CN111148519A - 制备寡核苷酸化合物的方法 - Google Patents

制备寡核苷酸化合物的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111148519A
CN111148519A CN201880062621.9A CN201880062621A CN111148519A CN 111148519 A CN111148519 A CN 111148519A CN 201880062621 A CN201880062621 A CN 201880062621A CN 111148519 A CN111148519 A CN 111148519A
Authority
CN
China
Prior art keywords
oligonucleotide
composition
certain embodiments
000mmol
mmol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201880062621.9A
Other languages
English (en)
Inventor
安东尼·弗兰克
凯文·克洛普弗
小唐纳德·约瑟夫·加拉格尔
拉蕾·贾法普尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nogra Pharma Ltd
Original Assignee
Celgene Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Celgene Corp filed Critical Celgene Corp
Publication of CN111148519A publication Critical patent/CN111148519A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/313—Phosphorodithioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C12N2310/3341—5-Methylcytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明涉及包含寡核苷酸、特别是SMAD7反义寡核苷酸的组合物以及制备所述组合物的方法。

Description

制备寡核苷酸化合物的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年7月28日提交的美国临时申请号62/538,504的优先权权益。前述相关申请的全部内容以引用方式并入本文。
1.技术领域
本申请涉及包含寡核苷酸、特别是Smad7反义寡核苷酸的组合物以及制备所述组合物的方法。
2.背景技术
寡核苷酸可用于多种生物学和生化应用中。例如，寡核苷酸可用于药物探索和开发中、用于诊断测试中、用作研究剂(诸如聚合酶链式反应(PCR)中的引物或探针)、用作靶标验证中的反义剂、用作转录因子的竞争性抑制剂、用作核酶、用作适体、用作免疫系统的刺激物或，或用作治疗疾病的生物治疗剂。因此，对寡核苷酸的增加的需求和使用已经导致对用于以越来越大的数千克规模合成具有GMP品质的寡核苷酸的快速、廉价且有效的方法的需求日益增长。
Mongersen(以前称为GED-0301)是一种21碱基的单链硫代磷酸酯寡核苷酸，其可与人SMAD7信使RNA(mRNA)杂交。Monteleone等人，2015,NEJM 372:1104-1113。在2期临床研究中，接受mongersen的克罗恩氏病参与者的缓解率和临床反应率明显高于接受安慰剂的参与者。Monteleone等人，2015,NEJM 372:1104-1113。Mongersen是序列为5'-GTC GCC CCTTCT CCC CGC AGC-3'的21碱基寡核苷酸。硫代磷酸酯化学反应包括在每个核苷酸间键中将非键合氧替换为硫原子。通过5-甲基化修饰核苷酸位置3和16处的胞嘧啶残基。
制备天然存在的寡核苷酸和修饰的寡核苷酸(诸如硫代磷酸酯寡核苷酸和二硫代磷酸酯寡核苷酸)的当前方法包括溶液合成工艺和固相合成工艺。例如，在固相合成中，所述工艺依赖于将核苷酸顺序地添加到生长中的寡核苷酸链的一个端部。仍然需要制备大的、数千克规模的具有GMP质量的单链硫代磷酸酯寡核苷酸，诸如Mongersen，所述单链硫代磷酸酯寡核苷酸通常是生物学研究、临床前试验和临床试验以及商业化生产所必需的，并且仍然需要这样的用于制备单链硫代磷酸酯寡核苷酸的合成方法，所述合成方法是快速、廉价且有效的，并且能够以大的数千克规模生产具有GMP或CGMP品质的最终靶寡核苷酸。
3.发明内容
在一个方面中，本文提供了单批寡核苷酸组合物，所述单批寡核苷酸组合物包含至少700mmol的寡核苷酸和至多25重量％的水；其中所述寡核苷酸具有以下核酸序列：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
在另一方面中，本文提供了单批寡核苷酸组合物，所述单批寡核苷酸组合物包含至少2g/mmol的合成规模为至少700mmol的寡核苷酸和至多25重量％的水；其中所述寡核苷酸具有以下核酸序列：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
在另一方面中，本文提供了单批寡核苷酸组合物，所述单批寡核苷酸组合物包含至少2kg的寡核苷酸和至多25重量％的水；其中所述寡核苷酸具有以下核酸序列：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
在另一方面中，本文提供了单批寡核苷酸组合物，所述单批寡核苷酸组合物包含至少50mol％的来自至少一个700mmol或更大的寡核苷酸合成柱的寡核苷酸输出，以及至多25重量％的水；其中所述寡核苷酸具有以下核酸序列：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
在另一方面中，本文提供了一种寡核苷酸的基本上纯的寡核苷酸组合物，其中5'-末端核苷的5'-羟基被保护；其中所述寡核苷酸具有以下核酸序列：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
在另一方面中，本文提供了至少700mmol的寡核苷酸组合物，所述寡核苷酸组合物包含具有至多25重量％的水和以下核酸序列的寡核苷酸：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，
其中：
1)X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷；并且
2)寡核苷酸是根据包括以下步骤的方法制备的：
a)提供连接到固体支撑物的接头，其中所述接头包含受保护的羟基；
b)使所述接头的受保护的羟基脱保护，从而产生脱保护的羟基；
c)独立地提供核苷亚磷酰胺，其中所述核苷亚磷酰胺包含受保护的羟基和受保护的亚磷酰胺；
d)将核苷亚磷酰胺独立地偶联至接头的脱保护的羟基，或来自反应循环的先前迭代的核苷的脱保护的羟基，从而产生亚磷酸三酯连接的核苷；
e)独立地硫醇化受保护的亚磷酸三酯键，从而产生受保护的硫代磷酸酯键；
f)任选地，对未反应的脱保护的羟基独立地加帽；
g)任选地，使核苷的受保护的羟基独立地脱保护；
h)重复所述提供、偶联、硫醇化、加帽和脱保护步骤(步骤c)至g)达预定次数以提供与固体支撑物结合的寡核苷酸；
i)使受保护的硫代磷酸酯键脱保护；
j)从固体支撑物上切割寡核苷酸；
k)从固体支撑物上洗脱寡核苷酸；
l)使用离子交换色谱柱纯化寡核苷酸洗脱物；以及
m)使用薄膜蒸发浓缩寡核苷酸化合物的溶液。
