CN111171122A - 一种来源于半夏的抗菌肽PtR946及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明本领域属于生物技术领域，具体涉及一种来源于半夏的抗菌肽PtR946及其应用。申请人通过利用枯草芽胞杆菌分泌表达系统，在半夏cDNA文库中筛选到抗菌肽PtR946，对其进行抑菌谱、最低抑菌浓度、热稳定、pH稳定性和酶稳定性等的性能研究，研究证明该抗菌肽具有广谱的抗菌特性，对所有供试的革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌有明显的抑制作用，抗菌肽PtR946在高温、pH 3.0‑10.0和蛋白酶处理的条件下也能表现出稳定的抑菌活性。通过对表达抗菌肽PtR946的工程菌进行固体发酵，提高该菌株的拮抗活性，降低生产成本，为规模化生产奠定基础，以实现该抗菌肽生防应用的价值。

Description

一种来源于半夏的抗菌肽PtR946及其应用
技术领域
本领域属于生物技术领域，具体涉及一种来源于半夏的抗菌肽PtR946及其应用。
背景技术
枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)是一种需氧的、对环境无害的、能产生抗逆较强的内生芽胞的杆状革兰氏阳性细菌，常见于土壤，水源和植物中(Kunst F 1997)，被美国食品药品监督管理局(FDA)认证为是安全的模式菌株(Generally recognized as safe，GRAS)。枯草芽胞杆菌被证明是一种优秀的应用系统生物学分析对各种条件的代谢反应的模式生物(Buescher et al 2012,Nicolas et al 2012)。通过在整体的基因特异水平上调节和修饰相应的代谢途径，可以在芽胞杆菌中获得广泛的细胞表型。枯草芽胞杆菌具有优良的发酵能力和天然的高分泌能力，它能产生大量的蛋白质，由于缺乏外膜，能直接分泌蛋白质到外部培养基中(M.Simonen 1993)。枯草芽胞杆菌作为一个多功能表达宿主，在基因工程的菌株方面具有重大意义(Liu et al 2013)，被广泛应用于农业、食品、制药等各个领域中，其作为生物防治剂具有良好的应用价值(Yanez-Mendizabal et al 2012,张杰et al2016)。
蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)兼性厌氧，产芽胞，是一种常见的革兰氏阳性食品污染菌种(Schoeni J L and C.2005)。一些菌株因产生呕吐型和致泻型两种毒素，而导致食物中毒，多发于夏秋季，临床表现为呕吐、腹痛、腹泻个别伴随头晕、乏力、食欲不振，常存在于乳制品、肉制品、水产品及米饭中(王彤et al 2017)。近年来，蜡样芽胞杆菌引发的食物中毒事件屡见不鲜，在我国细菌性中毒菌种中排前四。蜡样芽胞杆菌(B.cereus)除可使肠道感染引发食物中毒之外，还会引起一些免疫受损和免疫功能低下个体的系统性和局部的感染，感染的范围包括暴发性菌血症、中枢神经系统(CNS)感染(脑膜炎和脑脓肿)、眼内炎、肺炎和气性坏疽性皮肤感染等(Bottone 2010)。现今，蜡样芽胞杆菌对抗生素逐渐产生耐药性，在对13中抗菌药物的耐药性性研究中对Ampicillin、Penicillin等的抗生素耐药率>75％，细菌从对抗生素敏感变为耐药大概需要2年，而一个新型抗生素的研发周期大概是10年(丁元廷.2013)。细菌从敏感到耐药的速度远远超过抗生素的研发周期，因此加快新型抗菌剂研发和减缓细菌耐药速度都至关重要。
