CN111154884A - 一种肺腺癌预后预测的标志物及其应用 - Google Patents
一种肺腺癌预后预测的标志物及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111154884A CN111154884A CN202010170801.8A CN202010170801A CN111154884A CN 111154884 A CN111154884 A CN 111154884A CN 202010170801 A CN202010170801 A CN 202010170801A CN 111154884 A CN111154884 A CN 111154884A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rhoh
- lung adenocarcinoma
- gene
- methylation
- prognosis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 title claims abstract description 67
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 title claims abstract description 66
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 239000003550 marker Substances 0.000 title abstract description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 53
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims abstract description 47
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 47
- 101150041093 RHOH gene Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 3
- 101000666634 Homo sapiens Rho-related GTP-binding protein RhoH Proteins 0.000 description 41
- 102100038338 Rho-related GTP-binding protein RhoH Human genes 0.000 description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 9
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 4
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 4
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000012164 methylation sequencing Methods 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 2
- 238000010977 unit operation Methods 0.000 description 2
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 102100021631 B-cell lymphoma 6 protein Human genes 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 102000013446 GTP Phosphohydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108091006109 GTPases Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 101000971234 Homo sapiens B-cell lymphoma 6 protein Proteins 0.000 description 1
- 230000004163 JAK-STAT signaling pathway Effects 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102100025169 Max-binding protein MNT Human genes 0.000 description 1
