CN111148755A - 重组经修饰成纤维细胞生长因子及其治疗用途 - Google Patents

重组经修饰成纤维细胞生长因子及其治疗用途 Download PDF

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詹尼弗·詹金斯-埃弗利思
阿姆塔卡纳安·萨布拉马尼亚姆
拉尔夫·布拉德肖
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Abstract

本文描述经修饰成纤维细胞生长因子(FGF)多肽、包含所述经修饰FGF多肽的药物组合物和药剂，以及使用所述经修饰FGF多肽来治疗或预防受益于FGF的施用的病状的方法。

Description

重组经修饰成纤维细胞生长因子及其治疗用途
交叉引用
本申请要求2017年5月5日提交的美国临时专利申请号62/502,529、2017年5月5日提交的美国临时专利申请号62/502,540以及2017年11月10日提交的美国临时专利申请号62/584,624的权益，所述美国临时专利申请各自以引用的方式整体并入本文。
发明领域
本文描述经修饰成纤维细胞生长因子(FGF)多肽、包含所述经修饰FGF多肽的药物组合物和药剂，以及使用所述经修饰FGF多肽来治疗或预防受益于FGF的施用的病状的方法。
发明背景
FGF是在发育组织和成熟组织中广泛表达的大型多肽(Baird等人,Cancer Cells,3:239-243,1991)，并且在多种生理功能中起作用(McKeehan等人,Prog.Nucleic AcidRes.Mol.Biol.59:135-176,1998；Burgess,W.H.等人,Annu Rev.Biochem.58:575-606(1989))。FGF家族包括至少二十二个成员(Reuss等人,Cell Tissue Res.313:139-157(2003))。
发明内容
在一个实施方案中，本文提供一种包含具有一个或多个突变的如SEQ ID NO:1所示的序列的重组经修饰FGF-1多肽，其中所述多肽包含位于SEQ ID NO:1的第一残基的上游的N末端甲硫氨酸残基。在一些实施方案中，多肽进一步包含位于N末端甲硫氨酸残基与SEQID NO:1的第一残基之间的延伸肽。在一些实施方案中，延伸肽包含SEQ ID NO:3的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方案中，延伸肽包含如SEQ ID NO:4-8所示的序列中的任一者。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽是多肽的成熟形式。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:14-18的序列。
一个实施方案提供一种包含具有一个或多个突变的如SEQ ID NO:1所示的序列的重组经修饰FGF-1多肽，其中所述多肽进一步包含位于SEQ ID NO:1的第一残基的上游的延伸肽。在一些实施方案中，延伸肽包含SEQ ID NO:3的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，延伸肽包含如SEQ ID NO:4-8所示的序列中的任一者。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽是多肽的成熟形式。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:24-28的序列。
一个实施方案提供一种包含具有一个或多个突变的如SEQ ID NO:1所示的序列的重组经修饰FGF-1多肽，其中所述多肽进一步包含对SEQ ID NO:1的前五个残基中的一者或多者的截短，并且其中所述多肽包含在所述多肽的N末端的延伸肽。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:93-117的序列。在一些实施方案中，多肽进一步包含在延伸肽的N末端的甲硫氨酸残基。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽是多肽的成熟形式。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:118-141的序列。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽以包含136个氨基酸的形式表达。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽在其成熟形式中包含至少141个氨基酸。
一个实施方案提供一种包含在SEQ ID NO:1的位置67处的突变的重组经修饰FGF-1多肽。在一些实施方案中，多肽进一步包含对SEQ ID NO:1的前五个残基中的一者或多者的截短。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:146-149的序列。在一些实施方案中，多肽进一步包含延伸肽。在一些实施方案中，延伸肽包含SEQ ID NO:3的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方案中，延伸肽片段包含如SEQ ID NO:4-8所示的序列中的任一者。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽是多肽的成熟形式。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:174-204的序列。
一个实施方案提供一种包含如SEQ ID NO.2所示的序列的重组经修饰FGF-1多肽。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽是多肽的成熟形式。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含一个或多个选自以下的突变：Cys16Ser、Ala66Cys和Cys117Val。
一个实施方案提供一种重组经修饰FGF-1多肽，其中所述经修饰FGF-1包含SEQ IDNO:1的一个或多个突变，所述突变选自：Lys12Val、Cys16Ser、Ala66Cys、Cys117Val和Pro134Val，并且其中所述经修饰FGF-1多肽进一步包含肽ALTEK的至少一个残基。
一个实施方案提供一种重组经修饰FGF-1多肽，其包含SEQ ID NO:1的以下突变：Cys16Ser、Ala66Cys和Cys117Val，其中所述经修饰FGF-1多肽包含位于SEQ ID NO:1的第一残基的上游的甲硫氨酸残基以及位于N末端甲硫氨酸与SEQ ID NO:1的位置1之间的肽ALTEK的至少一个残基。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽不在具有延伸肽的情况下表达，并且通过不涉及移除延伸肽的步骤的方法来产生。
在一个实施方案中，提供一种包含上述实施方案中的任一者的重组多肽的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。在一些实施方案中，药物组合物是液体眼用制剂。在一些实施方案中，药物制剂外部施用，经由微针向角膜中施用，或在前房内施用。
在一个实施方案中，本文提供一种用于产生重组经修饰FGF-1多肽的方法，所述方法包括：在宿主细胞中表达所述经修饰FGF-1多肽，以及使所表达的多肽在所述宿主细胞的细胞质中成熟，其中所述经修饰FGF-1多肽包含SEQ ID NO:1的一个或多个突变，并且在具有位于SEQ ID NO:1的第一残基的上游的N末端甲硫氨酸残基的情况下表达。
在一个实施方案中，本文提供一种用于产生重组经修饰FGF-1多肽的方法，所述方法包括：在宿主细胞中表达所述经修饰FGF-1多肽，以及使所表达的多肽在所述宿主细胞的细胞质中成熟，其中所述经修饰FGF-1多肽包含SEQ ID NO:1的一个或多个突变、在N末端残基与SEQ ID NO:1的位置1之间的延伸肽，并且在具有N末端甲硫氨酸残基的情况下表达。
在一个实施方案中，本文提供一种用于产生重组经修饰FGF-1多肽的方法，所述方法包括：在宿主细胞中表达所述经修饰FGF-1多肽，以及使所表达的多肽在所述宿主细胞的细胞质中成熟，其中所述经修饰FGF-1多肽包含SEQ ID NO:1的一个或多个突变、延伸肽片段、对SEQ ID NO:1的前五个残基中的一者或多者的截短，并且其中所述多肽在具有位于SEQ ID NO:1的第一残基的上游的N末端甲硫氨酸残基的情况下表达。在一些实施方案中，N末端甲硫氨酸残基在多肽的成熟期间得以保留。在一些实施方案中，N末端甲硫氨酸残基在多肽的成熟期间由切割酶从多肽切下。在一些实施方案中，切割酶是甲硫氨酸氨基肽酶(metAP)。在一些实施方案中，metAP是细菌metAP、酵母metAP或人metAP。在一些实施方案中，切割酶是细菌metAP。在一些实施方案中，方法包括表达包含如SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:16所示的序列的经修饰FGF-1多肽。在一些实施方案中，方法包括表达包含如SEQ IDNO:2所示的序列的经修饰FGF-1多肽。在一些实施方案中，SEQ ID NO:2是在宿主细胞的细胞质中成熟之后的多肽的序列。
一个实施方案提供一种用于产生重组经修饰FGF-1多肽的方法，所述方法包括：在宿主细胞中表达所述经修饰FGF-1多肽，以及使所表达的多肽在所述宿主细胞的细胞质中成熟，其中所述经修饰FGF-1多肽包含在SEQ ID NO:1的位置67处的突变。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽进一步包含延伸肽片段以及对SEQ ID NO:1的前五个残基中的一者或多者的截短，并且其中所述多肽在具有位于SEQ ID NO:1的第一残基的上游的N末端甲硫氨酸残基的情况下表达。在一些实施方案中，方法包括使用溴化氰切割N末端甲硫氨酸残基。
一个实施方案提供一种用于产生根据上述实施方案中的任一者的重组经修饰FGF-1多肽的方法，所述方法包括：在宿主细胞中表达所述经修饰FGF-1多肽，通过亲和标签使所表达的多肽与亲和材料结合；切割所述亲和标签以释放所述多肽，以及使用试剂将所述多肽从所述亲和材料洗脱。在一些实施方案中，亲和标签包括多组氨酸、多赖氨酸、多天冬氨酸或多谷氨酸。在一些实施方案中，试剂包括甲醇、2-丙醇或另外的醇、二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮或另外的有机溶剂。在一些实施方案中，亲和材料是树脂框架。在一些实施方案中，亲和材料是离子交换树脂。在一些实施方案中，多肽在宿主细胞的细胞质中表达，并且不分泌至周质间隙中。在一些实施方案中，宿主细胞是微生物宿主细胞。在一些实施方案中，微生物表达系统选自：大肠杆菌(E.coli)表达系统、新月柄杆菌(Caulobacter crescent)表达系统和奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)表达系统。在一些实施方案中，微生物表达系统是大肠杆菌表达系统。
一个实施方案提供一种治疗或预防哺乳动物的眼部疾病、病症或病状的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用根据本公开内容的经修饰FGF-1或根据本公开内容的药物组合物。在一些实施方案中，眼部疾病、病症或病状是角膜或眼表面的疾病、病症或病状。在一些实施方案中，眼部疾病、病症或病状是角膜内皮的疾病、病症或病状。在一些实施方案中，角膜内皮的疾病、病症或病状是富克氏营养不良(Fuch’s dystrophy)、大疱性角膜病变、1型先天性遗传性内皮营养不良、2型先天性遗传性内皮营养不良、后部多形性角膜营养不良或干眼综合征。在一些实施方案中，眼部疾病、病症或病状是富克氏营养不良。在一些实施方案中，眼部疾病、病症或病状是角膜上皮的疾病、病症或病状。在一些实施方案中，角膜上皮的疾病、病症或病状是干眼综合征或由角膜手术或移植所致的角膜上皮损害。在一些实施方案中，角膜手术是屈光性角膜切削术(PRK)或激光辅助原位角膜磨镶术(LASIK)。在一些实施方案中，眼部疾病、病症或病状是角膜基质的疾病、病症或病状。在一些实施方案中，角膜基质的疾病、病症或病状是圆锥形角膜、格子状角膜营养不良、颗粒状角膜营养不良、斑块状角膜营养不良、施奈德结晶状角膜营养不良(Schnyder crystalline cornealdystrophy)、先天性基质角膜营养不良或斑点状角膜营养不良。
一个实施方案提供一种将角膜细胞移植至哺乳动物或促进细胞移植成功的方法，所述方法包括在将所述角膜细胞移植至所述哺乳动物之前、期间或之后用根据上述实施方案中的任一者的经修饰FGF-1处理待移植的所述角膜细胞。一个实施方案提供一种预防在组织再生期间结疤的方法，所述方法包括施用根据上述实施方案中的任一者的经修饰FGF-1。在一些实施方案中，在经受小梁切除术之后向哺乳动物施用经修饰FGF-1。
一个实施方案提供一种治疗或预防患者的化学物质或糜烂剂诱发的损伤的方法，所述方法包括向所述患者施用根据上述实施方案中的任一者的经修饰FGF-1多肽。在一些实施方案中，化学物质或糜烂剂诱发的损伤是眼部损伤或皮肤损伤。在一些实施方案中，眼部损伤是角膜损伤。
一个实施方案提供一种治疗患者的角膜损伤的方法，所述方法包括施用根据本公开内容的经修饰FGF-1多肽或根据本公开内容的药物组合物，其中所述角膜损伤由化学物质或糜烂剂诱发，并且其中施用所述经修饰FGF-1会促进角膜的再生，预防角膜的变性，并且预防化学损伤的长期后遗症。在一些实施方案中，历经约7天至约40年的时期施用经修饰FGF-1以预防角膜组织的变性。在一些实施方案中，角膜组织包括角膜上皮、基质、角膜内皮或角膜神经支配。在一些实施方案中，角膜损伤是基质损伤。在一些实施方案中，基质损伤包括基质结疤和角膜混浊。
一个实施方案提供一种预防患者的长期角膜损伤的方法，所述方法包括施用根据本公开内容的经修饰FGF-1多肽或根据本公开内容的药物组合物，其中所述角膜损伤由化学物质或糜烂剂引起。在一些实施方案中，角膜损伤是角膜内皮损伤。在一些实施方案中，施用经修饰FGF-1多肽会使角膜内皮细胞的功能增强，并且预防或减轻角膜的长期变性。在一些实施方案中，施用经修饰FGF-1多肽会预防角膜水肿和继发性前部角膜病变。在一些实施方案中，施用经修饰FGF-1多肽会预防角膜内皮细胞的丧失。在一些实施方案中，角膜损伤是基质损伤。在一些实施方案中，基质损伤包括基质结疤和角膜混浊。在一些实施方案中，角膜损伤是芥子气角膜病变(MGK)。在一些实施方案中，施用经修饰FGF-1多肽会导致与MGK相关的组织病理学病状的改善。在一些实施方案中，组织病理学病状包括角膜上皮层的增生以及上皮-基质细胞分离。在一些实施方案中，施用经修饰FGF-1多肽会导致水肿减轻以及角膜糜烂消除。在一些实施方案中，角膜糜烂的特征在于角膜的脱上皮化(de-epithelialization)。在一些实施方案中，施用经修饰FGF-1多肽会减轻角膜脱上皮化的严重性。在一些实施方案中，施用经修饰FGF-1多肽会导致角膜的较快再上皮化(re-epithelialization)。
一个实施方案提供一种使暴露于化学物质或糜烂剂的患者的眼表面上皮再生的方法，所述方法包括经眼施用根据上述实施方案中的任一者的经修饰FGF-1多肽。在一些实施方案中，眼表面上皮是角膜上皮。
一个实施方案提供一种预防暴露于化学物质或糜烂剂的患者的眼部上皮损伤的方法，所述方法包括经眼施用根据上述实施方案中的任一者的经修饰FGF-1多肽。在一些实施方案中，眼部损伤是由暴露于糜烂剂引起的角膜损伤。在一些实施方案中，角膜损伤是角膜上皮脱离。在一些实施方案中，施用经修饰FGF-1多肽会导致减轻在暴露于糜烂剂之后角膜上皮脱离的严重性。在一些实施方案中，施用经修饰FGF-1多肽会导致水肿减轻以及角膜糜烂消除。在一些实施方案中，角膜糜烂的特征在于角膜的脱上皮化。在一些实施方案中，施用经修饰FGF-1多肽会减轻角膜脱上皮化的严重性。在一些实施方案中，施用经修饰FGF-1多肽会导致角膜的较快再上皮化。在一些实施方案中，历经多达两周的时期施用经修饰FGF-1多肽，或施用经修饰FGF-1多肽直至角膜上皮的完全再生。在一些实施方案中，在暴露于糜烂剂之后48小时内施用第一剂经修饰FGF-1多肽。在一些实施方案中，化学物质包括氯气、光气、碱或酸。在一些实施方案中，糜烂剂包括硫芥(SM)、氮芥(NM)、路易氏剂(lewisite)或半芥(2-氯乙基乙基硫醚(CEES))。在一些实施方案中，糜烂剂是NM。在一些实施方案中，施用经修饰FGF-1多肽会抑制NM诱导的ADAM17上调。在一些实施方案中，化学物质或糜烂剂诱发的损伤是化学灼伤。在一些实施方案中，化学灼伤由氯气、光气、碱或酸引起。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含SEQ ID NO:1的位置16、66和117的突变。在一些实施方案中，突变是Cys16Ser、Ala66Cys和Cys117Val。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽在暴露于糜烂剂后较不易受到氧化。在一些实施方案中，糜烂剂是NM。
一个实施方案提供一种治疗疱疹性角膜病变的方法，所述方法包括向哺乳动物施用根据本公开内容的任何实施方案的经修饰FGF-1多肽或根据本公开内容的药物组合物。在一些实施方案中，疱疹性角膜病变由单纯疱疹病毒的原发感染引起。在一些实施方案中，疱疹性角膜病变是慢性疱疹性角膜病变。在一些实施方案中，疱疹性角膜病变继发于单纯疱疹病毒感染。在一些实施方案中，继发于单纯疱疹病毒感染的疱疹性角膜病变包括神经营养性角膜病变。在一些实施方案中，每日两次施用根据本公开内容的经修饰FGF-1多肽或根据本公开内容的药物组合物。在一些实施方案中，持续30天的持续时间施用根据本公开内容的经修饰FGF-1多肽或根据本公开内容的药物组合物。在一些实施方案中，施用根据本公开内容的经修饰FGF-1多肽或根据本公开内容的药物组合物会导致角膜溃疡的愈合；疼痛和炎症的持续时间的缩短；疼痛和炎症的减轻；角膜混浊、模糊、结疤的减轻；或其任何组合。在一些实施方案中，角膜溃疡包括疱疹性角膜溃疡。在一些实施方案中，哺乳动物是人。
一个实施方案提供一种治疗或预防患者的化学物质或糜烂剂诱发的损伤的方法，所述方法包括向所述患者施用包含一个或多个在SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134处的突变的经修饰FGF-1。在一些实施方案中，化学物质或糜烂剂诱发的损伤是眼部损伤或皮肤损伤。在一些实施方案中，眼部损伤是角膜损伤。
一个实施方案提供一种治疗患者的角膜损伤的方法，所述方法包括向所述患者施用包含一个或多个在SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134处的突变的经修饰FGF-1多肽，其中所述角膜损伤由化学物质或糜烂剂诱发，并且其中施用所述经修饰FGF-1会促进角膜的再生，预防角膜的变性，并且预防化学损伤的长期后遗症。在一些实施方案中，历经约7天至约40年的时期施用经修饰FGF-1以预防角膜组织的变性。在一些实施方案中，角膜组织包括角膜上皮、基质、角膜内皮或角膜神经支配。在一些实施方案中，角膜损伤是基质损伤。在一些实施方案中，基质损伤包括基质结疤和角膜混浊。
一个实施方案提供一种预防患者的长期角膜损伤的方法，所述方法包括向所述患者施用包含一个或多个在SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134处的突变的经修饰FGF-1多肽，其中所述角膜损伤由化学物质或糜烂剂引起。在一些实施方案中，角膜损伤是角膜内皮损伤。在一些实施方案中，施用经修饰FGF-1多肽会使角膜内皮细胞的功能增强，并且预防或减轻角膜的长期变性。在一些实施方案中，施用经修饰FGF-1多肽会预防角膜水肿和继发性前部角膜病变。在一些实施方案中，施用经修饰FGF-1多肽会预防角膜内皮细胞的丧失。在一些实施方案中，角膜损伤是基质损伤。在一些实施方案中，基质损伤包括基质结疤和角膜混浊。在一些实施方案中，角膜损伤是芥子气角膜病变(MGK)。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽的施用会导致与MGK相关的组织病理学病状的改善。在一些实施方案中，组织病理学病状包括角膜上皮层的增生以及上皮-基质细胞分离。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽的施用会导致水肿减轻以及角膜糜烂消除。在一些实施方案中，角膜糜烂的特征在于角膜的脱上皮化。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽的施用会减轻角膜脱上皮化的严重性。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽的施用会导致角膜的较快再上皮化。
一个实施方案提供一种使暴露于化学物质或糜烂剂的患者的眼表面上皮再生的方法，所述方法包括经眼施用包含一个或多个在SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134处的突变的经修饰FGF-1多肽。在一些实施方案中，眼表面上皮是角膜上皮。
一个实施方案提供一种预防暴露于化学物质或糜烂剂的患者的眼部上皮损伤的方法，所述方法包括经眼施用包含一个或多个在SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134处的突变的经修饰FGF-1多肽。在一些实施方案中，眼部损伤是由暴露于糜烂剂引起的角膜损伤。在一些实施方案中，角膜损伤是角膜上皮脱离。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽的施用会导致减轻在暴露于糜烂剂之后角膜上皮脱离的严重性。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽的施用会导致水肿减轻以及角膜糜烂消除。在一些实施方案中，角膜糜烂的特征在于角膜的脱上皮化。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽的施用会减轻角膜脱上皮化的严重性。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽的施用会导致角膜的较快再上皮化。在一些实施方案中，历经多达两周的时期施用经修饰FGF-1多肽，或施用经修饰FGF-1多肽直至角膜上皮的完全再生。在一些实施方案中，在暴露于糜烂剂之后48小时内施用第一剂经修饰FGF-1多肽。在一些实施方案中，化学物质包括氯气、光气、碱或酸。在一些实施方案中，糜烂剂包括硫芥(SM)、氮芥(NM)、路易氏剂或半芥(2-氯乙基乙基硫醚(CEES))。在一些实施方案中，其中糜烂剂是NM。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽的施用会抑制NM诱导的ADAM17上调。在一些实施方案中，化学物质或糜烂剂诱发的损伤是化学灼伤。在一些实施方案中，化学灼伤由氯气、光气、碱或酸引起。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含SEQ ID NO:1的位置16、66和117的突变。在一些实施方案中，突变是Cys16Ser、Ala66Cys和Cys117Val。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽在暴露于糜烂剂后较不易受到氧化。在一些实施方案中，糜烂剂是NM。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含如SEQ ID NO:2以及9-206中的任一者所示的序列。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含如SEQ ID NO:2以及9-204中的任一者所示的序列。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含如SEQ ID NO:205和206中的任一者所示的序列。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含如SEQ ID NO:2所示的序列。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含如SEQ ID NO:205所示的序列。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含如SEQ ID NO:206所示的序列。
一个实施方案提供一种治疗疱疹性角膜病变的方法，所述方法包括向哺乳动物施用包含如SEQ ID NO:205和206中的任一者所示的序列的经修饰FGF-1多肽或包含所述经修饰FGF-1多肽的药物组合物。在一些实施方案中，疱疹性角膜病变由单纯疱疹病毒的原发感染引起。在一些实施方案中，疱疹性角膜病变是慢性疱疹性角膜病变。在一些实施方案中，疱疹性角膜病变继发于单纯疱疹病毒感染。在一些实施方案中，继发于单纯疱疹病毒感染的疱疹性角膜病变包括神经营养性角膜病变。在一些实施方案中，每日两次施用包含如SEQID No:205和206中的任一者所示的序列的经修饰FGF-1多肽或包含所述经修饰FGF-1多肽的药物组合物。在一些实施方案中，持续30天的持续时间施用包含如SEQ ID No:205和206中的任一者所示的序列的经修饰FGF-1多肽或包含所述经修饰FGF-1多肽的药物组合物。在一些实施方案中，包含如SEQ ID No:205和206中的任一者所示的序列的经修饰FGF-1多肽或包含所述经修饰FGF-1多肽的药物组合物的施用会导致角膜溃疡的愈合；疼痛和炎症的持续时间的缩短；疼痛和炎症的减轻；角膜混浊、模糊、结疤的减轻；或其任何组合。在一些实施方案中，角膜溃疡包括疱疹性角膜溃疡。
一个实施方案提供一种治疗疱疹性角膜病变的方法，所述方法包括向哺乳动物施用包含如SEQ ID NO:2以及9-204中的任一者所示的序列的经修饰FGF-1多肽或包含所述经修饰FGF-1多肽的药物组合物。在一些实施方案中，疱疹性角膜病变由单纯疱疹病毒的原发感染引起。在一些实施方案中，疱疹性角膜病变是慢性疱疹性角膜病变。在一些实施方案中，疱疹性角膜病变继发于单纯疱疹病毒感染。在一些实施方案中，继发于单纯疱疹病毒感染的疱疹性角膜病变包括神经营养性角膜病变。在一些实施方案中，每日两次施用包含如SEQ ID No:2以及9-204中的任一者所示的序列的经修饰FGF-1多肽或包含所述经修饰FGF-1多肽的药物组合物。在一些实施方案中，持续30天的持续时间施用包含如SEQ ID No:2以及9-204中的任一者所示的序列的经修饰FGF-1多肽或包含所述经修饰FGF-1多肽的药物组合物。在一些实施方案中，包含如SEQ ID No:2以及9-204中的任一者所示的序列的经修饰FGF-1多肽或包含所述经修饰FGF-1多肽的药物组合物的施用会导致角膜溃疡的愈合；疼痛和炎症的持续时间的缩短；疼痛和炎症的减轻；角膜混浊、模糊、结疤的减轻；或其任何组合。在一些实施方案中，角膜溃疡包括疱疹性角膜溃疡。在一些实施方案中，哺乳动物是人。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物和专利申请都以引用的方式整体并入本文，所述引用的程度如同特定地和个别地指出将各个出版物或专利申请以引用的方式并入。
