CN103667245A - 一种固定d-氨基酸氧化酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固定D-氨基酸氧化酶的方法。本发明提供的固定D-氨基酸氧化酶的方法，包括如下步骤:将聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒、D-氨基酸氧化酶与催化剂LiClO4在缓冲液中进行反应，得到固定有D-氨基酸氧化酶的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒。本发明的实验证明，本发明以活性聚合物聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的磁性纳米颗粒为载体，在催化剂LiClO4的催化下实现了D-氨基酸氧化酶的简单、快速、高效固定，并以苯甲酸或其衍生物类抑制剂为例，进行了D-氨基酸氧化酶抑制剂筛选。
Description
技术领域
本发明涉及酶固定领域，尤其涉及一种固定D-氨基酸氧化酶的方法。
背景技术
D-氨基酸氧化酶（DAAO）是一种催化氧化D-氨基酸的黄素酶。在生物体中，D-氨基酸的生理水平对调节成熟化、激素分泌和信号传导等过程具有至关重要的作用。例如，D-丝氨酸是中枢神经系统中的内生神经递质，对很多生理过程都起着关键作用。研究表明脑脊髓液中D-丝氨酸的降低和精神分裂症相关。因而越来越多的研究者开始关注于寻找D-氨基酸氧化酶的抑制剂来调节D-丝氨酸的水平，继而寻找治疗相关疾病的方法。目前常用的D-氨基酸氧化酶抑制剂方法有比色法和荧光光谱法等，然而这些方法一般在自由溶液中进行，具有操作复杂、稳定性差和酶不能重复使用等缺点。而酶固定的方法可以解决在自由溶液中酶反应引发的问题，因此，可以通过酶固定的方式来建立简单、高效的D-氨基酸氧化酶抑制剂筛选的方法。
磁性纳米颗粒固定化酶不仅具有良好的稳定性、较高的酶解效率，而且还具有能在保持酶活性的前提下反复使用、易从反应介质中分离和防止酶解产物污染等优点。在众多的磁性纳米颗粒固定化酶材料中，聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的磁性纳米颗粒具有高官能度（环氧基团），因而酶负载量大，且能在温和的条件下和酶的氨基反应，因此是酶固定化材料的良好选择。然而，一般此类聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）修饰的磁性纳米颗粒和酶反应需要的时间较长，如室温搅拌24h，这对于D-氨基酸氧化酶这样的对环境敏感的酶是不利的。因此需要寻找有效的催化剂来提高酶的固定化效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种固定D-氨基酸氧化酶的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：将聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒、D-氨基酸氧化酶与催化剂LiClO4在缓冲液中进行反应，得到固定有D-氨基酸氧化酶的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒。
上述方法使D-氨基酸氧化酶固定在载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒上。
上述方法中，所述聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒、D-氨基酸氧化酶与催化剂LiClO4的质量比为20：5：2。
上述方法中，所述反应为：23-28℃反应1-5h，具体在本发明实施例中反应为25℃反应3h。
上述方法中，所述缓冲液为浓度为100.0mM、pH值为8.2的磷酸缓冲液。
上述100.0mM、pH值为8.2的磷酸缓冲液配方如下：称取0.78g磷酸二氢钠溶于50mL水中，用1.0M的氢氧化钠溶液调至pH8.2。
上述方法中，所述聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒中的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯的分子量为27487，PDI为1.78，聚合度为193。
上述方法中的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒按照如下方法制备：
1）用引发剂α-溴异丁酸（BIB）修饰Fe3O4磁性纳米颗粒，得到BIB修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒；其中，所述Fe3O4磁性纳米颗粒的粒径为12nm；具体操作步骤如下：将2g粒径约为12nm的Fe3O4磁性纳米颗粒和550mg的引发剂BIB在室温（25℃）下搅拌24h，然后用甲醇充分洗涤，再在50℃真空干燥12h，得到BIB修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒。
粒径约为12nm的Fe3O4磁性纳米颗粒采用传统的共沉淀法制备。
2）将步骤1）得到的BIB修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒和甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）在溶剂环己酮中、在催化剂CuBr和2,2’-联吡啶联用下，进行聚合反应，得到聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒。
具体操作步骤如下：取0.9g上述制备得到的BIB修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒加入到50mL的溶剂环己酮中，再加入催化剂（该催化剂为1.5mmol CuBr和4.5mmol2,2’-联吡啶联用）和单体GMA（300mmol），于55℃油浴搅拌聚合反应24h，得到的反应产物用四氢呋喃和水反复洗涤三次，再在50℃真空干燥12h，得到聚合物PGMA修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒（PGMAFe3O4磁性纳米颗粒）。
