CN111172125A - 一种固定化d-氨基酸氧化酶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种固定化D氨基酸氧化酶及其制备方法和应用。所述固定化D氨基酸氧化酶包括树脂和氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的D‑氨基酸氧化酶；所述的D‑氨基酸氧化酶与所述树脂通过共价键合作用连接，所述的树脂为环氧树脂和/或RBS氨基树脂。本发明的固定化DAAO酶的固定化挂载率高、稳定性好，多次使用后固定化酶活力剩余高，转化率高；用本发明固定化DAAO酶制备PPO，酶活损失少，酶的利用率高，生产成本降低。

Description

一种固定化D-氨基酸氧化酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物化工领域，具体涉及一种固定化D-氨基酸氧化酶及其制备方法和应用。
背景技术
草铵膦是由赫斯特公司80年代开发的广谱触杀型除草剂。目前世界上的三大除草剂是草甘膦、草铵膦、百草枯，相对于草甘膦和百草枯，草铵膦具有优异的除草性能及较小的副作用。草铵膦有两种光学异构体，分别为D-草铵膦和L-草铵膦，但是只有L-草铵膦具有除草活性，因此发展L-草铵膦的方法对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要意义。
US9834802B公开了一种制备L-草铵膦的方法，第一步为D-氨基酸氧化D-草铵膦为PPO，第二步为转氨酶氨化PPO为L-草铵膦。其采用多孔玻璃珠为载体，对DAAO酶和转氨酶进行共同固定化，反应完之后酶活为初始酶活的50％以上。其方法中采用了固定化酶，但是固定化的效果还不是很好，反应中酶活损失高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为克服现有的固定化D-氨基酸氧化酶存在的酶活低、稳定性差的缺陷，提供一种固定化D-氨基酸氧化酶及其制备方法和应用。本发明的制备方法的固定化酶挂载率高，利用本发明制备方法制备得到的固定化D-氨基酸氧化酶具有较高的酶活和稳定性。利用本发明的固定化D-氨基酸氧化酶制备L-草铵膦具有工艺操作简单、固废和产品损失低、产品收率高，以及反应成本降低等优势。
本发明主要通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明提供了一种固定化D氨基酸氧化酶，其包括树脂和氨基酸序列如SEQ IDNO.1(同专利US9834802B2中序列2的N54V,F58Q,M213S突变体)所示的D-氨基酸氧化酶；所述的D-氨基酸氧化酶与所述树脂通过共价键合作用连接，所述的树脂为环氧树脂和/或RBS氨基树脂。
较佳地，所述的环氧树脂为基质为甲基丙烯酸聚合物，官能团选自以下官能团中的一种的环氧树脂：
Figure BDA0002400067660000021
更佳地，所述的环氧树脂为SEPABEADSTM EC-EP环氧树脂、ReliZymeTM EP113环氧树脂，ReliZymeTM HFA403环氧树脂、SEPABEADSTM EC-HFA环氧树脂以及ReliZymeTM EP403环氧树脂中的一种或多种；进一步更佳地，所述的环氧树脂为SEPABEADSTM EC-EP环氧树脂和/或ReliZymeTM EP113环氧树脂，如SEPABEADSTM EC-EP环氧树脂、ReliZymeTM EP113环氧树脂以及SEPABEADSTM EC-EP环氧树脂和ReliZymeTM EP113环氧树脂。
本发明中的所述树脂较佳地为选自SEPABEADSTM EC-EP环氧树脂、ReliZymeTMEP113环氧树脂以及RBS氨基树脂中的一种或多种；更佳地为SEPABEADSTM EC-EP环氧树脂、ReliZymeTM EP113环氧树脂或者RBS氨基树脂。
需说明，本领域技术人员公知：本发明中树脂中所涉及的型号仅为限定树脂的结构，其他型号的、与本发明树脂结构相同的树脂也在本发明的保护范围之内。
本发明还提供一种所述固定化D氨基酸氧化酶的制备方法，所述的制备方法包括下述步骤：
将所述D-氨基酸氧化酶与所述树脂混合，发生共价链接反应后得连接有D-氨基酸氧化酶的树脂(固定化D-氨基酸氧化酶)。
经尝试后发现，如果所述树脂相对用量过多，则导致所述树脂利用率不高，容易造成树脂的浪费；而若所述的D-氨基酸氧化酶相对用量过多，则易导致固定化不充分，固定化后酶液残余酶活过多，造成酶的浪费。本发明中，所述D-氨基酸氧化酶与所述树脂的相对用量较佳地为10～300U/g，更佳地为85U/g。
所述的共价链接反应时间较佳地为10～30h，更佳地为20～25h。所述的共价链接反应温度较佳地为10～40℃，更佳地为18～22℃。