附图说明
图1说明芥子气与半胱氨酸的反应。
图2说明根据本公开内容的示例性经修饰FGF-1多肽(TTHX1114和TTHX1001)对人角膜内皮细胞的体外增殖的影响。点线对应于TTHX1114，而短划线对应于TTHX1001。
图3说明示例性兔角膜器官培养模型系统。
图4显示对角膜的糜烂性损伤的时间过程。
图5说明用示例性经修饰FGF-1多肽(TTHX114)进行的处理对糜烂剂诱发的损伤的影响，所述影响通过组织病理学染色来评估。
图6显示用于评估糜烂剂诱发的角膜损伤的影响的示例性组织病理学分级流程。
图7显示对糜烂剂暴露后的角膜和基质损伤的组织病理学分级。连续线对应于“上皮”，而短划线对应于“基质”。
图8显示在用示例性经修饰FGF-1多肽(TTHX1114)处理的角膜细胞中，对糜烂性损伤的组织病理学分级得以降低。短划线对应于“NM”，而点线对应于“NM+TTHX”。
图9显示在暴露于糜烂剂之后的角膜FGF-1水平。
图10说明在暴露于糜烂剂之后，在用示例性经修饰FGF-1多肽(TTHX1114)处理的角膜细胞中，ADAM17活化得以抑制。图10A显示未暴露于NM的角膜切片，而图10B显示用(下部图版)或不用(上部图版)示例性多肽(TTHX1114)处理的经暴露角膜的比较。
图11说明暴露于糜烂剂并且用示例性经修饰FGF-1多肽(TTHX1114)处理的角膜上皮细胞的增殖，所述增殖通过EdU并入来度量。短划线对应于“NM”，而实线对应于“NM+TTHX”。
图12显示示例性糜烂剂的结构。
具体实施方式
眼疾病和损伤可具有重度致衰弱性，并且以许多种形式发生。一类眼部疾病是芥子气角膜病变。芥子气是一种糜烂性毒性气体，最初由德国军队在第一次世界大战期间在1915年4月于伊普尔(Ypres)战场上释放。暴露于芥子气可导致历经数年而显现的长期并发症。角膜变得结疤和不规则，并且胆固醇和钙沉积在其组织中，从而导致进行性视力损害。裂隙灯检查揭示巩膜上组织显示特征性下翳。常见白瓷外观和不寻常的血管异常。这些显现为血管增大、扭曲，有时具有安瓿形轮廓，伴有静脉曲张和香肠样血管。随着时间的推移，发生角膜的致密浑浊化，这在中心和下部区段中最为明显，因为上部受到悬垂的眼睑保护。MGK的主要组织病理学特征包括例如上皮厚度不规则、退变性变化、上皮基底膜增厚、角膜细胞丧失以及鲍曼层(Bowman layer)破坏。(Kanavi等人,Chronic and delayed mustardgas keratopathy:a histopathologic and immunohistochemical study,Eur.JOphthalmol.2010年9月-10月；20(5):839-43)。通常，在角膜糜烂剂暴露的一天内，角膜上皮(CE)从基底膜(BM)脱落，角膜水肿在裸露的基质中显现，并且全层角质化在伤口边缘内是明显的。截至五天，上皮盖得以再生，并且角膜水肿开始减退。在暴露之后一周，CE得以部分层化，具有初步半桥粒连接。尽管具有这个明显改进，但一旦到达暴露之后三周，角膜即显现慢性损伤的临床特征，包括角膜水肿持续提升、角膜糜烂复发和新血管形成。截至八周，基底膜区经受重度变性。此外，受MGK影响的角膜似乎展现伤口愈合过程延迟。
本文提供经修饰FGF-1多肽、包含所述经修饰肽的药物组合物和药剂，以及使用所述经修饰FGF-1多肽来治疗各种病状的方法，所述病状诸如眼部疾病、病症和病状(例如富克氏营养不良)、糜烂剂诱发的角膜上皮和内皮损伤(例如芥子气角膜病变(MGK))、伤口愈合、心血管疾病(例如局部缺血)和神经病状(例如肌萎缩性侧索硬化(ALS))。
本文还提供一种通过施用经修饰成纤维细胞生长因子(FGF-1)多肽或包含所述经修饰肽的药物组合物或药剂来治疗化学物质或糜烂剂诱发的损伤的方法。在一些实施方案中，方法包括通过施用本文所述的经修饰FGF-1多肽来治疗由化学损伤例如化学灼伤诱发的芥子气角膜病变(MGK)。在一些实施方案中，方法包括通过施用本文所述的经修饰FGF-1多肽来治疗由糜烂剂例如氮芥(NM)诱发的芥子气角膜病变(MGK)。在一些实施方案中，方法包括治疗由化学战剂例如光气引起的化学损伤或热损伤。
在本文所述的其中经修饰FGF-1多肽在具有N末端甲硫氨酸(N-Met)残基的情况下表达的一些实施方案中，多肽随后在不进行需要蛋白水解切割以移除N末端肽的步骤的情况下加以纯化。因此，在一些实施方案中，本公开内容提供一种通过快速纯化方法制备的经修饰FGF-1多肽，所述快速纯化方法不涉及用于移除N末端肽的蛋白水解切割步骤。这对于根据优质生产规范(GMP)指导方针来生产经修饰FGF-1多肽是特别有利的。优势包括缺乏切割步骤，从而包括消除对后续纯化经切割产物以及移除用于切割的试剂的需要。此举的另一优势是由于处理得以减少并且对测试残余切割试剂和污染物的需要得以缩减，因此产率增加，所述切割试剂和污染物被引入用于切割以及后续分离经切割物质与未切割物质。
本文所述的经修饰FGF-1多肽可具有增加的稳定性(例如热稳定性)、降低数目的包埋游离硫醇和/或增加的有效硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)亲和力。
若干其他优势与经修饰FGF-1多肽在本文所述的方法中的使用相关。举例来说，本文所述的经修饰FGF-1多肽可在其药物组合物或制剂(例如眼用制剂)中在无肝素的情况下施用，从而避免与其生物来源相关的潜在安全性问题。此外，对肝素的避免允许使用较高剂量的经修饰FGF-1多肽而没有由局部肝素诱发的不利事件或预先存在的抗肝素抗体所致的并发症。此外，在不存在肝素的情况下，经修饰FGF与组织的即刻结合得以最大化，并且全身性分布得以显著降低。本文所述的经修饰FGF-1多肽的优势还在于具有增强的局部隔离和降低的再分布动力学，由此使在递送部位处的消除半衰期和平均滞留时间(MRT)增加，以及允许给药频率降低。这可能是因为本文所述的经修饰FGF-1多肽具有增加的稳定性(例如热稳定性)、降低数目的包埋游离硫醇和/或增加的有效硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)亲和力。
在各种实施方案中，本公开内容的FGF-1多肽包含在多肽的N末端的修饰，诸如添加、截短或添加和截短的组合。在一些实施方案中，修饰是添加单一N末端甲硫氨酸残基。在一些实施方案中，修饰是添加延伸肽。在一些实施方案中，修饰是对FGF-1多肽的前五个残基中的一者或多者的截短。在一些实施方案中，FGF-1多肽包含除N末端修饰之外还具有一个或多个突变的如SEQ ID NO:1所示的序列。
本文公开的经修饰FGF-1多肽的若干实例在多肽的成熟形式中包含N末端甲硫氨酸(N-Met)残基。当将氨基酸添加至蛋白质的N末端中时，生物活性的保留是不可预测的。一些蛋白质耐受此举，而一些并非如此，并且生物活性的保留和稳定性变化的可能性仅凭经验确定。本公开内容认识到，在保留生物活性和稳定性的情况下，N末端Met残基的添加得以耐受。
某些术语
应了解先前一般性描述和以下详细描述仅具有示例性和说明性，并且不限制任何要求保护的主题。在本申请中，除非另外明确陈述，否则单数的使用包括复数。必须注意的是，除非上下文另外明确规定，否则如说明书和随附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数个指示物。在本申请中，除非另外陈述，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其他形式诸如“include”、“includes”和“included”的使用是非限制性的。
本文所用的章节标题仅出于组织目的，并且不应解释为限制所述主题。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与由要求保护的主题所属领域中的技术人员通常理解相同的含义。如果存在对本文术语的多种定义，那么以这个章节中的那些定义为准。本文提及的所有专利、专利申请、出版物以及公开的核苷酸和氨基酸序列(例如可在GenBank或其他数据库中获得的序列)都以引用的方式并入本文。当提及URL或其他所述标识符或地址时，应了解所述标识符可变化，并且因特网上的特定信息可变化不定，但等效信息可通过检索因特网来得到。对其的提及证实所述信息是可用且公共传播的。
如本文所用，相对于某一序列的术语“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在将序列对准以及在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比，并且不将任何保守性置换视为序列同一性的一部分之后，候选序列中与特定序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以属于本领域中的技能的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，诸如EMBOSS MATCHER、EMBOSS WATER、EMBOSS STRETCHER、EMBOSS NEEDLE、EMBOSS LALIGN、BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适用于度量比对的参数，包括在所比较序列的全长上实现最大对准所需的任何算法。
标准化学术语的定义可见于参考著作中，包括但不限于Carey和Sundberg“ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY第4版”第A(2000)和B(2001)卷,Plenum Press,New York。除非另外指示，否则采用质谱法、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。
除非提供特定定义，否则与本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学关联采用的命名法以及本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学的实验室程序和技术是本领域中认可的那些。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及治疗患者。标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如电穿孔、脂质转染)。反应和纯化技术可例如使用具有制造商说明书的试剂盒进行，或如本领域中通常所实现地进行，或如本文所述地进行。先前技术和程序可通常根据常规方法以及如本说明书整篇引用和讨论的各种一般性和更具体参考文献中所述来进行。
应了解本文所述的方法和组合物不限于本文所述的特定方法、方案、细胞系、构建体和试剂，因此可变化。也应了解本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并非意图限制本文所述的方法、化合物、组合物的范围。
术语“治疗(treat/treating/treatment)”包括缓和、减弱或改善疾病、病症或病状症状，预防额外症状，改善或预防症状的潜伏代谢原因，抑制疾病、病症或病状，例如遏止疾病、病症或病状的发展，减轻疾病、病症或病状，导致疾病、病症或病状的消退，减轻由疾病、病症或病状引起的状况，或终止疾病、病症或病状的症状。术语“治疗”包括但不限于预防性治疗和/或治疗性治疗。
关于制剂、组合物或成分的术语“可接受”或“药学上可接受”是指对所治疗的受试者的总体健康状况不具有持久有害作用，或不消除本文所述的经修饰FGF的生物活性或性质，并且是相对无毒的。
通过施用特定经修饰FGF或药物组合物来对特定疾病、病症或病状的症状达成的术语“改善”是指可归因于施用所述经修饰FGF或药物组合物或与施用所述经修饰FGF或药物组合物相关的任何严重性减轻、发作延迟、进展减缓或持续时间缩短，无论是永久的还是暂时的，持续的还是短暂的。
如本文所用的术语“组合”或“药物组合”意指由混合或组合超过一种活性成分而产生的产品，并且包括活性成分的固定组合与非固定组合两者。术语“固定组合”意指一种活性成分(例如经修饰FGF)和共同药剂均以单一实体或剂量形式同时向患者施用。术语“非固定组合”意指一种活性成分(例如经修饰FGF)和共同药剂以单独实体形式同时、并行或无特定间隔时间限制地依序向患者施用，其中所述施用在患者体内提供有效水平的两种药剂。后者也适用于鸡尾酒疗法，例如施用三种或更多种活性成分。
如本文所用的术语“药物组合物”是指一种或多种经修饰FGF-1多肽连同一种或多种其他化学组分一起，所述化学组分诸如载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、混悬剂、增稠剂和/或赋形剂。药物组合物有助于向生物体施用经修饰FGF-1多肽。本领域中存在施用经修饰FGF-1多肽的多种技术，包括但不限于：外部、经眼、眼内、眼周、静脉内、口服、气雾剂、胃肠外施用。
如本文所用的术语“载体”是指有助于将感兴趣的药剂(例如经修饰FGF)并入细胞或组织中的相对无毒化学化合物或药剂。
术语“稀释剂”是指用于在递送之前稀释感兴趣药剂(例如经修饰FGF)的化合物。稀释剂也可用于使药剂稳定，因为它们可提供更稳定环境。溶解于缓冲溶液(其也可提供pH控制或维持)中的盐在本领域中用作稀释剂，包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液。
术语“共同施用”等意图涵盖向单一患者施用所选药剂(例如经修饰FGF或其组合物与共同药剂)，并且意图包括其中药剂通过相同或不同施用途径或在相同或不同时间加以施用的治疗方案。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指所施用的本文所述的经修饰FGF-1多肽、药剂、组合或药物组合物的将在一定程度上减轻所治疗的疾病、病症或病状的一种或多种症状的足够量。结果可为疾病的征象、症状或原因的减轻和/或缓和，或生物系统的任何其他期望的改变。举例来说，用于治疗用途的“有效量”是经修饰FGF、药剂、组合或药物组合物在没有过度不利副作用的情况下提供期望的药理学作用、治疗改进或疾病症状临床显著减轻所需的量。在任何个别情况下的适当“有效量”都可使用诸如剂量递增研究的技术来确定。术语“治疗有效量”包括例如预防有效量。应了解，“作用量”可由于在以下方面的变化而在受试者与受试者之间变化：经修饰FGF、组合或药物组合物的代谢；受试者的年龄、重量、总体状况；所治疗的病状；所治疗的病状的严重性；以及处方医师的判断。仅举例来说，治疗有效量可通过包括但不限于剂量递增临床试验的常规实验来确定。
术语“预防有效量”是指施加于患者的本文所述的经修饰FGF、化合物、药剂、组合或药物组合物的将在一定程度上减轻所治疗的疾病、病状或病症的一种或多种症状的量。在所述预防性应用中，所述量可取决于患者的健康状态、重量等。通过包括但不限于剂量递增临床试验的常规实验来确定所述预防有效量被视为完全属于本领域的技能。
如本文所用的术语“受试者”或“患者”是指作为治疗、观察或实验对象的动物。仅举例来说，受试者可为但不限于哺乳动物，包括但不限于人。
术语“增强(enhance/enhancing)”意指在效能或持续时间方面使所需作用增加或延长。举例来说，“增强”单独或呈组合形式的治疗剂的作用是指在效能、持续时间和/或量值方面使药剂治疗疾病、病症或病状的作用增加或延长的能力。当在患者中使用时，用于该用途的有效量将取决于疾病、病症或病状的严重性和过程；先前疗法；患者的健康情形和对药物的响应；以及治疗医师的判断。
术语“调节”意指直接或间接与靶标(例如FGF受体)相互作用以便改变靶标的活性，仅举例来说，包括增强靶标的活性，抑制或拮抗靶标的活性，限制靶标的活性，或扩展靶标的活性。在一些实施方案中，本文所述的经修饰FGF-1多肽和药物组合物可调节一种或多种相应靶标(例如一种或多种FGF受体)的活性。在一些实施方案中，本文所述的经修饰FGF-1多肽调节(例如增加)细胞(例如角膜内皮细胞)上一种或多种FGF受体的活性，从而例如导致细胞迁移和/或细胞增殖。
如本文所用的术语“靶标”是指能够由本文所述的选择性结合剂(例如经修饰FGF)或药物组合物结合的生物分子(例如靶标蛋白质或蛋白质复合物)诸如FGF受体，或生物分子的一部分。如本文所用的术语“非靶标”是指不由本文所述的选择性结合剂或药物组合物选择性结合的生物分子或生物分子的一部分。
术语“靶标活性”或“细胞应答”是指能够由经修饰FGF调节的生物活性或由经修饰FGF与FGF受体的结合所致的任何细胞应答。某些示例性靶标活性和细胞应答包括但不限于结合亲和力、信号转导、基因表达、细胞迁移、细胞增殖、细胞分化以及一种或多种与眼部疾病、病症或病状相关的症状的改善。
术语“疱疹性角膜炎”、“单纯疱疹性角膜炎”、“HSK”、“疱疹性角膜病变”、“角膜疱疹”和“疱疹性角膜结膜炎”是指通常由单纯疱疹病毒(HSV)引起的眼部疾病、病症或病状。
经修饰FGF-1多肽的表达形式和成熟形式
FGF刺激一个家族的七个FGF受体亚型，并且各个FGF刺激不同样式的受体以实现其特定作用。参见例如Ornitz等人(1996)The Journal of biological chemistry,1996,271(25):15292-7；Zhang等人(2006)The Journal of biological chemistry,2006,281(23):15694-700。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽是优选的，因为它结合并刺激所有七个FGF受体亚型。参见Ornitz等人(1996)The Journal of biological chemistry,1996,271(25):15292-7。
本文公开的实施方案涉及一种经修饰FGF-1多肽或包含经修饰FGF-1多肽的药物组合物(例如眼用制剂)。本文公开的实施方案还涉及一种通过施用经修饰FGF-1多肽或包含经修饰FGF-1多肽的药物组合物(例如眼用制剂)来治疗化学损伤或糜烂性损伤的方法。如本文所用的经修饰FGF多肽是指包含SEQ ID NO:1的一个或多个不同氨基酸残基的置换或突变和/或一个或多个氨基酸残基的一个或多个缺失和/或一个或多个氨基酸残基的一个或多个添加的重组FGF。
在第一实施方案中，本文提供一种包含具有一个或多个突变的如SEQ ID NO:1所示的序列的经修饰FGF-1多肽，其中所述经修饰多肽进一步包含在SEQ ID NO:1的第一残基的上游的甲硫氨酸残基。在一些实施方案中，包含N末端甲硫氨酸(N-Met)残基的经修饰FGF-1多肽是多肽的成熟形式。在一些情况下，根据第一实施方案，经修饰FGF-1多肽包含一个或多个在SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134处的突变。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽在具有在SEQ ID NO:1的第一残基的上游的甲硫氨酸残基的情况下在宿主细胞中表达。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽在成熟期间不经受用于移除N-Met残基的N末端加工。因此，在一些实施方案中，经修饰FGF-1的成熟形式包含N-Met残基以及一个或多个在SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134处的突变。包含N-Met残基的示例性经修饰FGF-1序列以SEQ ID NO:2公开。
本公开内容认识到，如本文所述的在其成熟形式中包含N-Met残基的经修饰FGF-1与不具有所述N-Met残基的形式具有类似的生物活性。N末端甲硫氨酸移除或切除是一种一旦多肽从核糖体脱离即发生的共翻译过程。对N末端甲硫氨酸的移除涉及切割酶即甲硫氨酸氨基肽酶(metAP)的底物特异性，甲硫氨酸氨基肽酶识别紧接着具有小侧链的氨基酸残基诸如丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸的甲硫氨酸残基。由于这种底物序列特异性，第一实施方案的包含紧接着苯丙氨酸(参见SEQ ID NO:1的位置1)的N-Met残基的经修饰FGF-1不由metAP加工。因此，通过使具有紧邻在SEQ ID NO:1的上游的甲硫氨酸残基的经修饰FGF-1表达，可获得包含甲硫氨酸作为其N末端残基的成熟经修饰FGF-1。在一些实施方案中，根据第一实施方案的经修饰FGF-1不在具有N末端肽的情况下表达，因此在后续纯化期间不经受用于移除所述N末端肽的蛋白水解切割。
在第二实施方案中，本文提供一种包含具有一个或多个突变的如SEQ ID NO:1所示的序列的经修饰FGF-1多肽，其中所述经修饰多肽进一步包含在SEQ ID NO:1的第一残基的上游的甲硫氨酸残基以及如SEQ ID NO:3所示的肽的一个或多个氨基酸。包含SEQ IDNO:3的一个或多个残基的肽在本文中被称为“延伸肽”。因此，根据第二实施方案的经修饰FGF-1包含具有一个或多个突变的如SEQ ID NO:1所示的序列、在SEQ ID NO:1的第一残基的上游的甲硫氨酸残基，以及位于甲硫氨酸残基与SEQ ID NO:1的第一残基之间的延伸肽。在一些实施方案中，包含N末端甲硫氨酸和位于甲硫氨酸残基与SEQ ID NO:1的第一残基之间的延伸肽的经修饰FGF-1多肽是多肽的成熟形式。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含一个或多个在SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134处的突变，所述多肽在具有在SEQ ID NO:1的第一残基的上游的甲硫氨酸残基并且进一步具有位于甲硫氨酸残基与SEQID NO:1的第一残基之间的延伸肽的情况下在宿主细胞中表达。在一些实施方案中，根据第二实施方案的经修饰FGF-1多肽在具有延伸肽的情况下表达，所述延伸肽包含SEQ ID NO:3的五个残基，位于甲硫氨酸残基与SEQ ID NO:1的第一残基之间。在一些实施方案中，根据第二实施方案的经修饰FGF-1多肽在具有SEQ ID NO:3的四个残基的情况下表达，所述四个残基位于甲硫氨酸残基与SEQ ID NO:1的第一残基之间。在一些实施方案中，根据第二实施方案的经修饰FGF-1多肽在具有SEQ ID NO:3的三个残基的情况下表达，所述三个残基位于甲硫氨酸残基与SEQ ID NO:1的第一残基之间。在一些实施方案中，根据第二实施方案的经修饰FGF-1多肽在具有SEQ ID NO:3的两个残基的情况下表达，所述两个残基位于甲硫氨酸残基与SEQ ID NO:1的第一残基之间。在一些实施方案中，根据第二实施方案的经修饰FGF-1多肽在具有SEQ ID NO:3的一个残基的情况下表达，所述一个残基位于甲硫氨酸残基与SEQ ID NO:1的第一残基之间。延伸肽的示例性序列包括SEQ ID NO:4-8。
在一些情况下，第二实施方案的包含延伸肽和N末端甲硫氨酸残基的经修饰FGF-1多肽不经受用于移除甲硫氨酸残基的N末端加工，而在一些情况下，甲硫氨酸由切割酶切除。通常，切割酶是甲硫氨酸氨基肽酶(metAP)。因此，在一些实例中，根据第二实施方案的经修饰FGF-1多肽的成熟形式包含紧接着如本文所述的延伸肽的N-Met残基。根据第二实施方案的包含N末端甲硫氨酸以及位于甲硫氨酸残基与SEQ ID NO:1的第一残基之间的延伸肽的一个或多个残基的经修饰FGF-1多肽的成熟形式的示例性序列如SEQ ID NO:9-13所示，其中所述序列进一步包含一个或多个在对应于SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134的氨基酸处的突变。包含N末端甲硫氨酸和延伸肽的成熟经修饰FGF-1多肽的额外示例性序列如SEQ ID NO:14-18所示。在一些其他实例中，根据第二实施方案的经修饰FGF-1多肽的成熟形式不包含N-Met残基，而是仅包含延伸肽。根据第二实施方案的包含位于SEQ ID NO:1的第一残基的上游的延伸肽的经修饰FGF-1多肽的成熟形式的示例性序列如SEQ ID NO:19-23所示，其中所述序列进一步包含一个或多个在对应于SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134的氨基酸处的突变。包含延伸肽的一个或多个残基的成熟经修饰FGF-1多肽的额外示例性序列如SEQ ID NO:24-28所示。在一些实施方案中，当延伸肽以丙氨酸(如在SEQID NO:4的情况下)或以苏氨酸(如在SEQ ID NO:5的情况下)起始时，甲硫氨酸残基由metAP切割。在那些情况下，成熟FGF-1多肽不包含N末端甲硫氨酸残基，例如SEQ ID NO:19、21、24和26。
在第三实施方案中，本文提供一种包含具有一个或多个突变的如SEQ ID NO:1所示的序列的经修饰FGF-1多肽，其中所述经修饰多肽进一步包含位于SEQ ID NO:1的第一残基的上游的延伸肽。在一些实施方案中，包含延伸肽的经修饰FGF-1多肽是多肽的成熟形式。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含一个或多个在SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134处的突变，所述多肽在具有位于SEQ ID NO:1的第一残基的上游的延伸肽的一个或多个氨基酸残基的情况下在宿主细胞中表达。在没有N末端甲硫氨酸残基的情况下表达的包含延伸肽的经修饰FGF-1多肽的示例性序列如SEQ ID NO:19-23所示，其中所述序列进一步包含一个或多个在对应于SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134的氨基酸处的突变。包含延伸肽的一个或多个残基并且在没有N末端甲硫氨酸残基的情况下表达的成熟经修饰FGF-1多肽的额外示例性序列如SEQ ID NO:24-28所示。
在第四实施方案中，本文提供一种包含具有一个或多个突变的如SEQ ID NO:1所示的序列的经修饰FGF-1多肽，其中所述经修饰多肽进一步包含对SEQ ID NO:1的前五个残基中的一者或多者的截短。在一些实施方案中，包含对SEQ ID NO:1的前五个残基中的一者或多者的截短的经修饰FGF-1多肽是多肽的成熟形式。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含一个或多个在SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134处的突变，其中SEQ ID NO:1的前五个残基中的一者或多者缺失。在一些情况下，包含截短的经修饰FGF-1多肽在具有N末端甲硫氨酸残基的情况下表达。举例来说，根据第四实施方案的经修饰FGF-1多肽可具有其中N-Met残基紧接着SEQ ID NO:1的第二残基天冬酰胺的序列。在一些情况下，经修饰FGF-1多肽包含紧接着SEQ ID NO:1的第三残基亮氨酸的N-Met残基。在一些情况下，经修饰FGF-1多肽包含紧接着SEQ ID NO:1的第四残基脯氨酸的N-Met残基。在一些情况下，经修饰FGF-1多肽包含紧接着SEQ ID NO:1的第五残基脯氨酸的N-Met残基。延伸肽可位于N-Met残基与SEQ ID NO:1的第一、第二、第三、第四或第五残基之间。根据第四实施方案的其中N-Met残基紧接着SEQ ID NO:1的第二、第三、第四或第五残基的经修饰FGF-1多肽的成熟形式的实例以SEQ ID NO:37-40,显示，其中序列进一步包含一个或多个在对应于SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134的氨基酸处的突变。包含截短和N-Met残基的经修饰FGF-1多肽的额外实例以SEQ ID NO:41-44提供。