由上述方法制备的固定有D-氨基酸氧化酶的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒也是本发明保护的范围。
上述的方法或上述的固定有D-氨基酸氧化酶的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒在D-氨基酸氧化酶抑制剂筛选中的应用也是本发明保护的范围。
本发明中的D-氨基酸氧化酶抑制剂筛选以苯甲酸或其衍生物为例，可以包括：苯甲酸、苯甲酰胺、邻硝基苯甲酸、间硝基苯甲酸、对硝基苯甲酸、邻羟基苯甲酸、间羟基苯甲酸、对硝基苯甲酸、邻氨基苯甲酸和对氨基苯甲酸等。
本发明的实验证明，本发明以活性聚合物PGMA修饰的磁性纳米颗粒为载体，在催化剂LiClO4的催化下实现了D-氨基酸氧化酶的简单、快速、高效固定，并以苯甲酸或其衍生物类抑制剂为例，进行了D-氨基酸氧化酶抑制剂筛选。本发明的方法克服了传统D-氨基酸氧化酶抑制剂筛选过程中的易失活、操作复杂和不可重复使用等不足。另外，本发明方法固定的D-氨基酸氧化酶具有良好的酶活性、稳定性和可重复使用性，从而提高了酶的利用率和酶抑制剂筛选效率，降低了成本。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、D-氨基酸氧化酶固定
1、引发剂α-溴异丁酸（BIB）修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒的制备
采用传统的共沉淀法（Massart,R.,Cabuil,V.,Synthesis of colloidal magnetitein alkaline medium:yield and particle size control.Journal de chimie physique,1987,84,967-973.）制备得到粒径约为12nm的Fe3O4磁性纳米颗粒。
将2.0g Fe3O4磁性纳米颗粒和550mg的引发剂BIB在室温（25℃）下搅拌24h，然后用甲醇充分洗涤，再在50℃真空干燥12h，得到BIB修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒。
2、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒的制备
采用“graft from”的方法制备得到聚合物PGMA修饰的磁性纳米颗粒，具体操作步骤如下：
取0.9g上述1制备得到的BIB修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒为引发剂加入到50mL的溶剂环己酮中，再加入催化剂（该催化剂为1.5mmol CuBr和4.5mmol 2,2’-联吡啶联用）和单体甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA，300mmol），于55℃油浴搅拌聚合反应24h，得到的反应产物用四氢呋喃和水反复洗涤三次，再在50℃真空干燥12h，得到聚合物PGMA修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒（PGMAFe3O4磁性纳米颗粒）。
将聚合物进行酸解（用盐酸酸解1h之后，进行分离得到聚合物）之后用于凝胶渗透色谱（GPC）分析，所用GPC仪的配置为Waters2414示差折光检测器、一套Waters聚苯乙烯凝胶柱和Waters1515HPLC溶剂泵，以四氢呋喃为洗脱剂且流速为1.0mL/min，得到聚合物的分子量（Mn）为27487，PDI为1.78，聚合度为193。
3、D-氨基酸氧化酶固定
2.5mg/mL的D-氨基酸氧化酶溶液的制备：将2.5mg D-氨基酸氧化酶溶解在1.0mL浓度为100.0mM、pH值为8.2的磷酸缓冲液中；
其中浓度为100.0mM、pH值为8.2的磷酸缓冲液按照如下方法制备：称取0.78g磷酸二氢钠溶于50.0mL水中，用1.0M的氢氧化钠溶液调至pH8.2。
D-氨基酸氧化酶固定：将20.0mg上述2制备得到的PGMAFe3O4磁性纳米颗粒和2.0mg的催化剂LiClO4加入到2.0mL2.5mg/mL的D-氨基酸氧化酶溶液中（反应体系中，PGMAFe3O4磁性纳米颗粒、D-氨基酸氧化酶与催化剂LiClO4的质量比为20：5：2），25℃搅拌反应3h，使PGMAFe3O4、LiClO4和D-氨基酸氧化酶在浓度为100mM、pH值为8.2的磷酸缓冲液中进行反应，水洗三次之后，得到固定有D-氨基酸氧化酶的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒（DAAOPGMAFe3O4）；再将其分散于50.0mM Tris-HCl缓冲液（pH8.2）中，然后保存在4℃冰箱中，用于后续的筛选抑制剂实验。
通过考马斯亮蓝法测定酶的固定量，具体步骤为：先配制考马斯亮蓝标准溶液（即称取10.0mg考马斯亮蓝G-250，加入5.0mL95%乙醇和10.0mL85%磷酸在100.0mL的容量瓶中定容），取90μL的考马斯亮蓝标准溶液和10μL的D-氨基酸氧化酶标准溶液（浓度范围0.08-2.5mg/mL）孵育2min后，用酶标仪测定其在595nm的紫外吸收，得到标准曲线：y=0.197x+0.284；通过同样的步骤测定酶固定之后的残液与考马斯亮蓝标准溶液孵育之后在595nm的紫外吸收，从标准曲线求得未反应的酶的量，即可求得固定量；酶固定量除以开始加入的D-氨基酸氧化酶的量，即为酶固定效率，结果得到3h之后的酶固定效率为88.6%，且酶活性保持良好。
以甲硫氨酸（Met）为底物进行酶解，酶解之后的样品用丹酰氯衍生之后，再采用手性配体交换毛细管电泳法（CLE-CE）进行分析。