番茄细菌性溃疡病菌(Clavibactermichiganensis)为细菌性维管束病害，番茄溃疡病菌除侵染番茄外，还侵染辣椒(Capsicum annuu)、龙葵(Solanum nigrum)、裂叶茄(S.triflorum)、紫花苜蓿及其它番茄属植物。也可寄生在心叶烟(Nicotianaglutinosa)和其它茄属植物(Eichenlaub and Gartemann 2011)。番茄溃疡病菌的接种寄主包括马铃薯、小麦、大麦、黄瓜、黑麦、燕麦、向日葵和西瓜等植物(魏亚东1996,王俊平and李树洋2014)。因其严重的产量和经济损失，番茄溃疡病在我国和很多其它国家都是检疫对象(León etal 2008)。目前通过化学手段防治效果有限，同时容易使病原菌产生抗药性，并且会污染环境。所以利用拮抗微生物日渐成为防治土传病害最有效环保最有发展前景的防治方法。
青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)是一种青枯菌是一种革兰阴性变形菌，且植物青枯病是世界性的第二大破坏性植物细菌性病害，其宿主范围之广，主要病原体不仅影响茄科植物，如番茄和马铃薯，还有许多杂草、作物、灌木和其他双子叶植物和单子叶植物；青枯病菌可在不同地方进化出对原生植物和宿主的引入有不同的能力，据统计，能感染超过250多种单子叶植物和54种双子叶植物(Genin and Denny 2012,Peeters et al 2013)。青枯病造成的产量损失一般在15％到95％。由于传统的防治方法对环境污染大和其他各种限制因素,生物防治方法逐渐得到研究人员的重视，利用生物防治手段防治青枯病逐渐成为重要的防治方法。
Figure BDA0002358761160000021
水稻白叶枯病是由水稻黄单胞水稻致病变种(Xanthomonasoryzae)引起的世界水稻生产上严重的细菌病害之一，其发病速度之快、引起的危害程度之大，被列为水稻一级病害之一(Bhagat J et al 2013)。水稻白叶枯病的防治一直以来都是人们关注的重点问题，目前防治水稻白叶枯病主要有以下几种方式：一是抗生素类药物；二是培育抗病品种；三是生物防治。前两种方式都有自己的局限性，抗生素药物的使用容易造成环境的污染；培育抗病品种作为目前最主要的防治白叶枯病的手段，但培育新品种往往需要较长的时间，而且长期单一抗病基因品种的使用会导致病菌产生新的变异；生物防治作为一种可持续的，无害的，耗资少的防治手段受到人们的广泛关注。
抗菌肽(AMPS)是相对较小的(6到100个氨基酸)，具有可变长度、序列和结构的双亲性分子。AMPs是一种多种宿主防御肽，作为抵御致病威胁的第一道防线，并通过免疫调节发挥作用。抗菌肽是近乎所有生命体先天免疫系统的重要组成部分，它们通常是抵御多种致病菌、寄生虫、包膜病毒和真菌的第一道防线。这些小分子量的多肽由于它们的广谱、快速作用、对哺乳类动物的细胞的低毒性和避免致病菌出现抵抗力的独特作用模式，被认为是富有前景的治疗药剂。另外，在医药运用上，抗菌肽也可以被创新的适用于农业的植物保护。抗菌肽所赋予的抗病能力也许可以帮组我们克服由于致病菌所引起的农业产品的减产、质量和安全。低分子量的抗菌肽对广泛的攻击植物或者动物的致病生物体有抑制活性(Thevissen et al 2007)。不同的抗菌肽展现出广谱抗性，对哺乳细胞的低毒性，而且有独特的作用方式。
病原菌对抗生素的耐药性是21世纪人类面临的最重要的健康挑战之一，随着世界范围内抗生素的滥用，造成了多重抗药性的“超级细菌”呈现爆发式的增长，开发高效、安全无毒、稳定性强的杀菌剂迫在眉睫。大量研究表明，抗菌肽能够成为传统抗生素的理想替代品，能够有效的解决日益加重的致病菌的抗药性(Czaplewski et al 2016)。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种来源于半夏的抗菌肽PtR946，所述的抗菌肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