所述的共价链接反应较佳地在缓冲液中进行，所述的缓冲液可为本领域常规使用的缓冲液，例如磷酸缓冲液，较佳地为20～2000mM的磷酸缓冲液；更佳地为50～500mM的磷酸缓冲液；进一步更佳地为100mM的磷酸缓冲液。所述的磷酸缓冲液优选磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。所述的磷酸缓冲液的pH较佳地为6～9，更佳地为7～8。
上述制备方法较佳地还包括过滤并使用润洗缓冲液润洗上述连接有D-氨基酸氧化酶的树脂，得所述固定化D氨基酸氧化酶。较佳地，还对上述固定化D氨基酸氧化酶进行干燥处理。
所述的润洗缓冲液可为本领域常规使用的缓冲液，例如磷酸缓冲液，较佳地为20～2000mM的磷酸缓冲液；更佳地为50～500mM的磷酸缓冲液；进一步更佳地为100mM的磷酸缓冲液。所述的磷酸缓冲液优选磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。
所述的润洗缓冲液的pH较佳地为6～9，更佳地为7～8。
本发明还提供一种上述固定化D-氨基酸氧化酶在合成L-草铵膦中的应用。
本发明还提供一种2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸(PPO)的制备方法，所述的制备方法包括：在上述固定化D-氨基酸氧化酶的存在下，将D-草铵膦盐(D-草铵膦在反应体系中以盐的形式存在)进行氧化反应，得到所述的2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸。所述固定化D-氨基酸氧化酶与D-草铵膦的质量比优选1:1～10:1，更优选2:1。
在所述的氧化反应中，所述的D-草铵膦盐的阳离子可为本领域常规的阳离子，例如铵离子、钠离子和/或钾离子；又可为所使用的缓冲液的阳离子。
在所述的氧化反应中，所述的D-草铵膦盐可单独存在、或与L-草铵膦盐共同存在(此时L-草铵膦盐可不发生反应，即：D,L-草铵膦盐)，例如：D型富集的草铵膦盐(即其中D型对映体的含量＞50％，乃至于纯D-草铵膦盐)、L型富集的草铵膦盐(即其中L-草铵膦的含量＞50％，不包括纯L-草铵膦盐的情况)或消旋体草铵膦盐。
为保证所述的氧化反应高效进行，所述的D,L-草铵膦盐的浓度较佳地为10～200g/L，更佳地为50～150g/L，进一步更佳地为80～120g/L，最佳地为100g/L。用于形成所述的D,L-草铵膦盐的D,L-草铵膦较佳地购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
所述的氧化反应较佳地还可在过氧化氢酶的存在下进行，所述的过氧化氢酶的浓度优选100～2000U/mL，更优选1000U/ml。
所述的氧化反应还可在通氧气的条件下进行。所述通氧气的速率较佳地为0.5VVM。当所述的氧化反应在通氧气的条件下进行时，所述的氧化反应还可在消泡剂的存在下进行。
所述的氧化反应较佳地在缓冲液中进行，所述的缓冲液可为本领域常规使用的缓冲液，例如磷酸缓冲液，较佳地为5～200mM的磷酸缓冲液；更佳地为50mM的磷酸缓冲液。所述的磷酸缓冲液优选磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。所述的缓冲液的pH较佳地为6～9，更佳地为7～8。
所述氧化反应中，所述反应体系的温度可为本领域常规，较佳地为5～37℃，更佳地为20℃。
所述氧化反应的时间可为本领域常规，例如5～7小时。
在上述2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸(PPO)的制备方法中，在所述氧化反应结束后，可过滤得固定化DAAO酶以再次用于PPO的制备。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的固定化DAAO酶的固定化挂载率高(最高可达98.8％)、稳定性好，多次使用后固定化酶活力剩余高(套用50批次后酶活力剩余甚至可达85.2％)，转化率高(可达99％以上)；用本发明固定化DAAO酶制备PPO，酶活损失少，酶的利用率高，生产成本降低。
附图说明
图1为标准品D,L-草铵膦的Marfey试剂柱前衍生HPLC图谱。
图2为标准品D,L-草铵膦的离子对的HPLC图谱。
图3为标准品PPO的离子对HPLC图谱。
图4为实施例3反应完全后反应液离子对HPLC图谱。
图5为实施例3反应完全后反应液Marfey试剂柱前衍生HPLC图谱。
图6为自制PPO质谱图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
以下实施例中，所用RBS氨基树脂购买自天津南开和成科技有限公司，其余树脂若没有特殊说明均购买自日本三菱化学公司。
产物的手性分析及浓度分析通过柱前衍生化高效液相色谱进行，具体的分析方法为：