- 101100381525 Mus musculus Bcl6 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 102000042463 Rho family Human genes 0.000 description 1
- 108091078243 Rho family Proteins 0.000 description 1
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N Zirconium Chemical compound [Zr] QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 101150036080 at gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006607 hypermethylation Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 208000002815 pulmonary hypertension Diseases 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 108010033674 rho GTP-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007268 rho GTP-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 108091006107 transcriptional repressors Proteins 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 229910052726 zirconium Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种肺腺癌预后预测的标志物及其应用，公开了所述的标志物为RHOH基因以及RHOH基因在制备肺腺癌预后预测产品的应用，所述的预测产品通过测定样本中RHOH基因的表达水平和甲基化水平预测患者预后情况。本申请还公开了一种用于肺腺癌预后预测的试剂盒，所述试剂盒包括RHOH基因表达水平检测的试剂盒和RHOH基因甲基化检测试剂盒。RHOH基因在肺腺癌组织中的低甲基化和特异性高表达，为肺腺癌的预后预测提供了一种新途径；提供的用于肺腺癌预后预测的试剂盒，检测准确率高，为肺腺癌患者的预后预测提供了一种更加快速、准确的检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及癌症分子诊断技术领域，是肺腺癌中RHOH基因表达及甲基化联合预测患者预后作用及其应用。
背景技术
目前，肺癌的发病率以及肿瘤致死率已经居于全球恶性肿瘤的前列。肺癌从病理学上可以分为小细胞肺癌以及非小细胞肺癌，而在非小细胞肺癌中，腺癌所占比例逐年升高，并且超过鳞癌成为发病率最高的肺癌类型。随着精准医疗概念的提出及运用，以往非选择性的肿瘤治疗时代成为过去。基因检测技术的发展使得许多潜在的靶点基因被发现，从而指导治疗。EGFR,ALK,KRAS等基因的靶向治疗已经开发并应用于临床，使得相关患者获益。然而一些抑癌基因由于其启动子区域的甲基化，常规的基因测序使得这部分基因很少被评估。针对基因甲基化研究将为我们提供更多潜在的肺腺癌诊治的新靶点。
RHOH是Rho GTP酶家族中的造血特异性GTP酶缺陷成员，RHOH作为具有转录抑制因子LAZ3/BCL6的融合转录物，于1995年首次被报道。研究表明RHOH在肿瘤的免疫应答以及肿瘤细胞通路调节中发挥重要作用。RHOH可调节JAK-STAT途径，从而负调节IL3诱导信号。RHOH主要在血液系统相关疾病中被报道。RHOH的低表达是急性髓性白血病(AML)患者的总体和无病生存的独立不利预后因素。其在慢性淋巴瘤细胞-微环境之间的相互作用中也起到重要作用。此外其表达与肺动脉高压的疾病进展相关。由于RHOH被认为是造血系统特异性表达的Rho家族成员，它非常适合作为肿瘤鉴别诊断的液体活检标记。尽管该基因已被证实有助于肿瘤发生，但关于它与实体肿瘤的研究还十分少见。
本发明人通过分析TCGA数据库中肺腺癌的基因表达及DNA甲基化数据，分析了基因甲基化与表达的相关性，并且从显著相关的基因中筛选出一系列DNA甲基化与肺腺癌患者术后总生存期相关的基因。本发明人从候选基因中选择RHOH进行进一步分析。分析发现RHOH甲基化与其基因表达存在显著负相关。RHOH基因表达水平及DNA甲基化水平均与肺腺癌患者术后总生存期相关，并且RHOH甲基化以及表达水平联合分析可更好预测肺腺癌患者的预后。接下来，我们围绕RHOH表达相关的4个甲基化位点，利用本单位的肺腺癌患者的样本进行了该基因的甲基化预后验证。我们当前的研究可能为肺腺癌的诊治提供一个新的靶点。目前的研究尚未在肺腺癌中报道RHOH及其甲基化的临床相关性。
发明内容
为了解决以上现有技术存在的问题，本发明的目的在于联合基因表达及基因甲基化水平，表明本发明所述分子标记RHOH为肺腺癌患者的临床疗效观察提供了新的分子靶标。