本发明的另一个目的是提供了一种制备抗菌肽PtR946的发酵方法，方法简单，成本低，可进行大规模制备。
本发明的最后一个目的在于提供了一种抗菌肽PtR946在制备细菌抑菌剂中的应用。为了完成上述目的，本发明采用如下技术方案：
申请人利用枯草芽胞杆菌分泌表达系统在高质量的半夏cDNA文库中，筛选能够使宿主细胞WB800自溶的基因，将出现自溶现象的菌株进行菌液PCR检测插入片段大小，提取质粒，重新转化WB800感受态细胞，PCR检测插入片段大小与之前相同，证明转化成功。在含卡那霉素的LB平板上再次划线，出现自溶现象，则表明自溶现象为插入基因引起。将其中自溶效果最好的菌株提取质粒，测序，最终获得抗菌肽PtR946的氨基酸序列。
一种来源于半夏的抗菌肽PtR946，所述抗菌肽的氨基酸序列为：KQLLQDEVICTNVPLLYICTVKHIEAMFFFCF；
上述氨基酸序列对应的核苷酸序列也为本发明的保护范围。
以上所述的核苷酸序列，优选的，如下：
AAGCAATTGCTTCAGGATGAGGTAATTTGTACAAATGTCCCATTACTGTATATATGCACAGTAAAACATATTGAAGCCATGTTTTTTTTTTGTTTC。
一种制备抗菌肽PtR946的发酵方法，包括：将编辑SEQ ID NO.1所示氨基酸的核苷酸序列插入到表达载体中，再转入枯草芽孢杆菌中获得基因工程菌，将该菌株进行固态发酵；以上所述的固态发酵的过程如下：将制得的基因工程菌以3-10％，体积质量比，接入固态发酵培养基中，发酵温度为35-40℃，发酵时间为24-72h，在发酵过程每4-8h进行翻动；
所述的固态发酵培养基的配方：麸皮10-14g，稻草粉6-10g，葡萄糖0.4-0.6，NaNO30.4-0.8g，KH2PO40.05-0.2g，料水比为1:1-2。
以上所述的发酵方法，优选的，是将制得的基因工程菌以接种量为5％接入固态发酵培养基中，发酵温度为37℃，发酵时间为48h，在发酵过程每4h进行翻动；
所述的固态发酵培养基的最佳配方为：麸皮12g，稻草粉8g，葡萄糖0.5g，NaNO30.6g，KH2PO40.1g，料水比为1:1.5。
一种半夏抗菌肽PtR946的应用，包括利用本发明提供的抗菌肽制备成抑菌剂，并应用到实际生产中；所述的抑菌剂中抑制的细菌包括但不限于：蜡样芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、大肠杆菌；番茄细菌性溃疡病菌、青枯病菌、水稻白叶枯病菌、小麦苗枯病菌。
附图说明
图1为枯草芽胞杆菌菌株扫描图片；
其中：A和B为对照菌株空载体，C和D为PtR946自溶菌株；A和C为20,000倍镜下的电镜图片，B和D和为40,000倍镜下的电镜图片。
图2为抗菌肽PtR946、WB800菌株蛋白抑菌圈示意图。
对峙的指示菌共6种分别标注在图的下方，在图中已标明测试菌株的相应位置。
图3为不同温度处理30min后的抗菌肽PtR946与3种指示菌的对峙图；
其中：A小麦苗枯病菌，B青枯病菌R21-5，C水稻白叶枯病菌；
a：4℃、b：30℃、c：50℃、d：70℃、e：100℃。
图4为不同温度处理后的抗菌肽PtR946的抑菌圈大小示意图。
图5为不同pH处理30min后的抗菌肽PtR946与3种指示菌的对峙图；
其中，a：ck、b：pH3、c：pH4、d：pH5、e：pH6、f：pH7、g：pH8、h：pH9、j：pH10；