在本文公开的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法的某些实施方案中，寡核苷酸的核苷酸间键中的至少一个是O,O-连接的硫代磷酸酯。
在本文公开的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法的某些实施方案中，寡核苷酸的所有核苷酸间键均是O,O-连接的硫代磷酸酯。
在本文公开的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物或制备方法的某些实施方案中，纯化步骤l)包括：
1)将来自洗脱步骤k)的寡核苷酸洗脱物加载到离子交换色谱柱上；
2)使来自末端核苷的受保护的羟基脱保护；以及
3)使用盐梯度从离子交换色谱柱洗脱寡核苷酸。
在本文公开的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物或制备方法的某些实施方案中，纯化步骤l)包括：
1)将来自洗脱步骤k)的寡核苷酸洗脱物加载到离子交换色谱柱上；
2)使来自末端核苷的受保护的羟基脱保护；
3)使用盐梯度从离子交换色谱柱洗脱寡核苷酸；以及
4)经由超滤和/或渗滤使来自离子交换柱的寡核苷酸洗脱物脱盐。
在本文公开的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物或制备方法的某些实施方案中，浓缩步骤m)包括使用薄膜蒸发浓缩寡核苷酸化合物的脱盐溶液。
在本文公开的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物或制备方法的某些实施方案中，用质子酸对加载的寡核苷酸洗脱物的末端核苷的受保护的5'-羟基进行脱保护。
在本文公开的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物或制备方法的某些实施方案中，用乙酸(诸如80％的乙酸水溶液)对受保护的5'-羟基基团进行脱保护。
在本文公开的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物或制备方法的某些实施方案中，经由超滤和/或渗滤工艺将完全脱保护的寡核苷酸脱盐。
在本文公开的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物或制备方法的某些实施方案中，使用薄膜蒸发浓缩完全脱保护的寡核苷酸洗脱物。
在本文公开的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物或制备方法的某些实施方案中，由薄膜蒸发产生的浓缩的完全脱保护的寡核苷酸是液体组合物，并且不进行冷冻干燥工艺。
在本文公开的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物或制备方法的某些实施方案中，将由薄膜蒸发产生的浓缩的完全脱保护的寡核苷酸经由冷冻干燥工艺进一步浓缩。
在本文公开的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物或制备方法的某些实施方案中，所述方法步骤按叙述它们的顺序执行。
在另一方面中，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如本文所公开的单批组合物或基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据如本文所公开的制备方法制备的寡核苷酸组合物中的至少一部分，以及药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。
在药物组合物的某些实施方案中，药物组合物是口服剂型，诸如片剂或包衣片剂。
在药物组合物的某些实施方案中，药物组合物包含在介于10-500mg之间的范围内的具有以下核酸序列的寡核苷酸：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
在药物组合物的某些实施方案中，药物组合物包含约40mg或约160mg的具有以下核酸序列的寡核苷酸：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
在另一方面中，本文提供了一种制备药物组合物的方法，所述方法包括配置如本文所公开的单批组合物或基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据如本文所公开的制备方法制备的寡核苷酸组合物中的至少一部分，以及药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。
在另一方面中，本文提供了一种制备一系列药物组合物的方法，所述方法包括将如本文所公开的单批组合物或基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据如本文所公开的制备方法制备的寡核苷酸组合物分成适于口服剂量的一系列部分、量或剂量，以及将所述适于口服剂量的一系列部分、量或剂量中的适于口服剂量的每个部分、量或剂量与药学上可接受的佐剂和/或赋形剂组合。
在制备所述一系列药物组合物的方法的某些实施方案中，所述一系列药物组合物是至少100种药物组合物。
在制备所述一系列药物组合物的方法的某些实施方案中，所述一系列药物组合物是介于100-1,000,000种之间的药物组合物。
在制备所述一系列药物组合物的方法的某些实施方案中，适于口服剂量的一系列部分、量或剂量中的适于口服剂量的每个部分、量或剂量包含在介于10-500mg之间的范围内的具有以下核酸序列的寡核苷酸：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
在制备所述一系列药物组合物的方法的某些实施方案中，适于口服剂量的一系列部分、量或剂量中的适于口服剂量的每个部分、量或剂量包含约40mg或约160mg的具有以下核酸序列的寡核苷酸：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
在制备所述一系列药物组合物的方法的某些实施方案中，所述一系列药物组合物是一系列片剂。
在制备所述一系列药物组合物的方法的某些实施方案中，所述一系列药物组合物是一系列包衣片剂。
在另一方面中，本文提供了一种药物组合物批料，所述药物组合物批料包含如本文所公开的单批组合物或基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据如本文所公开的制备方法制备的寡核苷酸组合物中的至少一部分，以及药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。
在药物组合物批料的某些实施方案中，所述药物组合物批料包含至少10重量％、至少20重量％、至少30重量％、至少40重量％、至少50重量％、至少60重量％、至少70重量％、至少80重量％、至少90重量％、至少95重量％或100重量％的如本文所公开的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据制备方法制备的寡核苷酸组合物。
在药物组合物批料的某些实施方案中，药物组合物批料包含至少一种口服剂型，诸如片剂或包衣片剂。
在药物组合物批料的某些实施方案中，药物组合物批料包含一系列口服剂型，诸如一系列片剂或一系列包衣片剂。
在如本文公开的单批组合物、药物组合物批料、制备单批组合物的方法、制备药物组合物的方法、或制备一系列药物组合物的方法的某些实施方案中，单批组合物、药物组合物批料、制备单批组合物的方法、制备药物组合物的方法、或制备一系列药物组合物的方法均符合分别在21 CFR 210.3(2)和21 CFR 210.3(10)下定义的术语批或批次。