本发明先对TCGA甲基化数据及基因表达数据进行标化，筛选其中与肺腺癌患者预后相关的基因，然后从中挑选出22个基因表达与甲基化水平相关的基因。接下来本发明人对这22个基因进行了GO分析(图1)。
本发明分析了TCGA数据库及本单位手术患者的样本RHOH甲基化测序结果。在肺腺癌中，RHOH甲基化差异亦与患者术后总生存期相关。
本发明在华东医院样本中，发明人设计了RHOH基因甲基化测序特异性引物(图2)，测序结果表明RHOH在肺腺癌组织与癌旁正常肺组织均呈现出高甲基化。然后根据其甲基化及表达联合分析，表明在TCGA以及华东医院的样本中，RHOH低甲基化高表达的肺腺癌患者预后更好(图3、4)。
对于本发明中的目标基因RHOH，申请人通过PRECOG网站(https://precog.stanford.edu/index.php)分析其在已经公布的肺腺癌测序数据中，RHOH表达量与患者预后的相关性(图5-7)，表明在多数研究中，RHOH表达量与肺腺癌患者的术后总体生存期存在显著相关。
本发明的主要技术方案如下：
RHOH基因在制备肺腺癌预后预测产品中的应用。
进一步的，所述的预测产品通过测定样本中RHOH基因的表达水平和甲基化水平预测患者预后情况。
进一步的，所述的样本为肺腺癌组织。
一种用于肺腺癌预后预测的试剂盒，所述试剂盒包括RHOH基因表达水平检测的试剂盒和RHOH基因甲基化检测试剂盒。
进一步的，所述RHOH基因表达水平检测的试剂盒包含如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的引物对，表达检测的内参为GAPDH。
Forward Primer(SEQ ID NO.1)：ATGCTGAGTTCCATCAAGTGC；
Reverse Primer(SEQ ID NO.2)：TCTGCCTGCTGGTAGGACA。
进一步的，所述RHOH基因甲基化检测试剂盒包含如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对。
Left primer(SEQ ID NO.3)：TGTTTAATAAAAGTAGGTGAAAATAAAAG；
Right primer(SEQ ID NO.4)：AAAAAATCATTTAAACTCTTCAATC。
有益效果：为了寻找与肺腺癌患者预后相关的甲基化基因，发明人首先从TCGA官网下载了最新的肺腺癌甲基化数据、基因表达数据、临床预后信息，并最终选择RHOH进一步分析。申请人表明RHOH甲基化与基因表达呈负相关，其甲基化与基因表达水平均与肺腺癌患者预后相关。接下来，本发明人将基因甲基化与其表达水平联合行预后相关性分析，表明联合分析预后预测效果优于单个预测指标。接下来发明人运用本单位手术患者肺腺癌及癌旁肺组织样本进行联合预后验证分析。综合可见，RHOH在肺腺癌的预后预测中具有不可忽视的重要意义。
综上所述，本发明有益效果主要体现在以下几个方面：
1、本申请首次证实了RHOH基因可作为肺腺癌预后预测标志物；
2、RHOH基因在肺腺癌组织中的低甲基化和特异性高表达，为肺腺癌的预后预测提供了一种新途径；
3、本申请提供了用于肺腺癌预后预测的试剂盒，检测准确率高，为肺腺癌患者的预后预测提供了一种更加快速、准确的检测方法。
附图说明
图1为TCGA数据库中筛选出的22个基因表达、甲基化水平与肺腺癌患者预后相关，并且表达与甲基化水平相关的基因的GO分析图。
图2为RHOH甲基化引物设计区域图。
图3为TCGA数据中RHOH与肺腺癌患者预后相关性分析结果图；A：RHOH表达与肺腺癌患者OS相关性，p＝0.00629；B：RHOH甲基化水平与肺腺癌患者OS相关性，p＝0.012；C：联合RHOH甲基化与基因表达预测肺腺癌患者OS，p＝0.004。
图4为组织样本验证RHOH基因甲基化和表达水平差异的不同预后结果图，p＝0.048。
图5-7为PRECOG网站中利用已发表公共测序数据中RHOH基因表达与预后相关性分析图。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：TCGA甲基化数据库研究
1.数据下载：
TCGA肺腺癌甲基化数据库下载于TCGA数据库官网，网址为https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/，搜索关键词为lung adenocarcinoma以及DNA methylation。数据下载日期为2019-03-27.所有数据均经过标准化处理。DNA甲基化队列的总样本量为616(53个正常，563个肺腺癌)。
2.数据处理：
(1)所有数据在进行进一步分析之前均经过标准化处理。
(2)在基因表达与位点甲基化相关性检测中，|Cor|>0.3且p＜0.05被认为具有显著相关。
(3)K-M分析被用于检测基因表达/基因甲基化程度与肺腺癌患者预后的相关性。