本公开内容还涉及包含SEQ ID NO:1的一个或多个突变的经修饰FGF-1多肽，其中所述多肽在具有紧接着延伸肽的N-Met残基的情况下表达，并且所述延伸肽紧接着对SEQID NO:1的前五个残基中的一者或多者的截短。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含一个或多个在SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134处的突变，其中所述多肽在具有紧接着延伸肽的N-Met残基的情况下表达，并且所述延伸肽紧接着对SEQ ID NO:1的前五个残基中的一者或多者的截短。在具有紧接着延伸肽的N-Met残基并且所述延伸肽紧接着对SEQID NO:1的前五个残基中的一者或多者的截短的情况下表达的所述序列的实例以SEQ IDNO:45-68公开，其中所述序列进一步包含一个或多个在对应于SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134的氨基酸处的突变。在一些实例中，N末端甲硫氨酸通过N末端加工来切下，因此，经修饰FGF-1多肽的成熟形式仅包含前导片段的一个或多个残基和紧接着的对SEQ IDNO:1的前五个残基中的一者或多者的截短，如SEQ ID NO:69-92所例示，其中示例性序列进一步包含一个或多个在对应于SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134的氨基酸处的突变。没有N-Met残基但包括延伸肽以及对N末端残基的截短的序列的额外实例以SEQ ID NO:93-117提供。
在一些实例中，N-Met残基被保留在成熟经修饰FGF-1多肽序列中，因此，成熟形式包含如SEQ ID NO:45-68例示的序列，所述序列进一步包含一个或多个在对应于SEQ IDNO:1的位置12、16、66、117和134的氨基酸处的突变。包含N-Met残基、延伸肽和对N末端残基的截短的序列的额外实例以SEQ ID NO:118-141提供。
在第五实施方案中，包含一个或多个在SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134处的突变的经修饰FGF-1多肽的截短形式在没有N末端甲硫氨酸残基并且也没有延伸肽的情况下表达。在一些实例中，根据第五实施方案的成熟经修饰FGF-1多肽包含如SEQ ID NO:29-32所示的序列，其中所述序列进一步包含一个或多个在对应于SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134的氨基酸处的突变。在一些实例中，根据第五实施方案的经修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:33-36的序列。
在其中包含一个或多个在SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134处的突变的经修饰FGF-1多肽或其截短形式在具有紧接着延伸肽的N末端甲硫氨酸的情况下表达的情况下，在表达之后，在多肽的成熟期间，甲硫氨酸残基被保留或从N末端切下。在其中经修饰FGF-1多肽在具有紧接于N-Met残基的丙氨酸的情况下表达的一些实例中，例如SEQ ID NO:14，甲硫氨酸被切割，以产生不包含N-Met残基的成熟FGF-1多肽，例如SEQ ID NO:19。在其中经修饰FGF-1多肽在具有紧接于N-Met残基的苏氨酸的情况下表达的一些实例中，例如SEQ ID NO:16，甲硫氨酸被切割，以产生不包含N-Met残基的成熟FGF-1多肽，例如SEQ IDNO:20。在其中经修饰FGF-1多肽在具有紧接于N-Met残基的谷氨酸的情况下表达的一些实例中，例如SEQ ID NO:17，甲硫氨酸不被切割，以产生包含N末端甲硫氨酸并且与表达形式具有相同序列的成熟FGF-1。
在第六实施方案中，本文提供一种包含如SEQ ID NO:1所示的序列的经修饰FGF-1多肽，所述序列包含在位置67处的突变。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含在SEQID NO:1的位置67处的突变、一个或多个在位置12、16、66、117和134处的其他突变，并且在具有N-Met残基的情况下表达。在位置67处的内部甲硫氨酸可例如用丙氨酸残基替换。在不存在处于位置67处的内部甲硫氨酸下，经修饰FGF-1多肽的N末端甲硫氨酸可在表达后使用特异性切割在甲硫氨酸残基之后的酰胺键的试剂溴化氰(CNBr)加以切割。在一些情况下，根据第六实施方案的经修饰FGF-1多肽在具有延伸肽的情况下表达。在一些其他情况下，根据第六实施方案的经修饰FGF-1多肽以包含对SEQ ID NO:1的前五个残基中的一者或多者的截短的形式表达，如SEQ ID NO:142-149所例示，其中序列进一步包含一个或多个在对应于SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134的氨基酸处的突变。在其他实例中，根据第六实施方案的经修饰FGF-1多肽以包含延伸肽和对SEQ ID NO:1的前五个残基中的一者或多者的截短的形式表达，如SEQ ID NO:151-175所例示。根据第六实施方案的处于其成熟形式的经修饰FGF-1多肽的额外实例如SEQ ID NO:174-204所示。在以包含内部甲硫氨酸突变的形式表达的经修饰FGF-1多肽之中，在其中多肽在具有紧接着来自延伸肽的丙氨酸或苏氨酸残基的N末端甲硫氨酸的情况下表达的情况下，例如分别是SEQ ID NO:175和SEQ ID NO:177，N末端甲硫氨酸可在多肽的成熟期间由metAP或使用CNBr切下。
在第七实施方案中，本文提供一种用于如本文所述的方法中的包含如SEQ ID NO:205所示的序列的经修饰FGF-1多肽。在第八实施方案中，本文提供一种用于如本文所述的方法中的包含如SEQ ID NO:206所示的序列的经修饰FGF-1多肽。
本公开内容进一步涉及包含对SEQ ID NO:1的缺失、插入和置换的任何组合的经修饰FGF-1多肽，前提是所述经修饰多肽包含SEQ ID NO:1的一个或多个突变。可将氨基酸置换引入经修饰FGF-1多肽中，并且针对所期望的活性对产物进行筛选，所述所期望的活性是例如在治疗眼部病症方面的保留/改进的有效性、在改善富克氏营养不良方面的增加的效能、对芥子气角膜病变的改进的治疗。也可将氨基酸置换引入经修饰FGF-1多肽中，并且针对所期望的物理化学性质对产物进行筛选，所述所期望的物理化学性质是例如较不倾向于聚集、改进的溶解性、延长的半衰期、容易配制成眼用药物、增强的稳定性、改进的储存期限。涵盖保守性氨基酸置换与非保守性氨基酸置换两者。
如任何以上实施方案中的经修饰FGF-1多肽以包含至少136个氨基酸的形式表达。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽以包含137个氨基酸的形式表达。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽以包含138个氨基酸的形式表达。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽以包含139个氨基酸的形式表达。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽以包含140个氨基酸的形式表达。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽以包含141个氨基酸的形式表达。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽以包含142个氨基酸的形式表达。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽以包含143个氨基酸的形式表达。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽以包含144个氨基酸的形式表达。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽以包含145个氨基酸的形式表达。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽以包含146个氨基酸的形式表达。
如任何以上实施方案中的经修饰FGF-1多肽在成熟形式中包含至少136个氨基酸。在一些实例中，经修饰FGF-1多肽在成熟形式中包含137个氨基酸。在一些实例中，经修饰FGF-1多肽在成熟形式中包含138个氨基酸。在一些实例中，经修饰FGF-1多肽在成熟形式中包含139个氨基酸。在一些实例中，经修饰FGF-1多肽在成熟形式中包含140个氨基酸。在一些实例中，经修饰FGF-1多肽在成熟形式中包含141个氨基酸。在一些实例中，经修饰FGF-1多肽在成熟形式中包含142个氨基酸。在一些实例中，经修饰FGF-1多肽在成熟形式中包含143个氨基酸。在一些实例中，经修饰FGF-1多肽在成熟形式中包含144个氨基酸。在一些实例中，经修饰FGF-1多肽在成熟形式中包含145个氨基酸。在一些实例中，经修饰FGF-1多肽在成熟形式中包含146个氨基酸。
在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽的序列与SEQ ID NO:1具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，前提是所述多肽在多肽的成熟形式中包含N-Met残基。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽的序列与选自SEQ ID NO:9-13的序列中的任一者具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，前提是所述多肽在其成熟形式中包含N-Met残基，并且多肽包含一个或多个在对应于SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134的氨基酸位置处的突变。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽的序列与选自SEQ ID NO:14-18的序列中的任一者具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，前提是所述多肽在其成熟形式中包含N-Met残基。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽的序列与选自SEQ ID NO:19-23的序列中的任一者具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，前提是所述多肽在其成熟形式中不包含N-Met残基，并且多肽包含一个或多个在对应于SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134的氨基酸位置处的突变。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽的序列与选自SEQ IDNO:24-28的序列中的任一者具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，前提是所述多肽在其成熟形式中不包含N-Met残基。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽的序列与选自SEQ ID NO:19-23的序列中的任一者具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，前提是所述多肽在其成熟形式中不包含N-Met残基，并且多肽包含一个或多个在对应于SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134的氨基酸位置处的突变。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽的序列与选自SEQ ID NO:37-40的序列中的任一者具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，前提是所述多肽在其成熟形式中包含N-Met残基，并且多肽包含一个或多个在对应于SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134的氨基酸位置处的突变。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽的序列与选自SEQ ID NO:41-44的序列中的任一者具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，前提是所述多肽在其成熟形式中包含N-Met残基。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽的序列与选自SEQ ID NO:45-68的序列中的任一者具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，前提是所述多肽包含一个或多个在对应于SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134的氨基酸位置处的突变，并且所述多肽在其成熟形式中不包含N-Met残基。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽的序列与选自SEQID NO:69-92的序列中的任一者具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，包含一个或多个在对应于SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134的氨基酸位置处的突变，并且所述多肽在其成熟形式中包含N-Met残基。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽的序列与选自SEQ ID NO:93-117的序列中的任一者具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，前提是所述多肽在其成熟形式中不包含N-Met残基。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽的序列与选自SEQ ID NO:118-141的序列中的任一者具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，前提是所述多肽在其成熟形式中包含N-Met残基。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽的序列与选自SEQ ID NO:29-32的序列中的任一者具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，前提是所述多肽包含一个或多个在对应于SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134的氨基酸位置处的突变。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽的序列与选自SEQ ID NO:33-36的序列中的任一者具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽的序列与选自SEQ ID NO:142-204的序列中的任一者具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽与在位置12处以例如突变Lys12Val加以突变的SEQ ID NO:1具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述经修饰FGF-1多肽在其成熟形式中包含N末端甲硫氨酸。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ ID NO:1的位置12处的突变例如突变Lys12Val，并且具有对SEQ ID NO:1的前五个残基中的一者或多者的截短的序列，其中所述经修饰FGF-1多肽在其成熟形式中包含N-Met残基。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ ID NO:1的位置12处的突变例如突变Lys12Val，具有延伸肽，并且具有对SEQ ID NO:1的前五个残基中的一者或多者的截短的序列，其中所述经修饰FGF-1多肽在其成熟形式中包含N-Met残基。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ ID NO:1的位置12处的突变例如突变Lys12Val的序列，其中多肽进一步包含在SEQ ID NO:1的位置67处的甲硫氨酸的突变，并且在具有在N末端的甲硫氨酸的情况下表达，所述甲硫氨酸在多肽的成熟形式中从多肽切下。
在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽与在位置16处以例如突变Cys16Ser加以突变的SEQ ID NO:1具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述经修饰FGF-1多肽在其成熟形式中包含N-Met残基。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ ID NO:1的位置16处的突变例如突变Cys16Ser，并且具有对SEQID NO:1的前五个残基中的一者或多者的截短的序列，其中所述经修饰FGF-1多肽在其成熟形式中包含N-Met残基。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ ID NO:16的位置16处的突变例如突变Cys16Ser，具有延伸肽，并且具有对SEQ ID NO:1的前五个残基中的一者或多者的截短的序列，其中所述经修饰FGF-1多肽包含N-Met残基。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ ID NO:1的位置16处的突变例如突变Cys16Ser的序列，其中多肽进一步包含在SEQ ID NO:1的位置67处的甲硫氨酸的突变，并且在具有在N末端的甲硫氨酸的情况下表达，所述甲硫氨酸在多肽的成熟形式中从多肽切下。
在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽与在位置66处以例如突变Ala66Cys加以突变的SEQ ID NO:1具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述经修饰FGF-1多肽在其成熟形式中包含N末端甲硫氨酸。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ ID NO:1的位置66处的突变例如突变Ala66Cys，并且具有对SEQ ID NO:1的前五个残基中的一者或多者的截短的序列，其中所述经修饰FGF-1多肽在其成熟形式中包含N-Met残基。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ ID NO:1的位置66处的突变例如突变Ala66Cys，具有延伸肽，并且具有对SEQ ID NO:1的前五个残基中的一者或多者的截短的序列，其中所述经修饰FGF-1多肽在具有N-Met残基的情况下表达。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ ID NO:1的位置66处的突变例如突变Ala66Cys的序列，其中多肽进一步包含在SEQ ID NO:1的位置67处的甲硫氨酸的突变，并且在具有在N末端的甲硫氨酸的情况下表达，所述甲硫氨酸在多肽的成熟形式中从多肽切下。
在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽与在位置117处以例如突变Cys117Val加以突变的SEQ ID NO:1具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述经修饰FGF-1多肽在其成熟形式中包含N-Met残基。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ ID NO:1的位置117处的突变例如突变Cys117Val，并且具有对SEQ ID NO:1的前五个残基中的一者或多者的截短的序列，其中所述经修饰FGF-1多肽在其成熟形式中包含N-Met残基。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ ID NO:1的位置117处的突变例如突变Cys117Val，具有延伸肽，并且具有对SEQ ID NO:1的前五个残基中的一者或多者的截短的序列，其中所述经修饰FGF-1多肽在其成熟形式中包含N-Met残基。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ ID NO:1的位置117处的突变例如突变Cys117Val的序列，其中多肽进一步包含在SEQ ID NO:1的位置67处的甲硫氨酸的突变，并且在具有在N末端的甲硫氨酸的情况下表达，所述甲硫氨酸在多肽的成熟形式中从多肽切下。
在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽与在位置134处以例如突变Pro134Val加以突变的SEQ ID NO:1具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述经修饰FGF-1多肽在其成熟形式中包含N末端甲硫氨酸。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ ID NO:1的位置134处的突变例如突变Pro134Val，并且具有对SEQ ID NO:1的前五个残基中的一者或多者的截短的序列，其中所述经修饰FGF-1多肽在其成熟形式中包含N-Met残基。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ IDNO:1的位置134处的突变例如突变Pro134Val，具有延伸肽，并且具有对SEQ ID NO:1的前五个残基中的一者或多者的截短的序列，其中所述经修饰FGF-1多肽在其成熟形式中包含N-Met残基。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ ID NO:1的位置134处的突变例如突变Pro134Val的序列，其中多肽进一步包含在SEQ ID NO:1的位置67处的甲硫氨酸的突变，并且在具有在N末端的甲硫氨酸的情况下表达，所述甲硫氨酸在多肽的成熟形式中从多肽切下。
在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽与在SEQ ID NO:1的位置16、66和117处以例如突变Cys16Ser、Ala66Cys和Cys117Val加以突变的SEQ ID NO:1具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述经修饰FGF-1多肽在其成熟形式中包含N-Met残基。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ ID NO:1的位置16、66和117处的突变例如突变Cys16Ser、Ala66Cys和Cys117Val，并且具有对SEQ ID NO:1的前五个残基中的一者或多者的截短的序列，其中所述经修饰FGF-1多肽在其成熟形式中包含N-Met残基。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ ID NO:1的位置16、66和117处的突变例如突变Cys16Ser、Ala66Cys和Cys117Val，具有延伸肽，并且具有对SEQID NO:1的前五个残基中的一者或多者的截短的序列，其中所述经修饰FGF-1多肽包含N-Met残基。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ ID NO:1的位置16、66和117处的突变例如突变Cys16Ser、Ala66Cys和Cys117Val的序列，其中多肽进一步包含在SEQ IDNO:1的位置67处的甲硫氨酸的突变，并且在具有在N末端的甲硫氨酸的情况下表达，所述甲硫氨酸在多肽的成熟形式中从多肽切下。
在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽的序列与选自SEQ ID NO:2以及9-204的序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽的序列与SEQ ID NO:205或206具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽是热稳定的。如本文所用，热稳定FGF(例如热稳定FGF-1)是指相对于SEQ ID NO:1具有经修饰氨基酸序列的FGF，其在相同条件下，相比于SEQ ID NO:1的多肽也更稳定。能够向FGF(例如FGF-1)赋予热稳定性的突变和用于评估热稳定性的方法的实例在例如美国专利号7,790,682；7,595,296；7,696,171；7,776,825；7,659,379；8,119,776；8,153,770；8,153,771；和8,461,111；美国专利申请公开号2011/0224404和2013/0130983；以及Xia等人PloS one.(2012)7(11):e48210中描述。在一些实施方案中，使FGF-1中的位置12和/或134突变以产生热稳定的经修饰FGF-1。
在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含一个或多个使反应性硫醇(例如游离半胱氨酸)的数目降低的修饰。FGF-1中所述修饰的实例在例如美国专利号7,790,682；7,595,296；7,696,171；7,776,825；7,659,379；8,119,776；8,153,770；8,153,771；和8,461,111；美国专利申请公开号2011/0224404和2013/0130983；以及Xia等人PloS one.(2012)7(11):e48210中描述。在一些实施方案中，使SEQ ID NO:1中的位置83和/或117突变以产生反应性硫醇的数目降低的经修饰FGF-1。