A为小麦苗枯病菌；B为青枯病菌R21-5；C为水稻白叶枯病菌。
图6为pH对抗菌肽PtR946的抑菌活性的稳定性示意图。
其中：A为小麦苗枯病菌；B为青枯病菌R21-5；C为水稻白叶枯病菌。
图7为不同蛋白酶对抗菌肽PtR946的抑菌活性的影响示意图；
其中，a：CK、b：蛋白酶E、c：脂肪酶、d：胃蛋白酶、e：木瓜蛋白酶、f：α-淀粉酶、g：蛋白酶K；
A为小麦苗枯病菌，B为青枯病菌R21-5，C为水稻白叶枯病菌。
图8为不同蛋白酶处理抗菌肽PtR946后其抑菌圈大小示意图；
A为小麦苗枯病菌，B为青枯病菌R21-5，C为水稻白叶枯病菌。
图9为抗菌肽PtR946的激光共聚焦显微镜PI分析示意图；
枯草芽胞杆菌168(1×108CFU/mL)分别与抗菌肽Pt946(图9中A-C)和对照PBS缓冲液(图9中D-F)孵育。图片A和D为白光下，图片B和E为荧光下；图片C为A和B的组合，图片F为D和E的组合。
图10为抗菌肽PtR946的PI染色流式细胞数分析散点图；
将枯草芽胞杆菌168细胞分别与PBS缓冲液(图10中A)，20ng/μLWB800菌株蛋白(图10中B)和20ng/μL PtR946(图10中C)一起摇培1.5h，并在FACSVerse机器下观察。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。本发明是利用枯草芽孢杆菌发酵表达抗菌肽的方式进行PtR946的制备，利用本领域的其他蛋白表达方式，或者直接商业合成，也能达到本发明的效果。
实施例1：
半夏抗菌肽PtR946的获得：
1、在半夏cDNA文库，初步筛选能够使宿主细胞(WB8000)自溶的基因：取-70℃保存的枯草芽胞杆菌半夏cDNA文库菌株和WB800菌株解冻备用，在含kana的LB平板上点样处理，每12h观察结果，记录原本长势良好而后期出现自溶现象的菌株编号。
2、复筛：对于初筛有效果的菌株在含kana的LB平板上再次进行划线处理，每个菌株进行3个重复，每12h观察平板上长势，最终确定自溶效果稳定的菌株(图1中C和D)。
3、自溶菌株稳定性鉴定：在含kana的LB平板上再次划线，出现自溶现象，则表明自溶现象为插入基因引起。
4、将其中自溶效果最好的菌株提取质粒，测序后在NCBI上BLAST比对，未比对到相似序列，PtR946的核苷酸序列为：
AAGCAATTGCTTCAGGATGAGGTAATTTGTACAAATGTCCCATTACTGTATATATGCACAGTAAAACATATTGAAGCCATGTTTTTTTTTTGTTTC(SEQ ID NO.2所示。)
对应的氨基酸序列如下：KQLLQDEVICTNVPLLYICTVKHIEAMFFFCF(SEQ ID NO.1所示)。
实施例2：
表达抗菌肽PtR946的基因工程菌的制备及发酵：
1.(1)融合表达载体PBE-S-PtR946的构建
用T4连接酶将PtR946基因与含有Nde1和Xba1酶切位点的酶切后线性化PBE-S载体连接，获得目的基因融合表达载体PBE-S-PtR946。
(2)抗菌肽PtR946表达与分离纯化
将测序正确的融合表达载体PBE-S-PtR946质粒，用热激法转化到大肠杆菌HST08高效感受态细胞中扩增，提取质粒再转入WB800感受态细胞中获得PBE-S-PtR946融合表达菌株WB800/PtR946。利用组成型表达载体PBE-S的分泌表达特性，摇培LB(含kana)液体培养基72h获得WB800/PtR946发酵液，离心获得上清并用硫酸铵饱和溶液析出蛋白，4℃过夜后离心，用磷酸盐饱和溶液溶解沉淀，于4℃透析48h，纯化后即得目的蛋白，抗菌肽PtR946，包含SEQ ID NO.1所示序列。