在另一方面中，本文提供了一种治疗或管理患有炎症性肠病(inflammatorybowel disease,IBD)的患者的IBD的方法，所述方法包括施用如本文所公开的药物组合物。
在治疗或管理患有炎症性肠病(IBD)的患者的IBD的方法的某些实施方案中，IBD是克罗恩氏病(Crohn's disease,CD)。
在治疗或管理患有炎症性肠病(IBD)的患者的IBD的方法的某些实施方案中，IBD是溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)。
4.附图说明
以下附图例示了所公开的工艺的各方面，但不限制该工艺或本文公开的示例的范围。
图1.表示制备如本文所用的单批寡核苷酸组合物的某些实施方案的示意图。
5.具体实施方式
如本文所用，术语“抗SMAD7 ODN”和“抗SMAD7寡核苷酸”应理解为是指这样的寡核苷酸(ODN)，所述ODN包含与从SMAD7基因转录的mRNA分子中的核酸序列互补的核酸序列。更具体地，这种寡核苷酸可以与这种mRNA的编码区域中的核酸序列互补。在某些实施方案中，当将抗SMAD7 ODN引入细胞(例如，免疫细胞，诸如PBMC、pDC或B细胞)中时，所述抗SMAD7ODN可以减少SMAD7的表达。在某些实施方案中，抗SMAD7 ODN可以减少从该基因转录的mRNA的表达。在某些实施方案中，抗SMAD7 ODN可减少该基因编码的蛋白质的表达。在某些实施方案中，抗SMAD7 ODN可以减少由该基因编码的蛋白质从引入了抗SMAD7 ODN的细胞中的分泌。
如本文所用的术语“寡核苷酸”和“ODN”应理解为是指包含至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或至少30个核苷酸长；至多4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或至多30个核苷酸长；或介于10个与25个核苷酸长之间、介于15个与30个核苷酸长之间、介于15个与25个核苷酸长之间、或介于20个与30个核苷酸长之间；或18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或26个核苷酸长的核酸序列的核酸。在某些实施方案中，ODN的两个相邻核苷之间的核苷间键可以是磷酸酯键，例如，可以是单磷酸酯键，或者可以是硫代磷酸酯键。在某些实施方案中，ODN可包含一个或多个磷酸酯核苷间键和一个或多个硫代磷酸酯核苷间键。例如，在某些实施方案中，ODN的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷通过磷酸酯键(例如单磷酸酯键)连接。例如，在某些实施方案中，ODN的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷通过硫代磷酸酯键连接。在某些实施方案中，ODN的低聚糖(或糖)部分是天然存在的糖，诸如呋喃糖环系(例如核糖或2'-脱氧核糖环系)。例如，在某些实施方案中，ODN是脱氧核糖核苷酸(即，ODN的低聚糖(或糖)部分是脱氧核糖)。在某些实施方案中，ODN是核糖核苷酸(即，ODN的低聚糖(或糖)部分是核糖)。例如，在某些实施方案中，用于制备所需ODN的低聚糖(或糖)部分是脱氧核糖。在某些实施方案中，用于制备所需ODN的核苷的低聚糖(或糖)部分是核糖。在某些实施方案中，ODN的一个或多个碱基被化学修饰，例如被甲基化(例如，5-甲基-胞嘧啶、6-O-甲基-鸟嘌呤、或7-甲基-鸟嘌呤)。例如在第5.2节中描述了ODN的其他示例性化学修饰。
如本文所用的术语“SMAD7”(也称为CRCS3、FLJ16482、MADH7、MADH8、MAD(针对decapentaplegic的母本，果蝇)同源物7、MAD同源物8、SMAD、针对DPP同源物7的母本、针对DPP同源物8的母本)被理解为是指人蛋白质或由Entrez GeneID号4092标识的基因及其等位基因变体所编码的任何mRNA转录物。
如本文所用的术语“单批组合物”和“单批寡核苷酸组合物”应理解为是指这样的寡核苷酸组合物，所述寡核苷酸组合物来源于具有固体支撑物(例如，连接有接头的固体支撑物)和指定量的负载能力的至少一个寡核苷酸合成柱；或来源于在具有固体支撑物和指定量的负载能力的寡核苷酸合成柱上进行的至少一个合成轮次。例如，在某些实施方案中，单批组合物(或单批寡核苷酸组合物)是指这样的寡核苷酸组合物，所述寡核苷酸组合物来源于具有固体支撑物(例如，连接有接头的固体支撑物)和指定量的负载能力的多个寡核苷酸合成柱；或来源于在具有固体支撑物和指定量的负载能力的寡核苷酸合成柱上进行的多个合成轮次。例如，在某些实施方案中，单批组合物(或单批寡核苷酸组合物)是指这样的寡核苷酸组合物，所述寡核苷酸组合物来源于至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个或至多60个具有固体支撑物和指定量的负载能力的寡核苷酸合成柱或在具有指定量的负载能力的寡核苷酸合成柱上进行的合成轮次(例如，在并行柱上或彼此相邻的柱上进行的轮次)，例如不超过介于1-60个之间、介于1-55个之间、介于1-50个之间、介于1-45个之间、介于1-40个之间、介于1-35个之间、介于1-30个之间、介于1-25个之间、介于1-20个之间、介于1-15个之间、介于1-10个之间、介于1-9个之间、介于1-8个之间、介于1-7个之间、介于1-6个之间、介于1-5个之间、介于1-4个之间、介于1-3个之间、介于1-2个之间、介于3-10个之间、介于3-8个之间、介于3-5个之间、介于4-6个之间、介于5-10个之间、介于10-60个之间、介于10-50个之间、介于10-40个之间、介于10-30个之间、介于10-25个之间、介于10-20个之间、介于10-15个之间、介于20-50个之间、介于30-60个之间或介于40-55个之间的具有固体支撑物和指定量的负载能力的寡核苷酸合成柱或在具有指定量的负载能力的寡核苷酸合成柱上进行的合成轮次(例如，在并行柱上或彼此相邻的柱上进行的轮次)。例如，在某些实施方案中，单批组合物(或单批寡核苷酸组合物)是指这样的寡核苷酸组合物，所述寡核苷酸组合物来源于具有固体支撑物(例如，连接有接头的固体支撑物)和指定量的负载能力的至少一个或多个寡核苷酸合成柱；或来源于在具有固体支撑物和指定量的负载能力的寡核苷酸合成柱上进行的至少一个或多个合成轮次；其中来自具有固体支撑物和指定量的负载能力的至少一个或多个寡核苷酸合成柱(或合成轮次)的寡核苷酸合成输出可：(1)提供作为液体寡核苷酸组合物或固体寡核苷酸组合物的单批组合物(或单批寡核苷酸组合物)；或(2)进行合并或组合(以使所得合并/组合的寡核苷酸组合物具有一致的特性和性质，例如物理和化学性质分布在整个所述所得的合并/组合的寡核苷酸组合物中)，以提供作为液体寡核苷酸组合物或固体寡核苷酸组合物的单批组合物(或单批寡核苷酸组合物)。例如，在某些实施方案中，单批组合物(或单批寡核苷酸组合物)是指这样的寡核苷酸组合物，所述寡核苷酸组合物来源于具有固体支撑物(例如；连接有接头的固体支撑物)和指定量的负载能力的至少一个或多个寡核苷酸合成柱；或来源于在具有固体支撑物和指定量的负载能力的寡核苷酸合成柱上进行的至少一个或多个合成轮次；其中来自具有固体支撑物和指定量的负载能力的至少一个或多个寡核苷酸合成柱(或合成轮次)的寡核苷酸合成输出可：(1)通过至少一个另外的工艺以单次迭代或多次并行迭代(不一定同时进行)进行处理，所述至少一个另外的工艺包括：寡核苷酸化学转化工艺(例如，寡核苷酸脱保护或从固体支撑物上切割)、寡核苷酸纯化工艺(例如，离子交换色谱)、寡核苷酸脱盐工艺(例如，超滤和/或渗滤)、液体组合物浓缩工艺(例如，薄膜蒸发)或干燥工艺(例如，冷冻干燥)，或它们的组合；(2)进行合并或组合(以使所得合并/组合的寡核苷酸组合物具有一致的特性和性质，例如物理和化学性质分布在整个所述所得的合并/组合的寡核苷酸组合物中)：(a)然后通过至少一个另外的工艺(或它们的组合)以单次迭代或多次并行迭代(不一定同时进行)进行处理；或(b)随后将所得合并/组合的寡核苷酸组合物分成更小的部分，然后通过至少一个另外的工艺(或它们的组合)以多次并行迭代(不一定同时进行)进行处理；或(3)分成更小的部分，然后通过至少一个另外的工艺(或它们的组合)以多个并行迭代(不一定同时进行)进行处理。