在一些实施方案中，经修饰FGF包含一个或多个使得能够形成内部二硫键的修饰。在一些实施方案中，使SEQ ID NO:1中的位置66突变以产生包含内部二硫键的经修饰FGF-1。
在一些实施方案中，本文所述的经修饰FGF-1多肽可在制剂中无外源性肝素的情况下施用以达成稳定性，它们可在无肝素的情况下配制和施加，因此更加能够结合至组织乙酰肝素。所述经修饰FGF-1多肽对在手术、创伤或营养不良状况和疾病状态下暴露的组织乙酰肝素具有高亲和力，因此在施加时结合至患病组织。此外，更具热稳定性的经修饰FGF-1多肽适于在室温下配制和储存。经修饰FGF-1多肽的稳定性还使其适于以溶液(例如立即释放溶液)与持续释放制剂两者施用。
在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽是已在位置12、16、66、117和134中的一者或多者处被修饰的SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，经修饰FGF是已在位置16、66和117处被修饰的SEQ ID NO:1。氨基酸位置可被例如Ser、Cys、Val或其他氨基酸置换以在经修饰型氨基酸与野生型氨基酸之间创建二硫键。在一些实施方案中，经修饰FGF包含氨基酸序列SEQID NO:2，也被称为N-Met THX1114。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含一个或多个选自以下的突变：Lys12Val、Pro134Val、Ala66Cys、Cys117Val和Pro134Val。在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽包含序列SEQ ID NO:2。
在一些实施方案中，本文所述的经修饰FGF-1多肽或组合物可被制备成前药。“前药”是指在体内转化成母体药物的药剂。前药经常是有用的，因为在一些情况下，它们可比母体药物更易于施用。它们可例如通过口服施用而生物可用，而母体药物不行。前药也可在药物组合物中具有超过母体药物的改进的溶解性。
本文所述的经修饰FGF-1多肽可加以同位素标记(例如用放射性同位素)或通过其他手段来标记，包括但不限于使用发色团或荧光部分、生物发光标记、光可活化或化学发光标记。
本公开内容进一步涉及包含N末端修饰的经修饰FGF多肽，其中经修饰FGF多肽可为FGF家族的任何成员，包括FGF-1(SEQ ID NO:1)、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-15、FGF-16、FGF-17、FGF-18、FGF-19、FGF-20、FGF-21、FGF-22以及FGF-23和FGF-24。
在一些实施方案中，如本文所述的经修饰FGF-1多肽的合成使用本领域中所述的手段，使用本文所述的方法，或通过其组合来实现。
在一些实施方案中，经修饰FGF的序列与在一个或多个位置16、66和117处以例如突变Cys16Ser、Ala66Cys和Cys117Val加以突变的SEQ ID NO:1具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，经修饰FGF包含具有在位置16、66和117处的突变例如突变Cys16Ser、Ala66Cys和Cys117Val的野生型人FGF-1序列。
用于制备经修饰FGF-1多肽的重组技术
多种宿主-表达载体系统可用于产生本文提供的经修饰FGF-1多肽。所述宿主-表达系统表示经修饰FGF-1多肽可通过其来产生以及随后纯化的媒介物，但也表示在用适当核苷酸编码序列转化或转染时可原位展现经修饰基因产物的细胞。宿主-表达系统的实例包括但不限于细菌、昆虫、植物、哺乳动物，包括人宿主系统，诸如但不限于用含有编码经修饰FGF-1多肽的核苷酸序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)CaMV；烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus)TMV)感染的植物细胞系统，或用含有经修饰FGF-1多肽的编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或携带含有启动子的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统，包括人细胞系统，例如HT1080、COS、CHO、BHK、293、3T3，所述启动子源于哺乳动物细胞的基因组，例如金属硫蛋白启动子，或源于哺乳动物病毒，例如腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子，或源于衍生自酵母的质粒例如pSH19和pSH15，或源于噬菌体诸如λ噬菌体及其衍生物。细菌表达系统的实例包括但不限于衍生自大肠杆菌(Escherichia coli)的质粒(例如pBR322、pBR325、pUC12、pUC13和pET-3)；衍生自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的质粒(例如PUB110、pTP5和pC194)。
在一些实施方案中，选择宿主细胞品系以使其以所期望的特定方式调节所插入序列的表达，或修饰和加工基因产物。对蛋白质产物的所述修饰和加工对于蛋白质的功能可能是重要的。不同宿主细胞具有用于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特定机理。可选择适当细胞系或宿主系统以确保对所表达的外来蛋白质的正确修饰和加工。为此，可使用具有用于适当地对初级转录物进行加工、对基因产物进行糖基化和磷酸化的细胞机构的真核宿主细胞。包括人宿主细胞的所述哺乳动物宿主细胞包括但不限于HT1080、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3和WI38。
对于长期高产率产生重组肽，稳定表达是期望的。举例来说，可对稳定表达重组经修饰FGF-1多肽的细胞系进行工程化。在一些实施方案中，宿主细胞可用由适当表达控制元件例如启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等以及可选择标记控制的DNA转化，而不使用含有病毒复制起点的表达载体。在引入外来DNA之后，可使工程化细胞在富集培养基中生长1-2天，接着转换成选择性培养基。重组质粒中的可选择标记赋予对选择的抗性，并且允许细胞将质粒稳定整合至其染色体中并且生长以形成转化灶，所述转化灶转而可被克隆以及扩增成细胞系。在一些实例中，这个方法可有利地用于对表达经修饰FGF-1多肽产物的细胞系进行工程化。所述工程化细胞系可特别适用于筛选和评估影响基因产物的生物性质的化合物。
经修饰FGF-1多肽中的二硫键形成
在一些实施方案中，本公开内容的经修饰FGF-1多肽包含SEQ ID NO:1中的以下突变-Cys16Ser、Ala66Cys和Cys117Val，其中多肽包含在位置66和83处的半胱氨酸残基之间的内部二硫键。对于许多重组蛋白，形成正确二硫键对于获得其生物活性三维构象至关重要。形成错误二硫键可导致蛋白质错误折叠以及聚集成包涵体。在大肠杆菌中，半胱氨酸氧化通常在周质中发生，在周质中，在由主要来自Dsb家族的许多种酶催化的二硫键交换反应中形成二硫键(Rosano,G.L.和Ceccarelli,E.A.(2014).Recombinant proteinexpression in Escherichia coli:advances and challenges.Frontiers inMicrobiology,5,172)。相比之下，在细胞质中的二硫键形成较为稀少。这个情况会影响在细胞质中产生的具有二硫键的重组蛋白的产生，所述重组蛋白诸如包含在Cys66与Cys83之间的内部二硫键的经修饰FGF-1多肽。因此，在一些实例中，具有有利于二硫键形成的氧化细胞质环境的工程化大肠杆菌菌株被选作用于表达经修饰FGF-1多肽的宿主细胞(Rosano,G.L.和Ceccarelli,E.A.(2014).Recombinant protein expression in Escherichiacoli:advances and challenges.Frontiers in Microbiology,5,172)。所述菌株的实例包括但不限于Origami(Novagen)，其具有在K-12背景下的trxB-gor-基因型；以及
Figure BDA0002354729340000381
T7 Express菌株(NEB)，其具有在BL21(DE3)背景下的trxB-gor-基因型并且组成性地表达二硫键异构酶DsbC的染色体拷贝。已显示，DsbC促进将错误氧化的蛋白质修正成其正确形式，并且也是可有助于不需要二硫键的蛋白质的折叠的伴侣蛋白。在不受特定理论束缚下，预期由于DsbC的作用，较少靶标蛋白质诸如包含在Cys66与Cys83之间的内部二硫键的经修饰FGF-1多肽聚集成包涵体。因此，在某些实施方案中，本公开内容确定一种用于在细胞质中产生包含在Cys16与Cys83之间的内部二硫键的经修饰FGF-1多肽的改进方法。
在其中经修饰FGF-1多肽在具有N-Met残基的情况下表达的一些实施方案中，多肽随后在不进行需要蛋白水解切割以移除N末端肽的步骤的情况下加以纯化。因此，在一些实施方案中，本公开内容提供一种快速纯化本文所述的经修饰FGF-1多肽的方法，所述方法不涉及用于移除N末端肽的蛋白水解切割步骤。这对于根据优质生产规范(GMP)指导方针来生产经修饰FGF-1多肽是特别有利的。优势包括缺乏切割步骤，从而包括消除对后续纯化经切割产物以及移除用于切割的试剂的需要。此举的另一优势是由于处理得以减少以及对测试残余切割试剂和污染物的需要得以缩减，因此产率增加，所述切割试剂和污染物被引入来达成切割以及后续分离经切割物质与未切割物质。
使用方法
在一个实施方案中，本文提供一种治疗哺乳动物的眼部疾病、病症或病状的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用如以上实施方案中所述的经修饰FGF-1多肽。在一些情况下，用于本文所述的方法中的经修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:2以及9-204的序列。在一个实施方案中，本文提供一种治疗哺乳动物的眼部疾病、病症或病状的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用包含如SEQ ID NO:205或206所示的序列的经修饰FGF-1多肽。
在一些实施方案中，待治疗的眼部疾病、病症或病状是角膜内皮层的疾病、病症或病状。角膜内皮层的疾病、病症或病状包括但不限于富克氏营养不良、大疱性角膜病变、1型先天性遗传性内皮营养不良、2型先天性遗传性内皮营养不良、后部多形性角膜营养不良和干眼综合征。
在不受理论束缚下，据信在前房内注射至眼的房水中的经修饰FGF-1多肽的溶液会结合至内皮表面，并且尤其是角膜的未由健康内皮层覆盖的任何区域。经修饰FGF会刺激内皮细胞的生长和迁移。这使与内皮营养不良相关的角膜水肿减轻，并且使需要角膜或内皮移植的可能性降低。经修饰FGF的作用可发生在除最大程度营养不良的部位(通常在角膜中心)以外的部位处，并且还导致刺激角膜外周中的内皮细胞和小梁网(TM)中的内皮祖细胞池。
在一些实施方案中，待治疗的眼部疾病、病症或病状是角膜上皮的疾病、病症或病状。角膜上皮的疾病、病症或病状包括但不限于干眼综合征、炎症性病状诸如史蒂文斯-约翰逊综合征(Stevens-Johnson syndrome)，以及角膜上皮缺陷。
在一些实施方案中，待治疗的眼部疾病、病症或病状是疱疹性角膜病变。疱疹性角膜病变通常是由单纯疱疹病毒(HSV)引起的角膜感染。原发性感染可为宿主的粘膜直接暴露于感染性HSV的结果。在原发性感染以及在感觉性神经节中建立潜伏之后，病毒可被刺激以进入感染周期，在感染周期中病毒返回角膜。一旦到达角膜，这种复发性感染可导致各种并发症，特别是炎症性应答，炎症性应答如果足够强力，则可损害角膜的完整性，从而导致角膜溃疡、混浊、模糊、结疤，并且在重度情况下导致失明。继发于疱疹感染，可能发展出慢性疱疹性角膜病变、神经营养性角膜病变或两者。举例来说，由免疫介导并且在发达国家是主要角膜失明原因的基质感染由于慢性病毒再活化而发生，并且导致一种退变性病状——神经营养性角膜病变。正常角膜受到密集神经支配，但缺乏血管。在原发性病毒性感染之后的后续发作可不仅损害神经，从而导致角膜知觉减退(角膜感觉迟钝)，而且还导致血管生成和新血管形成。
在其他实施方案中，本文所述的经修饰FGF-1多肽可用于治疗上皮基底膜营养不良、梅斯曼青少年上皮角膜营养不良(Meesmann juvenile epithelial cornealdystrophy)、胶滴状角膜营养不良、立舍上皮角膜营养不良(Lisch epithelial cornealdystrophy)、上皮下粘液性角膜营养不良、雷斯-布克勒斯角膜营养不良(Reis-Bucklerscorneal dystrophy)或蒂尔-本克营养不良(Thiel-Behnke dystrophy)和复发性角膜糜烂。
在一些实施方案中，眼部病状包括对角膜(例如角膜表面或在角膜和房水的界面处的内皮层)的损害或由角膜手术引起的手术破坏，所述手术包括PRK、LASIK和任何穿透性角膜手术或角膜成形术。
本文还提供一种通过施用经修饰成纤维细胞生长因子(FGF-1)多肽或包含所述经修饰肽的药物组合物或药剂来治疗化学物质或糜烂剂诱发的损伤的方法。
在一个实施方案中，本文还提供一种通过施用如本文所述的经修饰FGF-1多肽来治疗化学损伤或糜烂性损伤的方法。在一些实施方案中，方法包括治疗由化学物质或糜烂剂引起的皮肤损伤或眼部损伤。在一些实施方案中，方法包括通过施用如本文所述的经修饰FGF-1多肽来治疗由糜烂剂例如氮芥(NM)诱发的芥子气角膜病变。在一些实施方案中，用如本文所述的经修饰FGF-1多肽治疗MGK会导致与MGK相关的组织病理学病状的改善，所述组织病理学病状诸如角膜上皮层的增生、上皮-基质细胞分离、水肿、角膜糜烂。在某些实施方案中，本公开内容的经修饰FGF-1的施用会导致水肿减轻以及角膜糜烂消除。角膜糜烂的特征通常在于角膜的脱上皮化，并且在一些实例中，经修饰FGF-1的施用会导致角膜的较快再上皮化或减轻角膜脱上皮化的严重性。在一个实施方案中，描述一种通过施用如本文所述的经修饰FGF-1来使暴露于化学物质或糜烂剂的患者的眼表面上皮再生的方法。在一些实施方案中，方法促进角膜的再生，预防角膜的变性，并且预防化学损伤的长期后遗症。在一些实例中，方法包括治疗角膜内皮损伤、角膜上皮损伤或角膜基质损伤。在其中方法治疗角膜内皮损伤的情况下，施用如本文所述的经修饰FGF-1会使角膜内皮细胞的功能增强，并且预防角膜的长期变性。在其中方法治疗角膜内皮损伤的一些情况下，施用如本文所述的经修饰FGF-1会预防角膜水肿和继发性前部角膜病变。在其中方法治疗角膜内皮损伤的一些情况下，施用如本文所述的经修饰FGF-1会预防角膜内皮细胞的丧失。在一些实施方案中，方法导致减轻角膜上皮脱离的严重性。在一些实施方案中，方法包括治疗基质损伤，诸如基质结疤和角膜混浊。
在一些实施方案中，眼部病状包括角膜的意外创伤或化学损伤或热损伤。在一些实例中，化学损伤或热损伤是化学灼伤。在一些实例中，化学损伤或热损伤由糜烂剂引起。在一些实例中，化学损伤或热损伤由化学战剂引起。
众多家居化合物和与职业有关的化合物具有诱发对眼和皮肤的化学灼伤的潜力。在不迅速干预的情况下，可能出现不可逆视力丧失和毁容。在不放热的情况下快速中和酸试剂与碱试剂两者并且限制扩散的试剂预期会有效治疗化学损伤。示例性化学损伤包括但不限于碱损伤、酸损伤。化学灼伤的常见来源包括硫酸(H2SO4)、盐酸(HCl)、氢氧化钠(NaOH)、石灰(CaO)、硝酸银(AgNO3)、过氧化氢(H2O2)、氯气和任何强氧化剂。
可导致本文所述的化学损伤或热损伤的示例性化学战剂是作为刺痒剂或荨麻剂的光气。光气是一种在室温和标准压力下具有高度毒性的无色气体，在0℃下凝结成发烟液体。它的分子式是COCl2。通过急性(短期)吸入而暴露于光气即具有极高毒性。已报道在人中的重度呼吸影响，包括肺水肿、肺气肿和死亡。重度眼部刺激和真皮灼伤可在眼或皮肤暴露之后发生。慢性(长期)吸入暴露于光气也可导致不可逆肺变化，诸如气肿和纤维化。由于它的快速穿透以及能够导致即时重度皮肤损伤，因此它的暴露可导致广泛和毁灭性影响，包括高致死性。来自新近研究的结果显示在小鼠模型中，外部皮肤暴露于光气蒸汽会在暴露之后数分钟内直至暴露后8小时导致暴露皮肤发白，伴有红斑环、坏死、水肿、轻度荨麻疹和红斑。这些临床皮肤表现形式伴有皮肤厚度增加、凋亡性细胞死亡、肥大细胞脱粒、指示嗜中性粒细胞浸润的髓过氧化物酶活性、p53磷酸化和积累，以及COX-2和TNFα水平增加。外部光气暴露还导致外周血管扩张，伴有肝、脾、肾、肺和心脏组织的血管中的RBC大大增加。预期这些事件可导致血压下降，从而导致休克、缺氧和死亡。参见Tewari-Singh N,GoswamiDG,Kant R,Croutch CR,Casillas RP,Orlicky DJ,Agarwal R,Cutaneous exposure tovesicant phosgene oxime:Acute effects on the skin and systemic toxicity,Toxicol Appl Pharmacol.2017年2月15日；317:25-32。
在一些实施方案中，经修饰FGF-1多肽可用于治疗、预防或改善由糜烂剂暴露引起的各种皮肤损伤的方法。
糜烂剂或起疱剂是产生皮肤损伤的毒性化合物，所述皮肤损伤类似于由灼伤引起的那些皮肤损伤。在吸入时，这些试剂影响上呼吸道以及肺，从而产生肺水肿。参见例如Ganesan,K.,S.K.Raza和R.Vijayaraghavan(2010)Chemical Warfare Agents,Journal ofPharmacy and Bioallied Sciences 2.3:166–178。这些试剂也可导致重度眼损伤。存在两种形式的糜烂剂：芥剂和砷剂。这类的化学战剂中最重要的物质是硫芥。其他成员包括氮芥(HN1、HN2和HN3)以及砷糜烂剂诸如路易氏剂(L1、L2和L3)、乙基二氯胂、甲基二氯胂、苯基二氯胂。图12显示糜烂剂的一些实例结构。糜烂剂的特定实例包括但不限于硫芥(SM)，即双-(2-氯乙基)硫醚；氯乙基乙基硫醚(CEES)、路易氏剂，以及作为氮芥(NM)家族的成员的2-氯-N-(2-氯乙基)-N-甲基乙胺盐酸盐。如本公开内容整篇所用，术语糜烂剂、致糜烂试剂或化学物质、糜烂性试剂等用于意指如本文明确列举的糜烂剂以及其他化合物，诸如毒素和/或化学战剂。硫芥自从在WWI中使用以来就是具有最高军事重要性的糜烂剂。氮芥于1930年代合成，但未大量生产用于战争。二氯甲基二乙胺(HN2，二氯甲二乙胺)已作为癌症化学治疗剂而得以更和平的应用，并且已经是用于这个目的的标准化合物许多年。路易氏剂(L)由于具有不燃性质以及类似于芥剂的毒性，因此于1918年被合成用于军事目的，但可能从未在战场上使用。芥剂具有类放射性，并且对分裂细胞极具毒性。芥剂具有亲脂性，并且易于穿透皮肤、大多数织物和橡胶。在穿过细胞膜之后，硫芥被转化成高度反应性硫鎓离子。它不可逆地使DNA、RNA和蛋白质烷基化，从而导致细胞死亡；最重要的靶标是DNA。芥剂使DNA的嘌呤碱基烷基化，并且对它们进行损害。路易氏剂更快被皮肤吸收，并且它在受影响器官中导致立刻的疼痛和刺激并产生更加全身性的症状。它直接结合硫氢基基团并使其失活。
长久以来已知的是在化学战争中使用硫芥(SM)以及其他糜烂性试剂。更新近地，在2015年8月，硫芥被ISIS用于攻击在伊拉克的库尔德武装以及攻击叙利亚。芥剂会使眼、皮肤和肺受损，其中眼是最敏感的。因为症状直至暴露之后2至4小时才显现，所以经暴露的人士不会立刻知道他们暴露于芥剂。这个延迟已促进当暴露症状最终显现时的混乱和惊恐。对于眼，这些症状由眼睑痉挛、流泪、刺激、疼痛和畏光组成。由经眼暴露于硫芥(SM)蒸汽所致的角膜损伤是最普遍的化学战争损伤。经眼暴露展现三种不同的剂量依赖性临床轨迹：完全损伤消退、立刻转变成慢性损伤或明显恢复之后后续显现出持久性眼部表现形式。后两种轨迹包括一系列角膜症状，总称为芥子气角膜病变(MGK)。在急性损伤期间的组织特异性损害可使角膜内皮和缘干细胞的再生能力减弱，由此使角膜易经受慢性或延迟形式的MGK。
对于一些患者，MGK在暴露之后数周发生；在其他患者中，它花费数年才显现。这个角膜病变的特征在于角膜结膜化和缘干细胞缺乏。已显示，在人角膜内皮中，由CEC丧失造成的间隙通常通过近端CEC扩散而得以填充。这些形态变化弥补内皮丧失，直至角膜与房水之间的屏障无法再维持，从而导致持久性角膜水肿和继发性前部角膜病变。因为成人CEC不在体内增殖，因此，CEC的任何丧失都潜在代表内皮能力的永久降低。因此，尽管内皮功能可在轻度损伤之后通过CEC扩散而恢复，但更重度损伤可超出人内皮的修复能力。兔不同于人，它们可经受有限CEC增殖，从而使它们从CEC丧失中恢复的能力得到提高。然而，与人一样，对兔内皮的足够重度的损伤也会导致不可逆角膜代偿失调和继发性角膜病变。
基于以上研究，已假设糜烂剂诱发的内皮失效可为MGK发病机理下的原因性机理。这个假设与已在人和兔中观察到的在SM与MGK显现之间的剂量依赖性以及已在人伤亡中报道的不同临床轨迹(消退型慢性MGK和延迟发作MGK)一致。根据这个假设，角膜暴露于低剂量的糜烂剂可导致急性上皮病变，伴有最小内皮毒性，并且角膜会恢复而无长期并发症。或者，暴露于导致对角膜内皮的不可挽回损伤的剂量的糜烂剂可导致内皮屏障失效，从而产生持久水肿，伴有继发性前部角膜病变。在重度损伤之后，在急性损伤与MGK发作之间可不存在明显延迟。
因此，用于最小化或预防归因于硫芥以及以类似方式起作用的化学毒剂特别是化学战剂的损伤的组合物和方法对于为美国国防部(U.S.Department of Defense)工作的科学家来说是重要事务。新近研究已显示，作为糜烂性试剂，芥剂化合物导致上皮–基质连接的丧失。在角膜中，形成微疱，并且一旦累积足够微疱，角膜上皮就不能紧紧固定于基底膜，从而导致上皮组织脱落。因此，期望针对SM的有效暴露后疗法增强角膜上皮保持连接于基质的能力。在不受理论束缚下，预期角膜上皮保持连接于基质的能力可能允许一些基底上皮有机会原位恢复，从而维持它们与它们的基底膜和基质的连接。还已经假设，在上皮–基质完整性方面的一个关键参与者是作为半桥粒的跨膜组分的胶原XVII(即BP180)。在损伤之后，由ADAM(“解整合素和金属蛋白酶(A Disintegrin And Metalloproteinase)”)家族的蛋白质(包括ADAM9、ADAM10和/或ADAM17)对胶原XVII的切割使上皮细胞从它们的基底膜释放，并且这个切割允许它们进行迁移。
ADAM17，也称为TNF-a转化酶或TACE，是对损伤的一般性应答以及是用于释放胶原XVII的“脱落酶”。假定由糜烂剂暴露诱发的角膜微疱化部分地归因于能够切割胶原XVII的ADAM17的活化。实验数据确认在暴露于糜烂剂NM的角膜的基底膜区域处，ADAM17表达受到诱导。因此，预期能够抑制暴露后ADAM17表达上调的药剂适用于减弱由糜烂剂引起的角膜损伤。
本公开内容提供治疗对诸如SM和NM等糜烂剂的暴露，降低所述暴露的不利作用，并以其他方式辅助治愈所述暴露的经修饰FGF-1多肽。本文公开的经修饰FGF-1多肽能够预防在暴露于糜烂剂诸如SM和/或NM之后ADAM17的过表达。
本公开内容还提供一种通过施用经修饰FGF-1多肽来治疗、预防对化学物质或糜烂剂诱发的损伤的暴露，降低所述暴露的不利作用，并以其他方式辅助治愈所述暴露的方法。在一些实施方案中，本文公开的方法进一步预防在暴露于糜烂剂诸如SM和/或NM之后ADAM17的过表达。
野生型FGF-1蛋白例如SEQ ID NO:1，具有易受氧化和烷基化的未配对半胱氨酸残基。参见图1。在本公开内容的其中经修饰FGF-1多肽不包含未配对半胱氨酸残基的一些实施方案中，所述经修饰FGF-1多肽较不易受到由糜烂剂造成的氧化和/或烷基化。实验数据也已指示，FGF-1及其mRNA的水平降低已知是由暴露于芥剂所致，并且据假设，这种丧失可在芥剂诱发的角膜病变的愈合缓慢中起作用。在本公开内容的一些实施方案中，不包含游离半胱氨酸残基并因此较不易受到或不受半胱氨酸修饰的经修饰FGF-1多肽有效加速角膜芥剂病变的愈合。
在本公开内容的一些实施方案中，方法包括施用不包含未配对半胱氨酸残基的经修饰FGF-1多肽，所述经修饰FGF-1多肽较不易受到由糜烂剂造成的氧化和/或烷基化。在本公开内容的一些实施方案中，方法包括施用不包含游离半胱氨酸残基并因此较不易受到或不受半胱氨酸修饰的经修饰FGF-1多肽。在一些实施方案中，本文公开的方法有效加速与MGK相关的角膜病变的愈合。
暴露于糜烂剂诸如硫芥(SM)和氮芥(NM)可导致重度皮肤损伤，伴有延迟起疱。根据它们的暴露剂量和时间，水肿和红斑可潜在发展成疱、溃疡、坏死、剥离和色素沉着变化，其持续存在暴露之后的数周乃至数年。参见例如Tewari-Singh N,Agarwal R,Mustardvesicating agent-induced toxicity in the skin tissue and silibinin as apotential countermeasure,Ann N Y Acad Sci.2016年6月；1374(1):184-92。另一示例性糜烂剂光气肟(CX)作为刺痒剂或荨麻剂也是一种潜在化学战争和恐怖分子武器。
在一些实施方案中，待治疗的眼部疾病、病症或病状是角膜基质的疾病、病症或病状。角膜基质的疾病、病症或病状包括但不限于圆锥形角膜、格子状角膜营养不良、颗粒状角膜营养不良、斑块状角膜营养不良、施奈德结晶状角膜营养不良、先天性基质角膜营养不良、斑点状角膜营养不良、创伤或化学损伤或热损伤或继发于感染诸如沙眼的损伤。
在其他实施方案中，本文所述的经修饰FGF-1多肽可在涉及对角膜(例如角膜内皮结构)的破坏的角膜移植程序(例如角膜移植或涉及德塞梅氏膜(Descemet’s membrane)的程序)之前、期间或之后施加，在所述程序中，加速角膜或眼表面细胞的愈合和/或改进对伤害的细胞应答(例如通过使移植细胞的活力和/或长久性增加)将产生治疗益处。
在额外实施方案中，本文所述的经修饰FGF-1多肽可用于提高准备用于移植的角膜细胞或角膜祖细胞的活力和健康状况。添加至用于所捐献角膜或其他所捐献角膜组织的器官培养基中的经修饰FGF-1多肽会刺激角膜细胞，并且使角膜在移植之前可储存的时长增加，以及使角膜将具有足以适用于移植的健康细胞的概率增加。此外，经修饰FGF-1多肽可在培养角膜祖细胞时在培养基中使用以刺激那些细胞的生长。
其他实施方案涉及调节角膜内皮细胞中一种或多种成纤维细胞生长因子受体(FGFR)的活性的方法，所述方法包括使所述角膜内皮细胞与经修饰FGF(例如经修饰FGF-1，诸如包含序列SEQ ID NO:2的经修饰FGF-1)接触。所述方法可用于增加或刺激一种或多种FGFR的活性，这可导致细胞迁移和/或细胞增殖增加。
