1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或多于10次。
本发明的一些方面涉及向对象施用免疫原性组合物。在一些情况下，对象是患者，并且施用免疫原性组合物涉及在医生办公室施用组合物。
在一些实施方案中，同时施用多于一种免疫原性组合物。例如，可施用包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或多于10种不同组合物的组合物。在某些实施方案中，组合物包含2或3种不同的免疫原性组合物。
在一些实施方案中，将一种或更多种抗癌剂与一种或更多种如本公开内容所述的免疫原性组合物组合施用于对象。“抗癌剂”可以是小分子、核酸、蛋白质、肽、多肽(例如，抗体、抗体片段等)或前述物质的任意组合。在一些实施方案中，在施用免疫原性组合物之前将抗癌剂施用于对象。在一些实施方案中，在施用免疫原性组合物之后将抗癌剂施用于对象。在一些实施方案中，抗癌剂与免疫原性组合物同时(例如，在与其相同的时间处)施用。
抗癌剂的一些实例包括但不限于：Abitrexate(甲氨蝶呤)、Abraxane(紫杉醇白蛋白稳定的纳米粒制剂)、曲妥珠单抗-美坦新偶联物(Ado-Trastuzumab Emtansine)、阿霉素PFS(盐酸多柔比星)、阿霉素RDF(盐酸多柔比星)、Adrucil(氟尿嘧啶)、飞尼妥(Afinitor)(依维莫司)、阿那曲唑、阿可达(Aredia)(帕米膦酸二钠)、瑞宁得(Arimidex)(阿那曲唑)、阿诺新(Aromasin)(依西美坦)、卡培他滨Clafen(环磷酰胺)、环磷酰胺、Cytoxan(Cytoxan)(环磷酰胺)、多西他塞、盐酸多柔比星、Efudex(氟尿嘧啶)、Ellence(盐酸表柔比星)、盐酸表柔比星、依维莫司、依西美坦、法乐通(Fareston)(托瑞米芬)、法洛德(Faslodex)(氟维司群)、弗隆(Femara)(来曲唑)、Fluoroplex(氟尿嘧啶)、氟尿嘧啶、FoleX(甲氨蝶呤)、FolexPFS(甲氨蝶呤)、氟维司群、盐酸吉西他滨、健择(Gemzar)(盐酸吉西他滨)、乙酸戈舍瑞林、赫赛汀(Herceptin)(曲妥珠单抗)、伊沙匹隆、Ixempra(伊沙匹隆)、Kadcyla(曲妥珠单抗-美坦新偶联物)、二甲苯磺酸拉帕替尼、来曲唑、梅格施(Megace)(乙酸甲地孕酮)、乙酸甲地孕酮、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤LPF(甲氨蝶呤)、Mexate(甲氨蝶呤)、Mexate-AQ(甲氨蝶呤)、Neosar(环磷酰胺)、诺瓦得士(Nolvadex)(柠檬酸他莫昔芬)、Nolvadex(柠檬酸他莫昔芬)、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定的纳米粒制剂、帕米膦酸二钠、Perjeta(帕妥珠单抗)、帕妥珠单抗、柠檬酸他莫昔芬、紫杉酚(紫杉醇)、泰素帝(Taxotere)(多西他塞)、曲妥珠单抗、托瑞米芬、泰立沙(Tykerb)(二甲苯磺酸拉帕替尼)、希罗达(Xeloda)(卡培他滨)和诺雷德(Zoladex)(乙酸戈舍瑞林)。
自递送RNAi免疫治疗剂
如美国专利公开No.US 2016/0304873(其全部内容通过引用并入本文)中所描述的，通过用特定的sd-rxRNA试剂处理细胞来产生免疫治疗剂，所述sd-rxRNA试剂被设计成靶向并敲低参与免疫抑制机制的特定基因。具体地，表1中示出的以下细胞和细胞系已用sd-rxRNA成功地处理，并且在特定的人细胞中显示出敲低至少70％的靶基因表达。
这些研究示出了这些免疫原性试剂在通常对转染具有极大抗性的细胞中抑制靶基因表达的效用，并且表明所述试剂能够在任何细胞类型中降低靶细胞表达。
由于参与免疫抑制机制和/或控制T细胞分化，许多人基因被选为候选靶基因，包括BAX、BAK1、CASP8、ADORA2A、CTLA4、LAG3、TGFBR1、HAVCR2、CCL17、CCL22、DLL2、FASLG、CD274、IDO1、IL10RA、JAG1、JAG2、MAPK14、PDCD1、SOCS1、STAT3、TNFA1P3、TNFSF4、TYRO2、DNMT3A、PTPN6等。
表1
Figure BPA0000286473200000851
由于参与免疫抑制机制，许多人基因被选为候选靶基因，包括表2中列出的基因(括号中示出了GenBank登录号)：
表2
Figure BPA0000286473200000852
使用专有算法分析上表2中列出的每个基因，以鉴定每个基因的优选sd-rxRNA靶向序列和靶区域，以阻止抗原呈递细胞和T细胞的免疫抑制。表3中示出了PDCD1靶序列的一些非限制性实例。表4中示出了Cb1-b靶序列的一些非限制性实例。
表3
Figure BPA0000286473200000861
Figure BPA0000286473200000862
表4
Figure BPA0000286473200000871
出于本发明的目的，范围可在本文中表示为从“约”一个特定值，和/或至“约”另一特定值。当表达这样的范围时，另一实施方案包括从一个特定值和/或至另一特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，将理解，特定值形成另一实施方案。还将理解，每个范围的端点相对于另一端点并且独立于另一端点都是重要的。