(1)色谱条件：Agilent ZORBAX Eclipse plus C18，3.5μm，150*4.6mm。流动相A：0.1％TFA+H2O，流动相B：0.1％TFA+CAN。检测波长：340nm，流速：1.0mL/min，柱温：30℃。
(2)衍生化试剂：Marfey试剂
(3)衍生反应：称取50mg供试品于25ml容量瓶中，加15ml稀释液(纯水：乙腈＝50:50)并超声5min，再加纯化水稀释至刻度，混合均匀。移取上述溶液1ml于5ml容量瓶中，加入1ml的Marfey’s reagent溶液和0.1ml碳酸氢钠(1M)溶液，盖上盖子于50℃烘箱中避光加热1小时，反应结束后再加入0.1ml盐酸溶液，混合均匀。
移取1ml上述混合溶液，再加入4ml的稀释液，混合均匀即可倒入进样瓶。进样10μL进行分析。
PPO通过离子对色谱分析，具体的分析方法为：
色谱条件：ΜLtimate AQ-C18，5μm，4.6*250mm；流动相：0.05mol/L磷酸氢二铵PH＝3.6:10％四丁基氢氧化铵水溶液：乙腈＝91:1:8；检测波长：205nm；流速：1.0ml/min；柱温：25℃。
样品：5mg/ml H2O溶液。进样10μL进行分析。
转化率＝(反应物-剩余反应物)/反应物×100％(反应物：D-草铵膦)
实施例1D-氨基酸氧化酶的制备
TB培养基：称取12g蛋白胨，24g酵母粉，4ml甘油，2.31gKH2PO4和16.43gK2HPO4溶于1000ml去离子水中，充分搅拌至完全溶解，于121℃高温灭菌20min，冷却待用。
将D-氨基酸氧化酶基因(序列如SEQ ID NO.2所示)酶连pET28a(购自Novagen公司)，酶切位点NdeI&HindIII，将酶连好的载体，转化宿主大肠杆菌BL21感受态细胞(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)。将构建好的菌种接种TB培养基，200rpm摇床，30℃，IPTG浓度0.1mM诱导过夜，收菌。
将培养结束后收集到的菌体，按照菌体与磷酸氢二钠磷酸二氢钠缓冲液的质量体积比1:10加入100mM pH7.5的磷酸氢二钠磷酸二氢钠缓冲液重悬，高压均质破碎，破碎液离心(速度以及时间4000转/分钟，20分钟)去除沉淀，得到的上清液为含重组DAAO酶液，酶活力为8.5U/mL。
酶活定义：在pH8.0、25℃条件下，每分钟生成1μmol丙酮酸所需的酶量定义为1单位(1U)。
检测方法：三角瓶中加入8.99ml浓度为100mM的D-丙氨酸溶液，10μL 1万U/mL的过氧化氢酶和1mL稀释酶液，混匀，立即放于25℃摇床中150转/min反应10min。吸取1mL反应液立即加入100μL 2M的盐酸中终止反应，混匀，加入4.9mL去离子水稀释，混匀。吸取2mL稀释液，加入0.8mL 2，4-二硝基苯肼溶液，混匀后静置反应10min。加入3.2ml 3M氢氧化钠溶液，摇匀后静置15min，用分光光度计在550nm处测吸光值，从而计算出酶活。
实施例2固定化树脂的筛选
分别称取不同类型的固定化树脂5g，加入50mL实施例1制备得到的DAAO酶液混合，20℃条件下130转/min摇床中反应20h，过滤，用100mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液洗涤两次，过滤得固定化DAAO酶。其中，DAAO酶与各种不同类型的固定化树脂的相对用量为85U/g。
酶活定义：在pH8.0、25℃条件下，每分钟生成1μmol丙酮酸所需的酶量定义为1单位(1U)。
检测方法：三角瓶中加入9.99ml浓度为100mM的D-丙氨酸溶液，10μL 1万U/mL的过氧化氢酶和100mg固定化DAAO酶，混匀，立即放于25℃摇床中150转/min反应10min。吸取1mL反应液立即加入100μL 2M的盐酸中终止反应，混匀，加入4.9mL去离子水稀释，混匀。吸取2mL稀释液，加入0.8mL 2，4-二硝基苯肼溶液，混匀后静置反应10min。加入3.2ml 3M氢氧化钠溶液，摇匀后静置15min，用分光光度计在550nm处测吸光值，从而计算出酶活。
Figure BDA0002400067660000061
表1
Figure BDA0002400067660000062
Figure BDA0002400067660000071