在额外实施方案中描述通过施用根据本公开内容的经修饰FGF-1多肽来治疗代谢疾病的方法。可用所公开经修饰FGF-1多肽治疗的示例性代谢疾病包括但不限于：(1)葡萄糖利用病症和与其相关的后遗症，包括糖尿病(I型和2型)、妊娠性糖尿病、高血糖症、胰岛素抗性、葡萄糖代谢异常、“糖尿病前期”(空腹血糖受损(IFG)或糖耐量受损(IGT))以及与高血糖病状相关或由高血糖病状所致的其他生理病症，包括例如组织病理学变化，诸如胰腺β细胞破坏；(2)血脂异常及其后遗症，诸如动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、脑血管病症等；(3)可与代谢综合征相关的其他病状，诸如肥胖症和身体质量升高(包括其合并症，诸如但不限于非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和多囊卵巢综合征(PCOS))，并且还包括血栓形成、高凝状态和血栓前状态(动脉和静脉)、高血压、心血管疾病、中风和心脏衰竭；(4)其中涉及炎症性反应的病症或病状，包括动脉粥样硬化、慢性炎症性肠病(例如克罗恩氏病(Crohn's disease)和溃疡性结肠炎)、哮喘、红斑狼疮、关节炎或其他炎症性风湿性病症；(5)细胞周期或细胞分化过程的病症，诸如脂肪细胞肿瘤、脂瘤性癌，包括例如脂肉瘤、实体瘤和赘生物；(6)中枢和外周神经系统的神经变性疾病和/或脱髓鞘性病症，和/或涉及神经炎症性过程的神经疾病，和/或其他外周神经病变，包括阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、多发性硬化症、帕金森氏病(Parkinson's disease)、进行性多灶性脑白质病和吉兰-巴雷综合征(Guillian-Barre syndrome)；(7)皮肤和皮肤学病症和/或伤口愈合过程的病症，包括红斑-鳞状皮肤病；以及(8)其他病症诸如综合征X、骨关节炎和急性呼吸窘迫综合征。还描述通过施用治疗有效量的所公开经修饰FGF-1多肽(或编码所述经修饰FGF-1多肽的核酸分子)来使餐后和空腹血糖降低，使胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性改进，使全身性慢性炎症减轻，使哺乳动物的肝脂肪变性改善，使食物摄取减少，或达成其组合的方法。
在一些实施方案中，施用经修饰FGF-1多肽以达成伤口愈合。伤口的实例包括但不限于擦伤、撕裂、开放性气胸(blowing wound)(例如开放性气胸(open pneumothorax))、灼烧伤口、挫伤、枪伤、切割伤口、开放性伤口、穿透性伤口、穿孔性伤口、穿刺伤口、串线伤口、刺戳伤口、手术伤口、皮下伤口、糖尿病性病变或切线伤口。可通过本文所述的化合物和组合物来治疗的伤口的额外实例包括急性病状或伤口，诸如热灼伤、化学灼伤、辐射灼伤、由过度暴露于紫外线辐射引起的灼伤(例如晒伤)；对身体组织的损害，诸如由于劳动和分娩而对会阴部的损害；在医学程序诸如外阴切开术期间遭受的损伤；创伤诱发的损伤，包括切口、割口、表皮脱落；由于意外而遭受的损伤；手术后损伤以及慢性病状，诸如压疮、褥疮、与糖尿病和不良循环相关的病状，以及所有类型的粉刺。此外，伤口可包括皮炎，诸如脓疱病、擦烂、毛囊炎和湿疹；在牙科手术之后的伤口；牙周疾病；在创伤之后的伤口；以及肿瘤相关伤口。伤口的其他实例包括动物咬伤、动脉疾病、昆虫叮伤和咬伤、骨感染、受损害的皮肤/肌肉移植物、坏疽、皮肤撕破或撕裂、皮肤老化、手术割口(包括缓慢愈合性或非愈合性手术伤口)、脑内出血、动脉瘤、皮肤薄弱以及手术后感染。
本发明的治疗性肽也可用于治疗由不限于以下各项引起的外部伤口：刮伤、切口、撕裂伤口、咬伤伤口、子弹伤口、刺戳伤口、灼烧伤口、晒伤、化学灼伤、手术伤口、褥疮、辐射损伤、所有种类的急性和慢性伤口、由美容皮肤程序产生的伤口或病变。肽也可用于改善皮肤老化的影响。肽可加速外部伤口中的伤口愈合和/或改进受伤区域或经受老化和疾病的皮肤的美容外观。肽可用于治疗由不限于以下各项引起的内部损伤：疾病、手术、枪击、刺戳、意外、梗塞、局部缺血性损伤，所述内部损伤针对器官和组织，包括但不限于心脏、骨、脑、脊髓、视网膜、外周神经以及通常经受急性和慢性损伤、疾病、先天性和发育性畸形和老化过程的其他组织和器官。
在一些实施方案中，施用经修饰FGF-1多肽以治疗灼烧损伤。示例性灼烧伤口包括但不限于“灼伤溃疡”，包括例如由于灼烧损伤而发生的溃疡，所述灼烧损伤包括第一度灼伤(即皮肤的浅表区域变红)；第二度灼伤(损伤部位起疱，可在疱液移除之后自发愈合)；第三度灼伤(灼伤贯穿整个皮肤，并且伤口愈合通常需要手术干预)；烫伤(可由于滚烫热水、油脂或散热器流体而发生)；热灼伤(可由于火焰而发生，通常是深度灼伤)；化学灼伤(可来自酸和碱，通常是深度灼伤)；电灼伤(在住宅周围的低电压或在工作中的高电压)；爆炸喷溅(通常是浅表损伤)；以及接触灼伤(通常是深度的，并且可由于消声器尾管、热熨斗和火炉而发生)。如本文所用，延迟愈合或难以愈合的伤口可包括例如特征至少部分在于以下各项的伤口：1)炎症性阶段延长，2)细胞外基质(ECM)形成缓慢，和3)上皮化速率降低。已显示，生长因子例如FGF-1在神经再生和神经愈合方面起重要作用。已提议将FGF-1用于在脊髓损伤或创伤诸如臂丛损伤、神经免疫学病症诸如急性或特发性横贯性脊髓炎(TM)、或其中需要对神经元或神经组织进行再生和/或保护的任何其他疾病或病状之后使神经系统组织再生，因为据信FGF-1会刺激神经增殖和生长，并且可具有神经保护性。参见例如Cheng,H.等人,“Spinal Cord Repair with Acidic Fibroblast Growth Factor as aTreatment for a Patient with Chronic Paraplegia,”SPINE 29(14):E284-E288(2004)；以及Lin,P-H.,“Functional recovery of chronic complete idiopathictransverse myelitis after administration of neurotrophic factors,”Spinal Cord44:254-257(2006)。已知的是FGF-1在脊髓损伤和轴突再生的模型中具有神经营养性活性，促进轴突生长，并且发挥有益作用。因此，在一些实施方案中，本公开内容的经修饰FGF-1多肽促进神经再生，并且可用于治疗受益于神经再生的病状的方法中。在一些实例方法中，神经病状是肌萎缩性侧索硬化(ALS)。在一些实例方法中，神经病状是急性或特发性横贯性脊髓炎(TM)。在某些情况下，经修饰FGF-1多肽可与其他生长因子以及其他药物活性组分组合施用以治疗受益于神经再生的病状。
药物组合物、施用方法和给药
可使用一种或多种有助于将活性化合物加工成可在药学上使用的制剂的生理上可接受的载体(包括赋形剂和助剂)，以常规方式配制包含如本文所述的经修饰FGF多肽的药物组合物。适当制剂取决于所选施用途径。关于适于本文所述的药物组合物的赋形剂的额外细节可例如见于以下中：Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第19版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；Liberman,H.A.和Lachman,L.编,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,NewYork,N.Y.,1980；以及Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第7版(Lippincott Williams&Wilkins1999)，其由于所述公开内容而以引用的方式并入本文。
如本文所用的药物组合物是指经修饰FGF与其他化学组分诸如载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、混悬剂、增稠剂和/或赋形剂，以及任选的其他治疗性和/或预防性成分的混合物。药物组合物有助于向生物体施用经修饰FGF。在实施本文提供的治疗或使用方法时，以药物组合物形式向患有待治疗的眼部疾病、病症或病状的哺乳动物施用治疗有效量的本文所述的经修饰FGF-1多肽。在一些实施方案中，哺乳动物是人。治疗有效量可视疾病的严重性、受试者的年龄和相对健康状况、所用化合物的效能以及其他因素而广泛变化。药学上可接受或适合的组合物包括眼科适合或可接受的组合物。
药物组合物(例如用于通过注射来递送或用于以滴眼剂形式施加)可呈液体或固体形式。液体药物组合物可包含例如以下中的一者或多者：无菌稀释剂诸如注射用水、盐水溶液(优选生理盐水)、林格氏溶液(Ringer's solution)、等张氯化钠、可充当溶剂或混悬介质的固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂；抗细菌剂；抗氧化剂；螯合剂；用于调整张力的缓冲剂和试剂诸如氯化钠或右旋糖。胃肠外制剂可封闭在由玻璃或塑料制造的安瓿、一次性注射器或多次剂量小瓶中。生理盐水通常用作赋形剂，并且可注射药物组合物或经眼递送的组合物(例如呈滴眼剂形式)优选是无菌的。
本文所述的经修饰FGF多肽或药物组合物可通过任何适合手段来递送至受试者中，包括例如外部、眼内、前房内、口服、胃肠外、静脉内、腹膜内、鼻内(或对例如鼻、喉和支气管的粘膜的其他递送方法)，或通过向眼部局部施用，或通过眼内或眼周装置。局部施用的模式可包括例如外部施加、滴眼剂、眼内注射或眼周注射。眼周注射通常涉及将化合物注射在结膜下或注射至特农氏间隙(Tennon's space)(在覆盖眼的纤维组织下方)中。眼内注射通常涉及将经修饰FGF或药物组合物注射至玻璃体中。在某些实施方案中，施用是非侵入式的，诸如通过外部施加或滴眼剂。在一些实施方案中，施用通过外部方法与前房内方法的组合来达成。
本文所述的经修饰FGF或药物组合物可使用药学上可接受(适合)的载体或媒介物以及本领域中常规使用的技术来配制以进行施用。药学上可接受或适合的载体包括眼科适合或可接受的载体。载体根据特定经修饰FGF的溶解性来选择。适合眼科组合物和制剂包括可诸如通过滴眼剂、注射等来向眼部局部施用的那些。在滴眼剂的情况下，制剂也可任选包括例如眼科相容的试剂，诸如等张剂，诸如氯化钠、浓缩甘油等；缓冲剂，诸如磷酸钠、乙酸钠等；表面活性剂，诸如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(也被称为聚山梨醇酯80)、硬脂酸聚羟氧40酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油等；稳定剂，诸如柠檬酸钠、依地酸钠(sodium edentate)等；防腐剂，诸如苯扎氯铵、对羟基苯甲酸酯等；以及其他成分。防腐剂可例如在约0.001至约1.0％重量/体积的水平下采用。制剂的pH通常在可为眼科制剂所接受的范围内，诸如在约pH 4至8的范围内。
对于注射，经修饰FGF或药物组合物可以以可注射脂质体溶液、缓慢释放聚合物体系等形式提供于注射级盐水溶液中。眼内和眼周注射为本领域技术人员所知，并且描述于包括例如Spaeth编,Ophthalmic Surgery:Principles of Practice,W.B.Sanders Co.,Philadelphia,Pa.,85-87,1990的众多出版物中。
在一些实施方案中，经修饰FGF或药物组合物(例如眼用制剂)通过微针向角膜中施用(Jiang等人(2007).Invest Ophthalmol Vis Sci48(9):4038-4043)。将微针阵列用经修饰FGF或药物组合物涂覆，并且相对于角膜加以按压以使微针穿透至角膜基质中，但不穿透整个角膜。接着将微针移除，并且经修饰FGF或药物组合物留在角膜基质中。这种经修饰FGF或药物组合物可刺激角膜细胞进行增殖和迁移，并且抑制基质细胞通常具有的结疤应答。
对于包含至少一种本文所述的经修饰FGF-1多肽的组合物通过粘膜途径的递送，包括向鼻部通道、喉和气道中的递送，组合物可以以气雾剂形式递送。化合物可呈用于粘膜内递送的液体或粉末形式。举例来说，组合物可通过具有适合推进剂诸如烃推进剂(例如丙烷、丁烷、异丁烯)的加压气雾剂容器来递送。组合物可通过非加压递送系统诸如喷雾器或雾化器来递送。
适合的口服剂型包括例如片剂、丸剂、小袋剂或由硬质或软质明胶、甲基纤维素或易溶解于消化道中的另外适合物质制得的胶囊。可使用适合的无毒固体载体，包括例如药品级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。(参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(Gennaro,第21版MackPub.Co.,Easton,PA(2005)))。
可配制本文所述的经修饰FGF-1多肽或药物组合物以达成持续或缓慢释放。所述组合物可通常使用熟知技术来制备，并且通过例如眼周、眼内、经直肠、口服或皮下植入，或通过在期望靶标部位处植入，或通过外部施加来施用。持续释放制剂可含有分散于载体基质中和/或包含于由速率控制膜包围的储器内的药剂。供在所述制剂内使用的赋形剂是生物相容性的，并且也可为生物可降解的；优选地，制剂提供相对恒定水平的活性组分释放。包含在持续释放制剂内的活性化合物的量取决于植入部位、释放的速率和预期持续时间，以及待治疗或预防的病状的性质。
通过眼部途径施用的药物或组合物的全身性药物吸收为本领域技术人员所知(参见例如Lee等人,Int.J.Pharm.233:1-18(2002))。在一个实施方案中，本文所述的化合物通过外部眼递送方法来递送(参见例如Curr.Drug Metab.4:213-22(2003))。组合物可呈滴眼剂、油膏剂或软膏剂等形式，诸如水性滴眼剂、水性眼用混悬液、非水性滴眼剂以及非水性眼用混悬液、凝胶剂、眼用软膏剂等。对于制备凝胶剂，可使用例如羧基乙烯基聚合物、甲基纤维素、海藻酸钠、羟丙基纤维素、乙烯马来酸酐聚合物等。
在另一实施方案中，经修饰FGF溶液或药物组合物(例如眼用制剂)含有透明质酸、羧甲基纤维素或提供增加的眼部耐受性、粘度和重量摩尔渗透浓度的其他多糖以产生舒适眼用溶液。
经修饰FGF或包含至少一种本文所述的经修饰FGF-1多肽的药物组合物的剂量可视患者(例如人)的状况而不同，所述状况也就是眼部疾病、病症或病状的阶段、总体健康情形、年龄以及医学领域技术人员将会用来确定剂量的其他因素。当组合物以滴眼剂形式使用时，例如可每日约1至约6次施加每单位剂量一滴至数滴，优选是1或2滴(每1滴约50μl)。
药物组合物可以如由医学领域技术人员确定的适合于待治疗(或预防)的疾病、病症或病状的方式施用。适当的剂量以及适合的施用持续时间和频率将由诸如患者的状况、患者的疾病、病症或病状的类型和严重性、活性成分的特定形式和施用方法等因素决定。一般来说，适当的剂量和治疗方案以足以提供治疗和/或预防益处(例如改进的临床效果，诸如更频繁的完全或部分缓解，或更久无疾病，或症状严重性减轻)的量提供组合物。对于预防性使用，剂量应足以预防眼部疾病、病症或病状，延迟眼部疾病、病症或病状的发作，或降低眼部疾病、病症或病状的严重性。最优剂量可通常使用实验模型和/或临床试验来确定。最优剂量可取决于患者的身体质量、重量或血容量。
在各种实施方案中，本公开内容的经修饰FGF-1多肽可历经一段时期以每日剂量形式向受试者施用。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰FGF-1多肽可慢性或长期施用。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰FGF-1多肽可持续数天、数周、数月、数年的时期加以施用，或历经受试者的终生持续治疗。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰FGF-1多肽可持续约7天、15天、约21天、约30天、约3个月、约6个月、约12个月、约18个月、约2年、约5年、约7年、约10年、约15年、约20年、约25年、约30年、约35年或约40年的时期加以施用。在一些实施方案中，可根据各种因素来确定用于个别受试者的治疗方案。在一些实例中，治疗方案取决于对导致化学损伤或热损伤的化合物诸如糜烂性化合物的暴露水平。在一些实施方案中，治疗方案针对急性暴露是持续约2周，而针对长期暴露是持续数月至1年。在一些实施方案中，治疗方案是慢性的。在一些实例中，因素可包括但不限于对角膜组织的变性程度响应于本公开内容的经修饰FGF-1多肽的施用的变化的确定。在一些实例中，因素可包括但不限于MGK后遗症响应于本公开内容的经修饰FGF-1多肽的施用的改善。在一些实例中，因素可包括但不限于角膜内皮病变响应于本公开内容的经修饰FGF-1多肽的施用的愈合。在一些实例中，因素可包括但不限于响应于本公开内容的经修饰FGF-1多肽的施用的角膜上皮细胞增殖。在一些实例中，因素可包括但不限于与富克氏营养不良相关的症状响应于本公开内容的经修饰FGF-1多肽的施用的减轻。在各实施方案中，相比于在稍后时间或在若干次剂量之后展现对组合物的响应的受试者，展现对组合物的立刻响应例如与富克氏营养不良相关的症状立刻减轻的受试者可需要更低频率的剂量。
可根据受试者的临床情形、状况和年龄、剂型等来适合地选择经修饰FGF-1多肽或药物组合物的剂量。在滴眼剂的情况下，本文所述的经修饰FGF可例如以约10ug/ml至约100mg/ml的经修饰FGF施用，每周一次至七次。
还提供制造本文所述的经修饰FGF-1多肽和药物组合物的方法。包含药学上可接受的赋形剂或载体以及至少一种本文所述的经修饰FGF-1多肽的组合物可通过以下步骤制备：根据任一本文所述或本领域中实施的方法合成经修饰FGF，接着将化合物与药学上可接受的载体一起配制。对组合物的配制必须是适当的，并且取决于若干因素，包括但不限于化合物的递送途径、剂量和稳定性。
至少一种本文所述的经修饰FGF可向人或其他非人脊椎动物施用。在某些实施方案中，经修饰FGF是大致上纯净的，因为它含有小于约5％，或小于约1％，或小于约0.1％的其他有机小分子，诸如例如在合成方法的一个或多个步骤中产生的污染性中间体或副产物。在其他实施方案中，可施用一种或多种本文所述的经修饰FGF-1多肽的组合。
可施用本文所述的组合物以达成预防性和/或治疗性治疗。在治疗性应用中，以足以治愈或至少部分遏止疾病或病状的症状的量向已罹患所述疾病或病状的患者施用组合物。有效达成这个用途的量将取决于疾病或病状的严重性和过程；先前疗法；患者的健康情形、重量和对药物的响应；以及治疗医师的判断。
在预防性应用中，向易患特定疾病、病症或病状或以其他方式处于特定疾病、病症或病状的风险下的患者施用本文所述的组合物。这种量被定义为“预防有效量或剂量”。在这个用途中，精确量也取决于患者的健康状态、重量等。
在其中患者的状况未改进的情况下，在医生的判断后，组合物的施用可被慢性施用，也就是说，持续延长的时期，包括在患者的生命的整个持续时间中，以改善或以其他方式控制或限制患者的疾病或病状的症状。
在其中患者的情形改进的情况下，在医生的判断后，组合物的施用可被连续给与；或者，可临时降低或临时中断所施用药物的剂量持续某一时长(即“休药期”)。
一旦患者的状况已发生改进，则在必要时施用维持剂量。随后，可随症状变化来使施用剂量或施用频率或两者降低至改进的疾病、病症或病状得以维持的水平。然而，在症状的任何复发后，患者可需要以长期方式进行间歇治疗。
所需剂量可宜以单次剂量形式或以分次剂量形式呈现，所述分次剂量同时施用(或历经短暂时期)或以适当的间隔施用，例如以每天两次、三次、四次或更多次亚剂量的形式。
本文所述的药物组合物可呈适于单次施用精确剂量的单位剂型。在单位剂型的情况下，制剂被分成含有适量的一种或多种经修饰FGF-1多肽的单位剂量。单位剂量可呈含有独立量的制剂的包装形式。非限制性实例是包装片剂或胶囊以及在小瓶或安瓿中的粉剂。可将水性混悬液组合物包装在单次剂量非可再闭合容器中。或者，可使用多次剂量可再闭合容器，在所述情况下，典型的是在组合物中包含防腐剂。仅举例来说，用于胃肠外注射的制剂可以以单位剂型呈现，所述单位剂型包括但不限于安瓿剂，或添加有防腐剂的多次剂量容器。
可通过标准药物程序在细胞培养物或实验动物中确定所述治疗方案的毒性和治疗功效，包括但不限于确定LD50(对群体的50％具有致死性的剂量)和ED50(在群体的50％中具有治疗有效性的剂量)。毒性作用与治疗作用之间的剂量比率是治疗指数，并且它可表示为LD50与ED50之间的比率。展现高治疗指数的化合物是优选的。由细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于阐明用于人的剂量范围。所述化合物的剂量优选处于包括具有最小毒性的ED50的循环浓度的范围内。根据所采用的剂型和利用的施用途径，剂量可在这个范围内变化。
组合治疗
经修饰FGF-1多肽和药物组合物也可与由于它们对待治疗的病状的治疗价值而选择的其他治疗剂组合使用。经修饰FGF-1多肽和药物组合物也可与由于它们对治疗糜烂性损伤的治疗价值而选择的其他治疗剂组合使用。所述药剂不必于同一药物组合物中施用，并且可由于不同物理和化学特征而必须通过不同途径来施用。确定施用模式以及当可能时于同一药物组合物中施用的合理性完全在临床医师的知识范围内。初始施用可根据本领域中认可的确定方案进行，接着，基于观察到的效果，可由临床医师修改剂量、施用模式和施用次数。
对所用这些任选额外药剂的特定选择将取决于主治医师的诊断和其对患者状况的判断以及适当治疗方案。根据疾病、病症或病状的性质、患者的状况，以及对所用药剂的实际选择，可并行(例如同时、基本上同时或在同一治疗方案内)或依序施用药剂。在评估所治疗的疾病和患者的状况之后，确定施用顺序以及在治疗方案期间施用各治疗剂的重复次数完全在医师的知识范围内。
构成本文公开的组合疗法的药物制剂可为组合剂型或呈意图用于大致上同时施用的单独剂型。构成组合疗法的药物制剂也可依序施用，其中任一治疗性化合物均通过需要两步施用的方案来施用。两步施用方案可需要依序施用活性剂，或间隔开施用单独的活性剂。根据各药物制剂的性质，诸如药物制剂的效能、溶解性、生物利用率、血浆半衰期和动力学概况，多个施用步骤之间的时期可在数分钟至数小时的范围内。靶标分子浓度的昼夜节律变化也可决定最优剂量间隔。
当药物用于治疗组合中时，治疗有效剂量可变化。用于以实验方式确定用于组合治疗方案的药物和其他药剂的治疗有效剂量的方法描述于文献中。举例来说，文献中已广泛描述使用节拍式给药，即提供更频繁的较低剂量以使毒性副作用最小化。组合治疗进一步包括在不同时间开始和停止以辅助对患者的临床管理的周期性治疗。
举例来说，可将经修饰物并入含有其他活性成分的制剂中，所述活性成分诸如类固醇、抗生素、消炎剂、细胞因子诸如IL-1或IL-1的类似物，或细胞因子的拮抗剂诸如IL-17的抑制剂。
其他示例性细胞因子包括但不限于白介素(例如IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-1α、IL-1β和IL-1RA)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、制瘤素M、红细胞生成素、白血病抑制因子(LIF)、干扰素、B7.1(也称为CD80)、B7.2(也称为B70、CD86)、TNF家族成员(TNF-α、TNF-β、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail)和迁移抑制因子MIF。
在一些实施方案中，本文所述的组合或药物组合物在免疫抑制疗法中施用以降低、抑制或预防免疫系统的活性。免疫抑制疗法在临床上用于：预防对移植器官和组织的排斥；治疗自体免疫疾病或最可能具有自体免疫来源的疾病；以及治疗一些其他非自体免疫炎症性疾病。
在一些实施方案中，本文所述的经修饰FGF-1多肽和药物组合物与一种或多种消炎剂一起施用，所述消炎剂包括但不限于非类固醇消炎药(NSAID)和皮质类固醇(糖皮质素)。
NSAID包括但不限于：阿司匹林、水杨酸、龙胆酸、水杨酸胆碱镁、水杨酸胆碱、水杨酸胆碱镁、水杨酸胆碱、水杨酸镁、水杨酸钠、二氟尼柳、卡洛芬、非诺洛芬、非诺洛芬钙、氟比洛芬、布洛芬、酮洛芬、萘丁酮(nabutone)、酮咯酸、酮咯酸氨丁三醇、萘普生、奥沙普秦、双氯芬酸、依托度酸、吲哚美辛、舒林酸、托美丁、甲氯灭酸盐、甲氯灭酸钠、甲灭酸、吡罗昔康、美洛昔康和COX-2特异性抑制剂(诸如但不限于塞来昔布、罗非昔布、伐地昔布、帕瑞昔布、依托昔布、罗美昔布、CS-502、JTE-522、L-745,337和NS398)。
皮质类固醇包括但不限于：倍他米松、泼尼松、阿氯米松、醛固酮、安西奈德、倍氯米松、倍他米松、布地奈德、环索奈德、氯倍他索、氯倍他松、氯可托龙、氯泼尼醇、可的松、可的伐唑、地夫可特、脱氧皮质酮、地索奈德、去羟米松、脱氧皮质酮、地塞米松、二氟拉松、二氟可龙、二氟泼尼酯、氟氯缩松、氟氢可的松、氟氢缩松、氟米松、氟尼缩松、氟轻松、醋酸氟轻松、氟可丁、氟考龙、氟米龙、氟培龙、氟泼尼定、氟替卡松、福莫可他、哈西缩松、卤米松、氢化可的松/皮质醇、醋丙氢化可的松、丁丙氢化可的松、丁酸氢化可的松、氯替泼诺、甲羟松、甲泼尼松、甲泼尼龙、醋丙甲泼尼龙、糠酸莫米松、帕拉米松、泼尼卡酯、泼尼松/泼尼松龙、利美索龙、替可的松、曲安西龙和乌倍他索。
用作消炎剂的其他药剂包括以引用的方式并入本文的美国专利公开2005/0227929中公开的那些。
一些可商购获得的消炎剂包括但不限于：
Figure BDA0002354729340000581
(双氯芬酸和迷索前列醇)、
Figure BDA0002354729340000582
(5-氨基水杨酸)、
Figure BDA0002354729340000583
(5-氨基水杨酸)、
Figure BDA0002354729340000584
(安替比林和苯佐卡因)、
Figure BDA0002354729340000585
(柳氮磺胺吡啶)、
Figure BDA0002354729340000586
(奥沙普秦)、
Figure BDA0002354729340000587
(依托度酸)、
Figure BDA0002354729340000588
(甲灭酸)、
Figure BDA0002354729340000589
(甲泼尼龙)、
Figure BDA00023547293400005810
(阿司匹林)、
Figure BDA00023547293400005811
(阿司匹林)、
Figure BDA00023547293400005812
(吲哚美辛)、
Figure BDA00023547293400005813
(罗非昔布)、
Figure BDA00023547293400005814
(塞来昔布)、
Figure BDA00023547293400005815
(伐地昔布)、
Figure BDA00023547293400005816
(依托昔布)、
Figure BDA00023547293400005817
(罗美昔布)、
Figure BDA00023547293400005818
Figure BDA0002354729340000591
(布洛芬)、
Figure BDA0002354729340000592
(双氯芬酸)、
Figure BDA0002354729340000593
(酮洛芬)、
Figure BDA0002354729340000594
(美洛昔康)、
Figure BDA0002354729340000595
(萘丁美酮)、
Figure BDA0002354729340000596
(萘普生)、
Figure BDA0002354729340000597
(吡罗昔康)。