(4)公用芯片数据中RHOH基因表达与肺腺癌预后相关性分析的结果来自PREdiction of Clinical Outcomes from Genomic profiles网站(PRECOG，https://precog.stanford.edu)，所选用的芯片编号分别为：ca00153，ca00182，ca00191，GSE19188，GSE31547，GSE3141，GSE4716，GSE8894，GSE29013，GSE31210，GSE10245，GSE11969，GSE13213。
(5)TCGA数据下载软件为Perl，数据处理及分析所使用软件为R，版本号为3.3.1.使用的Rpackage有：limma，lush，survival等。
3.GO分析：
GO分析使用的为DAVID6.8(https://david.ncifcrf.gov/)，当前研究主要分析的为BP,CC,MF三个方面的GO数据。p值<0.05被认为有意义，数据分析软件使用的为R，所使用的R package为：GOplot。
4.数据分析结果：
在前期的研究中，我们分析了TCGA数据库中与肺腺癌患者预后相关的基因共2929个。在当前的研究中，我们从DNA甲基化数据库中筛选了与基因表达具有显著相关性的基因，并从中筛选出69个与肺腺癌患者预后相关的基因。我们发现，在表达水平与患者预后相关的基因中，22个基因的甲基化和表达显着相关。接下来，我们按照甲基化差异结果，对这些基因进行了GO分析，如图1。并且在相关通路上的基因都是在肺腺癌中相对低甲基化。
在当前的研究中，本发明人分析了TCGA数据库中RHOH基因表达水平与肺腺癌患者总体生存期的关系，可见RHOH表达与肺腺癌患者的预后存在显著联系(图3A，p＝0.00629)，并且RHOH高表达的患者总体生存期较RHOH低表达的患者长。此外，我们还收集了一些其他公用数据库中RHOH基因表达以及患者预后的数据进行分析，值得注意的是，在多数的数据集中，RHOH基因高表达的患者其生存可能性更大(图5-7)。接下来我们分析了RHOH甲基化与肺腺癌患者OS的联系，发现RHOH高甲基化的患者预后较RHOH低甲基化的患者差(图3B，p＝0.012)。接下来，我们将RHOH基因表达以及甲基化进行联合分析，发现RHOH基因高甲基化且低表达的患者预后显著差于RHOH低甲基化高表达的患者，且较单一指标运用更有意义(图3C，p＝0.004)。
实施例2：RHOH基因表达及甲基化水平检测
1.研究对象：
我们所使用的50例肺腺癌织组织样本来自发明申请人团队所在医院胸外科诊断为肺腺癌，并且进行手术切除的患者。所取用组织块在切除后立即置于组织冻存管内，并置于液氮中保存。病理学诊断以华东医院病理科石蜡切片诊断为准。
2.组织DNA提取：
首先我们选取适量的组织进行DNA提取，所使用的试剂盒为E.Z.N.A.TM TissueDNA Kit(Omega Bio-Tek)。
(1)预冷组织研磨仪至4℃。选取适量的组织，加入200μL缓冲液，研磨至组织破碎。
(2)加入25μL OB蛋白酶并涡旋混合均匀。在摇动的水浴中于55℃孵育，以实现完全裂解。
(3)加入5μLRNase A(25mg/mL)并在室温下孵育2-5分钟。
(4)以10,000x g离心5分钟以沉淀不溶的组织碎片。小心吸出上清液，然后转移到无菌微量离心管中，留下任何不溶的沉淀物。
(5)加入220μL Buffer BL并涡旋混合。在70℃下孵育10分钟。
(6)加入220μL的无水乙醇(室温)，并通过以最大速度涡旋15秒彻底混合。上下吹打混合。
(7)在2mL收集管中组装一个DNA吸附柱。将步骤6中的所有裂解物转移到包括可能形成的任何沉淀物的色谱柱中。以8,000x g离心1分钟以结合DNA。丢弃流通液体。
(8)将色谱柱放入第二个2mL收集管中，并通过移液500μLHB进行清洗。8,000x g离心1分钟。丢弃流通液和2mL收集管。
(9)将色谱柱放入第二个2mL收集管中，用移液器吸取700μL用乙醇稀释的DNAWash Buffer进行洗涤。8,000x g离心1分钟。丢弃流通液，并在下一步骤中重新使用2mL收集管。
(10)将柱子放回步骤10的2mL收集管中，用第二个700μL用乙醇稀释的DNA WashBuffer洗涤柱子，并如上所述离心。丢弃流通。
(11)将色谱柱放回相同的2mL收集管中，以最大速度(>12,000x g)离心空色谱柱2分钟以干燥色谱柱。该步骤对于确保后续步骤中的最佳洗脱至关重要。
(12)将色谱柱放入无菌的1.5mL微量离心管中，加入50-200μL预热(70℃)洗脱缓冲液。让试管在室温下静置3分钟。
(13)要从色谱柱上洗脱DNA，以10,000x g离心1分钟。用第二个100-200μL的洗脱缓冲液重复洗脱。
(14)取2μL用NanoDrop 2000检测DNA的浓度及纯度。
3.RHOH表达量检测
(1)预冷组织研磨仪至4℃，切取适量组织(肺腺癌/癌旁正常组织)于加有锆珠的组织研磨管中，加入500μL NucLeoZOL，于组织研磨仪中匀浆；
(2)将匀浆液加入新的1.5mL EP管中，加入200μL RNase-free水，充分混匀，室温静置15min；
(3)4℃低温离心，12000g，15min；
(4)取520μL上清加入新的1.5mL EP管中，加入500μL buffer MX，充分混匀；