此外，出于本发明的目的，没有数量词修饰的术语是指该实体的一个/种或更多个/种；例如，“蛋白质”或“核酸分子”是指这些化合物中的一种或更多种或者至少一种化合物。因此，没有数量词修饰的术语、“一个/种或更多个/种”和“至少一个/种”在本文中可互换使用。还应注意，术语“包含”、“包括”和“具有”可互换使用。此外，“选自以下的”化合物是指以下列表中的一种或更多种化合物，包括两种或更多种化合物的混合物(即，组合)。
根据本发明，分离的或生物学上纯的蛋白质或核酸分子是已经从其天然环境中取出的化合物。因此，“分离的”和“生物学上纯的”不一定反映化合物已纯化的程度。本发明的分离的化合物可从其天然来源获得，可使用分子生物学技术产生或者可通过化学合成产生。
通过以下实施例进一步说明本文中所述的组合物和方法，所述实施例绝不应被解释为进一步的限制。贯穿本申请引用的所有参考文献(包括文献参考、授权的专利、公开的专利申请和共同待决的专利申请)的全部内容在此明确地通过引用并入。
实施例
实施例1：sd-rxRNA的工程化和测试
使用专有算法分析表1中列出的基因，以鉴定优选的sd-rxRNA靶向序列和靶区域。表3、表4、表6和表8中示出了PDCD1和Cbl-b靶序列和/或sd-rxRNA序列的一些非限制性实例。用于分析编码AKT、Tet2、B1imp-1、T-Box21、PTPN6和HK2的基因的代表性序列示于表7和9至13中。
实施例2：靶向TIGIT的自递送RNAi免疫治疗剂
使用专有算法分析编码TIGIT的基因(NCBI GenBank登录号NM_173799)，以鉴定优选的sd-rxRNA靶向序列和靶区域，以阻止抗原呈递细胞和T细胞的免疫抑制。TIGIT的结果示于表5中。
表5
Figure BPA0000286473200000891
实施例3：在人原代T细胞中靶向PDCD1的高效、经化学优化的sd-rxRNA的鉴定
原代人T细胞获自AllCells(CA)，并在含有10％胎牛血清(Gibco)和1000IU/mlIL2的完全RPMI培养基中培养。在转染之前，将细胞用抗CD3/CD28Dynabead(Gibco，11131)根据制造商的说明书活化至少4天。通过将sd-rxRNA在每个样品(孔)的无血清RPMI中单独稀释至0.2至2μM来制备靶向PDCD1的经化学优化的sd-rxRNA，并以96孔板的每孔100μl进行等分。在含有4％FBS和IL22000U/ml的RPMI培养基中以1,000,000个细胞/ml制备细胞，并将其以100μl/孔与预先稀释的sd-rxRNA一起接种到96孔板中。靶向PDCD1的sd-rxRNA的一些实例在表6中提供。
表6
Figure BPA0000286473200000901
检索表(Key)
A＝腺苷
G＝鸟苷
U＝尿苷
C＝胞苷
m＝2’-O-甲基核苷酸
f＝2’氟核苷酸
Y＝5甲基尿苷
X＝5甲基胞苷
*＝硫代磷酸酯键联
.＝磷酸二酯键联
TEG-Ch1＝胆固醇-TEG-甘油
P＝5’无机磷酸
VP-5’乙烯基膦酸酯
S-5’硫代磷酸酯
72小时之后，将转染的细胞以300×g离心10分钟。除去培养基，并将细胞重悬于40μL磷酸盐缓冲盐水(Gibco)中。随后将细胞转移至Invitrogen mRNA捕获板，并根据制造商的说明书分离RNA。Taqman基因表达测定用于以下组合：人PDCD1-FAM(Taqman，Hs01550088_m1)/人PPIB-FAM(Taqman HS00168719_m1)。一式三份地准备反应体积，但是每个样品一式两份地运行。将45μl体积/孔的每种反应混合物与15μl RNA/孔组合，所述RNA来自先前分离的RNA。使用Taqman RNA to CT 1步试剂盒根据制造商的说明书扩增样品。
图1中示出的结果示出了递送至T细胞的靶向PDCD1的sd-rxRNA试剂的显著沉默，在2μM sd-rxRNA的情况下获得了对基因表达的大于60％至70％抑制。
实施例4：在人原代T细胞中靶向PDCD1的经化学优化的sd-rxRNA的六点剂量响应曲线
原代人T细胞获自AllCells(CA)，并在含有10％胎牛血清(Gibco)和1000IU/mLIL2的完全RPMI培养基中培养。在转染之前，将细胞用抗CD3/CD28Dynabead(Gibco，11131)根据制造商的说明书活化至少4天。通过将sd-rxRNA在每个样品(孔)的无血清RPMI中单独稀释至0.06至2μM来制备靶向PDCD1的经化学优化的sd-rxRNA，并以96孔板的每孔100μl进行等分。在含有4％FBS和IL22000U/ml的RPMI培养基中以1,000,000个细胞/ml制备细胞，并将其以100μl/孔接种至具有预先稀释的sd-rxRNA的96孔板中。
72小时之后，将转染的细胞以300×g离心10分钟。除去培养基，并将细胞重悬于40μL磷酸盐缓冲盐水(Gibco)中。随后将细胞转移至Invitrogen mRNA捕获板，并根据制造商的说明书分离RNA。Taqman基因表达测定用于以下组合：人PDCD1-FAM(Taqman，Hs01550088_m1)/人PPIB-FAM(Taqman，Hs00168719_m1)。将45μl体积/孔的每种反应混合物与15μl RNA/孔组合，所述RNA来自先前分离的RNA。如实施例3中所述地扩增样品。
图2中示出的结果示出了递送至T细胞的靶向PDCD1的sd-rxRNA试剂PD26和PD27的显著沉默，在2μM sd-rxRNA的情况下获得了对基因表达的大于60％至70％抑制。
实施例5：在人原代T细胞中靶向TIGIT的sd-rxRNA的沉默活性