2.PBE-S-PtR946融合表达菌株WB800/PtR946的固态发酵：
固态发酵培养基组成为：麸皮12g，稻草粉8g，葡萄糖0.5g，NaNO30.6g，KH2PO40.1g，料水比为1:1.5，接种量为5％(体积质量比)，发酵温度为37℃，发酵时间为48h，在发酵过程每4h进行翻动，发酵芽胞量为11.2×109CFU/g。
在本发明中，WB800菌株蛋白作为对照，其制备方法为将宿主菌株WB800按照上述工程菌相同的方式进行发酵，相同方法提取蛋白即得。
实施例3：
抗菌肽PtR946抑制细菌效果：
1、指示菌备用：以1％的接种量摇培蜡样芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌168、枯草芽胞杆菌330-2和大肠杆菌DE337℃，170r/min培养；番茄细菌性溃疡病菌YCKYBI、青枯病菌R21-5、水稻白叶枯病菌、小麦苗枯病菌，28℃，170r/min，震荡培养8-10h。
2、摇培后，取300μL指示菌菌液10mL摇菌管中，混入4mL 50℃左右的半固体NA培养基，快速混匀，迅速倒入固体LB培养基平板中，平铺整个培养皿，放置5min，使培养基充分凝固晾干。
3、将培养皿分为6个区域/8个区域，每个区域中心放置无菌的滤纸片，使之与培养基充分粘合。
4、调整抗菌肽PtR946的浓度为1000ng/mL。
5、吸取抗菌肽PtR94620μL，缓慢滴在一个区域的滤纸片上，使液体缓慢均匀扩散，按同样的方法将对照菌株的粗蛋白滴在另一区域的滤纸片上，无菌工作台内吹干。
6、37℃/28℃摇培的细菌37℃/28℃培养箱倒置培养，随时观察。
通过测定抑菌圈大小来计算抗菌肽PtR946的抗菌活性。共进行3次实验，每次实验进行3次技术重复。结果如图2和表1中所示，滴有抗菌肽PtR946的滤纸片周围都出现大的抑菌圈，而对照WB800菌株蛋白没有明显的抑菌圈出现。抗菌肽PtR946展现出了广谱的抑菌活性，在9种细菌平板上均展现出了不同程度的抑制作用，且大部分平均抑菌圈直径都在2cm以上，表现出高效的抑菌能力。
表1抗菌肽PtR946抑制细菌活性
Figure BDA0002358761160000071
实施例4：
抗菌肽的热稳定处理研究：
1、将提取的蛋白PtR946分成均等的5份，放于1.5mL EP管中，各蛋白的使用浓度均为1000ng/mL。
2、将蛋白分别放入4℃、30℃、50℃、70℃和100℃干浴锅中加热30min，加热后拿出，备用。
3、以1％的接种量摇培青枯病菌R21-5、水稻白叶枯病菌、小麦苗枯病菌，28℃、170r/min，震荡培养8-10h。
4、摇培后，取300μL指示菌菌液于10mL摇菌管中，混入4mL 50℃左右的半固体NA培养基，快速混匀，迅速倒入固体LB培养基平板中，平铺整个皿，放置5min，使培养基充分凝固晾干。
5、将培养皿分为5个区域，每个区域中心放置无菌的滤纸片，使之与培养基充分粘合。
6、吸取提取的菌株粗蛋白20μL，缓慢滴在一个区域的滤纸片上，使液体缓慢均匀扩散，按同样的方法将对照菌株的粗蛋白滴在另一区域的滤纸片上，无菌工作台内吹干。
7、28℃培养箱倒置培养，随时观察。实验重复3次以上，记录结果。
结果如图3和图4所示，抗菌肽PtR946在所有的高温条件下都表现出较为稳定的抑菌活性。从抗菌肽的温度变化曲线如图4所示，虽然随着温度的上升，抗菌肽的抑菌活性会有些许的下降，但从显著性分析(P≤0.05)可得抗菌肽的抑菌活性随着温度的变化仍能保持较为稳定。具有较为热稳定性的抗菌肽为后续的生物制剂的开发提供了潜能。
实施例5：
抗菌肽的pH处理研究：
1、将提取的蛋白PtR946分成均等的8份，每一份为100μL，放于1.5mL EP管中，各蛋白的使用浓度均为1000ng/mL。
