CN114509523A - 将嵌合ms2谱图的实时搜索结果馈送到动态排除列表中 - Google Patents

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Abstract

一种方法包含：获得第一质谱图；选择所述第一质谱图的第一峰；隔离包含所述第一峰的隔离窗口中的前体离子；对所隔离离子进行碎裂和分析以获得第二质谱图；对所述第二质谱图执行实时搜索以找到目标前体和与所述目标前体共隔离在某一隔离窗口中的近等压前体离子两者；将在所述实时搜索期间产生识别的所述前体离子添加到排除列表中；选择存在于所述第一质谱图中而不在所述排除列表上的第二峰；以及对所述第二峰的离子进行碎裂和分析以获得第三质谱图。

Description

将嵌合MS2谱图的实时搜索结果馈送到动态排除列表中
技术领域
本公开总体上涉及包含将嵌合MS2谱图的实时搜索结果馈送到动态排除列表中的离子色谱的领域。
背景技术
质谱仪通常与色谱系统耦接，以便识别和表征来自测试样品的洗脱物质。在这种耦合系统中，洗脱液被电离，并且获得一系列质谱扫描，用于随后的数据分析。由于测试样品可能含有许多物质或化合物，因此通常希望能够在感兴趣的物质或化合物洗脱时自动确定或识别它们，并使用这些识别通知随后的串联质谱收集。
被称为MSn的串联质谱法是一种使源自样品的前体离子在受控条件下经受碎裂来产生产物离子的流行且广泛使用的分析技术。串联质谱是一种每级质量分析之间具有碰撞或反应过程的利用多级质量分析的操作模式。通常，此碰撞或反应过程之前是离子选择步骤，其中一个或多个离子与母离子生成的其它前体离子隔离。多级质量分析的耦接通过提供关于化合物的碎裂或反应特征的额外信息，提供了确定或识别感兴趣的物质或化合物的能力。产物离子质谱含有可用于结构测定并且用于识别具有高特异性的样品组分的信息。具有两级质量分析的串联质谱分析法通常称为MS/MS或MS2。
在数据依赖模式中，洗脱样品由质谱仪自动分析。首先收集母体扫描图。此母体扫描图通常简单地为存在于电离的洗脱液中的所有物质的MS1扫描图。使用各种算法和标准，质谱仪识别母体扫描图中的离子，用于通过MS2进行后续分析。在一些数据依赖的质谱仪方法中，仪器然后可以在MS2扫描图中识别产物离子，用于通过更高阶MSn扫描进行进一步分析。用于前体离子识别的标准可以简单到强度阈值或电荷状态要求。或者所述标准可以涉及如动态排除列表等更复杂的过滤，其中先前选择用于MSn分析的离子在用户定义的时间段内从额外的MSn分析中排除。
在典型的MS2实验中，可以分析的前体的数量受到色谱峰宽度和质谱仪收集MS2扫描图所用时间的限制。从上文可以理解，需要最小化在数据依赖的MS2分析期间收集的数据中的冗余。
发明内容
在第一方面，一种方法可以包含：获得第一质谱图；选择所述第一质谱图的第一峰；隔离包含所述第一峰的隔离窗口中的前体离子；对所隔离离子进行碎裂和分析以获得第二质谱图；对所述第二质谱图执行实时搜索以找到目标前体和与所述目标前体共隔离在某一隔离窗口中的近等压前体离子两者；将在所述实时搜索期间产生识别的所述前体离子添加到排除列表中；选择存在于所述第一质谱图中而不在所述排除列表上的第二峰；以及对所述第二峰的离子进行碎裂和分析以获得第三质谱图。
在第一方面的各个实施例中，所述隔离窗口的宽度可以小于约10m/z。
在第一方面的各个实施例中，所述目标前体可以在所述实时搜索期间未识别到所述目标前体时添加到所述排除列表中。
在第一方面的各个实施例中，在选择所述第一质谱图的所述第一峰之前，所述方法可以进一步包含：隔离在宽度大于所述隔离窗口的宽度的第二隔离窗口中的前体离子；对所隔离离子进行碎裂和分析以获得第四质谱图；对所述第四质谱图执行实时搜索以找到共隔离在所述第二隔离窗口中的一组前体离子；以及将所述组前体离子添加到排除列表中。在特定实施例中，所述第二隔离窗口的所述宽度可以为至少约4m/z。在各个实施例中，其中所述第二隔离窗口可以是以数据独立性方式选择的。在各个实施例中，所述第二隔离窗口可以是基于第一质谱图中的多个峰的位置选择的。在特定实施例中，所述第二隔离窗口可以是基于所述第二隔离窗口内的前体离子峰的数量选择的。在特定实施例中，所述第二隔离窗口可以是基于用所述第二隔离窗口隔离的前体离子通量选择的。