例如，在某些实施方案中，单批组合物(或单批寡核苷酸组合物)是指这样的寡核苷酸组合物，所述寡核苷酸组合物来源于具有固体支撑物(例如，连接有接头的固体支撑物)和指定量的负载能力的至少一个或多个寡核苷酸合成柱；或来源于在具有固体支撑物和指定量的负载能力的寡核苷酸合成柱上进行的至少一个或多个合成轮次；其中来自具有固体支撑物和指定量的负载能力的至少一个或多个寡核苷酸合成柱(或合成轮次)的寡核苷酸合成输出可：通过至少一个另外的工艺以单次迭代或多次并行迭代(不一定同时进行)进行处理，所述至少一个另外的工艺包括：寡核苷酸化学转化工艺(例如，寡核苷酸脱保护或从固体支撑物上切割)、寡核苷酸纯化工艺(例如，离子交换色谱)、寡核苷酸脱盐工艺(例如，超滤和/或渗滤)、液体组合物浓缩工艺(例如，薄膜蒸发)或干燥工艺(例如，冷冻干燥)，或它们的组合；其中：(1)寡核苷酸合成输出可以：(a)进行合并或组合(以使所得合并/组合的寡核苷酸组合物具有一致的特性和性质，例如物理和化学性质分布在整个所述所得合并/组合的寡核苷酸组合物中)：(i)然后通过至少一个另外的工艺(或它们的组合)以单次迭代或多次并行迭代(不一定同时进行)进行处理；或者(ii)随后将所得的合并/组合的寡核苷酸组合物分成更小的部分，然后通过至少一个另外的工艺(或它们的组合)以多次并行迭代(不一定同时进行)进行处理；或者(b)分成更小的部分，然后通过至少一个另外的工艺(或它们的组合)以多次并行迭代(不一定同时进行)进行处理；和/或(2)从至少一个另外的工艺中的任意一个、多个或每一个所产生的输出可以：(a)提供作为液体寡核苷酸组合物或固体寡核苷酸组合物的单批组合物(或单批寡核苷酸组合物)；(b)进行合并或组合(以使所得合并/组合的寡核苷酸组合物具有一致的特性和性质，例如物理和化学性质分布在整个所得的合并/组合的寡核苷酸组合物中)：(i)提供作为液体寡核苷酸组合物或固体寡核苷酸组合物的单批组合物(或单批寡核苷酸组合物)；(ii)然后通过第二个、下一个、或下游的(参见例如，图1)至少一个另外的工艺(或它们的组合)以单次迭代或多次并行迭代(不一定同时进行)进行处理；或(iii)随后将所得合并/组合的寡核苷酸组合物分成更小的部分，然后通过第二个、下一个、或下游的(参见例如，图1)至少一个另外的工艺(或它们的组合)以多次并行迭代(不一定同时进行)进行处理；或者(c)分成更小的部分，然后通过第二个、下一个、或下游的(参见例如，图1)至少一个另外的工艺(或它们的组合)以多次并行迭代(不一定同时进行)进行处理。例如，在某些实施方案中，合并或组合工艺、或来源于所述合并或组合工艺的所得寡核苷酸组合物(例如，单批组合物或单批寡核苷酸组合物)、或特定工艺(诸如寡核苷酸合成工艺、化学转化工艺、纯化工艺、脱盐工艺、液体浓缩工艺、和/或干燥工艺，或它们的组合)的输出符合美国联邦法规法典法条21的第210小节和第211小节(分别为“21 CFR 210”和“21 CFR 211”)中的CGMP要求，所述CGMP要求以引用方式整体并入本文。例如，在某些实施方案中，单批组合物(或单批寡核苷酸组合物)和/或来源于合并或组合工艺的所得寡核苷酸组合物、或特定工艺(诸如寡核苷酸合成工艺、化学转化工艺、纯化工艺、脱盐工艺、液体浓缩工艺、和/或干燥工艺，或它们的组合)的输出可符合如在21 CFR 210.3(2)下定义的术语“批”(“’批’是指特定量的药物或其他材料，所述特定量的药物或其他材料旨在具有在指定的极限内的一致的特性和质量，并且是在同一制造周期期间根据单一制造次序生产的”)。例如，在某些实施方案中，单批组合物(或单批寡核苷酸组合物)和/或来源于合并或组合工艺的所得寡核苷酸组合物、或特定工艺(诸如寡核苷酸合成工艺、化学转化工艺、纯化工艺、脱盐工艺、液体浓缩工艺、和/或干燥工艺，或它们的组合)的输出可符合如在21 CFR 210.3(10)下定义的“批次”(“‘批次’是指批或批中指定标识的部分，所述批或批中指定标识的部分具有在指定极限内的一致的特性和质量；或者，在通过连续工艺生产的药品的情况下，其是以确保所述药品具有在指定极限内的一致的特性和质量的方式以单位时间或单位量生产的指定标识的量”)。在某些实施方案中，所述指定量可以是至少100mmol，诸如至少150mmol、至少200mmol、至少250mmol、至少300mmol、至少500mmol、至少600mmol、至少700mmol、至少800mmol、至少900mmol、至少1,000mmol、至少1,200mmol、至少1,400mmol、至少1,600mmol、至少1,800mmol、至少2,000mmol、至少2500mmol、至少3,000mmol、至少3,500mmol、至少4,000mmol或至少5,000mmol，例如，指定的量可以在介于300-5,400mmol之间的范围内，诸如在介于300-4,500mmol之间、介于300-4,000mmol之间、介于300-3,600mmol之间、介于300-3,000mmol之间、介于600-3,000mmol之间、介于700-3,600mmol之间、介于700-2,700mmol之间、介于700-2,500mmol之间、介于700-2,400mmol之间、介于700-2,000mmol之间、介于700-1,900mmol之间、介于700-1,800mmol之间、介于700-1,700mmol之间、介于700-1,600mmol之间、介于700-1,500mmol之间、介于700-1,400mmol之间、介于700-1,300mmol之间、介于700-1,200mmol之间、介于700-1,100mmol之间、介于700-1,000mmol之间、介于700-900mmol之间、介于800-1,200mmol之间、介于800-1,000mmol之间、介于900-1,600mmol之间、介于900-1,800mmol之间、介于900-2,400mmol之间、介于900-2,700mmol之间、介于900-3,600mmol之间、介于1,800-2,700mmol之间、介于1,800-3,600mmol之间、介于1,000-3,000mmol之间、介于1,000-2,500mmol之间、介于1,000-2,000mmol之间、介于1,000-1,500mmol之间、介于1,250-1,750mmol之间、介于1,500-3,000mmol之间、介于1,500-2,500mmol之间、介于1,500-2,000mmol之间、介于1,600-2,400mmol之间、介于2,000-3,000mmol之间、介于2,500-3,000mmol之间、介于2,700-3,600mmol之间、介于2,700-4,500mmol之间、介于3,000-4,000mmol之间、介于3,600-4,500mmol之间、或介于3,600-5,400mmol之间的范围内。在某些实施方案中，通过具有固体支撑物和指定量的负载能力的至少一个或多个寡核苷酸合成柱(或合成轮次)合成的寡核苷酸的量和/或在来自所述至少一个或所述多个寡核苷酸合成柱(或合成轮次)的所得寡核苷酸合成输出中所包含的寡核苷酸的量可以是寡核苷酸的指定量。在某些实施方案中，可以用包含指定量的寡核苷酸的寡核苷酸组合物执行另外的工艺中的一个或多个，或另外的工艺中的每一个。在某些实施方案中，通过合成工艺下游的另一工艺(例如，寡核苷酸化学转化工艺(例如，寡核苷酸脱保护或从固体支撑物上切割)、寡核苷酸纯化工艺(例如，离子交换色谱)、寡核苷酸脱盐工艺(例如，超滤和/或渗滤)、液体组合物浓缩工艺(例如，薄膜蒸发)和/或干燥工艺(例如，冷冻干燥))处理的寡核苷酸的量，可以是所述寡核苷酸的指定量。例如，通过合成工艺下游的另一工艺处理的指定量的寡核苷酸可以单次迭代进行处理，可以进行分割并然后以多个并行迭代进行处理(不一定同时进行)，或者可以多个并行迭代中的一个或多个或每一个进行处理。在多个并行迭代(不一定同时进行)中的一个或多个或每一个进行处理。在某些实施方案中，另外的工艺中的一个或多个、或另外的工艺中的每一个可以在单次迭代中执行，诸如以涉及指定量的寡核苷酸的规模执行。在某些实施方案中，另外的工艺中的一个或多个或另外的工艺中的每一个可以多次迭代执行，诸如以涉及指定量的寡核苷酸的规模执行，例如以多个并行迭代(不一定同时进行)执行，或者可以利用同一设备(例如，合成柱、离子交换柱)以串行方式进行多次迭代来执行，或它们的组合。在某些实施方案中，多个并行迭代(不一定同时进行)可以是不超过2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个或至多60个并行迭代，例如不超过介于2-60个、2-55个、2-50个、2-45个、2-40个、2-35个、2-30个、2-25个、2-20个、2-15个、2-10个、2-9个、2-8个、2-7个、2-6个、2-5个、2-4个、2-3个、3-10个、3-8个、3-5个、4-6个、5-10个、10-60个、10-50个、10-40个、10-30个、10-25个、10-20个、10-15个、20-50个、30-60个或40-55个之间的并行迭代。在某些实施方案中，寡核苷酸合成输出或从另外的工艺产生的输出(诸如化学转化的寡核苷酸输出、纯化的寡核苷酸输出、脱盐的寡核苷酸输出、浓缩的寡核苷酸液体组合物输出，和/或干燥的寡核苷酸组合物输出)，可包含指定量的寡核苷酸。在某些实施方案中，由寡核苷酸合成工艺产生或由另外的工艺中的一个或多个产生的至少一个输出、合并或组合的输出、或分割的输出可以是(或包括)指定量的寡核苷酸。在某些实施方案中，可以按照以下顺序在合成工艺的下游进行另外的工艺：寡核苷酸化学转化工艺(例如，寡核苷酸脱保护或从固体支撑物上切割)、寡核苷酸纯化工艺(例如，离子交换色谱)、寡核苷酸脱盐工艺(例如，超滤和/或渗滤)、液体组合物浓缩工艺(例如，薄膜蒸发)，以及干燥工艺(例如，冷冻干燥)。在某些实施方案中，可以按照以下顺序在合成工艺的下游进行另外的工艺：寡核苷酸化学转化工艺(例如，寡核苷酸脱保护或从固体支撑物上切割)、寡核苷酸纯化工艺(例如，离子交换色谱)、和寡核苷酸脱盐工艺(例如，超滤和/或渗滤)；其中所述顺序之后可以进行液体组合物浓缩工艺(例如，薄膜蒸发)和/或干燥工艺(例如，冷冻干燥)；或其中所述顺序可不包括液体组合物浓缩工艺(例如，薄膜蒸发)和/或干燥工艺(例如，冷冻干燥)。在某些实施方案中，单批组合物(或单批寡核苷酸组合物)可以是液体寡核苷酸组合物(例如，纯化的液体寡核苷酸组合物、脱盐并纯化的液体寡核苷酸组合物，或浓缩的寡核苷酸液体组合物)。在某些实施方案中，用于制备单批组合物(或单批寡核苷酸组合物)的方法不包括干燥工艺，诸如冷冻干燥工艺。在某些实施方案中，用于制备单批组合物(或单批寡核苷酸组合物)的方法不包括液体组合物浓缩工艺(诸如薄膜蒸发工艺)和干燥工艺(诸如冷冻干燥工艺)。在某些实施方案中，单批组合物(或单批寡核苷酸组合物)可以是固体寡核苷酸组合物。在某些实施方案中，用于制备单批组合物(或单批寡核苷酸组合物)的方法包括干燥工艺，诸如冷冻干燥工艺。
本申请提供了以包括固相寡核苷酸合成的多步骤工艺制备寡核苷酸化合物(例如，寡核苷酸，诸如硫代磷酸酯连接的寡核苷酸)的方法，所述固相寡核苷酸合成涉及具有以下操作的迭代合成循环：偶联，硫醇化(或氧化)，(任选的)加帽，和(任选的)脱保护，从固体支撑物上切割受粗保护的寡核苷酸，将受粗保护的寡核苷酸加载到制备型阴离子交换色谱柱上，然后脱保护，并随后通过阴离子交换色谱纯化，经由超滤/渗滤脱盐，以及进行寡核苷酸化合物溶液的浓缩(诸如经由薄膜蒸发进行浓缩)，以产生寡核苷酸化合物。
更具体地，迭代合成工艺利用亚磷酰胺化学、三苯甲基保护基团(诸如5'-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)(DMT)保护基)和固体支撑物(例如可控孔度玻璃或交联的聚苯乙烯固体支撑物，诸如连接有接头的交联的聚苯乙烯固体支撑物)来装配寡核苷酸序列，其中迭代合成涉及偶联、硫醇化(或氧化)、(任选的)加帽、和(任选的)5'-脱保护的循环。利用亚磷酰胺化学的偶联反应包括活化选定的脱氧核糖-亚酰胺、与支撑物固定的受保护核苷酸或寡核苷酸的游离5'-羟基反应。在预定数量的迭代合成循环后，磷酸酯键或硫代磷酸酯键上的保护基团(诸如氰乙基保护基团)被去除，然后通过碱处理将所得的粗制寡核苷酸从固体支撑物上切割下，所述碱处理还使粗制寡核苷酸上的碱基保护基脱保护。所得的粗制寡核苷酸在末端寡核苷上仍具有5'-羟基保护基，将其加载到制备型阴离子交换色谱柱上，并用质子酸将末端5'-羟基保护基脱保护。将脱保护的寡核苷酸通过阴离子交换色谱纯化，经由超滤/渗滤脱盐，然后浓缩以去除过量的水(诸如经由薄膜蒸发浓缩)，以得到寡核苷酸化合物。
在某些实施方案中，制备寡核苷酸的方法可以包括以下步骤或由以下步骤组成：
a)提供连接到固体支撑物的接头，其中所述接头包含受保护的羟基；
b)使所述接头的受保护的羟基脱保护，从而产生脱保护的羟基；
c)独立地提供核苷亚磷酰胺，其中所述核苷亚磷酰胺包含受保护的羟基和受保护的亚磷酰胺；
d)将核苷亚磷酰胺独立地偶联至接头的脱保护的羟基，或来自反应循环的先前迭代的核苷的脱保护的羟基，从而产生亚磷酸三酯连接的核苷；
e)独立地硫醇化受保护的亚磷酸三酯键，从而产生受保护的硫代磷酸酯键；
f)任选地，对未反应的脱保护的羟基独立地加帽；
g)任选地，使核苷的受保护的羟基独立地脱保护；
h)重复所述提供、偶联、硫醇化、加帽和脱保护步骤(步骤c)至g))达预定次数以提供与固体支撑物结合的寡核苷酸；
i)使受保护的硫代磷酸酯键脱保护；
j)从固体支撑物上切割寡核苷酸；
k)从固体支撑物上洗脱寡核苷酸；
l)使用离子交换色谱柱纯化寡核苷酸洗脱物；
m)浓缩寡核苷酸化合物的溶液，诸如使用薄膜蒸发浓缩。
在某些实施方案中，制备寡核苷酸的方法包括独立地对核苷的未反应的脱保护的羟基加帽的步骤和/或独立地脱保护核苷的受保护的羟基的步骤。在某些实施方案中，根据本文所述的制备寡核苷酸的方法，在反应循环的每次迭代(不包括最后一次迭代(即，不在最后一次迭代中执行))中执行对核苷的未反应的脱保护的羟基加帽的任选步骤和脱保护核苷的受保护的羟基的任选步骤。
在某些实施方案中，制备寡核苷酸的方法可以包括以下步骤或由以下步骤组成：
a)提供连接到固体支撑物的接头，其中所述接头包含受保护的羟基；
b)使所述接头的受保护的羟基脱保护，从而产生脱保护的羟基；
c)独立地提供核苷亚磷酰胺，其中所述核苷亚磷酰胺包含受保护的羟基和受保护的亚磷酰胺；
d)将核苷亚磷酰胺独立地偶联至接头的脱保护的羟基，或来自反应循环的先前迭代的核苷的脱保护的羟基，从而产生亚磷酸三酯连接的核苷；
e)独立地硫醇化受保护的亚磷酸三酯键，从而产生受保护的硫代磷酸酯键；
f)任选地，对未反应的脱保护的羟基独立地加帽；
g)任选地，使核苷的受保护的羟基独立地脱保护；
h)重复所述提供、偶联、硫醇化、加帽和脱保护步骤(步骤c)至g))达预定次数以提供与固体支撑物结合的寡核苷酸；
i)使受保护的硫代磷酸酯键脱保护；
j)从固体支撑物上切割寡核苷酸；
k)从固体支撑物上洗脱寡核苷酸；
l)使用离子交换色谱柱纯化寡核苷酸洗脱物；