2、分别用1mol/L的HCL和1mol/L的NaOH将各蛋白液的pH浓度调成：3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，空白对照为不做任何处理的蛋白液。
3、以1％的接种量摇培青枯病菌R21-5、水稻白叶枯病菌、小麦苗枯病菌，28℃摇床170r/min，8-10h。
4、摇培后，取300μL指示菌菌液于10mL摇菌管中，混入4mL 50℃左右的半固体NA培养基，快速混匀，迅速倒入固体LB培养基平板中，平铺整个皿，放置5min，使培养基充分凝固晾干。
5、将培养皿分为5个区域，每个区域中心放置无菌的滤纸片，使之与培养基充分粘合。
6、吸取提取的菌株粗蛋白20μL，缓慢滴在一个区域的滤纸片上，使液体缓慢均匀扩散，按同样的方法将对照菌株的粗蛋白滴在另一区域的滤纸片上，无菌工作台内吹干。
7、28℃培养箱倒置培养，随时观察。实验重复3次以上，记录结果。
结果如图5和图6所示，无论是在酸性的条件下还是在碱性(pH3.0-10.0)的条件下，抗菌肽PtR946的抑菌活性没有明显的变化，表现出较为稳定的抑菌活性，说明的该抗菌肽具有酸碱耐受性。
实施例6：
抗菌肽的蛋白酶处理研究：
1、将提取的蛋白PtR946分成均等的7份，每一份为100μL，放于1.5mL EP管中，各蛋白的使用浓度均为1000ng/mL。
2、各蛋白液中加入0.5μL的蛋白酶处理，将脂肪酶处于30℃；胃蛋白酶处于37℃；木瓜蛋白酶、α-淀粉酶、蛋白酶K、蛋白酶E处于55℃反应1h。所有酶的使用浓度为100ng/ml。空白对照为不做任何处理的蛋白液。
3、以1％的接种量摇培青枯病菌R21-5、水稻白叶枯病菌、小麦苗枯病菌，28℃、170r/min，震荡培养8-10h。
4、摇培后，取300μL指示菌菌液于10mL摇菌管中，混入4mL 50℃左右的半固体NA培养基，快速混匀，迅速倒入固体LB培养基平板中，平铺整个皿，放置5min，使培养基充分凝固晾干。
5、将培养皿分为7个区域，每个区域中心放置无菌的滤纸片，使之与培养基充分粘合。
6、吸取提取的菌株粗蛋白20μL，缓慢滴在一个区域的滤纸片上，使液体缓慢均匀扩散，按同样的方法将对照菌株的粗蛋白滴在另一区域的滤纸片上，无菌工作台内吹干。
7、28℃培养箱倒置培养，随时观察。实验重复3次以上，记录结果。
结果如图7和图8所示，与对照相比，用脂肪酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶处理过的抗菌蛋白的抑菌活性较为稳定，而用蛋白酶E处理过的抗菌肽的抑菌活性均下降，用蛋白酶K处理过的抗菌蛋白没有抑菌活性。
实施例7：
抗菌肽最低抑菌浓度(MIC)测定：
在96孔板中分别加入OD600为0.8的指示菌：青枯病菌R21-5、水稻白叶枯病菌、小麦苗枯病菌100μL，后分别加入终浓度为25ng/μL、50ng/μL、100ng/μL、200ng/μL、400ng/μL、800ng/μL、1600ng/μL的WB800菌株蛋白(对照)和PtR946，空白对照为加入100μL的PBS缓冲液，将96孔板放入28℃恒温培养箱中静置18h。经酶标仪测定抗菌蛋白最低抑菌浓度的OD600值，并记录结果。抑菌率％＝(1-处理组/对照组)*100％
结果如表2所示，WB800菌株蛋白(对照)和PtR946对小麦苗枯的最低抑菌浓度分别为：800μg/mL和25μg/mL，对青枯病菌R21-5的最低抑菌浓度为：1600μg/mL和200μg/mL，对水稻白叶枯的最低抑菌浓度为：800μg/mL和50μg/mL。与对照WB800菌株蛋白相比，抗菌肽PtR94在较低的抑菌浓度条件下能够抑制病原菌的生长，具有较强的抗菌能力。