在第二方面，一种方法可以包含：隔离具有第一宽度的第一隔离窗口中的前体离子；对所隔离离子进行碎裂和分析以获得第一质谱图；对所述第一质谱图执行实时搜索以找到共隔离在所述第一隔离窗口中的第一组前体离子；将所述第一组中在所述实时搜索期间产生识别的前体离子添加到排除列表中；选择不在所述排除列表上的未识别到的前体峰；隔离具有第二宽度的第二隔离窗口中的前体离子，所述第二宽度比所述第一宽度窄并且以所述未识别到的前体峰为中心；对所隔离离子进行碎裂和分析以获得第二质谱图；对所述第二质谱图执行实时搜索以找到目标前体和与所述目标前体共隔离在某一隔离窗口中的近等压前体离子两者；从所述第一质谱图中移除与第二组前体离子的碎片相对应的特征，以获得经缩减质谱图；对所述经缩减质谱图执行实时搜索以找到共隔离在所述第一隔离窗口中的第三组前体离子；将来自所述第一组、所述第二组和所述第三组的产生识别的前体离子添加到所述排除列表中；选择不在所述排除列表上的第二未识别到的峰；以及对所述第二未识别到的峰的离子进行碎裂和分析以获得第三质谱图。
在第二方面的各个实施例中，所述目标前体可以在通过所述实时搜索未识别到所述目标前体时添加到所述排除列表中。
在第二方面的各个实施例中，所述第二隔离窗口可以与所述第一隔离窗口至少部分地重叠。
在第二方面的各个实施例中，所述第一隔离窗口可以是以数据独立性方式确定的。
在第二方面的各个实施例中，所述第一隔离窗口可以是基于全谱扫描图(surveyscan)中的多个峰的位置选择的。在特定实施例中，所述第一隔离窗口可以是基于所述第一隔离窗口内的前体离子峰的数量选择的。在特定实施例中，其中所述第一隔离窗口是基于用所述第一隔离窗口隔离的前体离子通量选择的。
在第三方面，一种质谱仪可以包含：离子源，所述离子源被配置成对样品进行电离以产生离子；质量分析器，所述质量分析器被配置成产生质谱图；以及控制器。所述控制器可以被配置成：获得第一质谱图；选择所述第一质谱图的第一峰；隔离包含所述第一峰的隔离窗口中的前体离子；对所隔离离子进行碎裂和分析以获得第二质谱图；对所述第二质谱图执行实时搜索以找到目标前体和与所述目标前体共隔离在某一隔离窗口中的近等压前体离子两者；将在所述实时搜索期间产生识别的所述前体离子添加到排除列表中；选择存在于所述第一质谱图中而不在排除列表上的第二峰；并且对所述第二峰的离子进行碎裂和分析以获得第三质谱图。
在第三方面的各个实施例中，所述隔离窗口的宽度可以小于约10m/z。
在第三方面的各个实施例中，所述控制器可以被进一步配置成：在选择所述第一质谱图的所述第一峰之前，隔离宽度大于所述隔离窗口的宽度的第二隔离窗口中的前体离子；对所隔离离子进行碎裂和分析以获得第四质谱图；对所述第四质谱图执行实时搜索以找到共隔离在所述第二隔离窗口中的一组前体离子；并且将所述组前体离子添加到排除列表中。在特定实施例中，所述第二隔离窗口的所述宽度可以为至少约4m/z。在特定实施例中，所述第二隔离窗口可以是以数据独立性方式选择的。在特定实施例中，所述第二隔离窗口可以是基于第一质谱图中的多个峰的位置选择的。在更特定的实施例中，所述第二隔离窗口可以是基于所述第二隔离窗口内的前体离子峰的数量选择的。在更特定的实施例中，所述第二隔离窗口可以是基于用所述第二隔离窗口隔离的前体离子通量选择的。
附图说明
为了更完整地理解本文所公开的原理和其优点，现在参考结合附图进行的以下描述，在附图中：
图1是根据各个实施例的示例性质谱系统的框图。
图2是展示了根据各个实施例的方法数据依赖性分析的流程图。
图3A针对451.74m/z和451.89m/z的基峰色谱图和两个选定离子色谱图。
图3B、3C、3D、3E和3F是全MS扫描图的质谱图和展示了对451.74m/z和451.89m/z前体离子的数据依赖性分析的MS2谱图。
图4是展示了根据各个实施例的使用实时搜索结果识别嵌合谱图中的另外的前体的方法数据依赖性分析的流程图。
图5是展示了根据各个实施例的将数据独立性方法和数据依赖性方法与识别嵌合谱图中的另外的前体相结合的方法的流程图。
图6是展示了根据各个实施例的在呈宽和窄MS2谱图的组合的形式的嵌合谱图中识别另外的前体的方法的流程图。
图7是根据各个实施例的用于使用实时搜索结果执行数据依赖性分析以通知峰选择的示例性系统的框图。
应当理解的是，附图不一定按比例绘制，附图中的对象彼此之间的关系也不一定按比例绘制。附图是旨在使本文公开的设备、系统和方法的各个实施例清楚且易于理解的描绘。适当的时候，贯穿附图，将使用相同的附图标记来指代相同或相似的部分。而且，应当理解的是，附图不旨在以任何方式限制本发明教导的范围。