在一个实施方案中，本文所述的组合物与白三烯受体拮抗剂一起施用，所述白三烯受体拮抗剂包括但不限于BAY u9773(参见EP00791576；1997年8月27日公开)、DUO-LT(Tsuji等人,Org.Biomol.Chem.,1,3139-3141,2003)、扎鲁司特
Figure BDA0002354729340000598
孟鲁司特
Figure BDA0002354729340000599
普鲁司特
Figure BDA00023547293400005910
及其衍生物或类似物。
在一些实施方案中，本文所述的经修饰FGF-1多肽和药物组合物与一种或多种Rho激酶抑制剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的经修饰FGF-1多肽和药物组合物与一种或多种额外生长因子一起施用，所述生长因子包括但不限于表皮生长因子(EGF)和神经生长因子(NGF)。参见例如Joyce等人(2009)Invest Ophthalmol.Vis Sci.50:2116–2122，血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子α和β(TGF-α和TFG-β)、血小板源性内皮生长因子(PD-ECGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、红细胞生成素、集落刺激因子(CSF)、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞/巨噬细胞CSF(GM-CSF)和一氧化氮合酶(NOS)。
试剂盒/制品
为用于本文所述的治疗性应用，本文还提供试剂盒和制品。所述试剂盒可包括托架、包装或容器，其被划分来容纳一个或多个诸如小瓶、管等的容器，各容器包含待用于本文所述的方法中的单独要素中的一者。适合容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。容器可由多种材料诸如玻璃或塑料形成。
本文提供的制品含有包装材料。用于包装药物产品的包装材料包括例如美国专利号5,323,907、5,052,558和5,033,252中的那些。药物包装材料的实例包括但不限于泡罩包装、瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器、瓶以及适于所选制剂和预定施用和治疗模式的任何包装材料。预期本文提供的经修饰FGF-1多肽和药物组合物的各种眼用制剂可作为针对将受益于本文所述的经修饰FGF或药物组合物的施用的任何眼部疾病、病症或病状的多种治疗方法。
举例来说，容器可包含经修饰FGF诸如具有序列SEQ ID NO:2的经修饰FGF-1。容器任选具有无菌入口。所述试剂盒任选包含化合物以及与它们在本文所述的方法中使用相关的标识性描述或标签或说明书。
试剂盒将通常可包含一个或多个额外的容器，各容器具有从商业和使用者立场来看合乎需要的用于使用本文所述的经修饰FGF的各种材料(诸如任选呈浓缩形式的试剂和/或装置)中的一者或多者。所述材料的非限制性实例包括但不限于缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器；列出内含物和/或使用说明书的托架、包装、容器、小瓶和/或管标签，以及具有使用说明书的包装插页。通常还将包括一套说明书。
标签可在容器上或与容器相伴。标签可在容器上，此时形成标签的字母、数字或其他符号被附着、模制或蚀刻至容器自身中；标签可与容器相伴，此时它存在于也容纳容器的贮器或托架内，例如呈包装插页形式。标签可用于指示内含物将用于特定治疗性应用。标签也可指示关于诸如在本文所述的方法中使用内含物的指导。
在某些实施方案中，经修饰FGF药物组合物可被呈现于可含有一个或多个含有本文提供的化合物的单位剂型的包装或分配器装置中。包装可例如含有金属或塑料箔，诸如泡罩包装。包装或分配器装置可伴有施用说明书。包装或分配器还可伴有与容器相伴的呈由管理药物的制造、使用或销售的政府机构指定的形式的告示，所述告示反映由所述机构对药物形式用于人或兽医学施用的核准。所述告示例如可为由美国食品与药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)对于处方药物核准的标签，或核准的产品插页。也可制备含有配制在相容性药物载体中的本文提供的经修饰FGF的组合物，将其放置在适当容器中，并且关于治疗指示的病状加以标记。
实施例
这些实施例仅出于说明目的而提供，并且不限制本文提供的权利要求的范围。可合成或可从商业来源获得本文所述的实施例中使用的起始物质和试剂。
实施例1：具有N末端甲硫氨酸(N-Met)的示例性经修饰FGF-1多肽与不具有N-Met的形 式具有类似活性
研究涉及包含序列SEQ ID NO:2(N-Met-TTHX1114)或SEQ ID NO:205(TTHX1001)的经修饰FGF-1多肽。经修饰FGF-1多肽使用如上在重组技术章节中所述的方法来产生。
实验方法和结果
在NIH-3T3细胞增殖测定中评估测试多肽的生物活性。结果指示在具有SEQ IDNO:2的经修饰FGF-1多肽与具有SEQ ID NO:205的经修饰FGF-1多肽之间，在诱导成纤维细胞的增殖的有效性方面无差异。
实施例2：经修饰FGF-1多肽对人角膜内皮细胞(HCEC)增殖的影响
研究涉及包含序列SEQ ID NO:2(N-Met-TTHX1114)或SEQ ID NO:205(TTHX1001)的经修饰FGF-1多肽。经修饰FGF-1多肽使用如上在重组技术章节中所述的方法来产生。
实验方法和结果
将来自健康供者的人角膜内皮细胞的原代培养物(第1代)在胎牛血清(FBS，8％)存在下接种于24孔板上，并且24小时后，用处于具有低(0.8％)FBS的培养基中的不同浓度的N-Met-TTHX1114(SEQ ID NO:2)、TTHX1001(SEQ ID NO:205)或wt-FGF-1(SEQ ID NO:1)处理。8％FBS组充当阳性对照。结果指示，相比于TTHX1001或wt-FGF-1，N-Met-TTHX1114在刺激人角膜上皮细胞增殖方面更强力，并且在其中具有剂量响应性。N-Met-TTHX1114的EC50比wt-FGF-1或其他测试的经修饰FGF-1多肽(TTHX1001；SEQ ID NO:205)的EC50低约100倍。
实施例3：氮芥诱发的角膜损伤
研究涉及包含序列SEQ ID NO:2的经修饰FGF-1多肽(N-Met-TTHX1114)对治疗氮芥(NM)诱发的角膜损伤的影响。经修饰FGF-1多肽使用如上在重组技术章节中所述的方法来产生。
实验方法
使用兔角膜器官培养模型系统评估在暴露于NM之后的愈合。获得兔眼(8–12周龄)，并且从该眼剖下具有2mm巩膜缘的角膜，以上皮侧向下的方式放置至点滴板中，并且将凹处用含558C熔融琼脂(0.75％)的杜贝卡氏改良依格氏培养基(Dulbecco’s modifiedEagle’s medium，DMEM)填充。该设置的非限制性实例显示于图3中。一旦溶液得以胶凝，就将角膜反转，以使上皮层可及。将培养物放置在60mm直径pyrex组织培养皿中。制备高葡萄糖DMEM，其含有13MEM-NEAA(最低必需培养基非必需氨基酸)、13RMPI 1640维生素溶液、13抗生素/抗霉菌素、抗坏血酸(0.45mM)和环丙沙星(10μg/ml)。将高葡萄糖DMEM添加至巩膜缘，保持角膜暴露于空气。将培养皿放置在伴有5％CO2的37℃加湿孵育器中。将各培养物的上皮用500μL培养基湿润，该培养基每7至9小时逐滴添加于中心角膜上。将糜烂性试剂NM逐滴添加于中心角膜上。将角膜样品(从其琼脂载体剥离)以上皮侧向下的方式放置在含有最佳切割温度(OCT，Tissue-Tek；Sakura,Torrance,CA,USA)复合物的冷冻切片包埋模具中，并且快速冷冻以进行组织学分析和免疫荧光测定，或直接速冻以进行进一步蛋白质分析，包括Western印迹和ADAM17活性测定(InnoZyme TACE活性测定试剂盒；Calbiochem,Billerica,MA,USA)。
使用NM诱发角膜损伤。首先将呈粉状固体形式的NM(目录号122564；Sigma-Aldrich)溶解于PBS中以达到100mM，接着用培养基稀释至10mM。施加10微升以将100nmol糜烂剂递送至角膜。在将NM施加于中心角膜上之后，使培养物返回至37℃孵育器中，在不移除糜烂剂的情况下持续2小时。在这个孵育之后，移除受污染的培养基，并且将新鲜培养基添加至中心角膜，直至培养皿中的液面达到巩膜缘的顶部。接着使对照未暴露角膜和经暴露角膜返回至37℃以进行22小时孵育，其中仅在三个短暂时期中移出以将20μL培养基添加至未接受N-Met-TTHX1114疗法的经暴露样品，或将20μL N-Met-TTHX1114作为疗法添加至中心角膜。首次met-TTHX1114施加保留8小时，第二次施加保留9小时，并且第三次施加保留5小时。因此，2小时暴露和后续处理的时长总计24小时。
对于分析NM暴露多快诱导ADAM17的实验，如所描述来建立培养。对于最短暴露时间，将NM溶液施加于角膜，接着立刻洗涤去除，并且将样品放置在蛋白质分离提取缓冲液中。此举用两个其他角膜加以重复以收集三次0分钟暴露。对于5分钟和10分钟暴露，将NM相应地添加至各组三个角膜，确保没有角膜无意中对NM暴露不足或暴露过度。提取所有角膜，并且加以处理以进行ADAM17活性测定。
使用InnoZyme ADAM17/TACE活性试剂盒(Calbiochem)根据供应商所提供的方案来定量来自角膜提取物的酶的活性。简要来说，将400μL洗涤缓冲液(来自InnoZyme试剂盒)施加于用抗人ADAM17抗体预涂覆的96孔板，随后进行两次洗涤。将角膜提取物和InnoZyme试剂盒标准物的一式三份样品(100μL)各自添加至三组孔中。将板密封，并且在室温下在温和振荡下孵育1小时。接着，将板用400μL洗涤缓冲液洗涤五次。将试剂盒中提供的ADAM17底物(100μL)添加至各孔中，并且在37℃下孵育5小时。在激发波长324nm和发射波长405nm下测量荧光，并且在图上报道为相对荧光单位。对于对ADAM17的免疫检测，首先将载片上经OCT-包埋的切片在20℃甲醇中固定10分钟。用处于具有0.05％吐温-20(Tween-20)的PBS(PBST)中的5％正常山羊血清(NGS)阻断非特异性结合1小时。将根据免疫荧光而发现仅检测活性酶的针对人ADAM 17的胞外域(氨基酸18–671)的小鼠单克隆抗体(5μg/mL于1.5％NGS中，MAB9304；R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)施加于载片，在室温下孵育1小时，接着将载片于PBST中洗涤三次，每次10分钟。对于阴性对照载片，将与对测试切片使用的初级抗体的体积相同的体积的PBST施加于切片，随后采用相同洗涤体积。在室温下孵育下，施加处于1.5％NGS中的缀合于AlexaFluor488的山羊抗小鼠IgG(1:1000；Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，持续1小时。在用PBST洗涤三次，每次5分钟之后，将0.4mg/mL DAPI施加于切片，持续5分钟以对核进行复染。Prolong Gold用于对载片进行封片。
结果
角膜器官培养物中NM诱发的损伤的组织病理学
由NM施以的损伤包括以下：(a)上皮层的增生，根据向下推进至基质中的上皮细胞的数目和深度的增加而显而易知。这被称为向下增生。未暴露(原初)角膜显示一定的向下增生，但该向下增生不像暴露于NM的角膜一样广泛；(b)基底细胞核向上朝基底上皮细胞的顶部升高；和(c)上皮-基质分离。组织病理学影响早在暴露后四天即可见。用于评估NM诱发的角膜损伤的影响的示例性组织病理学分级流程显示于图6中。组织病理学分级通过用N-Met-TTHX1114处理而得以改善。相较于来自未处理角膜的切片，经N-Met-TTHX1114处理的角膜切片展现较低评分(指示较小损伤)。
用N-Met-TTHX1114处理暴露于NM的角膜细胞保护免受损伤
用TTHX1114处理暴露于NM的角膜会保护角膜免遭由NM诱发的组织病理学损伤。在NM暴露之后，经N-Met-TTHX1114处理的角膜未展现向下增生。此外，在用N-Met-TTHX1114处理的角膜中，未见上皮-基质分离。
NM暴露使兔角膜中的FGF-1水平降低
将暴露于NM的兔角膜切片与抗FGF-1抗体一起孵育。在经暴露角膜中，观察到FGF-1水平的降低，如图9中所示。相较于原初角膜切片，暴露于NM的角膜切片在暴露后1天(图9的上部图版)和3天(图9的下部图版)显示对FGF-1的抑制增强。
NM暴露诱导兔角膜中的ADAM17活化
在暴露于NM的角膜中，在需要ADAM17酶就位以降解胶原XVII的基底膜区域处观察到强烈荧光信号，在未暴露角膜中未可观地检测到ADAM17。
N-Met-TTHX1114处理使兔角膜中NM暴露诱导的ADAM17活化降低
在用TTH1114处理角膜后，在外周和中心角膜中，ADAM17荧光信号得以减弱。ADAM17荧光信号的减弱或缺乏与角膜上皮-基质接合部的更好组织学外观相对应。
N-Met-TTHX1114处理改善NM暴露诱导的对角膜上皮增殖的抑制
外周角膜上皮层刺激通过角膜上皮细胞(CEC)的EdU并入来评估。使用标准程序来建立兔CEC的原代培养物，所述标准程序是例如由Kay等人所述的程序(Kay等人Investigativeophthalmology&visual science.1993；34(3):663-72；Lee等人,Investigativeophthalmology&visual science.2009；50(5):2067-76)。使细胞暴露于NM两小时。使用例如Click-IT测定试剂盒(Life Technologies)，在12孔板中进行增殖测定。EdU向角膜上皮细胞中的并入是上皮增殖的标志。相较于未处理对照，在NM暴露之后，当用N-Met-TTHX1114处理时，并入EdU的角膜上皮细胞的百分比是较低的。
实施例4：硫芥诱发的角膜内皮细胞损伤
研究涉及包含序列SEQ ID NO:2的经修饰FGF-1多肽(N-Met-TTHX1114)对治疗硫芥(SM)诱发的角膜损伤的影响。经修饰FGF-1多肽使用如上在重组技术章节中所述的方法来产生。
实验方法
在4个月时期期间，使具有8至16个动物的群组中的兔暴露于硫芥。在暴露之前一天，对各兔的背部上的4in2区域进行剪毛，并且将芬太尼贴片(25μg/h)放置在肩胛骨的前部。在暴露当天，以肌肉内施用15mg/kg的氯胺酮和7mg/kg的甲苯噻嗪来使兔麻醉，并且记录生理参数。使经麻醉兔的角膜暴露于SM蒸汽2.5分钟。在暴露之后两分钟，用10mL无菌盐水温和冲洗经暴露眼以洗去残余试剂。
在暴露之后24小时使第一组兔安乐死。在安乐死之后五分钟，使用100μLHamilton玻璃注射器(Hamilton Company,Reno,NV)将20μL 0.1mg/mL AlexaFluor 488(Life Technologies,Carlsbad,CA)溶解于PBS(pH 7.4)中的溶液通过30规格针来注射至前房中。在10分钟之后，切除角膜，并且于10mL PBS中洗涤三次，每次1分钟。将角膜转移至具有100μL PBS的14mL圆底管(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)中，并且在冰上在黑暗中在温和搅拌下孵育。在30分钟之后，于PBS中以1:5稀释上清液，并且使用激发波长488±10nm、发射波长524±10nm以及增益50，在Synergy MX荧光光度计(Biotek,Winooski,VT)上分析荧光。在Versadoc MP 4000(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)中用蓝光二极管和FITC滤光片组对代表性角膜进行成像。
将其余兔进一步分成用N-Met-TTHX1114在不同剂量下治疗的测试组和用对照媒介物治疗的模拟对照组。治疗持续约两周。使兔返回至笼中，并且提供随意取用的食物和水。芬太尼贴片在每72小时之后更换以管理不适直至暴露之后6天，并且此后根据需要自由施加。每日监测动物的疼痛和苦痛征象。使用厚度测量法、荧光素排斥测定和裂隙灯评估来定期对角膜损伤进行临床评估。
结果
硫芥(SM)暴露导致角膜内皮损伤
在SM暴露之后24小时通过扫描电子显微术(SEM)在370nm下显现的角膜展现向心损伤，伴有中心角膜中角膜内皮细胞(CEC)的广泛丧失，以及朝向暴露边缘的保留增加。为获得角膜内皮中由SM诱发的变化的更全面概况，通过电子显微术来评估后部角膜的精细结构。未暴露角膜的正面扫描电子显微照片揭示具有规则形状和尺寸，具有交错边界、顶端微绒毛和稀少纤毛的一层连续多角形细胞。在暴露的24小时内，所有角膜内皮都展现急性病变的迹象，伴有广泛中心CEC丧失以及在暴露半影中的更多扩散性糜烂。经暴露区域内的CEC显示两种一般性形态，即增大(高度减弱)的多形性细胞和圆形或梭形的细胞。大多数CEC展现非典型顶端膜形态，并且缺乏细胞与细胞间的交错。在具有CEC糜烂的区域中，剥脱的德塞梅氏膜(DM)由CEC板状伪足和线状伪足的复合分支覆盖。对角膜横截面的TEM成像确认向心损伤样式，其中CEC形态朝向损伤边缘而渐进地正常化。在中心病变附近的剥脱DM由广泛分支化的细胞突浸润。在更远端区域，常见伴有接头复合物丧失的重叠细胞突，暗示存在运动群体。发现通过SEM观察到的圆形CEC群体只覆盖多形性内皮，并且显示坏死或凋亡的征象。
用N-Met-TTHX1114进行的治疗使角膜内皮损伤消退
在暴露之后八周，在测试组(也被称为消退型眼)与模拟对照组(其稍后显现MGK)之间比较内皮细胞形态和结构。消退型眼通过在临床评估期间不存在特征性MGK后遗症诸如角膜糜烂、新血管形成或角膜模糊来区分，并且截至6周，具有在统计学上无法与模拟暴露对照相区分的角膜厚度。发现消退型眼的正面扫描显微照片惊人地类似于模拟暴露对照，具有单层良好组织的多角形细胞。相较于对照角膜，消退型眼中的平均CEC尺寸得以增加；另外，消退型角膜在后部表面上未展现重大可变性。相比之下，经模拟对照治疗的具有MGK内皮的兔显露在各动物之间在细胞形状和细胞尺寸方面的广泛可变性，从而指示动态损伤过程。在各角膜中常规地观察到内皮形态的局灶性可变性，其中一些区域展现增大但嵌合的CEC，而其他区域显示显著无组织化，伴有可变程度的顶端起泡，显示剥脱DM的区域，以及缺乏明确划定的细胞边界。这些现象未在经N-Met-TTHX1114治疗的消退型内皮中观察到。经N-Met-TTHX1114治疗的消退型角膜的透射电子显微镜图像极其类似于原初内皮。相比之下，经模拟对照治疗的具有MGK病变的内皮展现后部DM的扩散性增厚，这与水肿和/或角膜后纤维膜的沉积一致。MGK角膜还展现CEC应激或损伤的广泛标志，包括细胞质稀薄化、过度空泡形成以及内质网膨胀。存在高频率的重叠细胞突，这类似于24小时图像，并且暗示正在进行的试图重新定殖于新近剥脱的DM中。实施例5：经修饰FGF-1(N-Met-TTHX1114)在 伤口愈合方面是有效的
这项研究涉及包含序列SEQ ID NO:2的经修饰FGF-1多肽(N-Met-TTHX1114)对伤口愈合的速率的影响。
实验方法
11周龄的雌性C57BL/Ks-db/db糖尿病小鼠从Jackson Laboratories获得，并且在具有无菌水和垫料的无菌微型隔离盒中舍饲并保持在半屏障检疫设施中。
皮肤器官培养
在适合培养基中培养来自处于愈合中的受损小鼠的皮肤活检试样。简要来说，在37℃下在补充以0.25％热失活牛血清(Gibco)的DMEM(Gibco)培养基中孵育组织样品。每日用0、1、10和100μg/mL N-Met-TTHX1114处理皮肤试样，持续2天或3天。接着用4μCi的[甲基-3H]胸苷(来自含有20Ci/mmol的储备溶液；New England Biolabs)标记组织样品24小时。在胸苷标记之后，将皮肤试样洗涤，溶解，并且测定放射性计数。
伤口闭合模型
以腹膜内注射每kg体重110mg氯胺酮和9mg甲苯噻嗪来使小鼠麻醉。将中背部以及胸部皮肤剃毛，并且依次用2％氯己定手术洗消液和70％乙醇进行消毒。
直径1.6cm的模板用于在中间背侧区域上标记2.0cm2圆圈，并且单一全层伤口通过用无菌弧形虹膜剪进行钝性切除来创建。伤口面积通常在损伤之后不久就增加至约2.3cm2，推测是由于真皮沿伤口周界的紧缩。所有手术和后续愈合分析程序都使用完全无菌技术在层流通风橱中进行。在损伤之后第0、3和7天，外部施加不同剂量的过滤灭菌生长因子以及相应媒介物对照溶液。将伤口用半透明Bioclusive敷料覆盖以进行保护，维持潮湿环境，并且预防硬壳形成。在损伤之后第10天获取伤口流体样品，并且培养以获得好氧和厌氧微生物。将对应于展现每个伤口超过50个菌落的培养物的动物从研究分析中排除。对即使轻度或亚临床感染的预防会导致一致的最大愈合损害，由此为评估治疗作用提供较大的伤口愈合窗口。
愈合分析
以摄影方式记录伤口外观，并且将它们的周界显迹于无菌玻璃载片上，所述无菌玻璃载片在用一滴无菌生理盐水预湿润之后被直接施加于暴露的伤口表面。
在受伤之后立刻以及此后每周两次进行测量直至伤口完全闭合。使用适合计算机化图像分析(例如使用Presage C V-6；Advanced Imaging Concepts,Princeton,NJ)，由玻璃载片迹线确定伤口面积和周长。使用未配对双尾学生t检验(Student t test)来评估各组之间的差异的统计显著性。通过用在依序时间间隔下的伤口面积差异除以平均伤口周长来将表示为初始面积百分比减小的愈合变换成从伤口边缘进行的线性向内生长。在特定时间的总体向内生长是直至那个时间的递增性向内生长距离的总和。这个变换使闭合随时间而线性化，由此允许将愈合表示为随时间保持恒定的动力学速率。当潮湿肉芽组织不再明显，从而指示存在功能性表皮透水屏障时，伤口被视为完全愈合。
结果
来自处于愈合中的受损小鼠的皮肤活检试样响应于每日剂量的N-Met-TTHX1114而并入[甲基-3H]胸苷。皮肤内的细胞以剂量依赖性方式以促有丝分裂方式对N-Met-TTHX1114起响应。因此，N-Met-TTHX111会诱导皮肤器官培养物中的DNA合成。
此外，相较于用对照媒介物进行的治疗，直径是约1.6cm的全层真皮切除性伤口响应于在伤口引发之后第一周期间施加的各剂量的N-Met-TTHX1114而实质上更快闭合。因此，N-Met-TTHX1114会加速伤口闭合。
此外，经媒介物治疗的伤口和经N-Met-TTHX1114治疗的伤口的总体外观和平均尺寸显著不同。经N-Met-TTHX1114治疗的伤口早在治疗之后3天即显示新血管形成的征象，诸如可见的变红和浆液渗漏。相比之下，接受对照媒介物的伤口含有少许或不含有可见浆液，以及实质上较不明显的新血管生成征象。
实施例6：使用经修饰FGF-1多肽(N-Met-TTHX1114或TTHX-1114)来治疗疱疹性角 膜病变
这项研究涉及使用包含序列SEQ ID NO:2(N-Met-TTHX1114)或SEQ ID NO:205(TTHX1001)的经修饰FGF-1多肽来治疗疱疹性角膜病变。
方法
选择一组患有疱疹性角膜病变的患者用于这项研究。将患者分成三个子组。向第一子组中的患者经眼施用含有配制在磷酸盐缓冲盐水(在pH 7.2下)、0.3％丙二醇、0.4％聚乙二醇400和0.05％羟丙基瓜尔胶中的约500pg/ml(即5μg/ml)N-met TTHX1114(SEQ IDNO:2)的眼用制剂，诸如滴眼剂。向第二子组中的患者经眼施用含有配制在磷酸盐缓冲盐水(在pH 7.2下)、0.3％丙二醇、0.4％聚乙二醇400和0.05％羟丙基瓜尔胶中的约500pg/ml(即5μg/ml)TTHX1001(SEQ ID NO:205)的眼用制剂，诸如滴眼剂。向第三子组中的患者经眼施用不含有N-Met-TTHX1114(SEQ ID NO:2)或TTHX1001(SEQ ID NO:205)但在其他方面与向第一和第二子组施用的眼用制剂相同的模拟眼用制剂。对于所有三个子组，滴眼剂都由患者自我施用，或由护士或护理者施用。分别向第一、第二和第三子组中的患者施用含有N-Met-TTHX1114(SEQ ID NO:2)的眼用制剂、含有TTHX1001(SEQ ID NO:205)的眼用制剂和模拟眼用制剂，每日两次，持续多达30天。
结果
观察到在属于第一和第二子组的大多数患者中，含有N-Met-TTHX1114(SEQ IDNO:2)的眼用制剂和含有TTHX1001(SEQ ID NO:205)的眼用制剂在约14天内导致疱疹性角膜溃疡的愈合，以及疼痛和炎症的持续时间的缩短。此外，相比于第三子组中的用模拟物治疗的患者，第一和第二子组中的分别用含有N-Met-TTHX1114(SEQ ID NO:2)的眼用制剂和含有TTHX1001(SEQ ID NO:205)的眼用制剂治疗的患者的眼具有较少的角膜模糊和结疤。
实施例7：使用经修饰FGF-1多肽(N-Met-TTHX1114或TTHX-1001)来治疗慢性疱疹 性角膜病变
这项研究涉及使用包含序列SEQ ID NO:2(N-Met-TTHX1114)或SEQ ID NO:205(TTHX1001)的经修饰FGF-1多肽来治疗慢性疱疹性角膜病变。
方法
选择一组患有慢性疱疹性角膜病变的患者用于这项研究。将患者分成三个子组。向第一子组中的患者经眼施用含有配制在磷酸盐缓冲盐水(在pH 7.2下)、0.3％丙二醇、0.4％聚乙二醇400和0.05％羟丙基瓜尔胶中的约500pg/ml(即5μg/ml)N-Met-TTHX1114(SEQ ID NO:2)的眼用制剂，诸如滴眼剂。向第二子组中的患者经眼施用含有配制在磷酸盐缓冲盐水(在pH 7.2下)、0.3％丙二醇、0.4％聚乙二醇400和0.05％羟丙基瓜尔胶中的约500pg/ml(即5μg/ml)TTHX1001(SEQ ID NO:205)的眼用制剂，诸如滴眼剂。向第三子组中的患者经眼施用不含有N-Met-TTHX1114(SEQ ID NO:2)或TTHX1001(SEQ ID NO:205)但在其他方面与向第一和第二子组施用的眼用制剂相同的模拟眼用制剂。对于所有三个子组，滴眼剂都由患者自我施用，或由护士或护理者施用。分别向第一、第二和第三子组中的患者施用含有N-Met-TTHX1114(SEQ ID NO:2)的眼用制剂、含有TTHX1001(SEQ ID NO:205)的眼用制剂和模拟眼用制剂，每日两次，持续多达30天。
结果
观察到在属于第一和第二子组的大多数患者中，含有N-Met-TTHX1114(SEQ IDNO:2)的眼用制剂和含有TTHX1001(SEQ ID NO:205)的眼用制剂导致角膜溃疡的愈合，以及疼痛和炎症的减轻。此外，相比于第三子组中的用模拟物治疗的患者，第一和第二子组中的分别用含有N-Met-TTHX1114(SEQ ID NO:2)的眼用制剂和含有TTHX1001(SEQ ID NO:205)的眼用制剂治疗的患者的眼具有较少的角膜混浊、模糊和结疤。
实施例8：使用经修饰FGF-1多肽(N-Met-TTHX1114或TTHX-1001)来治疗神经营养 性角膜病变
这项研究涉及使用包含序列SEQ ID NO:2(N-Met-TTHX1114)或SEQ ID NO:205(TTHX1001)的经修饰FGF-1多肽来治疗继发于疱疹感染的神经营养性角膜病变。
方法