原代人T细胞获自AllCells(CA)，并在含有1000IU/ml IL2的完全RPMI培养基中培养。在转染之前，将细胞用抗CD3/CD28Dynabead(Gibco，11131)根据制造商的说明书活化至少4天。通过短暂涡旋以将珠从细胞中移出并使用指定的磁铁将其分离来收集细胞。通过将sd-rxRNA在每个样品(孔)的无血清RPMI中单独稀释至0.04至2μM来制备靶向TIGIT的经化学优化的sd-rxRNA，并以96孔板的每孔100μl进行等分。在含有4％FBS和IL22000U/ml的RPMI培养基中以1,000,000个细胞/ml制备细胞，并将其以100μl/孔接种至具有预先稀释的sd-rxRNA的96孔板中。靶向TIGIT的sd-rxRNA的一些实例在表4中提供。
72小时之后，将转染的细胞用100μl/孔的PBS洗涤一次，并用FastLane CellMultiplex试剂盒试剂根据制造商的说明书进行处理。Taqman基因表达测定用于以下组合：人TIGIT-FAM(Taqman，Hs00545087_m1_m1)/GAPDH-VIC。将18μl体积/孔的每种反应混合物与2μl裂解物/孔组合，所述裂解物来自先前制备的裂解物。如实施例2中所述地扩增样品。
图3中示出的结果示出了递送至T细胞的靶向TIGIT的sd-rxRNA试剂TIGIT 6和TIGIT 1的显著沉默，在2μM sd-rxRNA的情况下获得了对基因表达的大于60％至70％抑制。
实施例6：在离体培养中增强的来自用靶向PD-1和TIGIT的sd-rxRNA处理的活化人原代T细胞的T中枢记忆(TCM)分化。
该实施例描述了用sd-rxRNA修饰T细胞以实现T细胞的抗肿瘤效力与自我更新特性之间的平衡。图4示出了sd-rxRNA处理对T细胞分化状态进展的影响的示意图。简言之，用sd-rxRNA进行的T细胞处理在基于细胞的治疗的产生(例如，ACT的产生)期间影响细胞分化。另外，用靶向不同基因的多个sd-rxRNA进行的处理使得能够同时调节多种分化机制，例如信号传导途径、转录因子、代谢靶标和表观遗传调节剂。用sd-rxRNA进行的T细胞处理还允许靶向“非可被药物靶向的”机制。
健康供体的外周血获自Stem Express(Arlington，MA)。用来自Stem CellTechnologies(Cambridge，MA)的EasySepTM人初始全T细胞分离试剂盒根据制造商的说明书纯化初始T细胞。然后在AIM-V培养基+5％FBS+10ng/mL hIL2(GeneScript，Piscataway，NJ)中用CD3/CD28Dynabead(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)以1∶1的珠/细胞的比例活化经纯化的初始T细胞。将靶向PDCD1(PD-1)、TIGIT的经化学优化的sd-rxRNA和sd-rxRNA非靶向性对照以2μM添加至培养物。四天之后，收获细胞并用以下物质进行染色：活/死固定的Aqua死细胞染色试剂盒(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)、APC-H7缀合的抗人CD3、Pacific Blue缀合的抗人CD8、FITC缀合的抗人CCR7和APC缀合的抗人CD45RO(BDBioscience，San Jose，CA和BioLegend，San Diego，CA)。如图5中所示，与对照相比，当PD-1和TIGIT抑制时，T细胞向CD8+TCM(CCR7+CD45RO-)亚型的分化分别提高了3.9倍和1.7倍。
实施例7：在HepG2细胞中靶向HK2的sd-rxRNA的两点剂量响应曲线。
HepG2细胞获自ATCC(VA)，并在含有10％胎牛血清(Gibco)的完全EMEM培养基中培养。在转染之前二十四小时，将细胞以每孔10,000个细胞接种到96孔板中。通过将sd-rxRNA在每个样品(孔)的Accell培养基(Dharmacon，CO)中单独稀释至0.25至1μM来制备靶向HK2的sd-rxRNA化合物(例如，如表5中所示出的)，并以预先接种的96孔板的每孔100μl进行等分。在施用之后48小时，裂解转染的细胞，并使用基因特异性探针(Affymetrix)根据制造商的方案通过Quantigene分支DNA测定来确定mRNA水平。图6示出了靶向HK2的sd-rxRNA在体外在HepG2细胞中降低了靶基因mRNA水平。将数据针对持家基因(PPIB)归一化，并相对于非靶向性对照作图。误差棒表示生物学三次重复的平均值的标准差。
实施例8：在全T细胞中靶向HK2的sd-rxRNA的六点剂量响应曲线。
原代人T细胞获自AllCells(CA)，并在含有10％胎牛血清(Gibco)和含有1000IU/ml IL2的完全RPMI培养基中培养。在转染之前，将细胞用抗CD3/CD28Dynabead(Gibco，11131)根据制造商的说明书活化至少4天。通过将sd-rxRNA在每个样品(孔)的无血清RPMI中单独稀释至0.04至2μM来制备靶向HK2的sd-rxRNA化合物以及非靶向性对照sd-rxRNA(#28599)，并以96孔板的每孔100μl进行等分。在含有4％FBS和IL22000U/ml的RPMI培养基中以1,000,000个细胞/ml制备细胞，并将其以100μl/孔接种至具有预先稀释的sd-rxRNA的96孔板中。靶向HK2序列的sd-rxRNA的一些实例在表7中提供。在施用之后72小时，裂解细胞，并使用基因特异性探针(Affymetrix)根据制造商的方案通过Quantigene分支DNA测定来确定mRNA水平。图7示出了靶向HK2的sd-rxRNA在体外在人全T细胞中降低了靶基因mRNA水平。将数据针对持家基因(PPIB)归一化，并相对于非靶向性对照作图。误差棒表示生物学三次重复的平均值的标准差。
实施例9：T细胞中的Cbl-b沉默。