(5)将700μL混合液加入NucleoSpin，8000g，30s离心，弃废液；
(6)将剩余混合液加入NucleoSpin，8000g，30s离心，弃废液；
(7)加入700μL buffer RX，8000g，30s离心，弃废液；
(8)加入350μL buffer RX，8000g，2min，离心，弃废液；
(9)将柱子放置在新的1.5mL EP管中，开盖晾干5min，加入50μL RNase-free水，孵育1min；
(10)11000g，2min，4℃低温离心，收集离心好的液体，取2μL用NanoDrop 2000检测RNA的浓度及纯度(A260/A280，A260/A230)(11)RNA反转录成cDNA：
①取每种细胞RNA各2～3μg，按以下体系逐次加样(体积15μL)：
RNA 2～3μg
OligT(18) 1μL
DEPC(μL) 配平至15μL
②置70℃恒温PCR仪中5min，之后立即取出置于冰上；
③加入下列混合物10μL/管，冰上操作：
④42℃恒温PCR仪中反应60min；
(12)按照1:20稀释溶液，加入SYBR Green，按照以下程序进行qPCR检测：
4.取500ng基因组DNA，通过EZ DNA Methylation-Gold KitTM(Zymo Research，CA，USA)进行亚硫酸氢盐转化。
(1)20μL DNA样品加入PCR管中，再加入130μL CT Conversion Reagent。
(2)样品管置于热扩增仪中并进行下一步骤：①.98℃反应10min②.64℃反应2.5h③.4℃冷去后进行后续反应。
(3)在纯化柱中加600μL M-Binding Buffer并将柱子放于所提供的收集管中。
(4)将样品(来自2)加入到含有M-Binding Buffer的纯化柱中。盖上盖子，上下颠倒数次柱子使样品混匀。
(5)全速离心(11,000x g)30s。弃清液。柱中加入100μL M-Wash Buffer，全速离心30s。
(6)柱中加入200μL M-DesμLphonation Buffer，室温(20～30℃)放置15～20min。之后全速离心30s。
(7)向柱中加入200μL M-Wash Buffer，全速离心30s。另加200μL M-Wash Buffer，全速离心30s。
(8)柱子放入1.5mL离心管中。直接向柱子中加入10μL M-Elution Buffer。全速离心30s洗脱DNA；得到的DNA进行后续反应。
5.PCR反应：
Product size:511,Tm:66.4,CpGs in product:13
②PCR反应体系的配制：
| PCR Mix配制 | 体积(μL) |
| Takara Ex Taq HS(RR006A) | 0.25 |
| 10*Ex Taq Buffer | 2.5 |
| dNTP Mixture(2.5mM each) | 2 |
| DNA甲基化转化溶液(Template) | 1.5 |
| Forward Primer(10μM) | 0.5 |
| Reverse Primer(10μM) | 0.5 |
| Nuclease-Free Water | Up to25 |
③PCR循环条件：
6.PCR产物电泳检测，筛选合格的PCR产物进行纯化。
7.采用VAHTS Turbo DNA Library Prep Kit for
(ND102-0102))进行建库。
(1)末端修复，磷酸化并加dA尾
(2)将产物与接头连接
(1)将下列组分直接添加至65μL修复产物中：
| 成分 | 体积(μL) |
| VAHTS Turbo T4 DNA Ligase | 2.0μL |
| VAHTS Turbo Ligation Enhancer | 30.5μL |
| VAHTS Adapter for Illumina* | 2.5μL |
| In Total | 100.0μL |
(2)轻轻吹打混匀，离心后将反应液收集至管底。
(3)将反应管置于PCR仪中，进行下列反应：热盖On,105℃，20℃,15min，4℃维持；
(3)将连接产物进行纯化处理：
(4)PCR扩增:
①在灭菌PCR管中配制如下反应：
②轻轻吹打混匀，离心后收集反应液。
③将反应管置于PCR仪中，进行下述反应：
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 预变性 | 98℃ | 30sec | 1 |
| 变性 | 98℃ | 10sec | |
| 退火 | 65℃ | 30sec | 8 |
| 延伸 | 72℃ | 30sec | |
| 完全延伸 | 72℃ | 5min | 1 |
| 维持 | 4℃ |
(5)使用DNA Beads纯化样品
①将DNA Beads置于室温下至少30min。
②向1.5-mL LoBind tube中加入2.0倍的均匀的MagicPure Size Selection DNABeads，并加入文库。在漩涡混匀器上混匀并室温放置5min.
