CN111198226A - 对肽进行复用ms-3分析的方法 - Google Patents

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Abstract

一种方法包括：获得具有式[M+2A]2+的目标前体离子的前体质荷比值(m/z)p，M是肽分子并且A是一种或多种加合物；通过离子源从样品生成离子；纯化和碎裂包含(m/z)p的离子，因而生成多个MS‑2种类；共纯化和共碎裂MS‑2种类的所选择的子集，从而生成多个MS‑3种类，其中每个所选择的MS‑2种类是包含大于(m/z)p的相应(m/z)f的y型离子种类；质谱分析MS‑3种类并选择其子集，每个所选择的MS‑3种类包含满足质荷比选择标准的相应(m/z)g；以及从对应于所选择的MS‑3种类的质谱强度的总和确定肽的量。

Description

对肽进行复用MS-3分析的方法
技术领域
本发明总体上涉及质谱分析法和质谱仪，更具体地，涉及肽的三级串联 MS-3质谱分析。
背景技术
质谱分析法已成为快速、高效鉴定生物样品中蛋白质的首选方法。复杂蛋白质混合物中肽的串联质谱法可用于鉴定和量化原始混合物中存在的蛋白质。串联质谱仪通过选择单个质荷比(m/z)值并使前体离子碎裂，提供可用于测序和鉴定肽的产物离子来实现此目的。肽的产物离子所生成的信息可用于搜索肽和核苷酸序列数据库，从而鉴定由质谱表示的氨基酸序列，因此鉴定肽的来源蛋白质。将碎片离子模式与从序列数据库计算生成的理论碎片离子模式进行比较的分析方法可用于鉴定肽序列。此类方法可以鉴定最佳匹配的肽，并在统计学上确定哪个肽序列更有可能是正确的。这些算法通常利用m/z信息来鉴定各种产物离子。
通常，串联质谱分析包括碎裂选择的前体(或“母体”)离子并记录所得碎片离子的质谱。碎片离子质谱中的信息通常有助于阐明前体离子的结构。用于获得串联质谱(MS/MS或MS-2)谱图的一般方法是用合适的质量分析器分离选择的前体离子，并使前体离子与中性气体发生高能碰撞，以便分析所得碎片离子的质谱，从而生成质谱图。为了从前体离子获得更多信息，可以将MS的附加阶段应用于上述MS/MS方案，从而得到MS/MS/MS或MS-3。例如，碰撞池可以用作离子阱，其中碎片离子被共振激发以促进进一步的碰撞诱导解离 (CID)。
图1描述了肽和蛋白质片段通常采用(和在本文使用)的命名法。碎片离子的公认命名法是由Roepstorff和Fohlman首先提出的(在Roepstorff,P.和J. Fohlman.的《致编辑(Letter to the editors)》中，生物质谱法11，no.11(1984): 601-601.)，随后由Johnson等人进行了修改(Johnson、Richard S.、Stephen A. Martin、Klaus Biemann、JohnT.Stults，以及J.Throck Watson，《在串联质谱仪中通过碰撞诱导分解的肽的新型碎裂方法：亮氨酸和异亮氨酸的分化(Novel fragmentation process of peptides bycollision-induced decomposition in a tandem mass spectrometer:differentiation of leucine and isoleucine)》，分析化学59，no.21 (1987):2621-2625)这两篇文献均全文引入本文作为参考。当电荷保留在肽的 N-末端片段时，肽骨架的三个可能的碎裂点称为a、b和c，当电荷保留在C- 末端片段时，则称为x、y和z。编号表示从N和C末端分别碎裂哪个肽键，从而表示碎片离子中氨基酸残基的数目。从碎片转移或丢失的氢的数目分别用撇号表示在字母的左边和右边。失氨离子(17Da)和失水离子(18Da)对应的峰分别由字母右侧的上标星号和圆圈表示。
已经观察到，当沿着肽骨架碎裂时，低能CID主要产生a、b和y型碎片离子(离子产物)；a*、b*和y*以及a°、b°和y°。相反，电子转移解离(ETD) 主要产生c和z*型碎片离子，并且在更小的程度上产生a*、y离子和z’和c*型离子。常规分析技术被设计用来处理仅包含一种类型碎片(c/z或b/y)的光谱。
靶向MS分析是一种重要的肽分析方法。例如，作为一种治疗试验，肽丰度的量化可以用来作为一个代理的疾病状态的有机体。最常见的，使用具有液相色谱(LC)的靶向MS/MS(MS-2)，常规方法包括用质谱分析的第一阶段从洗脱的背景种类中选择肽离子种类，将选择的离子种类进行碎裂，并测量如此形成的碎片。对于肽分析，MS-2实验相对容易设置，因为对于一个给定的肽序列，可以预测最丰富、最具选择性的MS-2碎片很可能是骨架碎裂，其中电荷保留在肽C-末端或y离子上(见图1)。一种典型的策略是对比前体有更大m/z 值的y型离子种类进行询问。尽管通常需要验证这些转变的存在和选择性，但是对于之前没有研究过其碎裂的肽分子来说，这项任务要比研究其它分子类别简单得多，因为最可能的碎片离子种类的超集是已知的。
尽管常规的MS-2分析为肽量化提供了大量的选择性和通量，但是据一些研究人员估计，还需要1-2个数量级的灵敏度才能与免疫测定法的灵敏度水平相匹敌。质谱仪必须实现更好灵敏度的手段之一是找到提高测量选择性的方法；也就是说，如果分析物的信号没有降低得与干扰“噪声”一样快，则减少引起高基线和重叠峰的干扰。因此，较高分辨率的质谱分析通常优于标称质谱分辨率，只要其它有价值的分析数据(如速度和信号丰度)足够多。其它增加选择性的模式也越来越多地得到探索，例如将离子迁移率光谱仪的离子出口与质谱仪的离子入口进行耦合。
另一种提高MS选择性的众所周知的方法是在MS-2之外执行MS的其他阶段，即前体分离、碎裂和碎片离子测量的进一步阶段。传统上，MS-3分析主要用于定性任务，例如肽磷酸肽位点定位(例如，参见Xu、Hua、Liwen Wang、 Larry Sallans和Michael A.Freitas.的《用于磷酸肽串联质谱自动分析的分级 MS2/MS3数据库搜索算法(A hierarchical MS2/MS3 database search algorithm for automated analysis of phosphopeptidetandem mass spectra)》，蛋白质组学9，no.7 (2009):1763-1770)。最近，MS-3已经并且正用于用等压标记策略(例如串联质谱标签)的全局蛋白质组表征和量化，其中所有MS-2前体解离以在已知的质谱区域中形成相同的大约10个报告离子(例如，参见McAlister、GraemeC.、 David P.Nusinow、Mark P.Jedrychowski、Martin Wühr、Edward L.Huttlin、BrianK.Erickson、Ramin Rad、Wilhelm Haas和Steven P.Gygi.《多位点MS3能够准确、灵敏和多路检测跨癌细胞系蛋白质组的差异表达(MultiNotch MS3 enables accurate,sensitive,and multiplexed detection of differential expression across cancercell line proteomes)》，分析化学86，no.14(2014):7150-7158)。在该方法中，生成报告离子的激活步骤使用非常高的碰撞能量来驱动所有产物到达报告离子，因此没有着重于生成正常的肽骨架诊断碎片，其本身可以在靶向环境中使用。
因此，MS-3作为一种通用的靶向肽量化策略至今尚未得到很好的研究。主要原因是，尽管潜在的选择性释放很大，但是MS-3传统上缺乏灵敏度，因此需要非常长的停留时间来生成足够的碎片离子用于分析。例如，Lemoine等人 (Lemoine、
Figure RE-GDA0002387724140000041
Tanguy Fortin、Arnaud Salvador、Aurore Jaffuel、Jean-Philippe Charrier和Geneviève Choquet-Kastylevsky的《临床蛋白质组学的现状以及MRM 和MRM3在生物标志物验证中的应用(Thecurrent status of clinical proteomics and the use of MRM and MRM3 forbiomarker validation)》，分子诊断专家评论 (Expert review of moleculardiagnostics)12，no.4(2012):333-342)报告称靶向 MS-3扫描间隔的典型周期为300ms。随着多位点分离技术(op.cit.)的出现，这个问题在相当大的程度上得到了改善。在多位点分离技术中，多个MS-2碎片同时分离和碎裂，使得扫描的间隔时间可以达到30ms。尽管如此，仍然需要一种通用的方法来对任何特定的肽序列执行多路复用MS-3，特别是在缺乏关于肽碎裂行为的先验知识的情况下。这一点很重要，因为发现和靶向蛋白质组学之间的典型转化工作流程可能涉及数百或数千个肽的分析，几乎没有时间人工优化所关注或潜在所关注的几种不同肽的参数。目前已知的MS-3方法需要事先了解哪些MS-2碎片离子应该被分离并进一步碎裂，哪些MS-3碎片离子是由 MS-2碎片离子的激活形成的，以及这些碎片离子中哪些对量化最有用。本发明的方法通过有利地提供对某些肽分析物进行或获得定性和定量分析的能力，解决了本领域的上述需要，甚至在事先不知道一种或多种分析物的精确碎裂行为的情况下也是如此。
发明内容
本文件描述了一种针对无法获得特定碎裂数据的靶向肽执行MS-3肽分析的方法。根据本发明，相对于前体离子，最丰富的MS-2碎片通常位于一个可预测的m/z区域，而同时分离和碎裂MS-2碎片的最丰富的MS-3碎片位于另一个区域，通常位于比原始前体离子更少的m/z值处。根据本发明，用于任何给定肽的通用靶向MS-3方法包括分离m/z值大于前体m/z的y型第一代碎片离子种类，对分离的第一代碎片离子种类进行碎裂从而生成第二代y型碎片离子种类，并使用m/z值小于某一m/z的第二代y型碎片离子种类进行量化。本发明公开了用于对捕获在同一存储装置中的多个前体离子进行共振激发激活的其他技术。
根据本发明的第一方面，公开了一种用于目标肽的质谱分析的方法，所述方法包括：(a)接收或计算具有通式[M+2A]2+的目标前体离子种类的前体质荷比值(m/z)p，其中M表示中性目标肽分子的组成并且两个加合物A中的每一个是质子或碱金属阳离子；(b)将样品的一部分引入质谱仪的离子源中，其中所述离子源能够通过使样品中的目标肽(如果存在)电离而生成目标前体离子种类；(c)由离子源从样品中生成离子；(d)纯化和碎裂包含(m/z)p的离子，因而从其中生成多个第一代碎片离子种类(MS-2种类)；(e)共纯化和共碎裂多个所生成MS-2种类的所选子集，因而从其中生成多个第二代碎片离子种类(MS-3 种类)，其中所选MS-2种类中的每一种均是y型离子种类，并且包含相应的大于(m/z)p的碎片质荷比值(m/z)f；(f)质谱分析MS-3种类，并选择所生成的多个 MS-3种类的子集，其中所选MS-3种类中的每一种均包含相应的满足质荷比选择标准的第二代碎片质荷比值(m/z)g；以及(g)从所选MS-3种类的质谱强度的总和，确定样品中目标肽的量。
在各种实施例中，对多个所生成MS-3种类的子集的选择使得所选的每个 MS-3种类均是y型离子种类。在各种其它实施例中，对多个所生成MS-3种类的子集的选择使得仅选择其峰强度被观察为彼此正相关的MS-3种类，而不管它们是否包含y型或非y型离子种类。此类相关性可以包含在色谱洗脱过程中峰强度的共同变化。
在各种实施例中，质荷比选择标准使得第二代碎片质荷比值(m/z)g满足 (m/z)g小于(m/z)p的标准。在各种实施例中，质荷比选择标准使得第二代碎片质荷比值(m/z)g满足以下标准：(m/z)g小于共纯化和共碎裂的所有MS-2种类中的最低m/z值。在各种实施例中，选择多个所生成MS-2种类的子集包括选择n1个最丰富的y型MS-2种类，对于这些种类，(m/z)f大于(m/z)p，其中n1是一个预定的正整数。在各种实施例中，选择多个所生成MS-3种类的子集包括选择满足质荷比选择标准的n2个最丰富的y型MS-3种类，其中n2是一个预定的正整数。在各种实施例中，共碎裂多个所生成MS-2种类的选择子集包含通过共振激发型碰撞诱导的解离并且以其质荷比的相反顺序依次碎裂所述子集的所选 MS-2种类。在各种实施例中，从数据库条目输入多个所生成MS-2种类的选择子集的离子种类的m/z值和多个所生成MS-3种类的选择子集的离子种类的m/z 值。在各种其它实施例中，共碎裂多个所生成MS-2种类的选择子集包括通过束射型碰撞诱导解离来碎裂子集的所选MS-2种类。在各种实施例中，通过胰蛋白酶消化含有蛋白质的样品来制备样品。
根据本发明的第二方面，公开了一种质谱仪系统，其包括：(a)质谱仪，包括：(a1)离子源；(a2)离子选择或纯化装置，所述装置配置为从离子源接收离子；(a3)碎裂池，所述碎裂池配置为从离子选择或纯化装置中接收离子； (a4)质量分析器，所述质量分析器配置为接收来自离子选择或纯化装置的前体离子或来自碎裂池的碎片离子；以及(a5)检测器，所述检测器配置为接收来自质量分析器的离子；(b)电耦合到质谱仪的电源；以及(c)与质谱仪和电源电耦合的控制器，其中控制器包括计算机可读指令，其可运行以使控制器直接执行或使质谱仪执行靶肽的至少部分上述质谱方法。
附图说明
本发明的上述及各种其它方面将从以下描述中变得显而易见，以下描述仅以示例的方式给出并参考了附图，附图未按比例绘制，其中：
图1是肽骨架结构的图示，示出了肽和蛋白质的碎片离子通常采用的命名法；
图2是在指定的碎片离子指数范围内观察到的HeLa蛋白提取物胰蛋白酶消化物的约43000个碎片离子独特序列的各种离子类型分布的一组柱状图，这是由在具有140分钟梯度的纳米液相色谱分离中对消化物进行分级分离而产生的，其中每个碎片离子指数是相对于相应的双电荷前体离子的m/z取得的；
图3A是图2的胰蛋白酶消化物的约25000个碎片离子独特序列的出现总次数对常规指定的碎片离子指数的绘图(实线)，所述碎片离子独特序列是由在具有40分钟梯度的纳米液相色谱分离中对消化物进行分级分离而产生的，还包括表示在两种不同的约束情形下，明确地将观测到的质谱线分配给离子序列的计算概率与分配的碎片离子指数的柱状图；
图3B是图3A的数据的重绘图，其中每个碎片离子指数是相对于相应的双电荷前体离子的m/z取得的；
图4A是观察到的第二代碎片离子独特序列的各种离子类型相对于指定的碎片离子指数的分布的一组柱状图，所述第二代碎片离子独特序列是通过使用束射型碰撞诱导解离对图2的胰蛋白酶消化物的所选第一代碎片离子进行碎裂而获得的，其中所述消化物在具有40分钟梯度的纳米液相色谱分离中分级分离，并且其中每个碎片离子指数相对于相应的双电荷前体离子的m/z取得；
图4B是观察到的第二代碎片离子独特序列的各种离子类型相对于指定的碎片离子指数的分布的一组柱状图，所述第二代碎片离子独特序列通过使用共振激发型碰撞诱导解离将图2的胰蛋白酶消化物的所选第一代碎片离子碎裂而获得，其中所述消化物在具有40分钟梯度的纳米液相色谱分离中分级分离，并且其中每个碎片离子指数相对于相应的双电荷前体离子的m/z取得；
图5A是第一代碎片离子的质谱图(即MS-2质谱)，所述第一代碎片离子是通过将由序列SFANQPLEVVYSK组成的肽的2+离子种类进行碎裂而产生的，所述序列SFANQPLEVVYSK被混合到图2的HeLa蛋白提取物胰蛋白酶消化物中，其中由星形符号表示的质谱线表示选择用于共分离和同时碎裂的y 型第一代碎片离子种类，每个所选的离子种类具有大于其各自前体离子m/z的 m/z；
图5B是通过图5A中所示的所选第一代碎片离子种类的同时碎裂而生成的第二代碎片离子的质谱图(即MS-3质谱)，其中用于量化的第二代离子种类由菱形符号表示；
图6A是在由混合到HeLa蛋白消化物中的序列SFANQPLEVVYSK组成的肽进行液相色谱分级分离时生成的图5A所示的所选第一代y-型碎片离子种类的复合离子色谱图，其中所绘曲线表示对应于所选第一代y-型碎片离子种类的质谱线强度之和；
图6B是在肽SFANQPLEVVYSK液相色谱分级分离过程中生成的图5B所示的所选第二代y-型碎片离子的复合离子色谱图，其中所绘曲线表示对应于所选第二代y-型碎片离子的质谱线强度之和；
图7A-图7B是根据本发明的用于靶向质谱分析的第一方法的流程图的两个局部视图；
图8A-图8C是根据本发明的用于靶向质谱分析的第二方法的流程图的三个局部视图；以及
图9是根据本发明的各种实施例的示例性质谱分析系统的示意性框图。
具体实施方式
下面的描述是为了使本领域技术人员能够制造和使用本发明，并且是在特定应用及其要求的背景下提供的。对所述实施例的各种修改对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且本文中的通用原则可以应用于其它实施例。因此，本发明并不限于所示的实施例和实例，而是根据所示和所述的特征和原理给予尽可能广泛的范围。结合以下描述和附图，本发明的特定特征和优点将变得更加清楚。
在本文对本发明的描述中，应当理解，以单数形式出现的词包含其复数形式的对应词，并且以复数形式出现的词包含其单数形式的对应词，除非另有暗示或明确的理解或说明。因此，如本文所使用的“一”或“一个”也可以指“至少一个”或“一个或多个”，除非另有说明。此外，除非另有说明，所使用的“或”是包括性的，例如当“A”为真，“B”为真，或“A”和“B”都为真时，短语“A或B”为真。
还应当理解，对于本文所述的任何给定组件或实施例，为该组件列出的任何可能的候选项或备选项通常可以单独使用或与其他组件组合使用，除非另有隐含或明确的理解或说明。应当理解，此类候选或备选项的任何列表仅仅是说明性的，而不是限制性的，除非另有隐含或明确的理解或说明。此外，应当理解，本文所示的附图不一定是按比例绘制的，其中一些元件可能只是为了说明本发明而绘制。而且，在各个附图中可以重复附图标记以显示相应或类似的元件。
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义) 为准。还应当理解，在本发明中提及的量化术语之前存在暗示的“约”，使得轻微的和非实质性的偏差在本发明的范围内。在本发明中，除非另外特别说明，单数的使用包括复数。而且，所使用的“包含”、“包含”、“包含”、“含有”、“含有”、“含有”、“包括”、“包括”和“包括”并不旨在限制。
本发明的各个方面涉及所谓的靶向质谱分析。本文所用的“靶向分析”一词是指针对检测样品中特定已知所关注分析物的存在和/或测定样品中特定已知所关注分析物的丰度或相对丰度的测量或一组测量。因此，要确定其丰度和/ 或存在的所关注的分析物可以称为“靶向分析物”，并且通过使靶向分析物电离或通过使靶向分析物的电离产生的离子种类碎裂而产生的离子种类可以称为“靶向离子种类”。类似地，对应于靶向离子种类的质谱峰或线可称为“靶向质谱峰”或“靶向质谱线”。
如本文所述，术语“MS-2”(或等同地，MS2或“MS/MS”)是指事件序列，其中：(a)纯化或部分纯化包含质荷比为(m/z)p的所关注的前体离子种类；(b) 将纯化或部分纯化的前体离子种类在碎裂池或碰撞池中进行碎裂，从而生成具有质荷比值(m/z)f1、(m/z)f2、(m/z)f3,…的多个第一代产物离子种类的第一代产物离子；以及(c)质谱分析产物离子种类，以验证它们的存在和/或测量它们的丰度或相对丰度。当用于具体指一种或多种离子种类时，术语“MS-2”用于表示第一代产物离子种类。类似地，当用于具体指一种或多种离子种类时，术语“MS-1”用于表示前体离子种类。
如本文所述，术语MS-3(或等同地，MS3或“MS/MS/MS”)是指事件序列，其中：(a)纯化或部分纯化包含质荷比为(m/z)p的所关注的前体离子种类； (b)将纯化或部分纯化的前体离子种类在碎裂池或碰撞池中进行碎裂，从而生成具有质荷比值(m/z)f1、(m/z)f2、(m/z)f3……的多个第一代产物离子种类的第一代产物离子；(c)纯化或部分纯化第一代所关注的产物离子种类(m/z)fn；(d)将纯化或部分纯化的第一代产物离子种类在碎裂池或碰撞池中进行碎裂，从而生成具有质荷比值(m/z)g1、(m/z)g2、(m/z)g3,……的多个第二代产物离子种类的第二代产物离子；以及(e)质谱分析第二代产物离子种类，以验证它们的存在和/ 或测量它们的丰度或相对丰度。当用于具体指一种或多种离子种类时，术语“MS-3”用于表示第二代产物离子种类。
如本文所述，术语“碎裂事件”是指碎裂池或碰撞池内包括一个或多个所关注的离子种类的离子碎裂。如果多于一种离子种类的离子在碎裂事件中碎裂，则它们可以按顺序碎裂或同时碎裂。例如，在碎裂事件期间的顺序碎裂可以包含向碎裂或碰撞池提供连续的离子流，其中不同种类的离子分别在不同的时间引入到离子流中。可选地，同时碎裂可包含在离子存储装置内累积各种不同前体离子种类并随后将离子混合物释放到碎裂或碰撞池中的初始步骤。如本文所述，术语“共碎裂”是指在单个碎裂事件中多个离子种类的碎裂(按顺序地或同时地)。
一旦在碎裂池或碰撞池内生成，产物离子(第一代或第二代)可以直接传输到具有用于质谱分析和检测的检测器的质量分析器中。可选地，如上文所定义，由单个碎裂事件或多个碎裂事件生成的产物离子可在离子存储装置内累积为离子种类的混合物，然后引入质量分析器中。然后可以将产物离子种类的混合物转移到具有用于同时质谱分析和检测的检测器的质量分析器中。
如上文和本文其它地方所述，术语“纯化的”是指在从所关注的特定单个离子种类中消除不关注的其它污染物或背景离子种类的过程之后保留的单个离子种类。在操作上，这通常通过消除包含m/z值的离子来实现的，所述m/z值在关于所关注的离子种类的特定m/z的特定m/z范围之外，例如在关于特定m/z 值的±2Th或±1Th的范围之外。在消除不关注的各种离子种类之后保留在质谱仪或质量分析器内的(优选地)单个离子种类可以称为“纯化的”离子种类，或可选地，“分离的”离子种类。
如上文和本文其它地方所述，术语“部分纯化的”是指在消除其它不关注的污染物或背景离子种类的过程之后保留的具有(m/z)1的质荷比值的离子种类，同时保留具有质荷比值(m/z)2、(m/z)3、(m/z)4,…的其它所关注的离子种类，以及具有质荷比值(m/z)1的离子种类。根据该定义，当离子种类以混合物的形式存在，所述混合物还包含有限数目的其它所选的所关注离子种类，但不包括至少一些其它不关注的离子种类时，离子种类为部分纯化的。这种部分纯化的定义包括这样的情况，其中至少一些不特别所关注的低丰度污染物或背景离子种类可以在部分纯化步骤之后与所关注的离子种类保持混合。在操作上，可以通过消除包含m/z值不在(m/z)1、(m/z)2、(m/z)3、(m/z)4,…等中的至少一个的特定m/z范围(例如±2Th或±1Th范围)内的离子来实现部分纯化过程。可选地，部分纯化步骤可包含消除m/z值大于或小于特定m/z值的离子种类，同时保留所有其它离子种类。在消除不关注的各种离子种类之后保留在质谱仪或质量分析器内的多个离子种类可以称为“共纯化的”离子种类，或者可选地，“共分离的”离子种类。如本文所述，术语“共纯化”是指产生此类离子种类混合物的过程。本文所使用的术语“纯化”和“共纯化”旨在包括本技术领域中分别称为“分离”和“共分离”的各种过程。
在某些情况下，部分纯化可以包括分别纯化各种所关注的离子种类，然后将其一起存储在离子存储设备中。在某些情况下，部分纯化可包括离子阱内的多位点共纯化或使离子通过四极滤质器。多位点共纯化，其进一步描述于美国授权公告No.2014/0339421中，其全部内容通过引用并入本文，其是指在单个纯化事件中全部消除不关注离子的过程。
参考图9，其是根据本发明的各种实施例的示例性质谱分析系统的示意性框图，或者可选地，根据本发明的实施例可在其上实施。质谱分析系统900的各种实施例可包括如图9的框图中所示的组件。根据各种实施例，质谱系统900 可以包括质谱仪902，其中包括真空室910，其内部911通过抽空系统904保持在真空状态，控制器908和一个或多个电源906以提供一个或多个适当的振荡 (交流电AC)电压，向质谱仪的各个电极施加振荡射频(RF)电压或非振荡(直流电DC)电压。质谱仪902包括离子源912(其可以设置在真空室910的内部或外部)，用于电离从样品源901接收的化合物的分子；离子选择或纯化(S/P) 装置913，用于纯化或部分纯化所选离子种类的离子；碎裂池(FC)914，其通过束射类型(bCID)或共振激发类型(rCID)碰撞诱导解离来碎裂离子；质量分析器(MA)915，其配置为接收来自离子选择或纯化装置的前体离子或来自碎裂池的碎片离子，用于根据它们的不同质荷比(m/z)值来分离离子种类或以其他方式区分离子种类；以及检测器916，用于检测和测量各种离子种类的数量。