表中挂载率和固定化酶活力都较好的树脂类型为ReliZymeTM EP113、SEPABEADSTMEC-EP、ReliZymeTM EP403、SEPABEADSTM EC-HFA、ReliZymeTM HFA403和RBS，选取该6种类型树脂制备的DAAO固定化酶做稳定性筛选实验。方法为：用50mM pH为8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制标准品D,L-草铵膦(购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，其Marfey试剂柱前衍生HPLC图谱见图1；其中，出峰时间为12.016分钟的峰为D-草铵膦的峰，出峰时间为13.683分钟的峰为L-草铵膦的峰，后续没有标注具体时间的峰为Marfey试剂自身的峰；其离子对的HPLC图谱见图2)为50g/L，过氧化氢酶为1000U/mL的底物溶液，氨水调节pH为8.0。分别取上述6种DAAO固定化酶各5g，加入100mL底物溶液，20℃水浴锅中机械搅拌反应，按照0.5VVM通入氧气(每分钟通入0.5倍反应体积的氧气)。每隔一天取固定化酶，用50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠洗涤两次，检测酶活力，数据如表2所示。
表2固定化酶活稳定性检测
Figure BDA0002400067660000072
实施例3ReliZymeTM EP113-DAAO固定化酶批次反应制备PPO
用50mM pH为8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制D,L-草铵膦为80g/L，过氧化氢酶为1000U/mL的底物溶液，氨水调节pH为8.0。取4g ReliZymeTM EP113-DAAO固定化酶，加入50mL底物溶液，20℃水浴锅中机械搅拌反应，按照0.5VVM通入氧气(每分钟通入0.5倍反应体积的氧气)，反应通常在5-7h内结束，利用HPLC检测PPO的生成浓度(见图4，出峰时间9.799分钟的峰对应PPO)，并与标准品PPO(PPO为自制，质谱鉴定图谱见图6)的离子对HPLC图谱(见图3)进行比较，通过比较可以得出：反应顺利生成了PPO，并计算出PPO浓度；同时利用柱前衍生化高效液相色谱检测L-草铵膦的ee值。反应结束后过滤得ReliZymeTM EP113-DAAO固定化酶，加入50mL配好的底物溶液按照上述方法继续反应并对固定化酶重复套用。图5说明反应结束后反应体系中只剩L-草铵膦。
结果：14天内套用50批，其中ReliZymeTM EP113为载体的固定化酶活力剩余85.2％，L-草铵膦的ee值在98％以上，转化率在99％以上。
实施例4RBS-DAAO固定化酶批次反应制备PPO
用50mM pH为8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制D,L-草铵膦为80g/L，过氧化氢酶为1000U/mL的底物溶液，氨水调节pH为8.0。取4g RBS-DAAO固定化酶，加入50mL底物溶液，20℃水浴锅中机械搅拌反应，按照0.5VVM通入氧气(每分钟通入0.5倍反应体积的氧气)，反应通常在5-7h内结束，利用HPLC检测PPO的生成浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检测L-草铵膦的ee值。反应结束后过滤得RBS-DAAO固定化酶，加入50mL配好的底物溶液按照上述方法继续反应并对固定化酶重复套用。
结果：14天内套用50批，RBS-DAAO为载体的固定化酶活力剩余82.1％，L-草铵膦的ee值在98％以上，转化率在99％以上。
实施例5ReliZymeTM EP113-DAAO固定化酶连续反应制备PPO
用50mM pH为8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制D,L-草铵膦为80g/L，过氧化氢酶为1000U/mL的底物溶液，氨水调节pH为8.0。取200g ReliZymeTM EP113-DAAO固定化酶装于立式沸腾床中，加入2500mL上述底物溶液，以800mL/min的通气速度从底部通入氧气，用循环水浴控制夹套内温度为20℃，当反应转化率达到98％以上时，以8mL/min的流速从底物开始流入上述底物溶液，用反应瓶收集沸腾床上部流出的反应液进行连续反应。
结果：14天内反应了12.9kgD,L-草铵膦，反应液L-草铵膦的ee值在96％以上，转化率在98％以上，固定化酶活力剩余85.6％。
实施例6SEPABEADSTM EC-EP-DAAO固定化酶批次反应制备PPO
用50mM pH为8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制D,L-草铵膦为80g/L，过氧化氢酶为1000U/mL的底物溶液，氨水调节pH为8.0。取4g SEPABEADSTM EC-EP-DAAO固定化酶，加入50mL底物溶液，20℃水浴锅中机械搅拌反应，按照0.5VVM通入氧气(每分钟通入0.5倍反应体积的氧气)，利用HPLC检测PPO的生成浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检测L-草铵膦的ee值。当D-草铵膦构型小于2％时停止反应，反应结束后过滤得SEPABEADSTMEC-EP-DAAO固定化酶，加入50mL配好的底物溶液按照上述方法继续反应并对固定化酶重复套用。