③将试管放在磁力架上直至溶液澄清(大约3到5min)。弃上清
④向每个试管中加入250μL的70％乙醇。放置1min，使所有beads沉淀，弃掉乙醇。
⑤重复④。
⑥在37℃加热模块中干燥样品5min或直到残余的乙醇完全消失。
⑦加入15μL nuclease-free water，在漩涡混匀器上混匀，室温温育2min。静置2到3min，直到溶液澄清。
⑧将15μL左右的上清液转移至一个新的1.5-mL LoBind tube中。弃掉beads。
8.样本进行二代测序。
实施例3：临床验证
根据以上方法我们利用肺腺癌及癌旁组织样本进行RHOH预后预测能力的验证。在当前发明中，发明人选择RHOH进行针对性研究。我们共收集了50对肺腺癌及癌旁肺组织样本，提取他们的RNA进行RHOH表达水平检测，提取他们的DNA进行RHOH甲基化检测。RHOH表达量检测内参选择的是GAPDH。申请人发现在肺腺癌患者中，RHOH低甲基化且高表达的患者预后更好，p＝0.048。以上数据表明，RHOH可能作为一个新的肺腺癌诊治靶点。
以上显示和描述了本发明的基本原理、应用方法和本发明的优点。最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管本发明参照较佳实施例对本发明作了详细实施案例说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 华东医院
<120> 一种肺腺癌预后预测的标志物及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 1
atgctgagtt ccatcaagtg c 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 2
tctgcctgct ggtaggaca 19
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 3
tgtttaataa aagtaggtga aaataaaag 29
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 4
aaaaaatcat ttaaactctt caatc 25
Claims (6)
1.RHOH基因在制备肺腺癌预后预测产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的预测产品通过测定样本中RHOH基因的表达水平和甲基化水平预测患者预后情况。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的样本为肺腺癌组织。
4.一种用于肺腺癌预后预测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括RHOH基因表达水平检测的试剂盒和RHOH基因甲基化检测试剂盒。
5.根据权利要求4所述的一种用于肺腺癌预后预测的试剂盒，其特征在于，所述RHOH基因表达水平检测的试剂盒包含如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对。
6.根据权利要求4所述的一种用于肺腺癌预后预测的试剂盒，其特征在于，所述RHOH基因甲基化检测试剂盒包含如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010170801.8A CN111154884A (zh) | 2020-03-12 | 2020-03-12 | 一种肺腺癌预后预测的标志物及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010170801.8A CN111154884A (zh) | 2020-03-12 | 2020-03-12 | 一种肺腺癌预后预测的标志物及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111154884A true CN111154884A (zh) | 2020-05-15 |
Family
ID=70567331
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010170801.8A Pending CN111154884A (zh) | 2020-03-12 | 2020-03-12 | 一种肺腺癌预后预测的标志物及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111154884A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023056961A1 (zh) * | 2021-10-09 | 2023-04-13 | 梅傲科技(广州)有限公司 | 一种基于dna甲基化的肺腺癌预后评估方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101821405A (zh) * | 2007-06-01 | 2010-09-01 | 加利福尼亚大学董事会 | 肺癌的多基因预后试验 |
| US20130296328A1 (en) * | 2011-01-20 | 2013-11-07 | Université Libre de Bruxelles | Epigenetic portraits of human breast cancers |
| US20170074883A1 (en) * | 2015-09-14 | 2017-03-16 | Leukemia Therapeutics, LLC | Identification of novel diagnostics and therapeutics by modulating rhoh |
-
2020