T细胞在含有10％胎牛血清(Gibco)和含有1000IU/ml IL2的完全RPMI培养基中培养。在转染之前，将细胞用抗CD3/CD28Dynabead(Gibco，11131)根据制造商的说明书活化至少4天。通过将sd-rxRNA在每个样品(孔)的无血清RPMI中单独稀释至2uM或0.04至2μM来制备靶向CbI-b的sd-rxRNA化合物或非靶向性对照(NTC)sd-rxRNA，并以96孔板的每孔100μl进行等分。在含有4％FBS和IL22000U/ml的RPMI培养基中以1,000,000个细胞/ml制备细胞，并将其以100μl/孔接种至具有预先稀释的sd-rxRNA的96孔板中。靶向Cbl-b序列的sd-rxRNA的一些实例在表8中提供。在转染孵育期结束时，将平板接种的转染的细胞用100μl/孔PBS洗涤一次，并用FastLane Cell Multiplex试剂盒试剂根据制造商的说明书进行处理。Taqman基因表达测定用于以下组合：人Cbl-b-FAM/GAPDH-VIC。将18μl体积/孔的每种反应混合物与2μl裂解物/孔组合，所述裂解物来自先前制备的裂解物。按照制造商的说明书扩增样品。
图8中的结果示出了通过转染到T细胞中的sd-rxRNA化合物引起的两种Cbl-b的显著沉默，在1μM和2μM sd-rxRNA的情况下达到了对基因表达的70％至80％抑制。
实施例10：在人原代NK细胞中靶向CBLB的sd-rxRNA的六点剂量响应。
外周血leukopak获自Stem Cell Technologies。使用阴性选择试剂盒(Miltenyi)分离原代NK细胞，并在X-Vivo 10(Lonza)+1ng/ml IL-15中培养细胞。收集细胞用于转染，并在含有IL-15的X-vivo培养基中将细胞浓度调节至约1×106个细胞/mL。将细胞直接接种到含有sd-rxRNA的24孔板中，sd-rxRNA的最终浓度为0.125μM至2μM。在孵育72小时之后，收集转染的细胞，并使用RNEasy RNA分离试剂盒(Qiagen)根据制造商的方案分离RNA。Taqman基因表达测定用于以下组合：人Cblb-FAM(Taqman，Hs00180288_m1)/人TBP-FAM(Taqman，Hs00427620_m1)。将15μl体积/孔的每种反应混合物与5μl RNA/孔组合，所述RNA来自先前分离的RNA。根据RNA to Ct 1步方案(ThermoFisher)扩增样品。
图9中示出的结果示出了递送至人原代NK细胞的靶向Cblb的sd-rxRNA试剂27457的沉默，在2μM sd-rxRNA的情况下获得了对基因表达的大于80％抑制。
实施例11：在HepG2细胞中靶向DMNT3A的sd-rxRNA的三点剂量响应曲线。
HepG2细胞获自ATCC(VA)，并在含有10％胎牛血清(Gibco)的完全EMEM培养基中培养。在转染之前二十四小时，将细胞以每孔10,000个细胞接种到96孔板中。通过将sd-rxRNA在每个样品(孔)的Accell培养基(Dharmacon，CO)中单独稀释至0.25至1μM来制备靶向DMNT3A的sd-rxRNA化合物，并以预先接种的96孔板的每孔100μl进行等分。在施用之后48小时，裂解转染的细胞，并使用基因特异性探针(Affymetrix)根据制造商的方案通过Quantigene分支DNA测定来确定mRNA水平。图10示出了靶向DMNT3A的sd-rxRNA在体外在HepG2细胞中降低了靶基因mRNA水平。将数据针对持家基因(PPIB)归一化，并相对于非靶向性对照作图。误差棒表示生物学三次重复的平均值的标准差。
实施例12：在全T细胞中靶向DMNT3A的sd-rxRNA的五点剂量响应曲线。
原代人T细胞获自AllCells(CA)，并在含有1000IU/ml IL2的完全ImmunoCult-XFT细胞扩增培养基(Stem Cell Technologies，Vancouver，BC)中培养。在转染之前，将细胞用抗CD3/CD28Dynabead(Gibco，11131)根据制造商的说明书活化至少4天。通过将sd-rxRNA在每个样品(孔)的完全Immunocult中单独稀释至0.04至2μM来制备靶向DMNT3A的sd-rxRNA化合物以及非靶向性对照sd-rxRNA(#28599)，并以96孔板的每孔100μl进行等分。在完全Immunocult培养基中制备细胞，并将其以100μl/孔接种至具有预先稀释的sd-rxRNA的96孔板中。靶向DMNT3A的sd-rxRNA序列的一些实例在表9中提供。在施用之后72小时，裂解细胞，并使用基因特异性探针(Affymetrix)根据制造商的方案通过Quantigene分支DNA测定来确定mRNA水平。图11示出了靶向DMNT3A的sd-rxRNA在体外在人全T细胞中降低了靶基因mRNA水平。将数据针对持家基因(PPIB)归一化，并相对于非靶向性对照作图。误差棒表示生物学三次重复的平均值的标准差。
实施例13：在A549细胞中靶向PRDM1的sd-rxRNA的两点剂量响应。
A549细胞获自ATCC(VA)，并在含有10％胎牛血清(Gibco)的完全ATCC配制的F-12K培养基中培养。在转染之前二十四小时，将细胞以每孔10,000个细胞接种到96孔板中。通过将sd-rxRNA在每个样品(孔)的Accell培养基(Dharmacon)中单独稀释至0.2至2μM来制备靶向PRDM1的sd-rxRNA化合物，并以预先接种的96孔板的每孔100μl进行等分。在孵育72小时之后，裂解转染的细胞，并使用基因特异性探针(Affymetrix)根据制造商的方案通过Quantigene分支DNA测定来确定mRNA水平。