1)将来自洗脱步骤k)的寡核苷酸洗脱物加载到离子交换色谱柱上；
2)使来自末端核苷的受保护的羟基脱保护；以及
3)使用盐梯度从离子交换色谱柱洗脱寡核苷酸；以及
m)浓缩寡核苷酸化合物的溶液，诸如使用薄膜蒸发浓缩。
在某些实施方案中，制备寡核苷酸的方法包括独立地对核苷的未反应的脱保护的羟基加帽的步骤和/或独立地脱保护核苷的受保护的羟基的步骤。在某些实施方案中，根据本文所述的制备寡核苷酸的方法，在反应循环的每次迭代(不包括最后一次迭代(即，不在最后一次迭代中执行))中执行对核苷的未反应的脱保护的羟基加帽的任选步骤和脱保护核苷的受保护的羟基的任选步骤。
在某些实施方案中，制备寡核苷酸的方法可以包括以下步骤或由以下步骤组成：
a)提供连接到固体支撑物的接头，其中所述接头包含受保护的羟基；
b)使所述接头的受保护的羟基脱保护，从而产生脱保护的羟基；
c)独立地提供核苷亚磷酰胺，其中所述核苷亚磷酰胺包含受保护的羟基和受保护的亚磷酰胺；
d)将核苷亚磷酰胺独立地偶联至接头的脱保护的羟基，或来自反应循环的先前迭代的核苷的脱保护的羟基，从而产生亚磷酸三酯连接的核苷；
e)独立地硫醇化受保护的亚磷酸三酯键，从而产生受保护的硫代磷酸酯键；
f)任选地，对未反应的脱保护的羟基独立地加帽；
g)任选地，使核苷的受保护的羟基独立地脱保护；
h)重复所述提供、偶联、硫醇化、加帽和脱保护步骤(步骤c)至g))达预定次数以提供与固体支撑物结合的寡核苷酸；
i)使受保护的硫代磷酸酯键脱保护；
j)从固体支撑物上切割寡核苷酸；
k)从固体支撑物上洗脱寡核苷酸；
l)使用离子交换色谱柱纯化寡核苷酸洗脱物；
1)将来自洗脱步骤k)的寡核苷酸洗脱物加载到离子交换色谱柱上；
2)使来自末端核苷的受保护的羟基脱保护；
3)使用盐梯度从离子交换色谱柱洗脱寡核苷酸；以及
4)经由超滤和/或渗滤使来自离子交换柱的寡核苷酸洗脱物脱盐；以及
m)浓缩寡核苷酸化合物的脱盐溶液，诸如使用薄膜蒸发浓缩。
在某些实施方案中，制备寡核苷酸的方法包括独立地对核苷的未反应的脱保护的羟基加帽的步骤和/或独立地脱保护核苷的受保护的羟基的步骤。在某些实施方案中，根据本文所述的制备寡核苷酸的方法，在反应循环的每次迭代(不包括最后一次迭代(即，不在最后一次迭代中执行))中执行对核苷的未反应的脱保护的羟基加帽的任选步骤和脱保护核苷的受保护的羟基的任选步骤。
在某些实施方案中，制备寡核苷酸的方法可以包括以下步骤或由以下步骤组成：
a)提供连接到固体支撑物的接头，其中所述接头包含受保护的羟基；
b)使所述接头的受保护的羟基脱保护，从而产生脱保护的羟基；
c)独立地提供核苷亚磷酰胺，其中所述核苷亚磷酰胺包含受保护的羟基和受保护的亚磷酰胺；
d)将核苷亚磷酰胺独立地偶联至接头的脱保护的羟基，或来自反应循环的先前迭代的核苷的脱保护的羟基，从而产生亚磷酸三酯连接的核苷；
e)独立地硫醇化受保护的亚磷酸三酯键，从而产生受保护的硫代磷酸酯键，或任选地，独立地氧化受保护的亚磷酸三酯键，从而产生受保护的磷酸酯键；
f)任选地，对未反应的脱保护的羟基独立地加帽；
g)任选地，使核苷的受保护的羟基独立地脱保护；
h)重复所述提供、偶联、硫醇化或任选的氧化、加帽和脱保护步骤(步骤c)至g))达预定次数以提供与固体支撑物结合的寡核苷酸；
i)使受保护的硫代磷酸酯键和任选的受保护的磷酸酯键脱保护；
j)从固体支撑物上切割寡核苷酸；
k)从固体支撑物上洗脱寡核苷酸；
l)使用离子交换色谱柱纯化寡核苷酸洗脱物；以及
m)浓缩寡核苷酸化合物的溶液，诸如使用薄膜蒸发浓缩。
在某些实施方案中，制备寡核苷酸的方法包括独立地对核苷的未反应的脱保护的羟基加帽的步骤和/或独立地使核苷的受保护的羟基脱保护的步骤。在某些实施方案中，根据本文所述的制备寡核苷酸的方法，在反应循环的每次迭代(不包括最后一次迭代(即，不在最后一次迭代中执行))中执行对核苷的未反应的脱保护的羟基加帽的任选步骤和使核苷的受保护的羟基脱保护的任选步骤。
在某些实施方案中，制备寡核苷酸的方法可以包括以下步骤或由以下步骤组成：
a)提供连接到固体支撑物的接头，其中所述接头包含受保护的羟基；
b)使所述接头的受保护的羟基脱保护，从而产生脱保护的羟基；
c)独立地提供核苷亚磷酰胺，其中所述核苷亚磷酰胺包含受保护的羟基和受保护的亚磷酰胺；
d)将核苷亚磷酰胺独立地偶联至接头的脱保护的羟基，或来自反应循环的先前迭代的核苷的脱保护的羟基，从而产生亚磷酸三酯连接的核苷；
e)独立地硫醇化受保护的亚磷酸三酯键，从而产生受保护的硫代磷酸酯键，或任选地，独立地氧化受保护的亚磷酸三酯键，从而产生受保护的磷酸酯键；
f)任选地，对未反应的脱保护的羟基独立地加帽；
g)任选地，使核苷的受保护的羟基独立地脱保护；
h)重复所述提供、偶联、硫醇化或任选的氧化、加帽和脱保护步骤(步骤c)至g))达预定次数以提供与固体支撑物结合的寡核苷酸；
i)使受保护的硫代磷酸酯键和任选的受保护的磷酸酯键脱保护；
j)从固体支撑物上切割寡核苷酸；
k)从固体支撑物上洗脱寡核苷酸；
l)使用离子交换色谱柱纯化寡核苷酸洗脱物；
1)将来自洗脱步骤k)的寡核苷酸洗脱物加载到离子交换色谱柱上；
2)使来自末端核苷的受保护的羟基脱保护；以及
3)使用盐梯度从离子交换色谱柱洗脱寡核苷酸；以及
m)浓缩寡核苷酸化合物的溶液，诸如使用薄膜蒸发浓缩。
在某些实施方案中，制备寡核苷酸的方法包括独立地对核苷的未反应的脱保护的羟基加帽的步骤和/或独立地使核苷的受保护的羟基脱保护的步骤。在某些实施方案中，根据本文所述的制备寡核苷酸的方法，在反应循环的每次迭代(不包括最后一次迭代(即，不在最后一次迭代中执行))中执行对核苷的未反应的脱保护的羟基加帽的任选步骤和使核苷的受保护的羟基脱保护的任选步骤。
在某些实施方案中，制备寡核苷酸的方法可以包括以下步骤或由以下步骤组成：
a)提供连接到固体支撑物的接头，其中所述接头包含受保护的羟基；
b)使所述接头的受保护的羟基脱保护，从而产生脱保护的羟基；
c)独立地提供核苷亚磷酰胺，其中所述核苷亚磷酰胺包含受保护的羟基和受保护的亚磷酰胺；
d)将核苷亚磷酰胺独立地偶联至接头的脱保护的羟基，或来自反应循环的先前迭代的核苷的脱保护的羟基，从而产生亚磷酸三酯连接的核苷；
e)独立地硫醇化受保护的亚磷酸三酯键，从而产生受保护的硫代磷酸酯键，或任选地，独立地氧化受保护的亚磷酸三酯键，从而产生受保护的磷酸酯键；
f)任选地，对未反应的脱保护的羟基独立地加帽；
g)任选地，使核苷的受保护的羟基独立地脱保护；
h)重复所述提供、偶联、硫醇化或任选的氧化、加帽和脱保护步骤(步骤c)至g))达预定次数以提供与固体支撑物结合的寡核苷酸；
i)使受保护的硫代磷酸酯键和任选的受保护的磷酸酯键脱保护；
j)从固体支撑物上切割寡核苷酸；
k)从固体支撑物上洗脱寡核苷酸；
l)使用离子交换色谱柱纯化寡核苷酸洗脱物；
1)将来自洗脱步骤k)的寡核苷酸洗脱物加载到离子交换色谱柱上；
2)使来自末端核苷的受保护的羟基脱保护；
3)使用盐梯度从离子交换色谱柱洗脱寡核苷酸；以及
4)经由超滤和/或渗滤使来自离子交换柱的寡核苷酸洗脱物脱盐；以及
m)浓缩寡核苷酸化合物的脱盐溶液，诸如使用薄膜蒸发浓缩。
在某些实施方案中，制备寡核苷酸的方法包括独立地对核苷的未反应的脱保护的羟基加帽的步骤和/或独立地使核苷的受保护的羟基脱保护的步骤。在某些实施方案中，根据本文所述的制备寡核苷酸的方法，在反应循环的每次迭代(不包括最后一次迭代(即，不在最后一次迭代中执行))中执行对核苷的未反应的脱保护的羟基加帽的任选步骤和使核苷的受保护的羟基脱保护的任选步骤。