具体实施方式
本文描述了动态地排除可能存在于主扫描图中的产物离子的系统和方法的实施例。
本文所使用的章节标题仅仅是出于组织的目的并且不应被解释为以任何方式限制所描述的主题。
在对各个实施例的这种详细描述中，出于解释的目的，阐述了许多具体细节以提供对所公开的实施例的透彻理解。然而，本领域的技术人员将理解，可以在有或没有这些具体细节的情况下实践这些各个实施例。在其它情况下，结构和装置以框图形式示出。此外，本领域的技术人员可以容易地理解，呈现和执行方法的特定顺序是说明性的，并且经考虑可以改变所述顺序并且所述顺序仍然保持处于本文所公开的各个实施例的精神和范围内。
本申请中所引用的所有文献和类似材料，包含但不限于专利、专利申请、论文、书籍、专著和互联网网页，出于任何目的通过引用整体明确地并入。除非另外描述，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本文所描述的各个实施例所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。
应当理解，在本发明教导中讨论的温度、浓度、时间、压力、流速、横截面积等之前存在隐含的“约”，使得轻微的和非实质性的偏差都处于本发明教导的范围内。在本申请中，除非另外特别说明，否则单数的使用包含复数。而且，“包括(comprise或comprises或comprising)”、“含有(contain或contains或containing)”和“包含(include或includes或including)”的使用不旨在是限制性的。应当理解，上述的总体说明和以下详细说明两者均仅为示例性和解释性的并且不限制本发明教导。
如本文所使用的，“一个/种(a/an)”也可以指“至少一个”或“一个或多个”。而且，“或”的使用是包含性的，使得当“A”为真、“B”为真或“A”和“B”两者均为真时，短语“A或B”为真。进一步地，除非上下文另外要求，否则单数术语应该包含复数含义，并且复数术语应该包含单数含义。
“系统”阐述了一组真实或抽象的组件，包括整体，其中每个组件与整体内的至少另一个组件交互或相关。
质谱平台
质谱平台100的各个实施例可以包含如图1的框图中所示的组件。在各个实施例中，图1的元件可以合并为质谱平台100。根据各个实施例，质谱仪100可以包含离子源102、质量分析器104、离子检测器106和控制器108。
在各个实施例中，离子源102由样品生成多个离子。离子源可以包含但不限于：基质辅助激光解吸/电离(MALDI)源、电喷雾电离(ESI)源、大气压化学电离(APCI)源、大气压光电离源(APPI)、电感耦合等离子体(ICP)源、电子电离源、化学电离源、光电离源、辉光放电电离源、热喷雾电离源等。
在各个实施例中，质量分析器104可以基于离子的质荷比(m/z)分离离子。例如，质量分析器104可以包含四极滤质器分析仪、四极离子阱分析仪、飞行时间(TOF)分析仪、静电阱质量分析器(例如，轨道阱(ORBITRAP)质量分析器)、傅里叶变换离子回旋共振(FT-ICR)质量分析器等。在各个实施例中，质量分析器104还可以被配置成使用碰撞诱导解离(CID)、电子转移解离(ETD)、电子捕获解离(ECD)、光诱导解离(PID)、表面诱导解离(SID)等来碎裂离子，并且基于质荷比进一步分离碎裂离子。
在各个实施例中，质谱平台100可以包含多个质量分析器。以此方式，可以同时对两组离子进行质量分析。另外，如高分辨率静电阱质量分析器和低分辨率四极质量分析器或离子阱质量分析器等质量分析器可以具有不同的质量精确度和/或分辨率。
在各个实施例中，离子检测器106可以检测离子。例如，离子检测器106可以包含电子倍增器、法拉第杯(Faraday cup)等。可以通过离子检测器检测离开质量分析器的离子。在各个实施例中，离子检测器可以是定量的，使得可以确定离子的精确计数。
在各个实施例中，控制器108可以与离子源102、质量分析器104和离子检测器106通信。例如，控制器108可以配置离子源102或启用/禁用离子源102。另外，控制器108可以配置质量分析器104以选择将要检测的特定质量范围。进一步地，控制器108可以如通过调整增益调整离子检测器106的灵敏度。另外，控制器106可以基于检测到的离子的极性调整离子检测器106的极性。例如，离子检测器106可以被配置成检测正离子或被配置成检测负离子。
数据依赖性分析
图2是展示了数据依赖性分析200的方法的流程图。在202处，可以执行全谱扫描。全谱扫描可以用于识别存在于电离的洗脱液中的前体离子以用于进一步分析。通常，可以如通过利用低于引起碎裂所需阈值的低捕获能量在没有碎裂的情况下执行前体扫描。
在204处，可以在全谱扫描谱图(MS1谱图)中识别峰。本领域已知各种技术从质谱图中识别峰。通常，使用峰中心的某一近似值识别离子的质荷比。
在206处，可以选择峰用于分析。在各个实施例中，可以选择具有最高丰度的前体离子。在其它实施例中，可以至少部分地基于包括列表选择前体。包括列表可以包含特别感兴趣的质荷比或m/z范围，并且当在这些范围内检测到离子时，可以选择所述质荷比或m/z范围用于MS2分析。在另外的实施例中，可以使用排除列表避免如先前分析过的前体离子等列出的前体离子。已经采用许多其它标准选择用于分析的离子。通常将这些标准组合以对规则列表进行折衷。这些附加标准包含但不限于：电荷状态、单一同位素m/z分配、同位素比和质量差。
在208处，可以对选择的峰执行MS2分析。在第一阶段，可以基于从全谱扫描图中识别到的质荷比选择前体离子。可以碎裂选择的离子以产生产物离子，然后可以测量产物离子的质荷比。
在测量产物离子之后，可以在206处选择另一个峰用于分析。另外，可以周期性地执行202处的另外的全谱扫描，因为离子及其身份可以在整个色谱运行中改变。
在对复杂样品进行典型的数据依赖性LC-MS/MS分析期间收集的许多MS2扫描图可以是嵌合的。嵌合谱图含有来自多个共隔离前体的碎片离子。然而，在具有典型动态排除过滤器设置的标准数据依赖性分析期间，用于选择前体离子的算法可以用其自己的单独的MS2扫描图具体靶向这些近等压前体中的每个近等压前体。由于在这两次扫描中均可以对近等压前体进行隔离和碎裂，因此这些单独的MS2谱图中含有的MS2信息通常几乎是相同的。如此，本可以用于收集关于另外的前体的数据的时间被浪费在收集冗余信息上。
许多现代数据分析软件包支持搜索嵌合谱图。例如，所述软件可以识别近等压MS1前体离子并利用此额外的前体信息再次搜索对应的MS2谱图。研究复杂蛋白质组学样品的典型LC-MS/MS分析以识别嵌合谱图通常会产生>20％以上的肽谱匹配(peptide spectralmatch，PSM)。然而，这些PSM增益突显了在质谱仪如何收集数据，通常是收集可以作为关于这些近等压MS1特征的有效复制谱图的数据方面的低效率。理想地，仪器可以识别其何时从这些嵌合谱图之一拾取另外的PSM，并且然后智能地决定跳过收集另外的冗余MS2扫描图。
实时搜索(RTS)可以用于识别这些嵌合MS2扫描图中的所有肽谱匹配(PSM)。在各个实施例中，RTS可以包含在实验执行期间执行谱图搜索并且使用搜索结果通知前体选择或以其它方式修改正在进行的实验。如果RTS在嵌合MS2扫描图中成功识别出另外的前体，则还可以将这些另外的前体m/z值置入动态排除列表上。如果任何近等压前体不产生RTS谱图匹配，则不会将那些前体置入排除列表上，并且将来可能会通过另外的MS2扫描图靶向所述前体。
图3A-3F呈现了DDA实验收集了对近等压前体进行的连续MS2扫描(<0.2m/z的差异)的实例。质谱仪在同一MS1扫描图中识别出两种不同的前体，并且然后仪器收集了对两个物种进行的连续MS2扫描。图3A示出了色谱图(针对451.74m/z和451.89m/z的基峰色谱图和提取离子色谱图)。图3B示出了RT＝55.74处的MS1谱图。值得注意地，m/z＝451.74和m/z＝451.89处的近等压前体在同一保留时间洗脱。图3C是451.89m/z前体的MS2谱图，并且图3D是451.74m/z前体的MS2谱图。虽然两个MS2谱图之间存在一些差异，但大多数相同的产物离子在两次扫描中均出现。图3E和3F分别示出了451.89m/z前体和451.74m/z前体的识别。例如，峰302、304和306在图3E中未被识别但是451.74m/z前体的识别碎片，如图3F所示。类似地，峰308和310是图3E中的451.89m/z前体的识别碎片，但在图3F中作为未识别到的峰出现。这些数据是通过利用数据依赖性傅立叶变换MS2方法分析HeLa摘要来收集的。当与“前体检测”节点组合时，用Proteome Discoverer 2.5搜索这些数据会产生约6000个以上的PSM(40k对46k)，所述“前体检测”节点特意寻找嵌合MS2谱图并搜索另外的前体。
PSM的这种提升暴露了在典型的数据依赖性方法中MS2谱图收集的低效率。对于大多数这些嵌合谱图，近等压前体各自通过其自身相应的MS2扫描图进行询问。因此，即使“前体检测”算法导致PSM增加，唯一肽ID的数量增加也小得多(15％对5％)。那些相对增加之间的差异描述了不必要的MS2扫描子组。当在采集后正确搜索嵌合谱图时，扫描图含有不会向最终分析添加任何事物的冗余信息。
图4示出了使用实时搜索(RTS)克服由于对近等压前体执行冗余扫描而导致的低效率的方法400。在402处，执行初始MS1扫描，并且在404处，可以在MS1扫描图中识别潜在的前体离子(质量峰)。在406处，可以选择不在排除列表上的峰，以用于另外的分析。在各个实施例中，排除列表可以包含先前识别到的前体。在408处，可以对峰执行MS2分析。在各个实施例中，MS2分析可以涉及在峰处的窄质量范围内隔离前体离子并且对前体离子进行碎裂。在各个实施例中，MS2分析的隔离窗口可以为至少约0.4m/z并且不大于约10m/z，如不大于约5m/z，甚至不大于约2m/z。
在410处，可以使用实时谱图搜索以使用MS2谱图识别所有可能的匹配。在各个实施例中，这可以包含使用碎片离子识别具有目标m/z的前体离子以及在隔离窗口内具有m/z的近等压前体离子。在各个实施例中，对另外的前体的搜索可以基于在MS1扫描图中发现的其它前体峰。可替代地，另外的搜索可以基于理论前体列表，所述理论前体列表是基于MS2分析的隔离窗口生成的。在412处，可以将包含目标前体的所有识别前体添加到排除列表中。在各个实施例中，即使无法识别目标前体，也可以将目标前体添加到排除列表中。从MS2分析识别另外的前体并将所述前体添加到排除列表中可以避免对可以从第一次MS2分析中识别到的近等压前体离子执行第二次MS2分析。此提高的效率提供了可以在独特的前体离子之后消耗的另外的时间。
在将识别到的前体添加到排除列表中之后，可以在406处选择另一个峰以用于进行MS2分析或者可以执行另一个MS1扫描。通常，基于每个MS1扫描图执行若干MS2分析，但可以在整个色谱运行中收集多个MS1扫描图。
虽然所提供的实例示出了利用基本数据库查询进行实时搜索的标准的蛋白质组学数据依赖性MS2方法，但是本领域的技术人员将认识到此方法可以扩展到如小分子、n大于2的其它MSn水平等其它应用以及如谱图匹配等其它实时搜索技术。在线实时搜索的进一步扩展可以涉及用于搜索嵌合谱图的更先进的方法，例如多个MS2群体的谱减法和卷积拟合(convolved fitting)。
混合分析
使用RTS搜索嵌合谱图的一般概念可以扩展到包含利用混合数据独立性分析(DIA)/DDA和DDA/DDA方法的更先进的工作流程，其中第一次DIA或DDA扫描利用的隔离窗口比在“第二轮”分析中的DDA扫描利用的隔离窗口宽。
图5示出了用于使用RTS用于组合DIA和DDA技术的方法500。在502处，可以收集一系列DIA扫描。通常，这涉及将质量范围划分为子范围并收集针对子范围中的每个子范围的MS2扫描图。在504处，可以使用RTS来搜索DIA MS2扫描图以找到可能的匹配。由于DIA MS2扫描图的隔离窗口的宽度大于目标扫描或DDA MS2扫描图的典型隔离窗口宽度，因此在每个DIAMS2扫描图中可能会隔离更多的前体离子，从而使得对谱图进行去卷积和识别所有前体离子变得更加困难。然而，在此阶段通常可以识别至少一些前体离子。在506处，可以更新排除列表以包含从DIA MS2扫描图中识别到的任何前体。
在508处，可以收集DDA MS1扫描图，并且在510处，可以识别峰。在512处，可以选择不在排除列表上的峰。由于排除列表包含从DIA扫描中识别到的前体离子，因此将不会选择这些前体进行进一步分析。在514处，可以对峰执行DDA MS2分析。在516处，可以对DDA MS2扫描图执行RTS，以在DDA MS2扫描图的隔离窗口内识别目标前体以及任何近等压前体。此时，可以任选地更新排除列表以包含从DDAMS2扫描图中识别到的任何前体。在各个实施例中，即使无法识别目标前体，也可以将目标前体添加到排除列表中。
任选地，在518处，可以从DIA MS2扫描图中移除识别到的信号。在各个实施例中，可以从DIA MS2扫描图中减去对应于识别到的前体离子的碎片峰。在520处，可以搜索经缩减MS2扫描图以找到另外的前体匹配。在经缩减扫描图数据中的峰较少的情况下，可以识别另外的前体。这种解复用方法的可行性可以取决于这些DIA和DDA实验循环的时间以及DIA和DDA谱图质量如何对齐。
在522处，可以将来自DDA MS2扫描图和任选地经缩减DIA MS2扫描图的识别到的前体添加到排除列表中。接下来，可以在512处从DDA MS1扫描图中识别另外的峰，可以在508处收集另外的DDA MS1扫描图，或者可以在502处收集另外的一系列DIA MS2扫描图。通常，方法可以返回到512以识别用于DDA MS2分析的另外的峰，只要在DDA MS1扫描图中存在不在排除列表上的另外的峰，或者直到经过一定时间并且需要另外的DDA MS1扫描图或另一系列的DIA MS2扫描图。DDA与DIA扫描的确切平衡以及针对DDA和DIA扫描收集所分配的时间将根据样品和色谱条件而变化。
在各个实施例中，DDA MS2扫描图的隔离窗口的宽度可以为至少约0.2m/z，如至少约0.4m/z，并且不大于约10m/z，如不大于约5m/z，甚至不大于约2m/z。DIA MS2扫描图的隔离窗口可以比DDA MS2扫描图的隔离窗口的宽度宽，如至少约2.5m/z，如至少约5m/z，并且不大于约30m/z，如不大于约20m/z。通常，DIA MS2扫描图的隔离窗口的宽度可以是DDA MS2扫描图的隔离窗口的宽度的至少约两倍，如可以是DDA MS2扫描图的隔离窗口的宽度的至少约4倍。DIA MS2扫描图的隔离窗口的宽度可以比DDA MS2扫描图的隔离窗口的宽度不大于约50倍，如比DDA MS2扫描图的隔离窗口的宽度不大于约10倍。
图6示出了用于使用大隔离窗口执行初始轮MS2扫描和用更窄隔离窗口执行第二轮MS2扫描以靶向更加难以识别到的MS1特征的方法600。在602处，可以收集DDA MS1扫描图，并且在604处，可以识别峰。在606处，可以基于排除列表处理候选前体，以生成可行前体的列表。在608处，可以执行利用宽隔离窗口进行的MS2分析。可以使宽隔离窗口对齐以涵盖许多可行前体。在各个实施例中，可以选择宽隔离窗口以基于可行前体的分布划分MS1扫描图范围。可以基于MS1谱图区域中的峰的数量确定划分，使得峰密度较高的区域相比于峰密度较低的区域可以具有更小的隔离窗口，或者划分可以基于MS1谱图区域中的离子强度，使得更强峰的区域相比于较弱峰的区域可以具有更小的隔离窗口，或者其任何组合。在峰密度较高的区域收集更多的谱图可以降低这些区域中的宽MS2谱图的复杂性，这可以使得在此状态下能够识别更大部分的前体。在强度较高的区域收集更多的谱图可以平衡跨MS2谱图的离子通量，这可以增加对强度较弱的前体离子的灵敏度并最小化空间电荷效应，所述空间电荷效应在使用离子阱和具有有限的电荷容量和动态范围的阱状装置的质谱仪中可能是特别有问题的。在610处，可以对宽MS2扫描图执行RTS，以在宽MS2扫描图的隔离窗口内识别目标前体以及任何前体。
在612处，可以通过移除从宽MS2扫描图中识别到的前体来生成可行前体的经缩减列表。在614处，可以执行利用靶向来自经缩减可行前体列表的具体前体离子的窄隔离窗口进行的窄MS2分析。由于已经可行前体离子的经缩减列表中移除从宽MS2扫描图中识别到的前体离子，因此将不选择先前识别到的前体离子以用于进一步分析。在616处，可以对窄MS2扫描图执行RTS，以在窄MS2扫描图的隔离窗口内识别目标前体以及任何近等压前体。
任选地，在618处，可以从宽MS2扫描图中移除识别到的信号。在各个实施例中，可以从宽MS2扫描图中减去对应于识别到的前体离子的碎片峰。在620处，可以搜索经缩减宽MS2扫描图以找到另外的前体匹配。在经缩减扫描图数据中的峰较少的情况下，可以识别另外的前体。
在622处，可以将来自DDA MS2扫描图和任选地经缩减DIA MS2扫描图的识别到的前体添加到排除列表中。在各个实施例中，可以将通过窄MS2扫描图得到的目标前体添加到排除列表中，即使所述目标前体无法通过实时搜索识别出。接下来，可以在612处更新可行前体离子的经缩减列表，并且可以在614处对从可行前体离子的经缩减列表中识别到的另一个前体执行另外的MS2分析，可以在606处基于更新的排除列表过滤候选前体，并且可以在608处获得另外的宽MS分析，或者可以在602处收集另外的MS1扫描图。通常，方法可以返回到612以识别用于DDA MS2分析的另外的峰，只要在DDA MS1扫描图中存在不在排除列表上的另外的峰，或者直到经过一定时间并且需要另外的DDA MS1扫描图。
在各个实施例中，窄MS2扫描图的隔离窗口的宽度可以为至少约0.2m/z，如至少约0.4m/z，并且不大于约10m/z，如不大于约5m/z，甚至不大于约2m/z。宽MS2扫描图的隔离窗口可以比窄MS2扫描图的隔离窗口的宽度宽，如至少约2.5m/z，如至少约5m/z，并且不大于约30m/z，如不大于约20m/z。通常，宽MS2扫描图的隔离窗口的宽度可以是窄MS2扫描图的隔离窗口的宽度的至少约两倍，如可以是窄MS2扫描图的隔离窗口的宽度的至少约4倍。MS2扫描图的隔离窗口的宽度可以比窄MS2扫描图的隔离窗口的宽度不大于约50倍，如比窄MS2扫描图的隔离窗口的宽度不大于约10倍。
图7展示了用于使用实时谱图匹配执行数据依赖性分析的系统700。系统可以包含如图1中的质谱仪100等质谱仪702、数据分析器704和谱图库706。在各个实施例中，数据分析器704和谱图库706可以与质谱仪702本地驻留，如驻留在控制质谱仪702的计算机系统上。在其它实施例中，数据分析器704可以与质谱仪702本地驻留，并且谱图库706可以是基于云的。利用基于云的谱图库706，可能有利于数据分析器704本地高速缓存谱图库706的一部分。在又另一个实施例中，数据分析器704和谱图库706可以是基于云的。
质谱仪702可以向数据分析器704提供MS2谱图。数据分析器704可以执行MS2谱图与谱图库706的谱图匹配并且可以识别化合物。另外，数据分析器704可以通过模拟或基于谱图库706识别化合物的碎片离子。数据分析器704可以向质谱仪702提供碎片离子的排除列表。质谱仪702可以基于排除列表执行另外的分析。
虽然结合各个实施例对本发明教导进行了描述，但是本发明教导不旨在受限于这种实施例。相反，本发明教导涵盖各种替代方案、修改和等同物，如本领域的技术人员将理解的。
进一步地，在描述各个实施例时，本说明书可能已经以特定的步骤序列的方式呈现了方法和/或过程。然而，在方法或过程不依赖于本文所阐述的特定步骤顺序的程度上，所述方法或过程不应限于所描述的特定步骤序列。如本领域的普通技术人员将理解的，其它步骤序列也是可能的。因此，本说明书中所阐述的特定步骤顺序不应被解释为对权利要求的限制。另外，针对所述方法和/或过程的权利要求不应限于以所写顺序执行其步骤，并且本领域的技术人员可以容易地理解，可以改变序列并且所述序列仍然保持处于各个实施例的精神和范围内。

Claims (24)

1.一种方法，其包括：
获得第一质谱图；
选择所述第一质谱图的第一峰；
隔离包含所述第一峰的隔离窗口中的前体离子；
对所隔离离子进行碎裂和分析以获得第二质谱图；
对所述第二质谱图执行实时搜索以找到目标前体和与所述目标前体共隔离在某一隔离窗口中的近等压前体离子两者；
将在所述实时搜索期间产生识别的所述前体离子添加到排除列表中；
选择存在于所述第一质谱图中而不在所述排除列表上的第二峰；以及
对所述第二峰的离子进行碎裂和分析以获得第三质谱图。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述隔离窗口的宽度小于约10m/z。
3.根据权利要求1所述的方法，其中无论所述目标前体在所述实时搜索期间是否产生识别，所述目标前体都会被添加到所述排除列表中。
4.根据权利要求1所述的方法，在选择所述第一质谱图的所述第一峰之前，所述方法进一步包括：
隔离宽度大于所述隔离窗口的宽度的第二隔离窗口中的前体离子；
对所隔离离子进行碎裂和分析以获得第四质谱图；
对所述第四质谱图执行实时搜索以找到共隔离在所述第二隔离窗口中的一组前体离子；以及
将所述组前体离子添加到排除列表中。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述第二隔离窗口的所述宽度为所述隔离窗口的所述宽度的至少约两倍。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述第二隔离窗口是以数据独立性方式选择的。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述第二隔离窗口是基于第一质谱图中的多个峰的位置选择的。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述第二隔离窗口是基于所述第二隔离窗口内的前体离子峰的数量选择的。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述第二隔离窗口是基于用所述第二隔离窗口隔离的前体离子通量选择的。
10.一种方法，其包括：
隔离具有第一宽度的第一隔离窗口中的前体离子；
对所隔离离子进行碎裂和分析以获得第一质谱图；
对所述第一质谱图执行实时搜索以找到共隔离在所述第一隔离窗口中的第一组前体离子；
将所述第一组中在所述实时搜索期间产生识别的前体离子添加到排除列表中；
选择不在所述排除列表上的未识别到的前体峰；
隔离具有第二宽度的第二隔离窗口中的前体离子，所述第二宽度比所述第一宽度窄并且以所述未识别到的前体峰为中心；
对所隔离离子进行碎裂和分析以获得第二质谱图；
对所述第二质谱图执行实时搜索以找到目标前体和与所述目标前体共隔离在某一隔离窗口中的近等压前体离子两者；
从所述第一质谱图中移除与第二组前体离子的碎片相对应的特征，以获得经缩减质谱图；
对所述经缩减质谱图执行实时搜索以找到共隔离在所述第一隔离窗口中的第三组前体离子；
将来自所述第一组、所述第二组和所述第三组的产生识别的前体离子添加到所述排除列表中；
选择不在所述排除列表上的第二未识别到的峰；以及
对所述第二未识别到的峰的离子进行碎裂和分析以获得第三质谱图。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述目标前体在通过所述实时搜索未识别到所述目标前体时添加到所述排除列表中。
12.根据权利要求10所述的方法，所述第二隔离窗口与所述第一隔离窗口至少部分地重叠。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一隔离窗口是以数据独立性方式确定的。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一隔离窗口是基于全谱扫描图(surveyscan)中的多个峰的位置选择的。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一隔离窗口是基于所述第一隔离窗口内的前体离子峰的数量选择的。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一隔离窗口是基于用所述第一隔离窗口隔离的前体离子通量选择的。
17.一种质谱仪，其包括：
离子源，所述离子源被配置成对样品进行电离以产生离子；
质量分析器，所述质量分析器被配置成产生质谱图；以及
控制器，所述控制器被配置成：
获得第一质谱图；
选择所述第一质谱图的第一峰；
隔离包含所述第一峰的隔离窗口中的前体离子；
对所隔离离子进行碎裂和分析以获得第二质谱图；
对所述第二质谱图执行实时搜索以找到目标前体和与所述目标前体共隔离在某一隔离窗口中的近等压前体离子两者；
将在所述实时搜索期间产生识别的所述前体离子添加到排除列表中；
选择存在于所述第一质谱图中而不在所述排除列表上的第二峰；并且
对所述第二峰的离子进行碎裂和分析以获得第三质谱图。
18.根据权利要求17所述的质谱仪，其中所述隔离窗口的宽度小于约10m/z。
19.根据权利要求17所述的质谱仪，其中所述控制器被进一步配置成在选择所述第一质谱图的所述第一峰之前：
隔离宽度大于所述隔离窗口的宽度的第二隔离窗口中的前体离子；
对所隔离离子进行碎裂和分析以获得第四质谱图；
对所述第四质谱图执行实时搜索以找到共隔离在所述第二隔离窗口中的一组前体离子；并且
将所述组前体离子添加到排除列表中。
20.根据权利要求19所述的质谱仪，其中所述第二隔离窗口的所述宽度为所述隔离窗口的所述宽度的至少约两倍。
21.根据权利要求19所述的质谱仪，其中所述第二隔离窗口是以数据独立性方式选择的。
22.根据权利要求19所述的质谱仪，其中所述第二隔离窗口是基于第一质谱图中的多个峰的位置选择的。
23.根据权利要求22所述的质谱仪，其中所述第二隔离窗口是基于所述第二隔离窗口内的前体离子峰的数量选择的。
24.根据权利要求22所述的质谱仪，其中所述第二隔离窗口是基于用所述第二隔离窗口隔离的前体离子通量选择的。
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