图12中示出的结果示出了递送至A549细胞的靶向PRDM1的sd-rxRNA试剂的沉默，在2μM sd-rxRNA的情况下获得了对基因表达的大于40％抑制。将数据针对持家基因(HPRT)归一化，并相对于非靶向性对照作图。误差棒表示生物学三次重复的平均值的标准差。
实施例14：在A549细胞中靶向PRDM1的sd-rxRNA的六点剂量响应。
A549细胞获自ATCC(VA)，并在含有10％胎牛血清(Gibco)的完全ATCC配制的F-12K培养基中培养。在转染之前二十四小时，将细胞以每孔10,000个细胞接种到96孔板中。通过将sd-rxRNA在每个样品(孔)的Accell培养基(Dharmacon)中单独稀释至0.2μM和2μM来制备靶向PRDM1的sd-rxRNA化合物，并以预先接种的96孔板的每孔100μl进行等分。靶向PRDM1的sd-rxRNA序列的一些实例在表10中提供。在孵育72小时之后，裂解转染的细胞，并使用基因特异性探针(Affymetrix)根据制造商的方案通过Quantigene分支DNA测定来确定mRNA水平。
图13中示出的结果示出了递送至A549细胞的靶向PRDM1的sd-rxRNA试剂的沉默，在2μM sd-rxRNA的情况下获得了对基因表达的大于80％抑制。将数据针对持家基因(HPRT)归一化，并相对于非靶向性对照作图。误差棒表示生物学三次重复的平均值的标准差。
实施例15：在A549细胞中靶向PTPN6的sd-rxRNA的六点剂量响应。
A549细胞获自ATCC(VA)，并在含有10％胎牛血清(Gibco)的完全ATCC配制的F-12K培养基中培养。在转染之前二十四小时，将细胞以每孔10,000个细胞接种到96孔板中。通过将sd-rxRNA在每个样品(孔)的Accell培养基(Dharmacon)中单独稀释至0.2μM和2μM来制备靶向PTPN6的sd-rxRNA化合物，并以预先接种的96孔板的每孔100μl进行等分。在孵肓72小时之后，裂解转染的细胞，并使用基因特异性探针(Affymetrix)根据制造商的方案通过Quantigene分支DNA测定来确定mRNA水平。
图14中示出的结果示出了递送至A549细胞的靶向PTPN6的sd-rxRNA试剂的沉默，在2μM sd-rxRNA的情况下获得了对基因表达的大于40％抑制。将数据针对持家基因(TFRC)归一化，并相对于未转染的对照作图。误差棒表示生物学三次重复的平均值的标准差。
实施例16：在A549细胞中靶向PTPN6的sd-rxRNA的六点剂量响应。
A549细胞获自ATCC(VA)，并在含有10％胎牛血清(Gibco)的完全ATCC配制的F-12K培养基中培养。在转染之前二十四小时，将细胞以每孔10,000个细胞接种到96孔板中。通过将sd-rxRNA在每个样品(孔)的Accell培养基(Dharmacon)中单独稀释至0.2至2μM来制备靶向PTPN6的sd-rxRNA化合物，并以预先接种的96孔板的每孔100μl进行等分。靶向PTPN6的sd-rxRNA序列的一些实例在表11中提供。在孵育72小时之后，裂解转染的细胞，并使用基因特异性探针(Affymetrix)根据制造商的方案通过Quantigene分支DNA测定来确定mRNA水平。
图15中示出的结果示出了递送至A549细胞的靶向PTPN6的sd-rxRNA试剂28613、28614、28617、28623、28627、28628和28629的沉默，在2μM sd-rxRNA的情况下获得了对基因表达的大于80％抑制。将数据针对持家基因(TFRC)归一化，并相对于非靶向性对照作图。误差棒表示生物学三次重复的平均值的标准差。
实施例17：在U2OS细胞中靶向TET2的sd-rxRNA的两点剂量响应。
U2OS细胞获自ATCC(VA)，并在含有10％胎牛血清(Gibco)的完全ATCC配制的McCoy’s 5a培养基中培养。在转染之前二十四小时，将细胞以每孔10,000个细胞接种到96孔板中。通过将sd-rxRNA在每个样品(孔)的Accell培养基(Dharmacon)中单独稀释至0.2至2μM来制备靶向TET2的sd-rxRNA化合物，并以预先接种的96孔板的每孔100μl进行等分。在孵育72小时之后，裂解转染的细胞，并使用基因特异性探针(Affymetrix)根据制造商的方案通过Quantigene分支DNA测定来确定mRNA水平。
图16中示出的结果示出了递送至A549细胞的靶向TET2的sd-rxRNA试剂的沉默，在2μM sd-rxRNA的情况下获得了对基因表达的大于80％抑制。将数据针对持家基因(PPIB)归一化，并相对于非靶向性对照作图。误差棒表示生物学三次重复的平均值的标准差。
实施例18：在U2OS细胞中靶向TET2的sd-rxRNA的六点剂量响应。
U2OS细胞获自ATCC(VA)，并在含有10％胎牛血清(Gibco)的完全ATCC配制的F-12K培养基中培养。在转染之前二十四小时，将细胞以每孔10,000个细胞接种到96孔板中。通过将sd-rxRNA在每个样品(孔)的Accell培养基(Dharmacon)中单独稀释至0.2至2μM来制备靶向TET2的sd-rxRNA化合物，并以预先接种的96孔板的每孔100μl进行等分。靶向TET2的sd-rxRNA序列的一些实例在表12中提供。在孵育72小时之后，裂解转染的细胞，并使用基因特异性探针(Affymetrix)根据制造商的方案通过Quantigene分支DNA测定来确定mRNA水平。
图17中示出的结果示出了递送至U2OS细胞的靶向TET2的sd-rxRNA试剂的沉默，在2μMsd-rxRNA的情况下获得了对基因表达的大于60％抑制。将数据针对持家基因(PPIB)归一化，并相对于非靶向性对照作图。误差棒表示生物学三次重复的平均值的标准差。
实施例19：在全T细胞中靶向TBX21的sd-rxRNA的两点剂量响应曲线。
原代人T细胞获自AllCells(CA)，并在含有10％胎牛血清(Gibco)和含有1000IU/ml IL2的完全RPMI培养基中培养。在转染之前，将细胞用抗CD3/CD28Dynabead(Gibco，11131)根据制造商的说明书活化至少4天。通过将sd-rxRNA在每个样品(孔)的无血清RPMI中单独稀释至0.2μM和1μM来制备靶向TBX21的sd-rxRNA化合物，并以96孔板的每孔100μl进行等分。在含有4％FBS和IL22000U/ml的RPMI培养基中以1,000,000个细胞/ml制备细胞，并将其以100μl/孔接种至具有预先稀释的sd-rxRNA的96孔板中。靶向TET2的sd-rxRNA序列的一些实例在表13中提供。在施用之后72小时，裂解转染的细胞，并使用基因特异性探针(Affymetrix)根据制造商的方案通过Quantigene分支DNA测定来确定mRNA水平。
图18示出了靶向TBX21的sd-rxRNA在体外在Tan T细胞中降低了靶基因mRNA水平。将数据针对持家基因(PPIB)归一化，并相对于非靶向性对照作图。误差棒表示生物学三次重复的平均值的标准差。
实施例20：在人原代NK细胞中靶向TIGIT的sd-rxRNA的三点剂量响应。
外周血leukopak获自Stem Cell Technologies。使用阴性选择试剂盒(Miltenyi)分离原代NK细胞，并在含有10％FBS(Gibco)和100IU/ml IL-2的RPMI中培养细胞。
收集细胞用于转染，并在含有5％FBS(Gibco)和100IU/ml IL-2的RPMI中将细胞浓度调节至约1×106个细胞/mL。将细胞直接接种到含有sd-rxRNA的24孔板中，sd-rxRNA的最终浓度为0.5μM至2μM。靶向TIGIT的sd-rxRNA序列的一些实例在表5中提供。在孵育72小时之后，收集转染的细胞，并使用RNEasy RNA分离试剂盒(Qiagen)根据制造商的方案分离RNA。Taqman基因表达测定用于以下组合：人TIGIT-FAM(Taqman，Hs00545087_m1)/人TBP-FAM(Taqman，Hs00427620_m1)。将15μl体积/孔的每种反应混合物与5μl RNA/孔组合，所述RNA来自先前分离的RNA。根据RNAto Ct 1步方案(ThermoFisher)扩增样品。
图19中示出的结果示出了递送至人原代NK细胞的靶向TIGIT的sd-rxRNA试剂27459的沉默，在2μM sd-rxRNA的情况下获得了对基因表达的大于80％抑制。
实施例21：在人原代T细胞中靶向AKT1的sd-rxRNA的六点剂量响应曲线
原代人T细胞获自AllCells(CA)，并在含有10％胎牛血清(Gibco)和1000IU/mlIL2的完全RPMI培养基中培养。在转染之前，将细胞用抗CD3/CD28Dynabead(Gibco，11131)根据制造商的说明书活化至少4天。通过将sd-rxRNA在每个样品(孔)的无血清RPMI中单独稀释至0.06至2μM来制备靶向AKT1的sd-rxRNA化合物，并以96孔板的每孔100μl进行等分。在含有4％FBS和IL22000U/ml的RPMI培养基中以1,000,000个细胞/ml制备细胞，并将其以100μl/孔接种至具有预先稀释的sd-rxRNA的96孔板中。靶向AKT1的sd-rxRNA序列的一些实例在表11中提供。72小时之后，将转染的细胞以300×g离心10分钟。除去培养基，并将细胞重悬于40μL磷酸盐缓冲盐水(Gibco)中。随后将细胞转移至Invitrogen mRNA捕获板，并根据制造商的说明书分离RNA。Taqman基因表达测定用于以下组合：人AKT1-FAM(Taqman，Hs0178289_m1)/人PPIB-FAM(Taqman，Hs00168719_m1)。将45μl体积/孔的每种反应混合物与15μl RNA/孔组合，所述RNA来自先前分离的RNA。根据制造商的说明书扩增样品。
图20中示出的结果示出了递送至T细胞的靶向AKT1的sd-rxRNA试剂28115的沉默，在2μM sd-rxRNA的情况下获得了对基因表达的大于40％抑制。
表格清单：
表1示出了使用sd-rxRNA成功沉默的基因的一些实例。
表2示出了用sd-rxRNA沉默的候选基因的一些实例。
表3示出了PD1靶向序列的一些实例。
表4示出了Cb1-b靶向序列的一些实例。
表5示出了TIGIT靶向序列和sd-rxRNA的一些实例。
表6示出了PD1sd-rxRNA的一些实例。
表7示出了HK2靶序列和sd-rxRNA的一些实例。
表8示出了Cb1-b sd-rxRNA的一些实例。
表9示出了DNMT3A靶序列和sd-rxRNA的一些实例。
表10示出了PRDM1靶序列和sd-rxRNA的一些实例。
表11示出了PTPN6靶序列和sd-rxRNA的一些实例。
表12示出了TET2靶序列和sd-rxRNA的一些实例。
表13示出了Tbox21靶序列和sd-rxRNA的一些实例。
表7
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表8-Cbl-b sd-rxRNA
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检索表
A＝腺苷
G＝鸟苷
U＝尿苷
C＝胞苷
m＝2’-O-甲基核苷酸
f＝2’氟核苷酸
Y＝5甲基尿苷
X＝5甲基胞苷
*＝硫代磷酸酯键联
.＝磷酸二酯键联
TEG-Chl＝胆固醇-TEG-甘油
P＝5’无机磷酸
表9
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表10
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表11
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表12
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表13
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本领域技术人员将认识到或者能够仅使用常规实验确定本文中所述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。这样的等同方案旨在由所附权利要求书涵盖。
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Claims (44)

1.针对编码TIGIT、PDCD1、AKT、p53、Cbl-b、Tet2、Blimp-1、T-Box21、DNM3A、PTPN6或HK2的基因的经化学修饰的双链核酸分子，任选地其中所述经化学修饰的双链核酸分子针对包含选自表3至13内序列之序列的至少12个连续核苷酸的序列。
2.权利要求1所述的经化学修饰的双链核酸分子，其中所述经化学修饰的双链核酸分子是sd-rxRNA。
3.权利要求1或2所述的经化学修饰的双链核酸分子，其中所述经化学修饰的双链核酸分子包含至少一个2’-O-甲基修饰和/或至少一个2’-氟修饰，以及至少一个硫代磷酸酯修饰。
4.针对编码TIGIT、PDCD1、AKT、P53、Cbl-b、Tet2、Blimp-1、T-Box21、DNMT3A、PTPN6或HK2的基因的sd-rxRNA，其中所述sd-rxRNA包含选自表3至13内序列之序列的至少12个连续核苷酸。
5.权利要求4所述的sd-rxRNA，其中所述sd-rxRNA是经疏水性修饰的。
6.权利要求4或5所述的sd-rxRNA，其中所述sd-rxRNA与一个或更多个疏水性缀合物连接，任选地其中所述疏水性缀合物是胆固醇。
7.组合物，其包含权利要求1至3中任一项所述的经化学修饰的双链核酸分子以及可药用赋形剂。
8.权利要求7所述的组合物，其中所述经化学修饰的双链核酸分子包含选自表3、4、5、6或8之序列的至少12个连续核苷酸或者由其组成，任选地其中经化学修饰的双链核酸分子包含TIGIT 1(SEQ ID NO：60)、TIGIT 6(SEQ ID NO：65)、TIGIT 21(SEQ ID NO：100和101)、PD 26(SEQ ID NO：112和113)、CB 23(SEQ ID NO：236和237)或CB 29(SEQ ID NO：248和249)中所示序列。
9.组合物，其包含权利要求4至6中任一项所述的sd-rxRNA以及可药用赋形剂。
10.权利要求9所述的组合物，其中所述sd-rxRNA包含CB 23(SEQ ID NO：236或237)或CB 29(SEQ ID NO：248或249)中所示序列或者由其组成。
11.权利要求9所述的组合物，其中所述经化学修饰的双链核酸分子包含具有PD 26有义链(SEQ ID NO：112)中所示序列的有义链和/或具有PD 26反义链(SEQ ID NO：113)中所示序列的反义链。
12.权利要求11所述的组合物，其中所述经化学修饰的双链核酸分子或所述sd-rxRNA包含具有PD 26有义链(SEQ ID NO：112)中所示序列的有义链和具有PD 26反义链(SEQ IDNO：113)中所示序列的反义链，或者由其组成。
13.权利要求7至9中任一项所述的组合物，其中所述经化学修饰的双链核酸分子或所述sd-rxRNA包含具有CB 23有义链(SEQ ID NO：236)中所示序列的有义链和/或具有CB 23反义链(SEQ ID NO：237)中所示序列的反义链。
14.权利要求13所述的组合物，其中所述经化学修饰的双链核酸分子或所述sd-rxRNA由具有CB 23有义链(SEQ ID NO：236)中所示序列的有义链和具有CB 23反义链(SEQ IDNO：237)中所示序列的反义链组成。
15.权利要求7至9中任一项所述的组合物，其中所述经化学修饰的双链核酸分子或所述sd-rxRNA包含具有CB 29有义链(SEQ ID NO：248)中所示序列的有义链和/或具有CB 29反义链(SEQ ID NO：249)中所示序列的反义链。
16.权利要求15所述的组合物，其中所述经化学修饰的双链核酸分子或所述sd-rxRNA由具有CB 29有义链(SEQ ID NO：248)中所示序列的有义链和具有CB 29反义链(SEQ IDNO：249)中所示序列的反义链组成。
17.权利要求7至9中任一项所述的组合物，其中所述经化学修饰的双链核酸分子包含具有TIGIT 21有义链(SEQ ID NO：100)中所示序列的有义链和/或具有TIGIT 21反义链(SEQ ID NO：101)中所示序列的反义链。
18.权利要求17所述的组合物，其中所述经化学修饰的双链核酸分子包含具有TIGIT21有义链(SEQ ID NO：100)中所示序列的有义链和具有TIGIT 21反义链(SEQ ID NO：101)中所示序列的反义链。
19.免疫原性组合物，其包含宿主细胞，所述宿主细胞用经化学修饰的双链核酸分子离体处理以控制和/或降低所述宿主细胞的分化水平，以使得能够产生用于在人中施用的特异性免疫细胞群。