在某些实施方案中，制备寡核苷酸的方法可以包括以下步骤或由以下步骤组成：a)提供连接至固体支撑物的接头，其中所述接头包含受保护的羟基；b)独立地使接头的受保护的羟基脱保护，从而产生脱保护的羟基；c)独立地使核苷亚磷酰胺偶联到接头的脱保护的羟基上，或偶联到来自反应循环的先前迭代的核苷的脱保护的羟基上，从而产生亚磷酸三酯连接的核苷；d)独立地硫醇化受保护的亚磷酸三酯键，从而产生受保护的硫代磷酸酯键(或任选地，独立地氧化受保护的亚磷酸三酯键，从而产生受保护的磷酸酯键)；e)任选地，对未反应的脱保护的羟基独立地加帽；f)任选地，独立地使核苷的受保护的羟基脱保护；g)重复所述偶联、硫醇化(或任选的氧化)、加帽和脱保护步骤(步骤c)至f))达预定次数，以提供与固体支撑物结合的寡核苷酸；h)使受保护的硫代磷酸酯键脱保护；i)从固体支撑物上切割寡核苷酸；j)从固体支撑物上洗脱寡核苷酸；k)使用离子交换色谱柱纯化寡核苷酸洗脱物；以及l)浓缩来自离子交换柱的寡核苷酸化合物的溶液，诸如使用薄膜蒸发进行浓缩。在某些实施方案中，制备寡核苷酸的方法包括独立地对核苷的未反应的脱保护的羟基加帽的步骤和/或独立地使核苷的受保护的羟基脱保护的步骤。在某些实施方案中，根据本文所述的制备寡核苷酸的方法，在反应循环的每次迭代(不包括最后一次迭代(即，不在最后一次迭代中执行))中执行对核苷的未反应的脱保护的羟基加帽的任选步骤和使核苷的受保护的羟基脱保护的任选步骤。
在某些实施方案中，制备寡核苷酸的方法可以包括以下步骤或由以下步骤组成：a)提供连接至固体支撑物的接头，其中所述接头包含受保护的羟基；b)使接头的受保护的羟基脱保护，从而产生脱保护的羟基；c)使核苷亚磷酰胺独立地偶联到接头的脱保护的羟基上，或偶联到来自反应循环的先前迭代的核苷的脱保护的羟基上，从而产生亚磷酸三酯连接的核苷；d)独立地硫醇化受保护的亚磷酸三酯键，从而产生受保护的硫代磷酸酯键(或任选地，独立地氧化受保护的亚磷酸三酯键，从而产生受保护的磷酸酯键)；e)任选地，对未反应的脱保护的羟基独立地加帽；f)任选地，独立地使核苷的受保护的羟基脱保护；g)重复所述偶联、硫醇化(或任选的氧化)、加帽和脱保护步骤(步骤c)至f))达预定次数，以提供与固体支撑物结合的寡核苷酸；h)使受保护的硫代磷酸酯键(和任选的受保护的磷酸酯键)脱保护；i)从固体支撑物上切割寡核苷酸；j)从固体支撑物上洗脱寡核苷酸；k)使用离子交换色谱柱纯化寡核苷酸洗脱物；1)将来自洗脱步骤j)的寡核苷酸洗脱物加载到离子交换色谱柱上；2)使来自末端核苷的受保护的羟基脱保护；以及3)使用盐梯度从离子交换色谱柱洗脱寡核苷酸；以及l)浓缩来自离子交换柱的寡核苷酸化合物的溶液，诸如利用薄膜蒸发进行浓缩。在某些实施方案中，制备寡核苷酸的方法的纯化步骤k)可包括1)来自将洗脱步骤j)的寡核苷酸洗脱物加载到离子交换色谱柱上；2)使来自末端核苷的受保护的羟基脱保护；3)使用盐梯度从离子交换色谱柱洗脱寡核苷酸；以及4)经由超滤和/或渗滤使来自离子交换柱的寡核苷酸洗脱物脱盐。在某些实施方案中，制备寡核苷酸的方法包括独立地对核苷的未反应的脱保护的羟基加帽的步骤和/或独立地使核苷的受保护的羟基脱保护的步骤。在某些实施方案中，根据本文所述的制备寡核苷酸的方法，在反应循环的每次迭代(不包括最后一次迭代(即，不在最后一次迭代中执行))中执行对核苷的未反应的脱保护的羟基加帽的任选步骤和使核苷的受保护的羟基脱保护的任选步骤。
在某些实施方案中，制备寡核苷酸的方法可以包括以下步骤或由以下步骤组成：a)使连接至固体支撑物的接头的受保护的羟基脱保护，从而产生脱保护的羟基；b)独立地将核苷亚磷酰胺偶联到接头的脱保护的羟基上，或偶联到来自反应循环的先前迭代的核苷的脱保护的羟基上，从而产生亚磷酸三酯连接的核苷；c)独立地硫醇化受保护的亚磷酸三酯键，从而产生受保护的硫代磷酸酯键(或任选地，独立地氧化受保护的亚磷酸酯三酯键，从而产生受保护的磷酸酯键)；d)任选地，对未反应的脱保护的羟基独立地加帽；e)任选地，独立地使核苷的受保护的羟基脱保护；f)重复所述偶联、硫醇化(或任选的氧化)、加帽和脱保护步骤(步骤b)至e))达预定次数以提供与固体支撑物结合的寡核苷酸；g)使受保护的硫代磷酸酯键(和任选的受保护的磷酸酯键)脱保护；h)从固体支撑物上切割寡核苷酸；i)从固体支撑物上洗脱寡核苷酸；j)使用离子交换色谱柱纯化寡核苷酸洗脱物；以及k)浓缩来自离子交换柱的寡核苷酸化合物的溶液，诸如使用薄膜蒸发进行浓缩。在某些实施方案中，制备寡核苷酸的方法包括独立地对核苷的未反应的脱保护的羟基加帽的步骤和/或独立地使核苷的受保护的羟基脱保护的步骤。在某些实施方案中，根据本文所述的制备寡核苷酸的方法，在反应循环的每次迭代(不包括最后一次迭代(即，不在最后一次迭代中执行))中执行对核苷的未反应的脱保护的羟基加帽的任选步骤和使核苷的受保护的羟基脱保护的任选步骤。
在某些实施方案中，制备寡核苷酸的方法可以包括以下步骤或由以下步骤组成：a)使连接至固体支撑物的接头的受保护的羟基脱保护，从而产生脱保护的羟基；b)独立地将核苷亚磷酰胺偶联到接头的脱保护的羟基上，或偶联到来自反应循环的先前迭代的核苷的脱保护的羟基上，从而产生亚磷酸三酯连接的核苷；c)独立地硫醇化受保护的亚磷酸三酯键，从而产生受保护的硫代磷酸酯键(或任选地，独立地氧化受保护的亚磷酸酯三酯键，从而产生受保护的磷酸酯键)；d)任选地，对未反应的脱保护的羟基独立地加帽；e)任选地，独立地使核苷的受保护的羟基脱保护；f)重复所述偶联、硫醇化(或任选的氧化)、加帽和脱保护步骤(步骤b)至e))达预定次数以提供与固体支撑物结合的寡核苷酸；g)使受保护的硫代磷酸酯键(和任选的受保护的磷酸酯键)脱保护；h)从固体支撑物上切割寡核苷酸；i)从固体支撑物上洗脱寡核苷酸；j)使用离子交换色谱柱纯化寡核苷酸洗脱物；以及1)将来自洗脱步骤i)的寡核苷酸洗脱物加载到离子交换色谱柱上；2)使来自末端核苷的受保护的羟基脱保护；以及3)使用盐梯度从离子交换色谱柱洗脱寡核苷酸；k)浓缩来自离子交换柱的寡核苷酸化合物的溶液，诸如使用薄膜蒸发进行浓缩。在某些实施方案中，制备寡核苷酸的方法的纯化步骤j)可以包括1)将来自洗脱步骤i)的寡核苷酸洗脱物加载到离子交换色谱柱上；2)使来自末端核苷的受保护的羟基脱保护；3)使用盐梯度从离子交换色谱柱洗脱寡核苷酸；以及4)经由超滤和/或渗滤使来自离子交换柱的寡核苷酸洗脱物脱盐。在某些实施方案中，制备寡核苷酸的方法包括独立地对核苷的未反应的脱保护的羟基加帽的步骤和/或独立地使核苷的受保护的羟基脱保护的步骤。在某些实施方案中，根据本文所述的制备寡核苷酸的方法，在反应循环的每次迭代(不包括最后一次迭代(即，不在最后一次迭代中执行))中执行对核苷的未反应的脱保护的羟基加帽的任选步骤和使核苷的受保护的羟基脱保护的任选步骤。
在某些实施方案中，制备寡核苷酸的方法可在所述迭代的至少一个中进一步包括在加帽步骤f)与脱保护步骤g)之间的预溶胀步骤。在某些实施方案中，制备寡核苷酸的方法还可以包括在所述迭代的至少一个中的步骤的一个或多个步骤之间，任选地用非质子溶剂(诸如乙腈)洗涤载体。
5.1 SMAD7反义寡核苷酸
在某些实施方案中，使用本文描述的方法来合成SMAD7反义寡核苷酸(有时称为抗SMAD7 ODN或SMAD7 AON)。在某些实施方案中，抗SMAD7 ODN是化学修饰的SMAD7 ODN。
反义寡核苷酸是与编码靶蛋白质(例如，SMAD7)的信使RNA(mRNA)互补的短合成寡核苷酸序列。不受理论束缚，反义寡核苷酸序列可以与mRNA分子中的互补区域杂交，从而产生双链杂交体，所述双链杂交体可以导致遍在的催化酶(诸如核糖核酸酶)的激活，所述催化酶降解DNA/RNA杂交链，从而阻止蛋白质翻译。不受理论的约束，本文提供的反义寡核苷酸可以与其靶序列杂交作为RNA或DNA。因此，即使提供DNA序列作为靶标，也包括相应的RNA序列(包括尿嘧啶代替胸腺嘧啶)。
例如，抗SMAD7 ODN当被引入细胞或被细胞吸收时，可以通过降低所述细胞中SMAD7 mRNA的水平或通过降低所述细胞中SMAD7蛋白的水平来降低所述细胞中的SMAD7表达。具体地，抗SMAD7 ODN可降低体外(例如，在培养细胞中)或体内例如，在受试者(诸如人患者或动物模型生物)中)SMAD7表达。