结果：14天内套用41批，SEPABEADSTM EC-EP-DAAO为载体的固定化酶活力剩余44.7％，L-草铵膦的ee值在98％以上，转化率在99％以上。
实施例7不同D,L-草铵膦浓度对反应时间和L-草铵膦产率的影响
用50mM pH为8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制D,L-草铵膦浓度分别为50g/L、80g/L、100g/L、120g/L、150g/L和200g/L，氨水调节pH为8.0。各取50mL，分别加入过氧化氢酶至终浓度为1000U/mL，取ReliZymeTM EP113-DAAO固定化酶按照酶和D,L-草铵膦质量比1：1加入固定化酶，20℃水浴锅中机械搅拌反应，按照0.5VVM通入氧气(每分钟通入0.5倍反应体积的氧气)，利用HPLC检测PPO的生成浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检测L-草铵膦的ee值。结果见表3。
表3
D,L-草铵膦浓度 反应时间 产率 L-草铵膦ee值
50g/L 4h 99％ 99％以上
80g/L 5h 99％ 99％以上
100g/L 7h 98％ 98％
120g/L 9h 96％ 95％
150g/L 12h 94％ 93％
200g/L 23h 90％ 85％
对比例1
除树脂外，其他均同实施例6：
用SEPABEADSTM EC-HFA-DAAO、ReliZymeTM EP403-DAAO固定化酶批次反应制备PPO。
结果：
14天内套用11批，SEPABEADSTM EC-HFA为载体的固定化酶活力仅剩余13.8％，L-草铵膦的ee值在98％以上，转化率在99％以上。
14天内套用9批，ReliZymeTM EP403为载体的固定化酶活力仅剩余9.2％，L-草铵膦的ee值在98％以上，转化率在99％以上。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海弈柯莱生物医药科技有限公司
<120> 一种固定化D-氨基酸氧化酶及其制备方法和应用
<130> P20010787C
<150> 2019101653154
<151> 2019-03-05
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 368
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 固定化D氨基酸氧化酶的氨基酸序列
<400> 1
Met His Ser Gln Lys Arg Val Val Val Leu Gly Ser Gly Val Ile Gly
1 5 10 15
Leu Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser Val His Ile
20 25 30
Leu Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr Phe Ala Ser
35 40 45
Pro Trp Ala Gly Ala Val Trp Thr Pro Gln Met Thr Leu Thr Asp Gly
50 55 60
Pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Glu Ser Thr Phe Lys Lys Trp Val Glu
65 70 75 80
Leu Val Pro Thr Gly His Ala Met Trp Leu Lys Gly Thr Arg Arg Phe
85 90 95
Ala Gln Asn Glu Asp Gly Leu Leu Gly His Trp Tyr Lys Asp Ile Thr
100 105 110
Pro Asn Tyr Arg Pro Leu Pro Ser Ser Glu Cys Pro Pro Gly Ala Ile
115 120 125
Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu Ser Val His Ala Pro Lys Tyr Cys Gln
130 135 140
Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Gln Lys Leu Gly Ala Thr Phe Glu Arg Arg
145 150 155 160
Thr Val Thr Ser Leu Glu Gln Ala Phe Asp Gly Ala Asp Leu Val Val