在各种实施例中，离子选择或纯化(S/P)装置913可包含仅使选择离子种类完全通过其中的四极滤质器或多极离子阱，例如三维阱或线性离子阱，其经配置以在保留选择离子的同时从所述阱共振地喷射不需要的离子。在各种实施例中，离子源903从样品生成多个离子。离子源可以是基质辅助激光解吸/电离 (MALDI)源或电喷雾电离(ESI)源、热喷雾离子源、纸喷雾离子源或能够生成可测量比例的具有通式[M+2A]2+的离子的任何其它离子源，其中M表示中性肽分子的组成，A表示携带单个正电荷的加合物离子，并且其中两个加合物A中的每一个可以是质子或碱金属阳离子。因此，本文所使用的通式[M+2A]2+表示[M+2H]2+、[M+2Na]2+、[M+H+Na]2+等中的任一种。已知肽的胰蛋白酶消化物的电喷雾电离产生高比例的双质子化的所谓“分子离子”，其具有式[M+2H]2+ (参见，例如，美国专利No.5,952,653，其全部内容通过引用并入本文)。然而，此类离子种类以及具有通式[M+2A]2+的离子可以在没有胰蛋白酶消化的情况下以较小比例通过以上列出的离子源类型生成。
在各种实施例中，质量分析器915可基于离子的m/z值来分离离子。例如，质量分析器915可以包括四极滤质器分析器、四极离子阱分析器、飞行时间 (TOF)分析器、静电阱(例如，轨道阱ORBITRAP)质量分析器、傅立叶变换离子回旋共振(FT-ICR)质量分析器等。在各种实施例中，离子检测器106可检测离子。例如，离子检测器106可包括电子倍增器、法拉第杯等。离开质量分析器的离子可由离子检测器检测。在其它情况下，离子阱可以包含静电阱质量分析器的一组探测电极，当离子在阱内移动时，通过电极内感应的图像电流探测到离子。在各种实施例中，离子检测器可以是量化的，从而可以确定离子的精确计数。质谱仪可以包含许多附加组件(未示出)，例如真空室的隔板、离子传输管、碰撞气体供应和入口、用于在组件和离子透镜之间路由离子的离子导向器和离子开关，或用于控制部件之间的离子流定时、用于控制离子动能、用于聚焦离子束或用于抑制离子流的关口等。
在各种实施例中，控制器908可通过与一个或多个电源906通信来控制质谱仪902的运行，从而向质谱仪的电极提供电压或电压波形，以引起适当的操作或离子流动。可选地，控制器可将指令信号直接发送到质谱仪的组件，例如离子源903、选择/纯化装置913、碎裂池914、质量分析器915和/或离子检测器916。控制器908还可以接收由检测器916获得并与之通信的数据。控制器 908可从质谱仪内不同位置处的传感器(例如，温度、压力等)接收信息。
控制器908包括耦合到电子存储器的至少一个中央处理单元(“CPU”)。每个CPU通常使用设置在一个或多个物理集成电路装置或芯片上的电路逻辑以硬件来实现。每个CPU可以是或可以包括一个或多个微处理器、微控制器、现场可编程门阵列或专用集成电路ASIC，而电子存储器可以包括随机存取存储器 (“RAM”)、动态随机存取存储器(“DRAM”)、静态随机存取存储器(“SRAM”)、闪速存储器和/或另一数字存储介质，并且还通常使用设置在一个或多个物理集成电路器件或芯片上的电路逻辑来实现。因此，可以认为存储器包括物理上位于别处的存储装置，例如至少一个CPU中的任何高速缓冲存储器，以及用作虚拟存储器的任何存储容量，例如存储在大容量存储设备上或存储在本地网络上或因特网上，通过至少一个网络接口耦合到控制器。存储器可以配备有计算机可读电子指令(例如，程序)，当控制器的逻辑电路访问并执行该指令时，该指令使得控制器908操作质谱仪系统900的硬件组件，从而执行根据本发明的下述质谱测量方法。
控制器可以包含或可以配备有计算机可读程序代码，其使得质谱仪执行根据本发明的方法，如下所述。例如，控制器908可以在执行代码期间发送注释信号，这些信号配置离子源903或启用/禁用离子源。另外，控制器908可在代码执行期间传输指令，所述指令配置质量分析器916以选择特定质谱范围来检测，其致使对特定种类的离子进行纯化或部分纯化，从而调节离子检测器916 的灵敏度或增益，使所选择的离子种类传输到碎裂池914并在其中进行碎裂，使所选择的离子种类累积在使离子传输到检测器916的离子存储装置(未示出) 中，等等。程序代码的执行可根据或响应于从检测器916接收到的测量数据而自动改变。
作为研究如何使任何给定肽分析物的MS-3碎片离子种类的选择系统化的问题的序言，第一个问题是通过测量这些离子的丰度和特异性，重新验证具有最大m/z值的y型MS-2肽离子种类应当提供最佳MS-2诊断结果的常规知识。这些结果稍后可以与MS-3离子种类的特异性进行比较。为了进行重新验证，执行标准液相色谱-质谱联用仪LC-MS实验；其中将来自Henrietta Lacks的海拉(HeLa)细胞系(来源，Sigma Aldrich)的1μg胰蛋白酶消化的蛋白质以 300nl/min的140分钟梯度引入到纳米液相色谱LC中，以数据相关采集(DDA) 方式分析洗脱液，其中采集一系列测量质谱并分离和碎裂双电荷(2+)离子种类。质谱分析所得碎片离子种类(MS-2种类)。用购自美国马塞诸塞州Thermo Fisher Scientific ofWaltham公司的Proteome Discoverer(PD)2.1管对数据进行分析。PD分析包括通过将实验碎片与来自所有可能肽的理论上产生的碎片的数据库匹配来确定产生MS-2光谱的肽序列，并结合统计分析来确定这些匹配的重要性。该方法确定了150000个肽序列，其中43000个为独特序列。将共同序列的光谱进行平均，并根据图1所示的方案将峰强度分配到相应的统计堆内，其中例如，指数“1”对应于m/z大于2+前体m/z的第一y型离子种类。这些数据表明，在所有离子类型中，y型MS-2离子的强度最大，而m/z比前体大的离子丰度最高。
为了确定这些y离子作为各自肽序列的唯一标识符的效用，使用40分钟梯度进行了多次相同类型的DDA实验，这更符合高通量靶向肽分析常见的时间框架。收集四个独立实验的结果，得到25k个独特序列。对于这些肽中的每个，计算其y-离子不受来自系综中所有其它肽的碎片离子的干扰(也称为“碰撞”) 的概率。这种碰撞分析将肽数据置于一系列过滤条件下，以确定是否会发生碰撞。根据过滤条件，如果2+前体质量在±0.35Da内，如果保留时间在±1.0min 内，并且如果任何理论碎片离子在预期y-离子的±0.35Da或±0.0125Da内，则推测发生碰撞。后两个范围分别是典型的四极质量分析器分辨率和ORBITRAP㈤静电阱质量分析器分辨率。
上述数据相关实验和后续分析的结果如图图3A和3B所示，其中直方图说明了在假定的过滤条件下每个特定y型碎片离子不受任何干扰(碰撞)的概率。在图3A中，y离子指数是根据惯例指定的(例如，参见图1)；在图3B中，每个y型离子的指数相对于其各自前体离子的m/z位置重新赋值，并根据重新赋值的指数合并数据。图3A-图3B中的柱状图203a对应于当两个y型碎片离子种类的m/z值彼此在±0.0125Da内时假定发生碰撞的过滤条件；图3A-3B中的柱状图203b对应于当两个y型碎片离子种类的m/z值彼此在±0.35Da内时假定发生碰撞的过滤条件。图3A-图3B中的曲线201是关于每个柱状图栈中包括的质谱峰数目的绘图，是肽碎片大小分布的度量。结果证实了传统的观点，即肽越大，越有可能不受干扰。值得注意的是，2+前体的位置用作具有高碰撞概率和低碰撞概率的离子之间的一般边界。因此，选择要进行共分离和共碎裂的第一代离子种类(即MS-2离子种类)的有用且简单的规则是选择m/z值大于前体离子的m/z值的n1个最丰富的y型离子种类，其中n1是一个预定的数目。另外，精确-质谱MS-2分析的好处在于，在不受干扰的情况下，测量±0.0125Da 偏差y-转变的可能性比测量±0.35Da偏差的更大。这些偏差分别代表在m/z为 500时大约20k和700的质谱分析分辨率。
随后，进行第二组实验，在一大组肽上收集MS-3数据。扩展具有DDA分析的40分钟梯度，使得对于每个MS-2光谱，选择m/z大于前体的三种最丰富的第一代碎片离子种类进行分离和碎裂，从而生成第二代碎片离子。该实验进行四次，两次使用束射类型CID碎裂(bCID)，两次使用共振激发型CID(rCID) 碎裂。用PD分析管对MS-2数据进行分析，每次运行产生约4000个测序肽，总共生成3000个独特肽。对可以成功结合肽序列的每个MS-2光谱对应的MS-3 光谱进行分析。每个MS-3光谱的{质量，强度}对进行重组，使得质谱轴相对于相应的第一代碎片离子种类。来自2+肽前体离子种类的数据如图4A和4B 所示，用于束射类型碎裂(bCID)和共振激发类型碎裂(rCID)。在这两种情况下，大部分离子流集中在y型离子及其水和氨损失中。因此，MS-3碎片的特性在大多数情况下是已知的。结果发现，在一般情况下，形成的大多数碎片的 m/z值小于生成其的相应第一代碎片离子种类的m/z值。然而，对于2+尤其是 3+MS-3第一代碎片离子种类的碎裂，可能存在以更大m/z形成的一些第二代碎片离子。