表2抗菌蛋白的最低抑菌浓度(MIC)
Figure BDA0002358761160000101
注：MIC：最低抑菌浓度(抑菌率>85％)。这些浓度代表重复进行的三个独立实验的平均值。
实施例8
激光共聚焦扫描显微镜检测：
1、划线37℃、12h培养枯草芽胞杆菌168。
2、挑取单菌落接种到3mL LB液体培养基中，37℃、170r/min过夜培养。
3、以1％的接种量于5mL LB液体培养基中，37℃、170r/min，持续测其浓度直至OD值达到0.6-0.8之间即可。
4、4℃离心4500r/min，10min，收集菌体，弃上清。
5、用预冷的PBS缓冲液清洗细胞3次，弃上清，将贴壁细胞垂落下来，动作轻柔。
6、重悬后测菌液OD值，调整至0.8-1.0之间即可，放置于4℃冰箱中备用
7、在1.5mL EP管中加入200μL调配好的枯草芽胞杆菌168细菌细胞菌液和200μL的Pt946蛋白液，对照为加入200μL的PBS缓冲液，37℃、170r/min摇培1.5h。
8、摇培后，4500r/min离心10min，用PBS缓冲液轻柔重悬沉淀两次，最后重悬于PBS缓冲液中。
9、向细胞悬液中加入4-6μL的PI，用手轻轻将沉淀弹匀，PI的使用浓度为10ug/mL。
10、4℃避光孵育15min。
11、孵育后，4500r/min离心5min，用PBS缓冲液清洗2次，最后重悬于PBS缓冲液中。
12、清洗盖玻片和载玻片后灭菌，将细菌悬液滴至玻片上10μL，上机观察。
碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)是一种核酸染料，能够透过凋亡细胞的细胞膜而使细胞核染红。为了进一步的验证PtR946能够破坏细菌的细胞膜，进行PI的染色实验。将抗菌肽PtR946和PBS缓冲液分别于枯草芽胞杆菌168(1×108CFU/mL)进行孵育，空白对照为PBS缓冲液。激光共聚焦扫描显微镜的结果如图9所示，用Pt946抗菌肽处理过的枯草芽胞杆菌168细菌绝大部分已被PI染色而发出红色荧光(图B和C)，而在用PBS缓冲液处理的对照组中没有观察到荧光(图E和F)。证明抗菌肽PtR946能破坏细菌的细胞膜，从而使细胞破损，达到抑菌的效果。
实施例9
流式细胞仪检测：
1、划线37℃、12h培养枯草芽胞杆菌168。
2、挑取单菌落接种到3mL LB液体培养基中，37℃、170r/min过夜培养。
3、以1％的接种量于5mL LB液体培养基中，37℃、170r/min，持续测其浓度直至OD值达到0.6-0.8之间即可。
4、4℃离心4500r/min，10min，收集菌体，弃上清。
5、用预冷的PBS缓冲液清洗细胞3次，弃上清，将贴壁细胞垂落下来，动作轻柔。
6、重悬后测菌液OD值，调整至0.8-1.0之间即可，放置于4℃冰箱中备用
7、在1.5mL EP管中加入200μL调配好的枯草芽胞杆菌168细菌细胞菌液和200μL的PtR946蛋白液，PtR946蛋白液浓度为20ng/μL，空白对照为加入200μL的PBS缓冲液，对照为20ng/μL的WB800菌株蛋白，37℃、170r/min摇培1.5h。
8、摇培后，4500r/min离心10min，用PBS缓冲液轻柔重悬沉淀两次，最后重悬于PBS缓冲液中。
9、向细胞悬液中加入4-6μL的PI，用手轻轻将沉淀弹匀，PI的使用浓度为10ug/mL。
10、4℃避光孵育15min。
11、孵育后，4500r/min离心5min，用PBS缓冲液清洗2次，洗去多余的PI，最后重悬于PBS缓冲液中。
12、上机检测。