- 2020-03-12 CN CN202010170801.8A patent/CN111154884A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101821405A (zh) * | 2007-06-01 | 2010-09-01 | 加利福尼亚大学董事会 | 肺癌的多基因预后试验 |
| US20130296328A1 (en) * | 2011-01-20 | 2013-11-07 | Université Libre de Bruxelles | Epigenetic portraits of human breast cancers |
| US20170074883A1 (en) * | 2015-09-14 | 2017-03-16 | Leukemia Therapeutics, LLC | Identification of novel diagnostics and therapeutics by modulating rhoh |
| CN108450004A (zh) * | 2015-09-14 | 2018-08-24 | 白血病治疗有限责任公司 | 通过调节RhoH来鉴定新的诊断和治疗 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 吴冠楠等: "Rho/Rho激酶在肺癌中的作用及其潜在治疗靶点", 《中华肺部疾病杂志(电子版)》 * |
| 吴福国等: "Rho GTP酶在肿瘤发生发展中的作用", 《生命的化学》 * |
| 张海英等: "毛细胞白血病相关生物学标记研究进展", 《重庆医学》 * |
| 钟晓明等: "大鼠肉瘤蛋白Ras同源物之RhoH", 《生命的化学》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023056961A1 (zh) * | 2021-10-09 | 2023-04-13 | 梅傲科技(广州)有限公司 | 一种基于dna甲基化的肺腺癌预后评估方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112094915B (zh) | 一种肉瘤融合基因和/或突变联合检测引物组及试剂盒 | |
| US10221458B2 (en) | Method for screening cancer | |
| CN111676292B (zh) | 一种用于检测肝癌的组合物，试剂盒及其用途 | |
| CN111187841A (zh) | 一种诊断肺腺癌的甲基化分子标志物及其应用 | |
| JP2019522478A (ja) | 遺伝子発現プロファイルを用いた肺癌の診断のための組成物及び方法 | |
| CN114672568B (zh) | 一种用于检测宫颈细胞基因甲基化的试剂盒 | |
| CN115516110A (zh) | 结直肠癌dna甲基化的检测方法及试剂 | |
| CN112899359A (zh) | 用于肺结节良恶性检测的甲基化标记物或其组合及应用 | |
| CN112646888A (zh) | 乳腺肿瘤特异性甲基化检测的试剂盒 | |
| CN115786459A (zh) | 一种应用于高通量测序检测实体瘤微小残留病的方法 | |
| CN111154884A (zh) | 一种肺腺癌预后预测的标志物及其应用 | |
| CN113862370B (zh) | 用于筛查肝癌的引物和探针、试剂盒及其应用 | |
| WO2019126343A1 (en) | Compositions and methods for diagnosing lung cancers using gene expression profiles | |
| EA010571B1 (ru) | Способ диагностики немелкоклеточного рака легких и набор для его осуществления | |
| Yuan et al. | OSMR and SEPT9: promising biomarkers for detection of colorectal cancer based on blood-based tests | |
| WO2022013880A1 (en) | Blood based biomarkers for early diagnosis and follow up of breast cancer | |
| CN116064798B (zh) | 一种子宫内膜癌基因甲基化检测试剂及其应用 | |
| CN116064788B (zh) | 乳腺癌早期筛查的多重基因甲基化检测荧光定量pcr试剂盒 | |
| CN116064797B (zh) | 一种子宫内膜癌基因甲基化水平检测试剂及其应用 | |
| CN114836538B (zh) | 生物标志物在hbv相关肝癌诊断及预后中的应用 | |
| CN113604576B (zh) | 肺腺癌检测试剂盒、存储介质及电子设备 | |
| CN117778582A (zh) | 用于检测胃癌的核酸组合、试剂盒及应用 | |
| Moradi et al. | Circulating RP11-445H22. 4 and TINCR are potential biomarkers for invasive ductal carcinoma of the breast | |
| CN117660642A (zh) | 外周血dna中辅助检测肺结节良恶性的甲基化生物标记物组合及其应用 | |
| CN115651982A (zh) | 肺癌甲基化基因标志物及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20200515 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |