CN111184912A - 一种京尼平改性纤维蛋白凝胶或微球及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种京尼平改性纤维蛋白凝胶或微球及其制备方法与应用，属于组织工程领域；本发明将蛋白交联剂京尼平应用于改性纤维蛋白凝胶或微球，以提高其强度和稳定性，减缓其降解速度，同时亦可交联细胞因子。所制备的凝胶或微球可以作为细胞因子和各类干细胞的载体用于皮肤、神经等组织缺损的修复。本发明具有制备工艺简单、生产周期短、制备原料来源广泛、制备过程可控等诸多优点；所构建的凝胶或微球具有稳定性好、免疫原性低等优点，若负载适宜的细胞因子和干细胞，有助于促进损伤组织修复。本发明可用于修复皮肤、神经及其它软组织缺损，具有广阔的应用前景。

Description

一种京尼平改性纤维蛋白凝胶或微球及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物材料领域，具体涉及一种京尼平改性纤维蛋白凝胶或微球及其制备方法与应用。

背景技术

各种由创伤所致的组织缺损常须进行人造组织、自体组织或异体组织的补充。由于人造组织具有来源广泛及免疫排斥小等优点，在临床获得广泛应用，如人造皮肤及各种骨水泥等。应用工程学的观念制备人造组织即为组织工程，其三要素包括：支架、细胞因子及种子细胞。支架和细胞因子常相互结合，构成种子细胞生存、增殖、分化及发挥功能的微环境。

纤维蛋白是由活化的凝血酶催化纤维蛋白原所形成的一种水凝胶，具有价格低廉、来源广泛、低免疫原性、生物相容度高及易控性等诸多优点，常用于促进手术创口愈合。目前亦有商业化的纤维蛋白制品用于修复皮肤缺损。但纤维蛋白凝胶存在的技术缺陷有：（1）低浓度纤维蛋白凝胶易降解；（2）纤维蛋白凝胶体内降解的主要产物D-二聚体对细胞存在毒性作用；（3）高浓度纤维蛋白凝胶则不利于培养液的渗透，从而阻碍细胞在凝胶内生长；（4）因缺乏细胞与凝胶共培养的适应阶段，若直接将纤维蛋白凝胶与细胞混合移植入损伤部位，细胞的存活率较低。因而对纤维蛋白凝胶改性，提高其强度，减缓其降解，改变其降解产物，具有很高的应用价值。

蛋白交联剂能将蛋白凝胶内的纤维相互交联起来，从而达到增强蛋白凝胶强度的效用。目前常用的蛋白类交联剂包括戊二醛、过氧化酶、多酚氧化酶及碳二亚胺等；其中戊二醛存在显著的细胞毒性，若残留将会影响损伤组织修复；过氧化酶及多酚氧化酶则会提高蛋白凝胶的脆性，不利于塑形；碳二亚胺价格昂贵且同样会增加纤维蛋白脆性。采用天然活性物质对纤维蛋白进行改性具有一定的优势。作为一种常用的中药成分，栀子主治淋证涩痛，血热吐衄，目赤肿痛，火毒疮疡等症，具有抑制炎症的功能。而京尼平是栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解后的产物，虽已成功用于交联明胶、胶原等蛋白类凝胶，但对纤维蛋白的效应目前尚不清楚。更重要的是，京尼平具有优良的生物相容性，且具有广泛的生物活性，能够发挥抗氧化及抗肿瘤的效用。我们的研究表明京尼平主要可显著增强纤维蛋白的强度，延缓其降解速度。

将纤维蛋白制备成微球形，能够显著增加纤维蛋白凝胶的表面积/体积比，在相同体积的纤维蛋白上负载更多的细胞。已有专利报道(US6150505，US08934283)纤维蛋白构建微球以作为细胞移植的载体。但单纯的纤维蛋白微球同样存在形态不规则，易于降解的缺陷。

发明内容

目前纤维蛋白凝胶或微球存在的技术缺陷有：（1）低浓度纤维蛋白凝胶易降解；（2）纤维蛋白凝胶体内降解的主要产物D-二聚体对细胞存在毒性作用；（3）高浓度纤维蛋白凝胶则不利于培养液的渗透，从而阻碍细胞在凝胶内生长；（4）因缺乏细胞与凝胶共培养的适应阶段，若直接将纤维蛋白凝胶与细胞混合移植入损伤部位，细胞的存活率较低。

针对上述技术问题，本发明提供一种京尼平改性纤维蛋白凝胶或微球及其制备方法与应用，该制备方法简单，成本低廉，且所得微球稳定性好，且效应显著，能用于负载生物因子或干细胞。

为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：

一种京尼平改性纤维蛋白凝胶，由60-100mg/ml纤维蛋白原、500-1000U/ml凝血酶、50-100 U/ml凝血XIII因子与质量体积比为0.1%-0.5%的京尼平混合而成。

上述京尼平改性纤维蛋白凝胶的制备方法，首先配制60 -100 mg/ml的纤维蛋白原，500-1000 U/ml的凝血酶，50-100 U/ml的凝血XIII因子，质量体积比为0.1%-0.5%的京尼平溶液；其次将纤维蛋白原与京尼平溶液按体积比为200-400：1进行混合均匀；再依次迅速加入凝血酶与凝血XIII因子，在4℃下静置，即得京尼平改性的纤维蛋白凝胶。

一种京尼平改性纤维蛋白微球，由60 -100 mg/ml纤维蛋白原、500-1000 U/ml凝血酶、50-100 U/ml凝血XIII因子与质量体积比为0.1%-0.5%的京尼平混合均匀，立即转入搅拌器上以油包水的方式制备而成。

上述京尼平改性纤维蛋白微球的制备方法，包括以下步骤：首先配制60 -100 mg/ml的纤维蛋白原，500-1000 U/ml的凝血酶，50-100 U/ml的凝血XIII因子及质量体积比为0.1%-0.5%的京尼平溶液；其次将纤维蛋白原与京尼平溶液按200-400：1的体积比混匀，依次加入凝血酶与凝血XIII因子，并迅速混匀得混合液；将混合液滴入在搅拌器上以900-1200 rpm旋转的预热植物油中，油温为60-80℃；静置10分钟后便可在油内发现大量的微球，4℃下继续静置3-5小时，让京尼平与纤维蛋白微球充分反应，即得京尼平改性的纤维蛋白微球。

京尼平改性纤维蛋白微球的清洗方法，包括以下步骤：将京尼平改性的纤维蛋白微球移入正己烷中，震荡后静置，弃去正己烷；重复上述步骤两遍；加入50%（v/v）的乙醇磷酸缓冲液（ethanol-PBS，清洗液）溶液，震荡后静置，弃去清洗液；重复上述步骤三遍，即完成微球的清洗。

上述京尼平改性纤维蛋白微球的消毒法为：以75%乙醇浸泡8小时以上，然后紫外照射过夜，注意其间要震荡微球；或者，以3-6 kGy剂量的Co60 辐照灭菌。

上述京尼平改性纤维蛋白凝胶在负载干细胞上的应用，所述干细胞为胚胎干细胞、诱导性多功能干细胞或成体干细胞。

上述京尼平改性纤维蛋白微球在交联细胞因子或/和负载干细胞上的应用。

上述京尼平改性纤维蛋白微球在交联细胞因子上的应用，包括以下步骤：将微球置于合适的缓冲液内，如PBS、细胞培养液等；加入终浓度为0.01-0.05 mg/ml的纤维蛋白原、终浓度为0.01-0.05 mg/ml的京尼平及100-1000 ng/ml的细胞因子；混匀后37℃过夜；以上操作均于无菌条件下完成。

作为改进的是，所述干细胞为胚胎干细胞、诱导性多能干细胞或成体干细胞；所述细胞因子为蛋白类的细胞因子。

采用天然活性物质对纤维蛋白进行改性具有双重效果。作为一种常用的中药成分，栀子主治淋证涩痛，血热吐衄，目赤肿痛，火毒疮疡等症，具有抑制炎症的功能。而京尼平是栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解后的产物，虽已成功用于交联明胶、胶原等蛋白类凝胶，但对纤维蛋白的效应目前尚不清楚。更重要的是，京尼平具有优良的生物相容性，且具有广泛的生物活性，能够发挥抗氧化及抗肿瘤的效用。我们的研究表明京尼平主要可显著增强纤维蛋白的强度，延缓其降解速度。

有益效果：与现有技术相比，本发明采用天然来源的京尼平作为交联剂，改性处理纤维蛋白或纤维蛋白微球，具有以下优势：

1、本发明制备的京尼平改性的纤维蛋白凝胶强度高于单纯的纤维蛋白凝胶，其降解速率低于后者；

2、本发明制备的京尼平改性的纤维蛋白微球较纤维蛋白凝胶的表面积显著扩大，能够负载更多的干细胞；而较未改性的纤维蛋白微球形态更为规则，强度更大，更耐降解；

3、本发明制备的京尼平改性的纤维蛋白凝胶或微球降解产物较纤维蛋白降解产物对干细胞的毒性为小。

附图说明

图1为实施例1制备的京尼平改性的纤维蛋白凝胶或微球的照片；其中，A为纤维蛋白凝胶，B为京尼平改性的纤维蛋白凝胶，C为纤维蛋白微球，D为经过筛选后的京尼平改性的纤维蛋白微球；

图2为京尼平改性处理纤维蛋白凝胶或微球后的相关性质变化，其中， A为弹性模量的变化；B为降解速率的变化，C为PBS处理一周后，微球形态的变化，D为纤维蛋白降解产物对干细胞的毒性变化；

图3为京尼平改性的纤维蛋白微球的图片；A为明场环境下京尼平改性的纤维蛋白微球，直径约为200微米，标尺长为30微米，B为京尼平改性纤维蛋白微球具有红色荧光，C为京尼平改性纤维蛋白交联音猬因子经免疫荧光染色后的荧光照片，D为外胚间充质干细胞生长于京尼平改性后的纤维蛋白微球表面；

图4为京尼平改性纤维蛋白凝胶或者微球修复小鼠皮肤缺损，所有照片均拍摄于术后3周，A显示皮肤缺损后仅进行抗感染处理，B显示皮肤缺损后局部填充纤维蛋白的修复效果，C显示皮肤缺损后局部填充京尼平改性纤维蛋白凝胶的修复效果，D显示皮肤缺损后局部填充京尼平改性纤维蛋白微球的修复效果，E为各组缺损大小的测量结果；

图5 为负载了外胚间充质干细胞的纤维蛋白（Fb）、京尼平改性纤维蛋白（GFb）以及京尼平改性纤维蛋白微球（GFmb）对小鼠脊髓损伤的修复效果，Control为脊髓损伤后未作特殊处理； A为后肢运动的BMS评分结果， B 为损伤部位空洞面积比例。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例1 京尼平改性纤维蛋白凝胶及微球的制备及比较

以无菌生理盐水配制100 mg/ml（W/V）的纤维蛋白原，1000 U/ml的凝血酶，100 U/ml的凝血XIII因子及0.5%（W/V）的京尼平溶液。所有的溶液经0.22微米滤膜过滤除菌，且即配即用。

首先将纤维蛋白原和京尼平按体积比400：1的比例混匀，然后依次加入总体积1/1000的凝血酶和凝血XIII因子。充分混合后置于4℃便得到京尼平改性的纤维蛋白凝胶（见图1B）。仅将100 mg/ml（W/V）纤维蛋白原与凝血酶和凝血XIII因子混合可获得纤维蛋白凝胶 （见图1A）。

将植物油（大豆油或者花生油）预热至80℃，然后置于可加热的搅拌器内以900rpm的速度搅拌，形成漩涡；搅拌器的加热温度设定为80℃。按制备京尼平改性纤维蛋白凝胶的比例迅速完全混合京尼平、纤维蛋白原、凝血酶及凝血XIII因子，立即加入旋转的植物油内。十分钟内便可见大量的微球形成。将含微球的油取出，置于4℃环境下4小时，可见微球逐渐由白色变成浅蓝色，直至深蓝色。