丹酰氯衍生步骤：取20μL的上清液、20μL的1.5mg/mL丹酰氯溶液（溶于丙酮）和20μL的40.0mM的碳酸锂水溶液（pH9.8）于200μL的离心管中混合均匀，微波（功率为480W）反应6min，然后加入5μL2%的乙胺终止反应，即得到丹酰氯衍生的样品。
CLE-CE的背景电解质的组成为：100.0mM硼酸、5.0mM乙酸铵、3.0mMZnSO4和15.0mM N-丁基-N-甲基哌啶鸟氨酸盐（[P1,4][Orn]），且pH为8.4。其中，[P1,4][Orn]的合成步骤如下：首先，将N-丁基-N-甲基哌啶溴盐（[P1,4]Br）和含羟基的阴离子交换树脂反应得到[P1,4]OH水溶液，然后将此水溶液逐滴加入到稍微过量的等摩尔的鸟氨酸（Orn）水溶液中于25℃搅拌反应24h，再在55℃真空干燥。为了除去多余未反应的Orn，用乙腈/甲醇（体积比为9：1）混合液多次洗涤反应产物并过滤。将滤液于60℃真空烘干12h，即得到产物[P1,4]Orn。
计算相对酶活性（RA）的公式定义如下：RA=(A0-An)/(A0-A1)。其中，A0是指酶解之前底物Met的峰面积，A1和An分别为固定化酶进行第一次酶解和第n次酶解之后底物Met的峰面积。
得到的固定有D-氨基酸氧化酶的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒（DAAOPGMAFe3O4）在重复使用10次之后，酶活性依然保持68.2%，且4℃冰箱保存4周之后，酶活性依然保持88.7%，而自由酶溶液（溶于100.0mM磷酸缓冲液中，pH值为8.2）在放置24h后，酶活性降低至10.6%。
实施例2、固定化的D-氨基酸氧化酶酶反应器在D-氨基酸氧化酶抑制剂筛选中的应用
将40μL2.0mM的甲硫氨酸（Met）溶液（溶于100.0mM磷酸缓冲液中，pH值为8.2）、40μL200.0μM的苯甲酸类酶抑制剂（溶于100.0mM磷酸缓冲液中，pH值为8.2）和0.4mg由实施例1制备的DAAOPGMAFe3O4在0.5mL离心管中混合，37℃孵育5min。孵育完成后，用磁铁回收DAAOPGMAFe3O4纳米颗粒，上清液进行丹酰氯衍生之后，得到丹酰氯衍生的样品，可直接用于CLE-CE分析。
上述苯甲酸类酶抑制剂分别为如下中的任一种：苯甲酸、苯甲酰胺、邻羟基苯甲酸、间羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、邻硝基苯甲酸、间硝基苯甲酸、对硝基苯甲酸、邻氨基苯甲酸和对氨基苯甲酸。
丹酰氯衍生方法和CLE-CE检测方法均同上。
抑制效率（I）的计算公式如下：I=(C2-C1)/(C0-C1)。其中，C0是指不加酶和抑制剂时的底物Met浓度，C1和C2分别指添加抑制剂和不添加抑制剂的条件下的酶解剩余底物Met浓度。
结果如下：
苯甲酸类酶抑制剂的抑制效率分别为：苯甲酸88.4%、苯甲酰胺9.6%、邻羟基苯甲酸38.7%、间羟基苯甲酸25.8%、对羟基苯甲酸19.7%、邻硝基苯甲酸5.8%、间硝基苯甲酸27.2%、对硝基苯甲酸32.2%、邻氨基苯甲酸22.2%、对氨基苯甲酸14.6%。其中，RSD≤1.2%（n=3）。同时，重复筛选10次酶抑制剂的RSD≤4.3%，说明它具有良好的可重复使用性。
采用本发明固定方法进行酶固定，可以快速、多次重复地进行酶抑制剂的筛选。
Claims (10)
1.一种固定D-氨基酸氧化酶的方法，包括如下步骤:将聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒、D-氨基酸氧化酶与催化剂LiClO4在缓冲液中进行反应，得到固定有D-氨基酸氧化酶的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒、D-氨基酸氧化酶与催化剂LiClO4的质量比为20：5:2。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述反应为：23-28℃反应1-5h。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述反应为25℃反应3h。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述缓冲液为浓度为100mM、pH值为8.2的磷酸缓冲液。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒中的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯的分子量为27487，PDI为1.78，聚合度为193。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：
所述聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒按照如下方法制备：
1）用引发剂α-溴异丁酸修饰Fe3O4磁性纳米颗粒，得到BIB修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒；
2）将步骤1）得到的BIB修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒和甲基丙烯酸缩水甘油酯在溶剂环己酮中、在催化剂CuBr和2,2’-联吡啶联用下，进行聚合反应，得到聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述Fe3O4磁性纳米颗粒的粒径为12nm。
9.由权利要求1-8中任一所述的方法制备的固定有D-氨基酸氧化酶的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒。
10.权利要求1-8中任一所述的方法或权利要求9所述的固定有D-氨基酸氧化酶的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒在D-氨基酸氧化酶抑制剂筛选中的应用。
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