选择一组患有神经营养性角膜病变的患者用于这项研究。将患者分成三个子组。向第一子组中的患者经眼施用含有配制在磷酸盐缓冲盐水(在pH 7.2下)、0.3％丙二醇、0.4％聚乙二醇400和0.05％羟丙基瓜尔胶中的约500pg/ml(即5μg/ml)N-Met-TTHX1114(SEQ ID NO:2)的眼用制剂，诸如滴眼剂。向第二子组中的患者经眼施用含有配制在磷酸盐缓冲盐水(在pH 7.2下)、0.3％丙二醇、0.4％聚乙二醇400和0.05％羟丙基瓜尔胶中的约500pg/ml(即5μg/ml)TTHX1001(SEQ ID NO:205)的眼用制剂，诸如滴眼剂。向第三子组中的患者经眼施用不含有N-Met-TTHX1114(SEQ ID NO:2)或TTHX1001(SEQ ID NO:205)但在其他方面与向第一和第二子组施用的眼用制剂相同的模拟眼用制剂。对于所有三个子组，滴眼剂都由患者自我施用，或由护士或护理者施用。分别向第一、第二和第三子组中的患者施用含有N-Met-TTHX1114(SEQ ID NO:2)的眼用制剂、含有TTHX1001(SEQ ID NO:205)的眼用制剂和模拟眼用制剂，每日两次，持续多达30天。
结果
观察到在属于第一和第二子组的大多数患者中，含有N-Met-TTHX1114(SEQ IDNO:2)的眼用制剂和含有TTHX1001(SEQ ID NO:205)的眼用制剂导致角膜溃疡的愈合，以及疼痛和炎症的减轻。此外，相比于第三子组中的用模拟物治疗的患者，第一和第二子组中的分别用含有N-Met-TTHX1114(SEQ ID NO:2)的眼用制剂和含有TTHX1001(SEQ ID NO:205)的眼用制剂治疗的患者的眼具有较少的角膜混浊、模糊和结疤。
实施例9：使用经修饰FGF-1多肽(N-met-TTHX1114或TTHX1001)来治疗复发性疱疹 性角膜病变以及抑制潜伏性病毒的再活化
这项研究涉及使用包含序列SEQ ID NO:2(N-Met-TTHX1114)或SEQ ID NO:205(TTHX1001)的经修饰FGF-1多肽来治疗继发于疱疹感染的神经营养性角膜病变。
方法
选择一组患有复发性角膜病变的患者用于这项研究。患者已经历至少一次疱疹性角膜病变发作。对于治疗复发性疱疹性角膜病变以及抑制潜伏性病毒的再活化，将患者分成三个子组。向第一子组中的患者经眼施用含有配制在磷酸盐缓冲盐水(在pH 7.2下)、0.3％丙二醇、0.4％聚乙二醇400和0.05％羟丙基瓜尔胶中的约50pg/ml至约500pg/ml(即5μg/ml)N-Met-TTHX1114(SEQ ID NO:2)的眼用制剂，诸如滴眼剂。向第二子组中的患者经眼施用含有配制在磷酸盐缓冲盐水(在pH 7.2下)、0.3％丙二醇、0.4％聚乙二醇400和0.05％羟丙基瓜尔胶中的约50pg/ml至500pg/ml(即5μg/ml)TTHX1001(SEQ ID NO:205)的眼用制剂，诸如滴眼剂。向第三子组中的患者经眼施用不含有N-Met-TTHX1114(SEQ ID NO:2)或TTHX1001(SEQ ID NO:205)但在其他方面与向第一和第二子组施用的眼用制剂相同的模拟眼用制剂。对于所有三个子组，滴眼剂都由患者自我施用，或由护士或护理者施用。分别向第一、第二和第三子组中的患者施用含有N-Met-TTHX1114(SEQ ID NO:2)的眼用制剂、含有TTHX1001(SEQ ID NO:205)的眼用制剂和模拟眼用制剂，每日两次，持续多达30天。
结果
观察到含有N-Met-TTHX1114(SEQ ID NO:2)的眼用制剂和含有TTHX1001(SEQ ID NO:205)的眼用制剂使无疾病间隔增加，并且使再活化病毒病变的严重性减轻，其中相比于第三子组中的用模拟物治疗的患者，接受经修饰FGF-1的患者具有更长的无复发性疾病时期。
实施例10：经修饰FGF-1多肽对人角膜内皮细胞(HCEC)增殖的影响
研究涉及包含序列SEQ ID NO:206(TTHX1114)或SEQ ID NO:205(TTHX1001)的经修饰FGF-1多肽。经修饰FGF-1多肽使用如上在重组技术章节中所述的方法来产生。
实验方法和结果
将来自健康供者的人角膜内皮细胞的原代培养物(第1代)在胎牛血清(FBS，8％)存在下接种于24孔板上，并且24小时后，用处于具有低(0.8％)FBS的培养基中的不同浓度的TTHX1114(SEQ ID NO:206)、TTHX1001(SEQ ID NO:205)或wt-FGF-1(SEQ ID NO:1)处理。8％FBS组充当阳性对照。结果指示，相比于TTHX1001或wt-FGF-1，TTHX1114在刺激人角膜上皮细胞增殖方面更强力，并且在其中具有剂量响应性。TTHX1114的EC50比wt-FGF-1或其他测试的经修饰FGF-1多肽(TTHX1001；SEQ ID NO:205)的EC50低约100倍，如图2中所说明。
实施例11：氮芥诱发的角膜损伤
研究涉及包含序列SEQ ID NO:206的经修饰FGF-1多肽(TTHX1114)对治疗氮芥(NM)诱发的角膜损伤的影响。经修饰FGF-1多肽使用如上在重组技术章节中所述的方法来产生。
实验方法
使用兔角膜器官培养模型系统评估在暴露于NM之后的愈合。获得兔眼(8-12周龄)，并且从该眼剖下具有2mm巩膜缘的角膜，以上皮侧向下的方式放置至点滴板中，并且将凹处用含558C熔融琼脂(0.75％)的杜贝卡氏改良依格氏培养基(DMEM)填充。该设置的非限制性实例显示于图3中。一旦溶液得以胶凝，就将角膜反转，以使上皮层可及。将培养物放置在60mm直径pyrex组织培养皿中。制备高葡萄糖DMEM，其含有13MEM-NEAA(最低必需培养基非必需氨基酸)、13RMPI 1640维生素溶液、13抗生素/抗霉菌素、抗坏血酸(0.45mM)和环丙沙星(10μg/ml)。将高葡萄糖DMEM添加至巩膜缘，保持角膜暴露于空气。将培养皿放置在伴有5％CO2的37℃加湿孵育器中。将各培养物的上皮用500μL培养基湿润，该培养基每7至9小时逐滴添加于中心角膜上。将糜烂性试剂NM逐滴添加于中心角膜上。将角膜样品(从其琼脂载体剥离)以上皮侧向下的方式放置在含有最佳切割温度(OCT，Tissue-Tek；Sakura,Torrance,CA,USA)复合物的冷冻切片包埋模具中，并且快速冷冻以进行组织学分析和免疫荧光测定，或直接速冻以进行进一步蛋白质分析，包括Western印迹和ADAM17活性测定(InnoZyme TACE活性测定试剂盒；Calbiochem,Billerica,MA,USA)。
使用NM诱发角膜损伤。首先将呈粉状固体形式的NM(目录号122564；Sigma-Aldrich)溶解于PBS中以达到100mM，接着用培养基稀释至10mM。施加10微升以将100nmol糜烂剂递送至角膜。在将NM施加于中心角膜上之后，使培养物返回至37℃孵育器中，在不移除糜烂剂的情况下持续2小时。在这个孵育之后，移除受污染的培养基，并且将新鲜培养基添加至中心角膜，直至培养皿中的液面达到巩膜缘的顶部。接着使对照未暴露角膜和经暴露角膜返回至37℃以进行22小时孵育，其中仅在三个短暂时期中移出以将20μL培养基添加至未接受TTHX1114疗法的经暴露样品，或将20μL TTHX1114作为疗法添加至中心角膜。首次TTHX1114施加保留8小时，第二次施加保留9小时，并且第三次施加保留5小时。因此，2小时暴露和后续处理的时长总计24小时。
对于分析NM暴露多快诱导ADAM17的实验，如所描述来建立培养。对于最短暴露时间，将NM溶液施加于角膜，接着立刻洗涤去除，并且将样品放置在蛋白质分离提取缓冲液中。此举用两个其他角膜加以重复以收集三次0分钟暴露。对于5分钟和10分钟暴露，将NM相应地添加至各组三个角膜中，确保没有角膜无意中对NM暴露不足或暴露过度。提取所有角膜，并且加以处理以进行ADAM17活性测定。
使用InnoZyme ADAM17/TACE活性试剂盒(Calbiochem)根据供应商所提供的方案来定量来自角膜提取物的酶的活性。简要来说，将400μL洗涤缓冲液(来自InnoZyme试剂盒)施加于用抗人ADAM17抗体预涂覆的96孔板，随后进行两次洗涤。将角膜提取物和InnoZyme试剂盒标准物的一式三份样品(100μL)各自添加至三组孔中。将板密封，并且在室温下在温和振荡下孵育1小时。接着，将板用400μL洗涤缓冲液洗涤五次。将试剂盒中提供的ADAM17底物(100μL)添加至各孔中，并且在37℃下孵育5小时。在激发波长324nm和发射波长405nm下测量荧光，并且在图上报道为相对荧光单位。对于对ADAM17的免疫检测，首先将载片上经OCT-包埋的切片在208C甲醇中固定10分钟。用处于具有0.05％吐温-20的PBS(PBST)中的5％正常山羊血清(NGS)阻断非特异性结合1小时。将根据免疫荧光而发现仅检测活性酶的针对人ADAM 17的胞外域(氨基酸18–671)的小鼠单克隆抗体(5μg/mL于1.5％NGS中，MAB9304；R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)施加于载片以在室温下孵育1小时，接着将载片于PBST中洗涤三次，每次10分钟。对于阴性对照载片，将与对测试切片使用的初级抗体的体积相同的体积的PBST施加于切片，随后采用相同洗涤体积。在室温下孵育下，施加处于1.5％NGS中的缀合于AlexaFluor488的山羊抗小鼠IgG(1:1000；Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，持续1小时。在用PBST洗涤三次，每次5分钟之后，将0.4mg/mL DAPI施加于切片，持续5分钟以对核进行复染。Prolong Gold用于对载片进行封片。
结果
角膜器官培养物中NM诱发的损伤的组织病理学
由NM施以的损伤包括以下：(a)上皮层的增生，根据向下推进至基质中的上皮细胞的数目和深度的增加而显而易知。这被称为向下增生。未暴露(原初)角膜(图4，下部图版)也显示一定的向下增生，但该向下增生不像暴露于NM的角膜(图4，上部图版)一样广泛；(b)基底细胞核向上朝基底上皮细胞的顶部升高；和(c)上皮-基质分离。组织病理学影响早在暴露后四天即可见。
用于评估NM诱发的角膜损伤的影响的示例性组织病理学分级流程显示于图6中，并且对NM诱发的角膜和基质损伤的组织病理学分级也说明于图7的图中。
用TTHX1114处理暴露于NM的角膜细胞保护免受损伤
用TTHX1114处理暴露于NM的角膜保护了角膜免遭由NM诱发的组织病理学损伤。如图5中所见，在NM暴露之后第4天，经TTHX1114处理的角膜未展现向下增生(比较图5的上部图版和下部图版)。此外，如图4的上部图版中所见的上皮-基质分离未见于用TTHX1114处理的角膜中(第6天，下部图版，图5)。
还发现在用TTHX1114处理的角膜中，对NM诱发的损伤的组织病理学分级得以降低。结果显示于图8中。
TTHX1114保护兔角膜中FGF-1水平免受NM暴露的降低
将暴露于NM的兔角膜切片与抗FGF-1抗体一起孵育。在经暴露角膜中，观察到FGF-1水平的降低，如图9中所示。相较于原初角膜切片，暴露于NM的角膜切片在暴露后1天(图9的上部图版)和3天(图9的下部图版)显示对FGF-1的抑制增强。
NM暴露诱导兔角膜中的ADAM17活化
在暴露于NM的角膜中，在需要ADAM17酶就位以降解胶原XVII的基底膜区域处观察到强烈荧光信号(图10B的上部图版显示在暴露后第1、4和6天的ADAM17免疫荧光结果)。在未暴露角膜中未可观地检测到ADAM17(图10A)。
TTHX1114处理使兔角膜中NM暴露诱导的ADAM17活化降低
在用TTH1114处理角膜后，在外周和中心角膜中，ADAM17荧光信号得以减弱(下部图版，图10B)。ADAM17荧光信号的减弱或缺乏与角膜上皮-基质接合部的更好组织学外观相对应。
TTHX1114处理改善NM暴露诱导的对角膜上皮增殖的抑制
外周角膜上皮层刺激通过角膜上皮细胞(CEC)的EdU并入来评估。使用标准程序来建立兔CEC的原代培养物，所述标准程序是例如由Kay等人所述的程序(Kay等人,Investigative ophthalmology&visual science.1993；34(3):663-72；Lee等人,Investigative ophthalmology&visual science.2009；50(5):2067-76)。使细胞暴露于NM两小时。使用例如Click-IT测定试剂盒(Life Technologies)，在12孔板中进行增殖测定。将EdU向角膜上皮细胞中的并入作为上皮增殖的标志加以评估。在NM暴露之后，当用TTHX1114处理时，并入EdU的角膜上皮细胞的百分比是较低的，如图11中所见。
实施例12：硫芥诱发的角膜内皮细胞损伤
研究涉及包含序列SEQ ID NO:206的经修饰FGF-1多肽(TTHX1114)对治疗硫芥(SM)诱发的角膜损伤的影响。经修饰FGF-1多肽使用如上在重组技术章节中所述的方法来产生。
实验方法
在4个月时期期间，使具有8至16个动物的群组中的兔进行暴露。在暴露之前一天，对各兔的背部上的4in2区域进行剪毛，并且将芬太尼贴片(25μg/h)放置在肩胛骨的前部。在暴露当天，以肌肉内施用15mg/kg的氯胺酮和7mg/kg的甲苯噻嗪来使兔麻醉，并且记录生理参数。使用如先前所述的蒸汽杯递送系统，使经麻醉兔的角膜暴露于SM蒸汽2.5分钟。在暴露之后两分钟，用10mL无菌盐水温和冲洗经暴露眼以洗去残余试剂。
在暴露之后24小时使第一组兔安乐死。在安乐死之后五分钟，使用100μLHamilton玻璃注射器(Hamilton Company,Reno,NV)将20μL 0.1mg/mL AlexaFluor 488(Life Technologies,Carlsbad,CA)溶解于PBS(pH 7.4)中的溶液通过30规格针来注射至前房中。在10分钟之后，切除角膜，并且于10mL PBS中洗涤三次，每次1分钟。将角膜转移至具有100μL PBS的14mL圆底管(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)中，并且在冰上在黑暗中在温和搅拌下孵育。在30分钟之后，于PBS中以1:5稀释上清液，并且使用激发波长488±10nm、发射波长524±10nm以及增益50，在Synergy MX荧光光度计(Biotek,Winooski,VT)上分析荧光。在Versadoc MP 4000(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)中用蓝光二极管和FITC滤光片组对代表性角膜进行成像。
将其余兔进一步分成用TTHX1114在不同剂量下治疗的测试组和用对照媒介物治疗的模拟对照组。治疗持续约两周。使兔返回至笼中，并且提供随意取用的食物和水。芬太尼贴片在每72小时之后更换以管理不适直至暴露之后6天，并且此后根据需要自由施加。每日监测动物的疼痛和苦痛征象。使用厚度测量法、荧光素排斥测定和裂隙灯评估来定期对角膜损伤进行临床评估。
结果
硫芥(SM)暴露导致角膜内皮损伤
在SM暴露之后24小时通过SEM在370nm下显现的角膜展现向心损伤，伴有中心角膜中角膜内皮细胞(CEC)的广泛丧失，以及朝向暴露边缘的保留增加。为获得角膜内皮中由SM诱发的变化的更全面概况，通过电子显微术来评估后部角膜的精细结构。模拟物暴露的角膜的正面扫描电子显微照片揭示具有规则形状和尺寸，具有交错边界、顶端微绒毛和稀少纤毛的一层连续多角形细胞。在暴露的24小时内，所有角膜内皮都展现急性病变的迹象，伴有广泛中心CEC丧失以及在暴露半影中的更多扩散性糜烂。经暴露区域内的CEC显示两种一般性形态，即增大(高度减弱)的多形性细胞和圆形或梭形的细胞。大多数CEC展现非典型顶端膜形态，并且缺乏细胞与细胞间的交错。在具有CEC糜烂的区域中，剥脱的德塞梅氏膜(DM)由CEC板状伪足和线状伪足的复合分支覆盖。对角膜横截面的TEM成像确认向心损伤样式，其中CEC形态朝向损伤边缘而渐进地正常化。在中心病变附近的剥脱DM由广泛分支化的细胞突浸润。在更远端区域，常见伴有接头复合物丧失的重叠细胞突，暗示存在运动群体。发现通过SEM观察到的圆形CEC群体只覆盖多形性内皮，并且显示坏死或凋亡的征象。
用TTHX1114进行的治疗使角膜内皮损伤消退在暴露之后八周，在测试组(也被称为消退组)与模拟对照组(其稍后显现MGK)之间比较内皮细胞形态和结构。消退型眼通过在临床评估期间不存在特征性MGK后遗症诸如角膜糜烂、新血管形成或角膜模糊来区分，并且截至6周，具有在统计学上无法与模拟暴露对照相区分的角膜厚度。发现消退型眼的正面扫描显微照片惊人地类似于模拟暴露对照，具有单层良好组织的多角形细胞。相较于对照角膜，消退型眼中的平均CEC尺寸得以增加；另外，消退型角膜在后部表面上未展现重大可变性。相比之下，经模拟对照治疗的具有MGK内皮的兔显露在各动物之间在细胞形状和细胞尺寸方面的广泛可变性，从而指示动态损伤过程。在各角膜中常规地观察到内皮形态的局灶性可变性，其中一些区域展现增大但嵌合的CEC，而其他区域显示显著无组织化，伴有可变程度的顶端起泡，显示剥脱DM的区域，以及缺乏明确划定的细胞边界。这些现象未在经TTHX1114治疗的消退型内皮中观察到。经TTHX1114治疗的消退型角膜的透射电子显微镜图像极其类似于原初内皮。相比之下，经模拟对照治疗的具有MGK病变的内皮展现后部DM的扩散性增厚，这与水肿和/或角膜后纤维膜的沉积一致。MGK角膜还展现CEC应激或损伤的广泛标志，包括细胞质稀薄化、过度空泡形成以及内质网膨胀。存在高频率的重叠细胞突，这类似于24小时图像，并且暗示正在进行的试图重新定殖于新近剥脱的DM中。
实施例13：使用经修饰FGF-1多肽(TTHX1114)来治疗疱疹性角膜病变
这项研究涉及使用包含序列SEQ ID NO:206的经修饰FGF-1多肽(TTHX1114)来治疗疱疹性角膜病变。
方法
选择一组患有疱疹性角膜病变的患者用于这项研究。将患者分成两个子组。向第一子组中的患者经眼施用含有配制在磷酸盐缓冲盐水(在pH 7.2下)、0.3％丙二醇、0.4％聚乙二醇400和0.05％羟丙基瓜尔胶中的约500pg/ml(即5μg/ml)TTHX1114(SEQ ID NO:206)的眼用制剂，诸如滴眼剂。向第二子组中的患者经眼施用不含有TTHX1114(SEQ ID NO:206)但在其他方面与向第一子组施用的眼用制剂相同的模拟眼用制剂。对于两个子组，滴眼剂均由患者自我施用，或由护士或护理者施用。分别向第一和第二子组中的患者施用含有TTHX1114(SEQ ID NO:206)的眼用制剂和模拟眼用制剂，每日两次，持续多达30天。
结果
观察到在属于第一子组的大多数患者中，含有TTHX1114(SEQ ID NO:206)的眼用制剂在约14天内导致疱疹性角膜溃疡的愈合，以及疼痛和炎症的持续时间的缩短。此外，相比于第二子组中的用模拟物治疗的患者，第一子组中的用含有TTHX1114(SEQ ID NO:206)的眼用制剂治疗的患者的眼具有较少的角膜模糊和结疤。
实施例14：使用经修饰FGF-1多肽(TTHX1114)来治疗慢性疱疹性角膜病变
这项研究涉及使用包含序列SEQ ID NO:206的经修饰FGF-1多肽(TTHX1114)。
方法
选择一组患有慢性疱疹性角膜病变的患者用于这项研究。将患者分成两个子组。向第一子组中的患者经眼施用含有配制在磷酸盐缓冲盐水(在pH 7.2下)、0.3％丙二醇、0.4％聚乙二醇400和0.05％羟丙基瓜尔胶中的约500pg/ml(即5μg/ml)N-Met-TTHX1114(SEQ ID NO:206)的眼用制剂，诸如滴眼剂。向第二子组中的患者经眼施用不含有TTHX1114(SEQ ID NO:206)但在其他方面与向第一子组施用的眼用制剂相同的模拟眼用制剂。对于两个子组，滴眼剂均由患者自我施用，或由护士或护理者施用。分别向第一和第二子组中的患者施用含有TTHX1114(SEQ ID NO:206)的眼用制剂和模拟眼用制剂，每日两次，持续多达30天。
结果
观察到在属于第一子组的大多数患者中，含有TTHX1114(SEQ ID NO:206)的眼用制剂导致角膜溃疡的愈合，以及疼痛和炎症的减轻。此外，相比于第二子组中的用模拟物治疗的患者，第一子组中的用含有TTHX1114(SEQ ID NO:206)的眼用制剂治疗的患者的眼具有较少的角膜混浊、模糊和结疤。
实施例15：使用经修饰FGF-1多肽(TTHX1114)来治疗神经营养性角膜病变
这项研究涉及使用包含序列SEQ ID NO:206的经修饰FGF-1多肽(TTHX1114)来治疗继发于疱疹感染的神经营养性角膜病变。
方法
选择一组患有神经营养性角膜病变的患者用于这项研究。将患者分成两个子组。向第一子组中的患者经眼施用含有配制在磷酸盐缓冲盐水(在pH 7.2下)、0.3％丙二醇、0.4％聚乙二醇400和0.05％羟丙基瓜尔胶中的约500pg/ml(即5μg/ml)TTHX1114(SEQ IDNO:206)的眼用制剂，诸如滴眼剂。向第二子组中的患者经眼施用不含有TTHX1114(SEQ IDNO:206)但在其他方面与向第一子组施用的眼用制剂相同的模拟眼用制剂。对于两个子组，滴眼剂均由患者自我施用，或由护士或护理者施用。分别向第一和第二子组中的患者施用含有TTHX1114(SEQ ID NO:206)的眼用制剂和模拟眼用制剂，每日两次，持续多达30天。
结果
观察到在属于第一子组的大多数患者中，含有TTHX1114(SEQ ID NO:206)的眼用制剂导致角膜溃疡的愈合，以及疼痛和炎症的减轻。此外，相比于第二子组中的用模拟物治疗的患者，第一子组中的相应地用含有TTHX1114(SEQ ID NO:206)的眼用制剂治疗的患者的眼具有较少的角膜混浊、模糊和结疤。
实施例16：使用经修饰FGF-1多肽(TTHX1114)来治疗复发性疱疹性角膜病变以及 抑制潜伏性病毒的再活化
这项研究涉及使用包含序列SEQ ID NO:206的经修饰FGF-1多肽(TTHX1114)来治疗继发于疱疹感染的神经营养性角膜病变。
方法
选择一组患有复发性角膜病变的患者用于这项研究。患者已经历至少一次疱疹性角膜病变发作。对于治疗复发性疱疹性角膜病变以及抑制潜伏性病毒的再活化，将患者分成两个子组。向第一子组中的患者经眼施用含有配制在磷酸盐缓冲盐水(在pH 7.2下)、0.3％丙二醇、0.4％聚乙二醇400和0.05％羟丙基瓜尔胶中的约50pg/ml至约500pg/ml(即5μg/ml)TTHX1114(SEQ ID NO:206)的眼用制剂，诸如滴眼剂。向第二子组中的患者经眼施用不含有TTHX1114(SEQ ID NO:206)但在其他方面与向第一子组施用的眼用制剂相同的模拟眼用制剂。对于两个子组，滴眼剂均由患者自我施用，或由护士或护理者施用。分别向第一和第二子组中的患者施用含有TTHX1114(SEQ ID NO:206)的眼用制剂和模拟眼用制剂，每日两次，持续多达30天。
结果
观察到含有TTHX1114(SEQ ID NO:206)的眼用制剂使无疾病间隔增加，并且使再活化病毒病变的严重性减轻，其中相比于第二子组中的用模拟物治疗的患者，接受经修饰FGF-1的患者具有更长的无复发性疾病时期。
序列
Figure BDA0002354729340000831
Figure BDA0002354729340000841
Figure BDA0002354729340000851
Figure BDA0002354729340000861
Figure BDA0002354729340000871
Figure BDA0002354729340000881
Figure BDA0002354729340000891
Figure BDA0002354729340000901
Figure BDA0002354729340000911
Figure BDA0002354729340000921
Figure BDA0002354729340000931
Figure BDA0002354729340000941
Figure BDA0002354729340000951

Claims (195)

1.一种包含具有一个或多个突变的如SEQ ID NO:1所示的序列的重组经修饰FGF-1多肽，其中所述多肽包含位于SEQ ID NO:1的第一残基的上游的N末端甲硫氨酸残基。
2.如权利要求1所述的重组经修饰FGF-1多肽，其中所述多肽进一步包含位于所述N末端甲硫氨酸残基与SEQ ID NO:1的所述第一残基之间的延伸肽。
3.如权利要求2所述的重组经修饰FGF-1多肽，其中所述延伸肽包含SEQ ID NO:3的一个或多个氨基酸残基。
4.如权利要求3所述的重组经修饰FGF-1多肽，其中所述延伸肽包含如SEQ ID NO:4-8所示的序列中的任一者。
5.如权利要求1-4中任一项所述的重组经修饰FGF-1多肽，其中所述经修饰FGF-1多肽是所述多肽的成熟形式。
6.如权利要求1-5中任一项所述的重组经修饰FGF-1多肽，其中所述经修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:14-18的序列。
7.一种包含具有一个或多个突变的如SEQ ID NO:1所示的序列的重组经修饰FGF-1多肽，其中所述多肽进一步包含位于SEQ ID NO:1的第一残基的上游的延伸肽。
8.如权利要求7所述的重组经修饰FGF-1多肽，其中所述延伸肽包含SEQ ID NO:3的一个或多个氨基酸。
9.如权利要求8所述的重组经修饰FGF-1多肽，其中所述延伸肽包含如SEQ ID NO:4-8所示的序列中的任一者。
10.如权利要求9所述的重组经修饰FGF-1多肽，其中所述经修饰FGF-1多肽是所述多肽的成熟形式。
11.如权利要求7-10中任一项所述的重组经修饰FGF-1多肽，其中所述经修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:24-28的序列。
12.一种包含具有一个或多个突变的如SEQ ID NO:1所示的序列的重组经修饰FGF-1多肽，其中所述多肽进一步包含对SEQ ID NO:1的前五个残基中的一者或多者的截短，并且其中所述多肽包含在所述多肽的N末端的延伸肽。
13.如权利要求12所述的重组经修饰FGF-1多肽，其中所述经修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:93-117的序列。
14.如权利要求12所述的重组经修饰FGF-1多肽，其中所述多肽进一步包含在所述延伸肽的N末端的甲硫氨酸残基。
15.如权利要求14所述的重组经修饰FGF-1多肽，其中所述经修饰FGF-1多肽是所述多肽的成熟形式。
16.如权利要求15所述的重组经修饰FGF-1多肽，其中所述经修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:118-141的序列。
17.如权利要求1-16中任一项所述的经修饰FGF-1多肽，其中所述经修饰FGF-1多肽以包含136个氨基酸的形式表达。
18.如权利要求1-16中任一项所述的经修饰FGF-1多肽，其中所述经修饰FGF-1多肽在其成熟形式中包含至少141个氨基酸。
19.一种重组经修饰FGF-1多肽，其包含在SEQ ID NO:1的位置67处的突变。
20.如权利要求19所述的重组经修饰FGF-1多肽，其中所述多肽进一步包含对SEQ IDNO:1的前五个残基中的一者或多者的截短。
21.如权利要求20所述的重组经修饰FGF-1多肽，其中所述经修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:146-149的序列。
22.如权利要求20所述的重组经修饰FGF-1多肽，其中所述多肽进一步包含延伸肽。
23.如权利要求22所述的重组经修饰FGF-1多肽，其中所述延伸肽包含SEQ ID NO:3的一个或多个氨基酸残基。
24.如权利要求23所述的重组经修饰FGF-1多肽，其中所述延伸肽片段包含如SEQ IDNO:4-8所示的序列中的任一者。