沥去植物油收获微球沉淀。然后以正己烷、丙酮、无水乙醇顺序清洗微球，清除微球表面的植物油。所获得的微球浸泡于无水乙醇中，分别以40目、50目及60目的筛子筛选微球，获得相对均一的不同直径的微球。微球可利用75%酒精浸泡、紫外照射或钴60进行灭菌（见图1D）。若制备过程中不添加京尼平，则可获得纤维蛋白微球（见图1C）。所得的京尼平改性纤维蛋白微球在光镜下呈圆形（见图3A），且具有红色荧光（见图3B）。

使用流变仪比较上述纤维蛋白凝胶和京尼平改性纤维蛋白凝胶的弹性模量，发现京尼平能显著增加纤维蛋白凝胶的弹性模量 （见图2A）。另一方面，京尼平显著延缓了纤维蛋白凝胶或者纤维蛋白微球在磷酸盐缓冲液中的降解 （见图2B）。将纤维蛋白微球或京尼平改性的纤维蛋白微球置于pH=7.4的磷酸盐缓冲液中1周，可见纤维蛋白微球形态变得很不规则，且球内孔隙增加，而京尼平改性的纤维蛋白微球则能保持其形态（见图2C）。将等重量的无菌纤维蛋白凝胶、纤维蛋白微球及京尼平改性的纤维蛋白凝胶、京尼平改性的纤维蛋白微球置于等量的无菌磷酸盐缓冲液中2周，取含降解产物的磷酸缓冲液按1：1与完全培养基混合培养等量的外胚间充质干细胞48 小时，以CCK-8法检测细胞的活性。结果表明，京尼平能显著降低纤维蛋白降解产物对细胞的毒性 （见图2D）。

实施例2 京尼平改性的纤维蛋白微球负载细胞因子或者干细胞

将实施例1中所得的微球混悬于待负载的细胞因子溶液中，依次加入0.05 mg/ml的纤维蛋白原及0.05 %的京尼平溶液，充分混匀，于37 ℃反应过夜。弃去上清液，以磷酸盐缓冲液清洗微球三遍，从而获得负载细胞因子的京尼平改性纤维蛋白微球（见图3C）。从图3C中可以看出京尼平改性后的纤维蛋白微球能够交联音猬因子。

培养干细胞，如骨髓间充质干细胞、毛囊干细胞及皮肤干细胞等。将干细胞制备成单细胞悬液，滴加在上述纤维蛋白微球上，一般五日左右，可见细胞布满微球表面 （见图3D）。此时微球可用于移植修复组织损伤。

实施例3 京尼平改性纤维蛋白凝胶或微球修复小鼠皮肤缺损

将20只小鼠以水合氯醛麻醉小鼠，以剪刀切除小鼠背部全层皮肤，大小为0.8 cm×0.8 cm。苏醒后，随机分为四组：对照组(control)、纤维蛋白组（Fb）、京尼平改性纤维蛋白组（GFb）及京尼平改性纤维蛋白微球组（GFmb，即genipin modified fibrin microbeads）。对照组伤处不做处理；Fb组在皮肤缺损处滴加纤维蛋白凝胶；GFb组在皮肤损伤部位滴加京尼平改性的纤维蛋白凝胶；GFmb在皮肤缺损部位加入大量京尼平改性的纤维蛋白微球，充满创口，然后用100 mg/ml的纤维蛋白封固在损伤部位。每组损伤部位均覆盖含抗生素的纱布。术后21天，发现对照组损伤部位缺口没有明显减小（见图4A）；Fb组损伤处缺口明显变小，但是并未完全消失，呈陨石坑样（见图4B）；GFb组和GFmb组缺口均完全消失，无显著差别（见图4C和4D）。缺口大小的测量结果见图4E。