这些数据可用于构建一种通用的多路复用MS-3肽靶向分析方法。给定肽序列，应选择一组预测丰度最大的MS-2碎片同时进行分离和激活。根据图2 中的数据，可以看出选择m/z大于前体m/z的MS-2离子种类将是自然的边界选择，从而使大量的离子可以进行第二次碎裂，并为MS-3离子种类提供一个可用的m/z范围。因此，应当用于量化的离子是m/z小于被选择用于随后碎裂的 MS-2离子种类的最低m/z的MS-3离子种类。
在图5A和图5B中描述了使用该方法的实际实施例，其分别说明了由序列SFANQPLEVVYSK组成的肽的MS-2质谱和MS-3质谱，该序列被混合到前述的HeLa蛋白提取物胰蛋白酶消化物中，如在肽的2+离子种类的碎裂之后获得的。图5A中用星号标记的线表示共纯化和共碎裂的第一代碎片离子种类，图 5B中的菱形表示选择用于肽定量的第二代碎片离子种类。用于选择用于定量的第二代碎片离子种类的标准，如用于图5B的结果，是选择一组观察到强度彼此正相关的碎片离子种类，例如观察到强度在色谱洗脱期间共同变化的那些离子种类。来自干扰污染物或背景离子种类的峰不与主峰共同变化，因此不考虑定量过程。可替代地，选择可以仅限于y型离子种类，因为观察到这些种类是最丰富的类型。
图6A和6B是分别在图5A和5B中标记的通过bCID形成的MS-2离子和 MS-3离子的离子色谱图，并且提供可以通过实施根据本发明的方法实现的选择性改进的视觉表示。具体地，图6A的图600是在目标肽SFANQPLEVVYSK 的色谱洗脱过程中获得的没有干扰的y-型MS-2离子的离子色谱图。图6B的曲线图650是衍生自相应MS-3碎片的离子色谱图，其峰651具有小得多的干扰，更平坦的基线653，因此比MS-2离子色谱图表现出更好的选择性。
当前体离子(即，MS-1离子种类)携带电荷2+时，则关于哪个第一代碎片离子种类(即，MS-2离子种类)将被碎片化以及哪个第二代碎片离子种类(即， MS-3离子种类)将被用于定量的上述选择标准通常导致选择m/z值小于原始前体离子的MS-3离子种类。因此，在许多情况下，选择MS-3离子种类的简单选择标准可能是选择m/z值小于前体离子的m/z的n2个最丰富的y型MS-3离子种类。其中n2是预定数目。因为存在MS-3碎片的广泛分布并且因为序列越长， MS-3碎片的分布越长(此处未显示数据)，最佳且最简单的程序是分离/碎裂 m/z值大于前体m/z的前六个(作为实例)y型MS-2离子种类(即，n2≤6)。 MS-2离子种类的这一有限数目通常将碎片以形成可观量的MS-3离子，其m/z 值小于前体离子种类的m/z，且因此可维持上文提及的简单选择标准。大多数 MS-2碎片丰度集中在刚好高于前体m/z的区域中，并且如欧洲公开 EP3249678A1中所公开的，其全部内容通过引用并入本文，当待共分离的离子的最小(m/z)1和最大(m/z)2落在一定范围内时，复用操作效果最佳。例如(m/z)2，≤2×(m/z)1。
在选择用于进一步碎裂的多电荷(3+或更大)MS-2离子种类的情况下，定量有用的MS-3离子的m/z范围可以更大。因此，如果用于定量的MS-3离子种类包括m/z值大于其碎裂产生MS-3离子种类的MS-2离子种类的最大m/z的 m/z值的离子种类，则可以获得最好的结果。通过将碎片化的MS-2离子种类限制为仅已知携带2+电荷状态的那些种类，可以避免这种复杂化。
对上述过程的修改可以改善总体结果。传统上，用于向多个前体离子种类赋予碎裂诱导能量的活化类型是所谓的束型碰撞诱导解离(此处缩写为bCID)，其中使离子在进入俘获区之前接收额外的动能，该俘获区还包括使动力学活化离子与之碰撞的中性气体分子。然而，目前教导的方法不限于这种活化模式。也可以使用其它模式，例如传统的共振激发型CID(这里缩写为rCID)。有几种方法来完成多种前体的共振活化和碎裂。一种此类的方式是以顺序的方式完成激活和碎裂，如2016海报演示中部分公开的(Remes，Philip M..《使用离子阱波形隔离进行的多靶向分析(Multiplexed Targeted Assays Using Ion TrapWaveform Isolation)》Proc.ASMS Ann.Conf.2016；Thermo Fisher Poster Note 64734)，通过引用将其全文并入本文，并且通过其使用单频波形每次一个前体地分离每个前体。随后已经认识到，进行多种前体的顺序活化的最佳方式是使活化按从高m/z到低m/z的顺序进行。例如，让有两种不同的前体离子种类m/z 300和m/z 1000被活化。当在从低m/z到高m/z的方向上活化时，将第一前体 (m/z 300)置于0.25的Mathieu q值以进行活化，因为该值传统上用作将能量放入前体中的能力和捕获由其产生的宽质谱范围的产物离子的能力之间的最佳折衷。在这种情况下，可以捕获的最低m/z碎片离子种类是(0.25×300)/0.908＝82Th。当下一个前体(m/z 1000)置于q＝0.25进行活化时，可以捕获的最低m/z 碎片是(0.25×1000)/0.908＝275Th。因此，使用从低到高的顺序活化过程导致从m/z 300离子种类形成的大部分碎片丢失。然而，通过在相反方向上进行，从高m/z前体活化到低m/z前体活化，碎片离子损失不是那么严重。在后一种情况下，m/z 1000离子形成其碎片直到m/z 275，然后m/z 300被激活，并且使其碎片直到m/z 82。
当活化和碎裂MS-2离子种类时从高m/z前进到低m/z也是有用的，因为由高m/zMS-2种类形成的任何MS-3碎片种类(当较低m/z MS-2种类碎裂时保留)本身可以进一步碎裂，以便产生较小的碎片，其m/z值然后将落入已经碎裂的m/z区域。选择用于定量。例如，图4显示最高丰度的MS-3碎片对应于仅仅2个残基的损失，结果是，在没有由高到低活化提供的进一步碎裂的情况下，一些MS-3离子种类的m/z值可能与定量区不一致。因此，随着碎裂的MS-2 离子种类数目的增加，这种高到低活化过程变得越来越有用。
因为从高m/z活化到低m/z是有利的，但是一些MS-2碎片离子不是y离子 (图2)，可以使用的另一种技术是活化整个m/z区域内的所有离子。也就是说，不是仅仅活化和碎裂m/z值大于前体m/z的y型离子种类，而是可以活化和碎裂该m/z区域中的所有离子。这可以通过将施加到碎裂池的电极上的俘获射频 (RF)振幅从高电压斜变到低电压来实现，从而使离子以从高到低m/z的顺序在q＝0.25处通过活化频率。另外，具有多个频率分量的波形可以施加在具有静态俘获RF幅度的一个或多个区域上。在这种同时活化的情况下，有必要应用从共同拥有的美国专利第9,875,885B2号获得的知识。其全文以引用的方式并入本文中，用于施加具有正确缩放的频率分量的激励波形，以便可以同时活化质谱和q不同的多个前体。
为了更好地说明上述过程，图7A-7B的集合和图8A-8C的集合描绘了根据本发明的用于靶向质谱分析的相应第一和第二方法的流程图。图7A-7B中概述的方法700涉及进行与肽分析物相关的定性或定量测定，其中该测定是基于单一质谱分析的结果，或可替代地，基于由组成不改变的单个样品进行的一组质谱分析的综合结果。在图8A-8C中概述的方法800涉及进行与肽分析物相关的定性或定量测定，其中该测定基于在分析物例如从色谱柱洗脱的过程中进行的一系列质谱分析。
方法700(图7A-7B)开始于检索(步骤701)所关注的肽分析物的靶向离子种类的目标质荷比(m/z)值，其中靶向离子种类具有如上定义的通式[M+2A]2+。这里假定目标m/z值(或多个值)是先验已知的，对应于当在与完成该方法所使用的条件对应的特定电离条件下电离时，目标分析物电离时产生的离子种类。一个或多个值可以从计算机可读存储中检索，例如数据库，可以基于肽分子M 和加合物A的假定组成来计算，可以由用户输入，可以从因特网检索等。
在方法700的步骤703中，使用质谱仪的离子源903(图9)电离样品或样品部分，其中离子源是能够产生可测量比例的具有通式[M+2A]2+的肽离子的类型，例如电喷雾型离子源。样品可以来自含有或怀疑含有所关注的肽分析物的任何样品。生物样本可包括例如血液、血清、血浆、尿液、粪便、痰、支气管扩张、鼻咽扩张、汗液、泪液、固体组织提取物、拭子(来自所有身体部位，包括皮肤)、脑脊液或唾液。环境样品可以包括例如食品、水或环境表面样品。任何前述样品、单独或组合，可以悬浮在合适的介质中，例如在溶剂中。
通常，样品在提供给质谱仪离子源之前以某种方式制备(步骤703)。样品制备可包括例如与溶剂混合、提取、生物细胞碎裂、离心、添加化学试剂或缓冲液、过滤、分级或其它化学分离等步骤。任选地，样品制备可以包括(任选的步骤702)通过生物样品的一种或多种蛋白质的蛋白水解酶消化(例如，通过胰蛋白酶消化)获得肽。在一些实验环境下，样品中少量(3-5种)某些特定肽的组合存在可以诊断衍生酶消化物的生物样品中特定靶向蛋白的存在。因此，如果目标肽分析物是此类一组肽中的一种，则通过执行方法700在样品中存在目标肽的阳性指示可能需要重复该方法，以便也调查该组中的其它肽是否存在于样品中。
在方法700的一些变型中，可以执行任选的705，由此操作质谱仪以便调查目标m/z值的存在，该目标m/z值指示可以通过靶向分析物的电离得到的目标离子种类。如果从测量中确定(步骤707)在调查中没有观察到对应于目标 m/z值的质谱峰，则可以推断(步骤708)靶向分析物以可调查的量不存在于样品中，并且因此可以终止方法700的执行。然而，通常，方法700的执行从步骤703进行到步骤709，在步骤709，对应于所选择的目标m/z的离子种类被纯化和碎裂。因此，碎裂的离子种类是前体离子种类，并且通过碎裂产生的碎片离子(产物离子)是第一代碎片离子种类(这里也称为MS-2离子种类)。碎裂可以通过束型碰撞诱导解离(bCID)或共振激发型碰撞诱导解离(rCID)完成。
通常，方法700的执行从步骤709进行到步骤715，在步骤715，第一代碎片离子种类的一部分本身被共分离和共碎裂，从而产生第二代碎片离子种类的群体(即，MS-3离子种类)。在步骤715中进一步碎裂的第一代碎片离子种类都具有大于前体目标m/z的m/z值。步骤715的碎裂可以通过束型碰撞诱导解离(bCID)或谐振激励型碰撞诱导解离(rCID)来完成。如果采用rCID过程，则优选地，多个第一代碎片离子的顺序活化和碎裂以从这些第一代碎片离子的高m/z值到低m/z值的顺序进行。
在方法700的变型中，任选的步骤711和713可以介于步骤709和715之间。在任选的步骤711中，质谱分析通过第一次碎裂(步骤709)产生的第一代碎片离子种类。然后，基于该质谱分析的结果，在步骤713中鉴定(即，选择)一定数目n1个第一代碎片离子种类作为用于步骤715中的进一步碎裂的前体离子，其中数目n1是可以包含预定恒定值的正整数。根据本发明，所选择的第一代碎片离子种类是m/z值大于前体离子种类的m/z值的y型离子种类。优选地，在步骤713中选择的第一代碎片离子种类是满足上述m/z条件的n1个最丰富的y型离子种类(例如，在图2中以正指数绘制的最丰富的y型离子)。否则，如果丰度不被用作峰选择标准，则m/z值大于前体的m/z值的峰的子集可以通过简单地从m/z值最接近前体的m/z值的碎片离子峰开始，按照m/z的升序计数直到数目n1的峰来确定。数目n1的值可以任意确定，或者更优选地，可以基于用户对可以预期的可用峰的近似数目的先验知识来确定，例如在前面段落中描述的。
在相同质谱分析的结果中，可以通过存在与互补b型离子种类相对应的峰来识别与y型离子种类相对应的质谱峰(参见图1)。一旦识别出代表y型离子种类的峰，则如图2所示，这种y型离子主要分布在仅少量碎片离子种类中(例如，此类种类的5-7种)。选择步骤713的上述逻辑子步骤可以在算法上实现，并因此由控制器908(图9)自动完成。应当注意，质谱分析步骤(步骤711) 和鉴定和选择步骤(713)通常可以跳过，因为如图2所示，相对于m/z区域中大于前体离子m/z的其它碎片离子类型，y型碎片离子种类将以大量存在。
随后在步骤717中质谱分析第二代碎片离子产生的离子步骤715。基于此质谱分析的结果，在步骤719(图7B)中鉴定(即，选择)特定整数n2个第二代碎片离子种类的质谱峰作为用于确定靶向分析物的定量丰度的标记。数目n2可以是整数常数，其基于可能预期的这种第二代碎片离子种类的近似数目的先前用户知识预定。根据本发明，选择用于定量丰度测定的峰是m/z值满足预定质荷比选择标准的那些峰。根据一些实施例，质荷比选择标准要求每个选择峰包含小于原始前体离子种类的m/z值(即，先前步骤705的目标m/z)的m/z值。根据一些其它实施例，质荷比选择标准要求每个所选择的峰包含在步骤709中碎裂的所有第一代碎片离子种类中小于最低m/z值的m/z值。(至少一些选择的峰将满足上述两个标准也是可能的。)
优选地，步骤719包括选择第二代碎片离子种类的一组峰，该第二代碎片离子种类的峰强度在时间上表现出彼此正相关，例如在色谱洗脱过程中共同变化。所选择的组可以包含所有此类的离子峰，其强度是相关的并且满足如上所述的质荷比选择标准之一。或者，所选择的组可以仅包含n2个最强峰，其强度相关并且满足质荷比选择标准之一。可替代地，所选择的组可以包含仅y型第二代碎片离子种类的峰，例如满足上述m/z选择标准中的一个或另一个的y型离子种类的n2个最强峰。众所周知，丰度可以从质谱峰高度确定或估计，优选地在基线之上，或可替代地，通过质谱峰下面的积分面积，优选地在基线校正之后。如果峰强度不用作峰选择标准，则满足m/z选择标准的相关峰或y型峰的子集可以通过以与关于任选的步骤713所述的类似方式简单计数来确定，除了y型质谱峰从高指数计数到低指数(参见图2)。因此，选择步骤719的逻辑子步骤可以在算法上实现并因此自动完成。
在方法700的步骤721中，将n2个质谱峰的峰强度(如在步骤719中确定的)相加。峰强度可以由质谱峰高度确定，优选地在基线之上，或可替代地，通过质谱峰下面的积分面积，优选地在基线校正之后。然后，该执行转到步骤 723，在该步骤中，峰强度的总和用于完成对样品中所关注的肽分析物的丰度或相对丰度进行定量或半定量测定。该步骤可以包括报告或记录所确定的丰度或相对丰度。定量或半定量测定可能需要使用已知量的合适校准材料预先校准质谱仪输出的强度标度。可替代地，定量或半定量测定可以采用与合适的内标物的比较，该内标物包含与所关注的分析物相似的化学性质，并且已经以已知量加入到样品中并经历如上所述的所有先前分析步骤。在执行步骤723之后，方法700的执行可以结束。
图8A-8C是根据本发明的用于靶向质谱分析的第二方法的流程图的三个局部视图。在图8A-8C中概述的方法800涉及测定基于在例如从色谱柱洗脱分析物的过程中进行的一系列质谱分析进行。所关注的分析物的定量分析不是来自任何单个质谱测量，而是通过确定离子色谱曲线下的面积来计算，一些实例描绘于图6A-6B中。
方法800的许多步骤与方法700的步骤基本相同。特别地，步骤801、802、 803、809、811、813、815和819(图8A-8B)分别基本上与方法700的步骤 701、702、703、709、711、713、715和719相同，因此这里不再描述。方法 800的主核心包含重复执行的一组步骤803、804、805、809、815、817和821，可能由任选的步骤811、813和819的一个或多个执行来补充。该组步骤的每个执行对应于所关注的肽分析物的已知或预期色谱洗脱期间的相应时间点(即，相应的保留时间)。在每个时间点进行MS-3分析，结果有助于构建特定于分析物的逐时间点的离子色谱图。在洗脱期结束时，将实验测量的信号强度相加，以确定离子色谱图的“曲线下面积”。初始步骤803的每个执行包含将样品的相应部分(例如，在特定时间从色谱柱出现的洗脱液)作为这些部分的连续流之一被引入质谱仪的电离源时，该部分电离。
在上述洗脱期之前，可以通过重复地执行判定步骤804的“否”分支重复地循环通过步骤803和804，以实现等待时间。在步骤804中确定是否已经开始洗脱期可以以多种方式中的一种或多种完成。例如，在相似的实验条件下，根据分析物的先前色谱分离，可以知道洗脱期的近似开始时间(以及结束时间)。因此，步骤804可以包含查阅定时器以及随后在实际经过时间(相对于参考实验开始时间)和预期开始时间之间的比较。为了确定离子色谱的预期峰(例如，图6B的峰651)的基线，可能希望在洗脱的实际开始之前稍微开始实验洗脱期，如图6B所示的时间t1。可替代地或可能另外地，可以通过连续测量总离子流来确定洗脱期的开始，总离子流由质谱仪的主离子检测器或辅助离子检测器测量。观察到离子流增加的时间可以与分析物洗脱的预期开始相关。作为又一替代方案，步骤804的每个执行可包含调查质谱分析以确定是否在目标前体离子的m/z 值处观察到质谱峰。一旦已经通过所采用的任何方式识别出洗脱期的开始，则执行经由步骤804的“是”分支前进到步骤805。如在判定步骤805中所确定的，洗脱期的结束可以以类似的方式进行。
在洗脱期间的每个时间点，在步骤809中纯化和碎裂目标前体离子种类，并且在步骤815中共分离和共碎裂如此产生的m/z值大于前体离子的目标m/z 的第一代碎片离子种类(图8B)。通常，方法800的执行可以直接从步骤809 进行到碎裂步骤815，而无需质谱分析和离子选择和分离，因为如图2所示，相对于m/z区域中大于前体离子m/z的其它碎片离子种类，y型碎片离子种类将以大量存在。然而，在方法800的变型中，任选的步骤811和813可以介于步骤809和815之间。在任选的步骤811中，质谱分析通过第一次碎裂(步骤809) 产生的第一代碎片离子种类。然后，基于该质谱分析的结果，在步骤813中鉴定(即，选择)一定数目n1个第一代碎片离子种类作为用于在步骤815中共分离和共碎裂的前体离子，其中数目n1是可以包含预定恒定值的正整数。根据本发明，所选择的第一代碎片离子种类是m/z值大于前体离子种类的m/z值的y 型离子种类。优选地，在步骤813中选择的所选择的第一代碎片离子种类是满足上述m/z条件的n1个最丰富的y型离子种类(例如，在图2中以正指数绘制的最丰富的y型离子)。否则，如果丰度不被用作峰选择标准，则m/z值大于前体的m/z值的峰的子集可以通过简单地从m/z值最接近前体的m/z值的碎片离子峰开始，按照m/z的升序计数直到数目n1的峰来确定。数目n1的值可以任意确定，或者更优选地，可以基于用户对可以预期的可用峰的近似数目的先验知识来确定，例如本文前面所描述的。
在碎裂步骤815中，第一代碎片离子种类被共分离并进一步碎裂，以便产生一组第二代碎片离子种类。然后在步骤817中质谱分析第二代碎片离子种类，并且基于质谱分析，然后在步骤821中记录对应于一定数目n2个所选择的第二代碎片离子种类的峰强度。步骤821可替代地包含或还可以包括对n2个峰强度求和。在每个执行步骤817和821时测量和记录的峰强度对应于肽分析物洗脱期间各自的时间点。因此，在步骤821的每个执行之后，方法800分支回到步骤803(图8A)，在步骤803处产生用于随后时间点的前体离子。
由于可能不存在关于其峰强度将被记录的第二代碎片离子种类的m/z值的先验知识，因此可能有必要在执行步骤803-821的至少一次迭代中确定这些值。因此，在至少一个此类的迭代中，可以执行调查步骤819。在步骤819中，鉴定并选择预定数目n2个第二代碎片离子种类。根据本发明，所选择的峰对应于第二代碎片离子种类，其m/z值满足预定的质荷比选择标准。根据一些实施例，质荷比选择标准要求每个选择峰包含小于原始前体离子种类的m/z值(即，先前步骤801的目标m/z)的m/z值。根据一些其它实施例，质荷比选择标准要求每个所选择的峰包含在步骤809中碎裂的所有第一代碎片离子种类中小于最低 m/z值的m/z值。(至少一些选择的峰将满足上述两个标准也是可能的。)
优选地，步骤819包括选择第二代碎片离子种类的一组峰，该第二代碎片离子种类的峰强度在时间上表现出彼此正相关，例如在色谱洗脱过程中共同变化。所选择的组可以包含所有此类的离子峰，其强度是相关的并且满足如上所述的质荷比选择标准之一。或者，所选择的组可以仅包含n2个最强峰，其强度相关并且满足质荷比选择标准之一。可替代地，所选择的组可以包含仅y型第二代碎片离子种类的峰，例如满足上述m/z选择标准中的一个或另一个的y型离子种类的n2个最强峰。众所周知，丰度可以从质谱峰高度确定或估计，优选地在基线之上，或可替代地，通过质谱峰下面的积分面积，优选地在基线校正之后。如果峰强度不用作峰选择标准，则满足m/z选择标准的相关峰或y型峰的子集可以通过以与关于方法700的任选的步骤713所述的类似方式简单计数来确定。除了y型质谱峰从高指数计数到低指数(参见图2)。因此，选择步骤 819的逻辑子步骤可以在算法上实现并因此自动完成。
一旦所关注的肽分析物的洗脱期结束，如在步骤805中所确定的，方法800 的执行分支到步骤831(图8C)，在步骤831计算对应于分析物的离子色谱峰曲线下的面积。该计算利用先前在步骤821的多次执行期间为所有时间点确定的强度数据。如果在步骤821中没有预先对各个时间点的每个峰强度求和，则该求和可以作为步骤831中的计算的一部分来完成。计算可以包括以已知方式对对应于分析物洗脱的时间点(例如，图6B的峰651)的测量数据完成基线校正，条件是一些时间点对应于基线部分653。步骤831还可以包括各种公知的数学步骤：信噪比分析、曲线平滑、最小二乘峰值建模和拟合、积分等。随后，在步骤833中使用步骤831的计算面积进行肽分析物丰度的定量或半定量测定。步骤831或步骤833可以利用已知量的合适校准材料预先校准质谱仪输出的强度标度。可替代地，定量或半定量测定可以采用与合适的内标物的比较，该内标物包含与所关注的分析物相似的化学性质，并且已经以已知量加入到样品中并经历如上所述的所有先前分析步骤。
包括在本申请中的讨论旨在用作基本描述。然而，读者应该意识到，具体讨论可能没有明确地描述所有可能的相关实施例，并且许多替换是隐含的。因此，所属领域的技术人员将容易认识到，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对所说明的实施例进行变化。例如，尽管方法700和方法800都是在假设关于目标分析物的唯一先验可用信息是单个前体离子的m/z的情况下示出和描述的，但是对于本领域普通技术人员显而易见的是，与可能的前体离子种类 (MS-1离子种类)、第一代碎片离子种类(MS-2离子种类)和第二代碎片离子种类(MS-2离子种类)有关的附加信息也可以在各种情况下获得。在此类情况下，可以修改信息检索步骤(步骤701和801)，以便输入该附加信息的一些或全部。
在一些变体中，所描绘的方法700和800利用质谱分析步骤(例如，步骤 711，817)和质谱峰搜索步骤(例如，步骤713、719、819)，这些步骤中的任一个或全部可以自动完成。为了“发现”一级和二级碎片离子种类的质谱峰以分别碎裂和可靠地用于定量。因此，本发明的方法是有利的，因为它们允许某些肽分析物的定性和定量分析，即使在事先不知道所关注的特定分析物(目标分析物)的精确碎裂行为的情况下。这些方法还可以利用包含质谱分析的附加步骤(例如，步骤705、804、805)来验证样品中所关注的前体离子种类的存在。本领域技术人员可以容易地认识到，一旦发现了这些峰的身份，则可以在数据库中获得该信息以用于随后执行该方法。因此，可以修改所描述的方法700 和800，以便包括将所发现的信息写入数据库的步骤。数据库中的每个条目可以包括肽分析物的描述，与采集对应于分析物的数据时采用的实验条件有关的信息，以及在执行本文所述的方法时观察到的对应于MS-1、MS-2和MS-3离子种类的峰的m/z值和强度。一旦信息已经被制表到数据库中并被整理，则方法的未来执行实例可任选地包括来自数据库的此类数据的输入(例如，步骤701 和801任选的部分b)，因为碎片离子种类的产生应当是可再现的，只要实验条件不改变。
本文提供的描述和术语都不旨在限制本发明的范围。本文提及的许多专利、专利申请、专利申请公开或其它文献通过引用整体并入本文，如同在本文中完全阐述一样。

Claims (27)

1.一种用于目标肽的质谱分析的方法，包括：
(a)接收或计算具有式[M+2A]2+的目标前体离子种类的前体质荷比值(m/z)p，其中M表示中性目标肽分子的组成并且每种加合物A是质子或碱金属阳离子；
(b)将样品引入质谱仪的离子源中，其中所述离子源能够通过使所述样品中的所述目标肽(如果存在)电离而生成所述目标前体离子种类；
(c)由所述离子源从所述样品中生成离子；
(d)纯化和碎裂包含所述(m/z)p的离子，因而从其中生成多个第一代碎片离子种类(MS-2种类)；