25.如权利要求19-24中任一项所述的重组经修饰FGF-1多肽，其中所述经修饰FGF-1多肽是所述多肽的成熟形式。
26.如权利要求25所述的重组经修饰FGF-1多肽，其中所述经修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:174-204的序列。
27.一种重组经修饰FGF-1多肽，其包含如SEQ ID NO.2所示的序列。
28.如权利要求27所述的重组经修饰FGF-1多肽，其中所述经修饰FGF-1多肽是所述多肽的成熟形式。
29.如权利要求1、7、12或19所述的重组经修饰FGF-1多肽，其中所述经修饰FGF-1多肽包含一个或多个选自以下的突变：Cys16Ser、Ala66Cys和Cys117Val。
30.一种重组经修饰FGF-1多肽，其中所述经修饰FGF-1包含SEQ ID NO:1的一个或多个突变，所述突变选自：Lys12Val、Cys16Ser、Ala66Cys、Cys117Val和Pro134Val，并且其中所述经修饰FGF-1多肽进一步包含肽ALTEK的至少一个残基。
31.一种重组经修饰FGF-1多肽，其包含SEQ ID NO:1的以下突变：Cys16Ser、Ala66Cys和Cys117Val，其中所述经修饰FGF-1多肽包含位于SEQ ID NO:1的第一残基的上游的甲硫氨酸残基以及位于所述N末端甲硫氨酸与SEQ ID NO:1的位置1之间的肽ALTEK的至少一个残基。
32.如权利要求1所述的重组经修饰FGF-1多肽，其中所述经修饰FGF-1多肽不在具有延伸肽的情况下表达，并且通过不涉及移除延伸肽的步骤的方法来产生。
33.一种药物组合物，其包含如权利要求1-32中任一项所述的重组多肽。
34.如权利要求33所述的药物组合物，其中所述药物组合物进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
35.如权利要求34所述的药物组合物，其中所述药物组合物是液体眼用制剂。
36.如权利要求35所述的药物组合物，其中所述药物制剂外部施用，经由微针向角膜中施用，或在前房内施用。
37.一种用于产生重组经修饰FGF-1多肽的方法，所述方法包括：在宿主细胞中表达所述经修饰FGF-1多肽，以及使所表达的多肽在所述宿主细胞的细胞质中成熟，其中所述经修饰FGF-1多肽包含SEQ ID NO:1的一个或多个突变，并且在具有位于SEQ ID NO:1的第一残基的上游的N末端甲硫氨酸残基的情况下表达。
38.一种用于产生重组经修饰FGF-1多肽的方法，所述方法包括：在宿主细胞中表达所述经修饰FGF-1多肽，以及使所表达的多肽在所述宿主细胞的细胞质中成熟，其中所述经修饰FGF-1多肽包含SEQ ID NO:1的一个或多个突变、在N末端残基与SEQ ID NO:1的位置1之间的延伸肽，并且在具有N末端甲硫氨酸残基的情况下表达。
39.一种用于产生重组经修饰FGF-1多肽的方法，所述方法包括：在宿主细胞中表达所述经修饰FGF-1多肽，以及使所表达的多肽在所述宿主细胞的细胞质中成熟，其中所述经修饰FGF-1多肽包含SEQ ID NO:1的一个或多个突变、延伸肽片段、对SEQ ID NO:1的前五个残基中的一者或多者的截短，并且其中所述多肽在具有位于SEQ ID NO:1的第一残基的上游的N末端甲硫氨酸残基的情况下表达。
40.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述N末端甲硫氨酸残基在所述多肽的成熟期间得以保留。
41.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述N末端甲硫氨酸残基在所述多肽的成熟期间由切割酶从所述多肽切下。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述切割酶是甲硫氨酸氨基肽酶(metAP)。
43.如权利要求42所述的方法，其中metAP是细菌metAP、酵母metAP或人metAP。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述切割酶是细菌metAP。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述方法包括表达包含如SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:16所示的序列的经修饰FGF-1多肽。
46.如权利要求37所述的方法，其中所述方法包括表达包含如SEQ ID NO:2所示的序列的经修饰FGF-1多肽。
47.如权利要求46所述的方法，其中SEQ ID NO:2是在所述宿主细胞的所述细胞质中成熟之后的所述多肽的序列。
48.一种用于产生重组经修饰FGF-1多肽的方法，所述方法包括：在宿主细胞中表达所述经修饰FGF-1多肽，以及使所表达的多肽在所述宿主细胞的细胞质中成熟，其中所述经修饰FGF-1多肽包含在SEQ ID NO:1的位置67处的突变。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述经修饰FGF-1多肽进一步包含延伸肽片段以及对SEQ ID NO:1的前五个残基中的一者或多者的截短，并且其中所述多肽在具有位于SEQID NO:1的第一残基的上游的N末端甲硫氨酸残基的情况下表达。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述方法包括使用溴化氰切割所述N末端甲硫氨酸残基。
51.一种用于产生根据权利要求1-32中任一项所述的重组经修饰FGF-1多肽的方法，所述方法包括：在宿主细胞中表达所述经修饰FGF-1多肽，通过亲和标签使所表达的多肽与亲和材料结合；切割所述亲和标签以释放所述多肽，以及使用试剂将所述多肽从所述亲和材料洗脱。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述亲和标签包括多组氨酸、多赖氨酸、多天冬氨酸或多谷氨酸。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述试剂包括甲醇、2-丙醇或另外的醇、二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮或另外的有机溶剂。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述亲和材料是树脂框架。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述亲和材料是离子交换树脂。
56.如权利要求51所述的方法，其中所述多肽在所述宿主细胞的细胞质中表达，并且不分泌至周质间隙中。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述宿主细胞是微生物宿主细胞。
58.如权利要求57所述的方法，其中微生物表达系统选自：大肠杆菌表达系统、新月柄杆菌表达系统和奇异变形杆菌表达系统。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述微生物表达系统是大肠杆菌表达系统。
60.一种治疗或预防哺乳动物的眼部疾病、病症或病状的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用根据权利要求1-32中任一项的药物组合物。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述眼部疾病、病症或病状是角膜或眼表面的疾病、病症或病状。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述眼部疾病、病症或病状是角膜内皮的疾病、病症或病状。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述角膜内皮的所述疾病、病症或病状是富克氏营养不良、大疱性角膜病变、1型先天性遗传性内皮营养不良、2型先天性遗传性内皮营养不良、后部多形性角膜营养不良或干眼综合征。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述眼部疾病、病症或病状是富克氏营养不良。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述眼部疾病、病症或病状是角膜上皮的疾病、病症或病状。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述角膜上皮的所述疾病、病症或病状是干眼综合征或由角膜手术或移植所致的角膜上皮损害。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述角膜手术是屈光性角膜切削术(PRK)或激光辅助原位角膜磨镶术(LASIK)。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述眼部疾病、病症或病状是角膜基质的疾病、病症或病状。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述角膜基质的所述疾病、病症或病状是圆锥形角膜、格子状角膜营养不良、颗粒状角膜营养不良、斑块状角膜营养不良、施奈德结晶状角膜营养不良、先天性基质角膜营养不良或斑点状角膜营养不良。
70.一种将角膜细胞移植至哺乳动物或促进细胞移植成功的方法，所述方法包括在将所述角膜细胞移植至所述哺乳动物之前、期间或之后用根据权利要求1-32中任一项的经修饰FGF-1或根据权利要求33-36中任一项的药物组合物处理待移植的所述角膜细胞。
71.一种预防在组织再生期间结疤的方法，所述方法包括施用根据权利要求1-32中任一项的经修饰FGF-1或根据权利要求33-36中任一项的药物组合物。
72.如权利要求71所述的方法，其中在经受小梁切除术之后向哺乳动物施用所述经修饰FGF-1。
73.一种治疗或预防患者的化学物质或糜烂剂诱发的损伤的方法，所述方法包括向所述患者施用根据权利要求1-32中任一项的经修饰FGF-1多肽或根据权利要求33-36中任一项的药物组合物。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述化学物质或糜烂剂诱发的损伤是眼部损伤或皮肤损伤。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述眼部损伤是角膜损伤。
76.一种治疗患者的角膜损伤的方法，所述方法包括施用根据权利要求1-32中任一项的经修饰FGF-1多肽或根据权利要求33-36中任一项的药物组合物，其中所述角膜损伤由化学物质或糜烂剂诱发，并且其中施用所述经修饰FGF-1会促进角膜的再生，预防角膜的变性，并且预防化学损伤的长期后遗症。
77.如权利要求73-76中任一项所述的方法，其中历经约7天至约40年的时期施用所述经修饰FGF-1以预防角膜组织的变性。
78.如权利要求77所述的方法，其中所述角膜组织包括角膜上皮、基质、角膜内皮或角膜神经支配。
79.如权利要求75所述的方法，其中所述角膜损伤是基质损伤。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述基质损伤包括基质结疤和角膜混浊。
81.一种预防患者的长期角膜损伤的方法，所述方法包括施用根据权利要求1-32中任一项的经修饰FGF-1多肽或根据权利要求33-36中任一项的药物组合物，其中所述角膜损伤由化学物质或糜烂剂引起。
82.如权利要求81所述的方法，其中所述角膜损伤是角膜内皮损伤。
83.如权利要求82所述的方法，其中施用所述经修饰FGF-1多肽会使角膜内皮细胞的功能增强，并且预防或减轻角膜的长期变性。
84.如权利要求82所述的方法，其中施用所述经修饰FGF-1多肽会预防角膜水肿和继发性前部角膜病变。
85.如权利要求82所述的方法，其中施用所述经修饰FGF-1多肽会预防角膜内皮细胞的丧失。
86.如权利要求81所述的方法，其中所述角膜损伤是基质损伤。
87.如权利要求86所述的方法，其中所述基质损伤包括基质结疤和角膜混浊。
88.如权利要求75所述的方法，其中所述角膜损伤是芥子气角膜病变(MGK)。
89.如权利要求86所述的方法，其中所述经修饰FGF-1多肽的施用会导致与MGK相关的组织病理学病状的改善。
90.如权利要求89所述的方法，其中组织病理学病状包括角膜上皮层的增生以及上皮-基质细胞分离。
91.如权利要求89所述的方法，其中所述经修饰FGF-1多肽的施用会导致水肿减轻以及角膜糜烂消除。
92.如权利要求91所述的方法，其中所述角膜糜烂的特征在于角膜的脱上皮化。
93.如权利要求92所述的方法，其中所述经修饰FGF-1多肽的施用会减轻角膜脱上皮化的严重性。
94.如权利要求93所述的方法，其中所述经修饰FGF-1多肽的施用会导致角膜的较快再上皮化。
95.一种使暴露于化学物质或糜烂剂的患者的眼表面上皮再生的方法，所述方法包括经眼施用根据权利要求1-32中任一项的经修饰FGF-1多肽或根据权利要求33-36中任一项的药物组合物。
96.如权利要求95所述的方法，其中所述眼表面上皮是角膜上皮。
97.一种预防暴露于化学物质或糜烂剂的患者的眼部上皮损伤的方法，所述方法包括经眼施用根据权利要求1-32中任一项的经修饰FGF-1多肽或根据权利要求33-36中任一项的药物组合物。
98.如权利要求97所述的方法，其中所述眼部损伤是由暴露于糜烂剂引起的角膜损伤。
99.如权利要求98所述的方法，其中所述角膜损伤是角膜上皮脱离。
100.如权利要求99所述的方法，其中所述经修饰FGF-1多肽的施用会导致减轻在暴露于所述糜烂剂之后角膜上皮脱离的严重性。
101.如权利要求100所述的方法，其中所述经修饰FGF-1多肽的施用会导致水肿减轻以及角膜糜烂消除。
102.如权利要求101所述的方法，其中所述角膜糜烂的特征在于角膜的脱上皮化。
103.如权利要求102所述的方法，其中所述经修饰FGF-1多肽的施用会减轻角膜脱上皮化的严重性。
104.如权利要求103所述的方法，其中所述经修饰FGF-1多肽的施用会导致角膜的较快再上皮化。
105.如权利要求73-104中任一项所述的方法，其中历经多达两周的时期施用所述经修饰FGF-1多肽，或施用所述经修饰FGF-1多肽直至所述角膜上皮的完全再生。
106.如权利要求105所述的方法，其中在暴露于所述糜烂剂之后48小时内施用第一剂所述经修饰FGF-1多肽。
107.如权利要求73-106中任一项所述的方法，其中所述化学物质包括氯气、光气、碱或酸。
108.如权利要求73-106中任一项所述的方法，其中所述糜烂剂包括硫芥(SM)、氮芥(NM)、路易氏剂或半芥(2-氯乙基乙基硫醚(CEES))。
109.如权利要求107所述的方法，其中所述糜烂剂是NM。
110.如权利要求109所述的方法，其中所述经修饰FGF-1多肽的施用会抑制NM诱导的ADAM17上调。
111.如权利要求73所述的方法，其中所述化学物质或糜烂剂诱发的损伤是化学灼伤。
112.如权利要求111所述的方法，其中所述化学灼伤由氯气、光气、碱或酸引起。
113.如权利要求73-112中任一项所述的方法，其中所述经修饰FGF-1多肽包含SEQ IDNO:1的位置16、66和117的突变。
114.如权利要求113所述的方法，其中所述突变是Cys16Ser、Ala66Cys和Cys117Val。
115.如权利要求114所述的方法，其中所述经修饰FGF-1多肽在暴露于糜烂剂后较不易受到氧化。
116.如权利要求115所述的方法，其中所述糜烂剂是NM。
117.一种治疗疱疹性角膜病变的方法，所述方法包括向哺乳动物施用根据权利要求1-32中任一项的经修饰FGF-1多肽或根据权利要求33-36中任一项的药物组合物。
118.如权利要求117所述的方法，其中所述疱疹性角膜病变由单纯疱疹病毒的原发感染引起。
119.如权利要求118所述的方法，其中所述疱疹性角膜病变是慢性疱疹性角膜病变。
120.如权利要求119所述的方法，其中所述疱疹性角膜病变继发于单纯疱疹病毒感染。
121.如权利要求120所述的方法，其中继发于单纯疱疹病毒感染的所述疱疹性角膜病变包括神经营养性角膜病变。
122.如权利要求117-121中任一项所述的方法，其中每日两次施用根据权利要求1-32中任一项所述的经修饰FGF-1多肽或根据权利要求33-36中任一项所述的药物组合物。
123.如权利要求117-122中任一项所述的方法，其中持续30天的持续时间施用根据权利要求1-32中任一项所述的经修饰FGF-1多肽或根据权利要求33-36中任一项所述的药物组合物。
124.如权利要求117-123中任一项所述的方法，其中根据权利要求1-32中任一项所述的经修饰FGF-1多肽或根据权利要求33-36中任一项所述的药物组合物的施用会导致角膜溃疡的愈合；疼痛和炎症的持续时间的缩短；疼痛和炎症的减轻；角膜混浊、模糊、结疤的减轻；或其任何组合。
125.如权利要求117-124中任一项所述的方法，其中所述角膜溃疡包括疱疹性角膜溃疡。
126.一种治疗或预防患者的化学物质或糜烂剂诱发的损伤的方法，所述方法包括向所述患者施用包含一个或多个在SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134处的突变的经修饰FGF-1。
127.如权利要求126所述的方法，其中所述化学物质或糜烂剂诱发的损伤是眼部损伤或皮肤损伤。
128.如权利要求127所述的方法，其中所述眼部损伤是角膜损伤。
129.一种治疗患者的角膜损伤的方法，所述方法包括向所述患者施用包含一个或多个在SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134处的突变的经修饰FGF-1多肽，其中所述角膜损伤由化学物质或糜烂剂诱发，并且其中施用所述经修饰FGF-1会促进角膜的再生，预防角膜的变性，并且预防化学损伤的长期后遗症。
130.如权利要求126-129中任一项所述的方法，其中历经约7天至约40年的时期施用所述经修饰FGF-1以预防角膜组织的变性。
131.如权利要求130所述的方法，其中所述角膜组织包括角膜上皮、基质、角膜内皮或角膜神经支配。
132.如权利要求128所述的方法，其中所述角膜损伤是基质损伤。
133.如权利要求132所述的方法，其中所述基质损伤包括基质结疤和角膜混浊。
134.一种预防患者的长期角膜损伤的方法，所述方法包括向所述患者施用包含一个或多个在SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134处的突变的经修饰FGF-1多肽，其中所述角膜损伤由化学物质或糜烂剂引起。
135.如权利要求134所述的方法，其中所述角膜损伤是角膜内皮损伤。
136.如权利要求135所述的方法，其中施用所述经修饰FGF-1多肽会使角膜内皮细胞的功能增强，并且预防或减轻角膜的长期变性。
137.如权利要求136所述的方法，其中施用所述经修饰FGF-1多肽会预防角膜水肿和继发性前部角膜病变。
138.如权利要求137所述的方法，其中施用所述经修饰FGF-1多肽会预防角膜内皮细胞的丧失。
139.如权利要求134所述的方法，其中所述角膜损伤是基质损伤。
140.如权利要求139所述的方法，其中所述基质损伤包括基质结疤和角膜混浊。
141.如权利要求128所述的方法，其中所述角膜损伤是芥子气角膜病变(MGK)。
142.如权利要求139所述的方法，其中所述经修饰FGF-1多肽的施用会导致与MGK相关的组织病理学病状的改善。
143.如权利要求142所述的方法，其中组织病理学病状包括角膜上皮层的增生以及上皮-基质细胞分离。
144.如权利要求142所述的方法，其中所述经修饰FGF-1多肽的施用会导致水肿减轻以及角膜糜烂消除。
145.如权利要求144所述的方法，其中所述角膜糜烂的特征在于角膜的脱上皮化。
146.如权利要求145所述的方法，其中所述经修饰FGF-1多肽的施用会减轻角膜脱上皮化的严重性。
147.如权利要求146所述的方法，其中所述经修饰FGF-1多肽的施用会导致角膜的较快再上皮化。
148.一种使暴露于化学物质或糜烂剂的患者的眼表面上皮再生的方法，所述方法包括经眼施用包含一个或多个在SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134处的突变的经修饰FGF-1多肽。
149.如权利要求148所述的方法，其中所述眼表面上皮是角膜上皮。
150.一种预防暴露于化学物质或糜烂剂的患者的眼部上皮损伤的方法，所述方法包括经眼施用包含一个或多个在SEQ ID NO:1的位置12、16、66、117和134处的突变的经修饰FGF-1多肽。
151.如权利要求150所述的方法，其中所述眼部损伤是由暴露于糜烂剂引起的角膜损伤。
152.如权利要求151所述的方法，其中所述角膜损伤是角膜上皮脱离。
153.如权利要求152所述的方法，其中所述经修饰FGF-1多肽的施用会导致减轻在暴露于所述糜烂剂之后角膜上皮脱离的严重性。
154.如权利要求153所述的方法，其中所述经修饰FGF-1多肽的施用会导致水肿减轻以及角膜糜烂消除。
155.如权利要求154所述的方法，其中所述角膜糜烂的特征在于角膜的脱上皮化。
156.如权利要求155所述的方法，其中所述经修饰FGF-1多肽的施用会减轻角膜脱上皮化的严重性。
157.如权利要求156所述的方法，其中所述经修饰FGF-1多肽的施用会导致角膜的较快再上皮化。
158.如权利要求126-157中任一项所述的方法，其中历经多达两周的时期施用所述经修饰FGF-1多肽，或施用所述经修饰FGF-1多肽直至所述角膜上皮的完全再生。
159.如权利要求158所述的方法，其中在暴露于所述糜烂剂之后48小时内施用第一剂所述经修饰FGF-1多肽。
160.如权利要求126-157中任一项所述的方法，其中所述化学物质包括氯气、光气、碱或酸。
161.如权利要求126-157中任一项所述的方法，其中所述糜烂剂包括硫芥(SM)、氮芥(NM)、路易氏剂或半芥(2-氯乙基乙基硫醚(CEES))。
162.如权利要求161所述的方法，其中所述糜烂剂是NM。
163.如权利要求162所述的方法，其中所述经修饰FGF-1多肽的施用会抑制NM诱导的ADAM17上调。
164.如权利要求126所述的方法，其中所述化学物质或糜烂剂诱发的损伤是化学灼伤。
165.如权利要求164所述的方法，其中所述化学灼伤由氯气、光气、碱或酸引起。
166.如权利要求126-165中任一项所述的方法，其中所述经修饰FGF-1多肽包含SEQ IDNO:1的位置16、66和117的突变。
167.如权利要求166所述的方法，其中所述突变是Cys16Ser、Ala66Cys和Cys117Val。
168.如权利要求167所述的方法，其中所述经修饰FGF-1多肽在暴露于糜烂剂后较不易受到氧化。
169.如权利要求168所述的方法，其中所述糜烂剂是NM。
170.如权利要求126-169中任一项所述的方法，其中所述经修饰FGF-1多肽包含如SEQID NO:2以及9-206中的任一者所示的序列。
171.如权利要求126-169中任一项所述的方法，其中所述经修饰FGF-1多肽包含如SEQID NO:2以及9-204中的任一者所示的序列。
172.如权利要求126-169中任一项所述的方法，其中所述经修饰FGF-1多肽包含如SEQID NO:205和206中的任一者所示的序列。
173.如权利要求126-169中任一项所述的方法，其中所述经修饰FGF-1多肽包含如SEQID NO:2所示的序列。
174.如权利要求126-169中任一项所述的方法，其中所述经修饰FGF-1多肽包含如SEQID NO:205所示的序列。
175.如权利要求126-169中任一项所述的方法，其中所述经修饰FGF-1多肽包含如SEQID NO:206所示的序列。
176.一种治疗疱疹性角膜病变的方法，所述方法包括向哺乳动物施用包含如SEQ IDNO:205和206中的任一者所示的序列的经修饰FGF-1多肽或包含所述经修饰FGF-1多肽的药物组合物。
177.如权利要求176所述的方法，其中所述疱疹性角膜病变由单纯疱疹病毒的原发感染引起。
178.如权利要求177所述的方法，其中所述疱疹性角膜病变是慢性疱疹性角膜病变。
179.如权利要求178所述的方法，其中所述疱疹性角膜病变继发于单纯疱疹病毒感染。
180.如权利要求179所述的方法，其中继发于单纯疱疹病毒感染的所述疱疹性角膜病变包括神经营养性角膜病变。
181.如权利要求176-180中任一项所述的方法，其中每日两次施用包含如SEQ ID No:205和206中的任一者所示的序列的所述经修饰FGF-1多肽或包含所述经修饰FGF-1多肽的药物组合物。
182.如权利要求176-181中任一项所述的方法，其中持续30天的持续时间施用包含如SEQ ID No:205和206中的任一者所示的序列的所述经修饰FGF-1多肽或包含所述经修饰FGF-1多肽的药物组合物。
183.如权利要求176-182中任一项所述的方法，其中包含如SEQ ID No:205和206中的任一者所示的序列的所述经修饰FGF-1多肽或包含所述经修饰FGF-1多肽的药物组合物的施用会导致角膜溃疡的愈合；疼痛和炎症的持续时间的缩短；疼痛和炎症的减轻；角膜混浊、模糊、结疤的减轻；或其任何组合。
184.如权利要求176-183中任一项所述的方法，其中所述角膜溃疡包括疱疹性角膜溃疡。
185.一种治疗疱疹性角膜病变的方法，所述方法包括向哺乳动物施用包含如SEQ IDNO:2以及9-204中的任一者所示的序列的经修饰FGF-1多肽或包含所述经修饰FGF-1多肽的药物组合物。
186.如权利要求185所述的方法，其中所述疱疹性角膜病变由单纯疱疹病毒的原发感染引起。
187.如权利要求186所述的方法，其中所述疱疹性角膜病变是慢性疱疹性角膜病变。
188.如权利要求187所述的方法，其中所述疱疹性角膜病变继发于单纯疱疹病毒感染。
189.如权利要求188所述的方法，其中继发于单纯疱疹病毒感染的所述疱疹性角膜病变包括神经营养性角膜病变。
190.如权利要求185-189中任一项所述的方法，其中每日两次施用包含如SEQ ID No:2以及9-204中的任一者所示的序列的所述经修饰FGF-1多肽或包含所述经修饰FGF-1多肽的药物组合物。
191.如权利要求185-190中任一项所述的方法，其中持续30天的持续时间施用包含如SEQ ID No:2以及9-204中的任一者所示的序列的所述经修饰FGF-1多肽或包含所述经修饰FGF-1多肽的药物组合物。
192.如权利要求185-191中任一项所述的方法，其中包含如SEQ ID No:2以及9-204中的任一者所示的序列的所述经修饰FGF-1多肽或包含所述经修饰FGF-1多肽的药物组合物的施用会导致角膜溃疡的愈合；疼痛和炎症的持续时间的缩短；疼痛和炎症的减轻；角膜混浊、模糊、结疤的减轻；或其任何组合。
193.如权利要求185-192中任一项所述的方法，其中所述角膜溃疡包括疱疹性角膜溃疡。
194.如权利要求176-193中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物包括人。
195.如权利要求117-125中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物包括人。
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