实施例4 京尼平改性纤维蛋白凝胶或微球修复小鼠脊髓损伤

取小鼠鼻粘膜，以组织块法培养外胚间充质干细胞。制备小鼠脊髓横断模型，分为对照组（Control）、纤维蛋白组（Fb）、京尼平改性纤维蛋白组（GFb）及京尼平改性纤维蛋白微球组（GFmb）。其中，对照组不进行处理。Fb组将50 mg/ml的纤维蛋白与外胚间充质干细胞混合种植于损伤部位。GFb组在损伤部位填充含外胚间充质干细胞的10 mg/ml的京尼平改性纤维蛋白。至于GFmb组，先以50 mg/ml的纤维蛋白原制备京尼平改性纤维蛋白微球，并提前在体外将外胚间充质干细胞培养于微球之上3天，在脊髓横断后，将包裹了干细胞的微球移植入缺损部位，并以2 mg/ml的纤维蛋白凝胶将所有的微球固定在缺损部位。一个月后，发现GFmb组小鼠的运动评分显著高于GFb组，而GFb组则显著高于Fb和对照组（见图5A）。损伤部位组织切片表明，GFmb组空洞面积最小，GFb空洞较大，但显著小于Fb和对照组（见图5B）。

Claims (9)

1.一种京尼平改性纤维蛋白凝胶，其特征在于，由60 -100 mg/ml纤维蛋白原、500-1000 U/ml凝血酶、50-100 U/ml凝血XIII因子与质量体积比为0.1%-0.5%的京尼平混合而成。

2.基于权利要求1所述的京尼平改性纤维蛋白凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：首先配制60 -100 mg/ml的纤维蛋白原，500-1000 U/ml的凝血酶，50-100 U/ml的凝血XIII因子，质量体积比为0.1%-0.5%的京尼平溶液；其次将纤维蛋白原与京尼平溶液按体积比为200-400：1进行混合均匀；再依次迅速加入凝血酶与凝血XIII因子，在4℃下静置，即得京尼平改性的纤维蛋白凝胶。

3.一种京尼平改性纤维蛋白微球，其特征在于，由60 -100 mg/ml纤维蛋白原、500-1000 U/ml凝血酶、50-100 U/ml凝血XIII因子与质量体积比为0.1%-0.5%的京尼平混合均匀，立即转入搅拌器上以油包水的方式制备而成。

4.基于权利要求3所述的一种京尼平改性纤维蛋白微球，其特征在于，包括以下步骤：首先配制60-100mg/ml的纤维蛋白原，500-1000 U/ml的凝血酶，50-100 U/ml的凝血XIII因子及质量体积比为0.1%-0.5%的京尼平溶液；其次将纤维蛋白原与京尼平溶液按200-400：1的体积比混匀，依次加入凝血酶与凝血XIII因子，并迅速混匀得混合液；将混合液滴入在搅拌器上以900-1200 rpm旋转的预热植物油中，油温为60-80℃；静置10分钟后便可在油内发现大量的微球，4℃下继续静置3-5小时，让京尼平与纤维蛋白微球充分反应，即得京尼平改性的纤维蛋白微球。

5.基于权利要求1所得的京尼平改性纤维蛋白凝胶在负载干细胞上的应用，其特征在于，所述干细胞为胚胎干细胞、诱导性多能干细胞或成体干细胞。

6.基于权利要求3所得的京尼平改性纤维蛋白微球在交联细胞因子或/和负载干细胞上的应用。

7.基于权利要求6所述的京尼平改性纤维蛋白微球在交联细胞因子上的应用，其特征在于，包括以下步骤：将微球置于缓冲液内；加入终浓度为0.01-0.05 mg/ml的纤维蛋白原、终浓度为0.01-0.05 mg/ml的京尼平及100-1000 ng/ml的细胞因子；混匀后37℃过夜；以上操作均于无菌条件下完成。

8.根据权利要求7所述的京尼平改性纤维蛋白微球在交联细胞因子上的应用，其特征在于，所述缓冲液为PBS或细胞培养液。

9.根据权利要求7所述的京尼平改性纤维蛋白微球在交联细胞因子上的应用，其特征在于，所述干细胞为胚胎干细胞、诱导性多能干细胞或成体干细胞；所述细胞因子为蛋白类的细胞因子。

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