(e)共纯化和共碎裂所述多个所生成MS-2种类的子集，因而从其中生成多个第二代碎片离子种类(MS-3种类)，其中共纯化和共碎裂的MS-2种类中的每一种包含相应的大于(m/z)p的碎片质荷比值(m/z)f；
(f)质谱分析所述MS-3种类并选择所述多个所生成MS-3种类的子集，其中所选MS-3种类中的每一种均包含相应的满足质荷比选择标准的第二代碎片质荷比值(m/z)g；以及
(g)从对应于所选MS-3种类的质谱强度的总和，确定所述样品中所述目标肽的量。
2.如权利要求1中所述的方法，其中如果(m/z)g小于(m/z)p，则MS-3种类质荷比值(m/z)g满足所述质荷比选择标准。
3.如权利要求1中所述的方法，其中如果(m/z)g小于共纯化和共碎裂的所有所述MS-2种类中的最低m/z值，则MS-3种类质荷比值(m/z)g满足所述质荷比选择标准。
4.如权利要求1中所述的方法，其中选择所述多个所生成MS-3种类的子集包括仅选择是y型离子种类的MS-3种类。
5.如权利要求1中所述的方法，其中选择所述多个所生成MS-3种类的子集包括仅选择具有随时间表现出彼此正相关的质谱峰强度的MS-3种类。
6.如权利要求4中所述的方法，其中选择所述多个所生成MS-3种类的子集包括选择满足所述质荷比选择标准的n2个最丰富的y型MS-3种类，其中n2是预定的正整数。
7.如权利要求1中所述的方法，其中共碎裂所述多个所生成MS-2种类的子集包括通过共振激发型碰撞诱导的解离并且以其质荷比的相反顺序依次碎裂所述子集的所选MS-2种类。
8.如权利要求1中所述的方法，还包括在数据库条目中记录所述多个所生成MS-3种类的所选子集的所述离子种类的所述m/z值。
9.如权利要求1中所述的方法，还包括，在生成所述多个MS-2种类的步骤(d)之后并且在共纯化和共碎裂所述多个所生成MS-2种类的子集的步骤(e)之前：
质谱分析所述多个MS-2种类；以及
选择所述多个所生成MS-2种类的子集，其中所选MS-2种类中的每一种是y型离子种类。
10.如权利要求9中所述的方法，其中选择所述多个生成的MS-2种类的子集包括选择n1个最丰富的y型MS-2种类，对所述n1个最丰富的y型MS-2种类为真的是(m/z)f大于(m/z)p，其中n1是预定的正整数。
11.质谱仪系统，包含：
质谱仪，所述质谱仪包含：
离子源；
离子选择或纯化装置，所述装置配置为从所述离子源接收离子；
碎裂池，所述碎裂池配置为从所述离子选择或纯化装置接收离子；
质量分析器，所述质量分析器配置为接收来自所述离子选择或纯化装置的前体离子或来自所述碎裂池的碎片离子；以及
检测器，所述检测器配置为从所述质量分析器接收离子；
电源，所述电源电耦合到所述质谱仪；以及
控制器，所述控制器电耦合到所述质谱仪和所述电源，
其中所述控制器包含计算机可读指令，所述计算机可读指令可运行以使所述控制器：
接收或计算具有式[M+2A]2+的目标前体离子种类的前体质荷比值(m/z)p，其中M表示中性目标肽分子的组成并且每种加合物A是质子或碱金属阳离子；
使所述质谱仪纯化和碎裂包含所述(m/z)p的离子，因而从其中生成多个第一代碎片离子种类(MS-2种类)；
使所述质谱仪共纯化和共碎裂所述MS-2种类的子集，因而从其中生成多个第二代碎片离子种类(MS-3种类)，其中所述MS-2种类的子集的每个离子种类包含相应的大于(m/z)p的碎片质荷比值(m/z)f；
使所述质谱仪质谱分析所述MS-3种类；
选择所述多个所生成MS-3种类的子集，其中所选MS-3种类中的每一种均包含相应的满足质荷比选择标准的第二代碎片质荷比值(m/z)g；以及
从对应于所选MS-3种类的质谱强度的总和，确定所述样品中所述目标肽的量。
12.如权利要求11中所述的质谱仪系统，其中如果(m/z)g小于(m/z)p，则MS-3种类质荷比值(m/z)g满足所述质荷比选择标准。
13.如权利要求11中所述的质谱仪系统，其中如果(m/z)g小于共纯化和共碎裂的所有所述MS-2种类中的最低m/z值，则MS-3种类质荷比值(m/z)g满足所述质荷比选择标准。
14.如权利要求11中所述的质谱仪系统，其中可运行以使所述控制器选择所述多个所生成MS-3种类的子集的所述计算机可读指令包含指令，所述指令可运行以使所述控制器仅从所述多个所生成MS-3种类中选择y型离子种类。
15.如权利要求11中所述的质谱仪系统，其中可运行以使所述控制器选择所述多个所生成MS-3种类的子集的所述计算机可读指令包含指令，所述指令可运行以使所述控制器仅选择具有随时间表现出彼此正相关的质谱峰强度的MS-3种类。
16.如权利要求11中所述的质谱仪系统，其中可运行以使所述控制器选择所述多个所生成MS-3种类的子集的所述计算机可读指令包含可运行以使所述控制器选择满足所述质荷比选择标准的n2个最丰富的y型MS-3种类的指令，其中n2是预定的正整数。
17.如权利要求11中所述的质谱仪系统，其中可运行以使所述控制器使所述质谱仪共碎裂所述多个所生成MS-2种类的子集的所述计算机可读指令包含指令，所述指令可运行以使所述控制器引起所述质谱仪通过共振激发型碰撞诱导的解离并且以其质荷比的相反顺序依次碎裂所述子集的所选MS-2种类。
18.如权利要求11中所述的质谱仪系统，其中所述控制器进一步包含计算机可读指令，所述计算机可读指令可运行以使所述控制器在数据库条目中记录所述多个所生成MS-3种类的所选子集的所述离子种类的所述m/z值。
19.如权利要求11中所述的质谱仪系统，其中所述控制器进一步包含计算机可读指令，所述计算机可读指令可运行以使所述控制器引起所述质谱仪在生成所述多个MS-2种类之后并且在共纯化和共碎裂所述多个所生成MS-2种类的子集之前：
质谱分析所述多个MS-2种类；并且
选择所述多个所生成MS-2种类的子集，其中所选MS-2种类中的每一种是y型离子种类。
20.如权利要求19中所述的质谱仪系统，其中选择所述多个生成的MS-2种类的子集包括选择n1个最丰富的y型MS-2种类，对所述n1个最丰富的y型MS-2种类为真的是(m/z)f大于(m/z)p，其中n1是预定的正整数。
21.用于目标肽的质谱分析的方法，包括：
(a)接收或计算具有式[M+2A]2+的目标前体离子种类的前体质荷比值(m/z)p，其中M表示中性目标肽分子的组成并且每种加合物A是质子或碱金属阳离子；
(b)当所述目标肽从色谱柱洗脱时：
(b1)将包含所述目标肽的相应样品部分引入质谱仪的离子源中，其中所述离子源能够通过使所述样品中的所述目标肽(如果存在)电离而生成所述目标前体离子种类；
(b2)由所述离子源从所述样品中生成离子；
(b3)纯化和碎裂包含所述(m/z)p的离子，因而从其中生成多个第一代碎片离子种类(MS-2种类)；
(b4)共纯化和共碎裂所述多个所生成MS-2种类的子集，因而从其中生成多个第二代碎片离子种类(MS-3种类)，其中共纯化和共碎裂的MS-2种类中的每一种包含相应的大于(m/z)p的碎片质荷比值(m/z)f；以及
(b5)质谱分析所述MS-3种类并且记录多个质谱强度，每个强度对应于多个所生成MS-3种类的所选子集中的相应一者，其中所述子集中的所选MS-3种类中的每一个均包含相应的满足质荷比选择标准的第二代碎片质荷比值(m/z)g；以及
(c)基于所有记录的质谱强度确定所述样品中目标肽的量。
22.如权利要求21中所述的方法，其中如果(m/z)g小于(m/z)p，则MS-3种类质荷比值(m/z)g满足所述质荷比选择标准。
23.如权利要求21中所述的方法，其中如果生成所述MS-3种类期间，(m/z)g小于共纯化和共碎裂的所有所述MS-2种类中的最低m/z值，则MS-3种类质荷比值(m/z)g满足所述质荷比选择标准。
24.如权利要求21中所述的方法，其中选择所述多个所生成MS-3种类的子集的每个实例包括仅选择y型离子种类。
25.如权利要求21中所述的方法，其中选择所述多个所生成MS-3种类的子集的每个实例包括仅选择具有随时间表现出彼此正相关的质谱峰强度的MS-3种类。
26.如权利要求21中所述的方法，其中选择所述多个所生成MS-3种类的子集的每个实例包括选择满足所述质荷比选择标准的n2个最丰富的y型MS-3种类，其中n2是预定的正整数。
27.如权利要求21中所述的方法，其中共碎裂所述多个所生成MS-2种类的子集每个实例包括通过共振激发型碰撞诱导的解离并且以其质荷比的相反顺序依次碎裂所述子集的所选MS-2种类。
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