流式细胞检测也使用到PI荧光探针进行染色。将20ng/μLWB800菌株蛋白和20ng/μL PtR946分别与枯草芽胞杆菌168一起摇培1.5h。其中PBS缓冲液处理为空白对照，经过流式细胞仪检测后。结果如图10所示，用PBS缓冲处理(图10中A)过的枯草芽胞杆菌168能被PI染色而发出荧光的细胞只有1.36％，用WB800菌株蛋白(图10中B)处理过的细菌细胞发出荧光有23.2％，而用20ng/μL PtR946(图10中C)处理过的枯草芽胞杆菌168细胞发出荧光的有89.5％。实验结果表明，抗菌肽PtR946能够破坏枯草芽胞杆菌168细胞的细胞膜，使细菌破损，从而达到抑菌的效果。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种来源于半夏的抗菌肽PtR946及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Lys Gln Leu Leu Gln Asp Glu Val Ile Cys Thr Asn Val Pro Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Ile Cys Thr Val Lys His Ile Glu Ala Met Phe Phe Phe Cys Phe
20 25 30
<210> 2
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagcaattgc ttcaggatga ggtaatttgt acaaatgtcc cattactgta tatatgcaca 60
gtaaaacata ttgaagccat gttttttttt tgtttc 96

Claims (7)

1.一种来源于半夏的抗菌肽，所述抗菌肽的氨基酸序列为：SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述氨基酸序列的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，所述的序列为SEQ ID NO.2所示。
4.表达权利要求1所述的抗菌肽的工程菌的发酵方法，包括：将编辑SEQ ID NO.1所示氨基酸的核苷酸序列插入到表达载体中，再转入枯草芽孢杆菌中获得基因工程菌，将该菌株进行固态发酵；以上所述的固态发酵的过程如下：将制得的基因工程菌以3-10%，体积质量比，接入固态发酵培养基中，发酵温度为35-40℃，发酵时间为24-72h，在发酵过程每4-8h进行翻动；
所述的固态发酵培养基的配方：麸皮10-14g，稻草粉6-10g，葡萄糖0.4-0.6，NaNO30.4-0.8g，KH2PO40.05-0.2g，料水比为1:1-2。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：是将制得的基因工程菌以接种量为5%接入固态发酵培养基中，发酵温度为37℃，发酵时间为48h，在发酵过程每4h进行翻动；
所述的固态发酵培养基的最佳配方为：麸皮12g，稻草粉8g，葡萄糖0.5g，NaNO30.6g，KH2PO40.1g，料水比为1:1.5。
6.权利要求1所述的抗菌肽在制备抑菌剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，所述的抑菌剂抑制：蜡样芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、大肠杆菌；番茄细菌性溃疡病菌、青枯病菌、水稻白叶枯病菌和/或小麦苗枯病菌。
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