165 170 175
Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Ile Asp Asp Gln
180 185 190
Ala Ala Glu Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys Ser Pro Cys
195 200 205
Lys Arg Cys Thr Ser Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Pro Ala Tyr Ile
210 215 220
Ile Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile Cys Gly Gly Thr Tyr Gly Val
225 230 235 240
Gly Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr Val Gln Arg Ile Leu
245 250 255
Lys His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Thr Ile Ser Ser Asp Gly Thr Ile
260 265 270
Glu Gly Ile Glu Val Leu Arg His Asn Val Gly Leu Arg Pro Ala Arg
275 280 285
Arg Gly Gly Pro Arg Val Glu Ala Glu Arg Ile Val Leu Pro Leu Asp
290 295 300
Arg Thr Lys Ser Pro Leu Ser Leu Gly Arg Gly Ser Ala Arg Ala Ala
305 310 315 320
Lys Glu Lys Glu Val Thr Leu Val His Ala Tyr Gly Phe Ser Ser Ala
325 330 335
Gly Tyr Gln Gln Ser Trp Gly Ala Ala Glu Asp Val Ala Gln Leu Val
340 345 350
Asp Glu Ala Phe Gln Arg Tyr His Gly Ala Ala Arg Glu Ser Lys Leu
355 360 365
<210> 2
<211> 1104
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 固定化D氨基酸氧化酶的基因（核苷酸序列）
<400> 2
atgcactctc agaaacgtgt tgttgttctg ggttctggtg ttatcggtct gtcttctgct 60
ctgatcctgg ctcgtaaagg ttactctgtt cacatcctgg ctcgtgacct gccggaagac 120
gtttcttctc agaccttcgc ttctccgtgg gctggtgctg tttggacccc gcagatgacc 180
ctgaccgacg gtccgcgtca ggctaaatgg gaagaatcta ccttcaaaaa atgggttgaa 240
ctggttccga ccggtcacgc tatgtggctg aaaggtaccc gtcgtttcgc tcagaacgaa 300
gacggtctgc tgggtcactg gtacaaagac atcaccccga actaccgtcc gctgccgtct 360
tctgaatgcc cgccgggtgc tatcggtgtt acctacgaca ccctgtctgt tcacgctccg 420
aaatactgcc agtacctggc tcgtgaactg cagaaactgg gtgctacctt cgaacgtcgt 480
accgttacct ctctggaaca ggctttcgac ggtgctgacc tggttgttaa cgctaccggt 540
ctgggtgcta aatctatcgc tggtatcgac gaccaggctg ctgaaccgat ccgtggtcag 600
accgttctgg ttaaatctcc gtgcaaacgt tgcacctctg actcttctga cccggcttct 660
ccggcttaca tcatcccgcg tccgggtggt gaagttatct gcggtggtac ctacggtgtt 720
ggtgactggg acctgtctgt taacccggaa accgttcagc gtatcctgaa acactgcctg 780
cgtctggacc cgaccatctc ttctgacggt accatcgaag gtatcgaagt tctgcgtcac 840
aacgttggtc tgcgtccggc tcgtcgtggt ggtccgcgtg ttgaagctga acgtatcgtt 900
ctgccgctgg accgtaccaa atctccgctg tctctgggtc gtggttctgc tcgtgctgct 960
aaagaaaaag aagttaccct ggttcacgct tacggtttct cttctgctgg ttaccagcag 1020
tcttggggtg ctgctgaaga cgttgctcag ctggttgacg aagctttcca gcgttaccac 1080
ggtgctgctc gtgaatctaa actg 1104

Claims (10)

1.一种固定化D氨基酸氧化酶，其特征在于，其包括树脂和氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的D-氨基酸氧化酶；所述的D-氨基酸氧化酶与所述树脂通过共价键合作用连接，所述的树脂为环氧树脂和/或RBS氨基树脂。
2.如权利要求1所述的固定化D氨基酸氧化酶，其特征在于，所述的环氧树脂为基质为甲基丙烯酸聚合物，官能团选自以下官能团中的一种的环氧树脂：
Figure FDA0002400067650000011
所述的环氧树脂优选SEPABEADSTM EC-EP环氧树脂、ReliZymeTM EP113环氧树脂，ReliZymeTM HFA403环氧树脂、SEPABEADSTM EC-HFA环氧树脂以及ReliZymeTM EP403环氧树脂中的一种或多种；更优选SEPABEADSTM EC-EP环氧树脂和/或ReliZymeTMEP113环氧树脂；
较佳地，所述的树脂选自SEPABEADSTM EC-EP环氧树脂、ReliZymeTM EP113环氧树脂以及RBS氨基树脂中的一种或多种；
更佳地，所述的树脂为SEPABEADSTM EC-EP环氧树脂、ReliZymeTM EP113环氧树脂或者RBS氨基树脂。
3.一种如权利要求1或2所述的固定化D氨基酸氧化酶的制备方法，所述的制备方法包括将所述D-氨基酸氧化酶与所述树脂混合，发生共价链接反应后得连接有D-氨基酸氧化酶的树脂。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述D-氨基酸氧化酶与所述树脂的相对用量为10～300U/g，较佳地为85U/g；
和/或，所述的共价链接反应时间为10～30h，较佳地为20～25h；
和/或，所述的共价链接反应温度为10～40℃，较佳地为18～22℃；
和/或，所述的共价链接反应在缓冲液中进行。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的缓冲液为磷酸缓冲液，较佳地为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液；所述的磷酸缓冲液的浓度优选20～2000mM，更优选50～500mM，进一步优选100mM；
和/或，所述的缓冲液的pH为6～9，较佳地为7～8。
6.一种如权利要求1或2所述的固定化D氨基酸氧化酶在合成L-草铵膦中的应用。
7.一种2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括：在所述固定化D-氨基酸氧化酶的存在下，将D-草铵膦盐进行氧化反应，得到所述的2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的固定化D-氨基酸氧化酶与D-草铵膦的质量比为1:1～10:1，优选2:1；
和/或，在所述的氧化反应中，所述的D-草铵膦盐可单独存在、或以D,L-草铵膦盐的形式存在；
和/或，所述的氧化反应在过氧化氢酶的存在下进行，所述的过氧化氢酶的浓度优选100～2000U/mL，更优选1000U/ml；
和/或，所述的氧化反应在通氧气的条件下进行，所述通氧气的速率优选0.5VVM；
和/或，所述的氧化反应在缓冲液中进行，所述的缓冲液优选磷酸缓冲液，所述的磷酸缓冲液的浓度较佳地为5～200mM，更佳地为50mM。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的D,L-草铵膦盐的浓度为10～200g/L，较佳地为50～150g/L，更佳地为80～120g/L，进一步佳地为100g/L。
10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的缓冲液的pH为6～9，较佳地为7～8。
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