20.权利要求19所述的免疫原性组合物，其中所述宿主绌胞包含针对编码PDCD1、AKT、p53、Cbl-b、Tet2、Blimp-1、T-Box21、DNMT3A、PTPN6或HK2的基因的经化学修饰的双链核酸分子，任选地其中所述经化学修饰的双链核酸分子针对包含选自表3至13内序列之序列的至少12个连续核苷酸的序列，进一步任选地其中所述经化学修饰的双链核酸分子针对PDCD1，并且包含选自表3或6之序列的至少12个连续核苷酸。
21.权利要求19或20所述的免疫原性组合物，其中所述经化学修饰的双链核酸分子包含至少一个2’-O-甲基修饰和/或至少一个2’-氟修饰，以及至少一个硫代磷酸酯修饰。
22.权利要求21所述的免疫原性组合物，其中所述经化学修饰的双链核酸分子是经疏水性修饰的。
23.权利要求22所述的免疫原性组合物，其中所述经化学修饰的双链核酸分子与一个或更多个疏水性缀合物连接，任选地其中所述疏水性缀合物是胆固醇。
24.权利要求19至23中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述宿主细胞选自：T细胞、NK细胞、抗原呈递细胞(APC)、树突细胞(DC)、干细胞(SC)、诱导多能干细胞(iPSC)、干细胞记忆T细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)。
25.权利要求24所述的免疫原性组合物，其中所述宿主细胞是T细胞。
26.权利要求24或25所述的免疫原性组合物，其中所述T细胞是CD8+T细胞，任选地其中在引入所述经化学修饰的双链核酸分子或所述sd-rxRNA之后，所述T细胞分化成TSCM或TCM，进一步任选地其中所述免疫原性组合物包含至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的TSCM或TCM绌胞。
27.权利要求24至26中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述T细胞包含表达高亲和力T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)的一种或更多种转基因。
28.权利要求19至27中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述宿主细胞来自健康供体。
29.用于产生免疫原性组合物的方法，所述方法包括将一种或更多种经化学修饰的双链核酸分子引入到细胞中，其中所述一种或更多种经化学修饰的核酸分子靶向PDCD1、AKT、p53、Cbl-b、Tet2、Blimp-1、T-Box21、DNMT3A、PTPN6和/或HK2，从而产生宿主细胞。
30.用于产生免疫原性组合物的方法，所述方法包括将权利要求1至6中任一项所述的经化学修饰的双链核酸分子或sd-rxRNA引入到细胞中。
31.权利要求29或30所述的方法，其中所述细胞是T细胞、NK细胞、抗原呈递细胞(APC)、树突细胞(DC)、干细胞(SC)、诱导多能干细胞(iPSC)、干细胞记忆T细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)。
32.权利要求30所述的方法，其中所述T细胞是CD8+T细胞，任选地其中在引入所述经化学修饰的双链核酸或sd-rxRNA之后，所述T细胞分化成TSCM或TCM，进一步任选地其中所述免疫原性组合物包含至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的TSCM或TCM细胞。
33.权利要求31或32所述的方法，其中所述T绌胞包含表达高亲和力T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)的一种或更多种转基因。
34.权利要求29至33中任一项所述的方法，其中所述细胞来自健康供体。
35.用于治疗患有增生性疾病或感染性疾病之对象的方法，所述方法包括向所述对象施用权利要求19至28中任一项所述的免疫原性组合物。
36.权利要求35所述的方法，其中所述增生性疾病是癌症。
37.权利要求35所述的方法，其中所述感染性疾病是病原体感染。
38.权利要求37所述的方法，其中所述病原体感染是细菌感染、病毒感染或寄生虫感染。
39.免疫原性组合物，其包含宿主细胞，所述宿主细胞包含针对TIGIT序列的经化学修饰的双链核酸分子，所述TIGIT序列包含选自表5内序列之序列的至少12个连续核苷酸。
40.免疫原性组合物，其包含宿主细胞，所述宿主细胞包含针对PDCD1序列的经化学修饰的双链核酸分子，所述PDCD1序列包含选自表3或6内序列之序列的至少12个连续核苷酸。
41.权利要求40或41所述的免疫原性组合物，其中所述经化学修饰的双链核酸分子是sd-rxRNA。
42.权利要求40至42中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述宿主细胞包含靶向PDCD1的第一经化学修饰的双链核酸分子或sd-rxRNA，和靶向TIGIT的第二经化学修饰的双链核酸分子或sd-rxRNA。
43.权利要求40至43中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述经化学修饰的双链核酸分子或sd-rxRNA在所述宿主细胞中诱导对PDCD1或TIGIT的至少50％抑制。
44.用于治疗患有增生性疾病或感染性疾病之对象的方法，所述方法包括向所述对象施用权利要求40至44中任一项所述的免疫原性组合物。
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