在某些实施方案中，抗SMAD7寡核苷酸可以被化学修饰。在某些实施方案中，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，可以呈阴离子形式，诸如具有钠抗衡离子(“Na+”)的阴离子形式，或者可以质子化以形成酸性形式。在某些实施方案中，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，可以包含硫代磷酸酯主链，所述硫代磷酸酯主链可以被全部或部分地质子化以形成酸性形式。
在某些实施方案中，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，可包含至少一个核苷间键，所述至少一个核苷间键是磷酸酯键，例如单磷酸酯键。在某些实施方案中，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，可包含至少一个核苷间键，所述至少一个核苷间键是硫代磷酸酯键。在某些实施方案中，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，可以包括至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个硫代磷酸酯键。在某些实施方案中，寡核苷酸(诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸)中至少5％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的核苷间键是硫代磷酸酯键。在某些实施方案中，所有核苷间键都是硫代磷酸酯键。
5.2寡核苷酸修饰
在某些实施方案中，通过本文所述方法合成的寡核苷酸(例如，抗SMAD7 ODN)是被化学修饰的。在某些特定的实施方案中，如本文所述的SMAD7 ODN可以具有与SMAD7mRNA的核苷酸序列互补的序列(即，SMAD7 ODN可以是反义寡核苷酸)。
根据本文所述的合成方法制备的寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，可包含例如非天然存在的核碱基、修饰的核苷间(主链)键、糖修饰或修饰的5'末端或3'末端。在某些实施方案中，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，可以包含非天然存在的序列标签。
在某些实施方案中，根据如本文所述的合成方法制备的寡核苷酸、抗SMAD7寡核苷酸、或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸可包含天然存在的核碱基、糖和共价核苷间(主链)键，以及非天然存在的部分。例如，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，可包括混合主链，例如包括一个或多个硫代磷酸酯键。
在某些实施方案中，根据本文所述的合成方法制备的寡核苷酸、抗SMAD7寡核苷酸、或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸还可包含核碱基修饰或取代。如本文所用，“未修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。化学修饰的SMAD7 ODN可以包括例如合成和天然的核碱基，诸如5-甲基胞嘧啶(5-Me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基衍生物和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤基、8-氨基、8-硫醇基、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤基(特别是5-溴基)、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-去氮杂鸟嘌呤和7-去氮杂腺嘌呤，或3-去氮杂鸟嘌呤和3-去氮杂腺嘌呤。寡核苷酸，诸如抗-SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗-SMAD7寡核苷酸，可以进一步包括核碱基，诸如在美国专利号3,687,808中公开的那些，在“The Concise Encyclopedia of PolymerScience And Engineering,”，第858-859页，Kroschwitz,J.I.编著，John Wiley&Sons,1990中公开的那些，由Englisch等人，Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613公开的那些，或由Sanghvi,Y.S.,第15章,Antisense Research and Applications,第289-302页,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编著,CRC Press,1993公开的那些，这些文献中的每一个均以引用方式整体并入本文。在某些实施方案中，寡核苷酸可以包括可以增加化学修饰的SMAD7 ODN的结合亲和力的核碱基。这种核碱基可以包括例如5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔尿嘧啶和5-丙炔胞嘧啶5-甲基胞嘧啶取代。在某些实施方案中，寡核苷酸可包括上述修饰的核碱基中的一个或多个与2'-O-甲氧基乙基糖修饰的组合。
在某些实施方案中，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，可具有一个或多个被5-甲基胞嘧啶取代的胞嘧啶残基。在某些实施方案中，一个或多个胞嘧啶残基形成CpG对的一部分。
在某些实施方案中，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，可以包含人工核苷，诸如脱氧胞苷和/或5-甲基2'-脱氧胞苷，或者可以包括人工核苷酸，诸如5-甲基-2'-脱氧胞苷5'-单磷酸酯和/或5-甲基-2'-脱氧胞苷5'-单硫代磷酸酯。在某些实施方案中，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，可包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个人工核苷。在某些实施方案中，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，可包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个人工核苷酸。
在某些实施方案中，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，包含CG二核苷酸序列。在某些实施方案中，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，包含GC二核苷酸序列。在某些实施方案中，CG或GC二核苷酸序列是多个CG二核苷酸序列和/或多个GC二核苷酸序列。在某些实施方案中，多个CG或GC二核苷酸序列是2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个或6个或更多个CG或GC二核苷酸序列。在某些实施方案中，多个CG或GC二核苷酸序列包含一个或多个CG二核苷酸序列和一个或多个GC二核苷酸序列。在某些实施方案中，多个CG或GC二核苷酸序列仅包含CG二核苷酸序列或仅包含GC二核苷酸序列。
在某些实施方案中，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，包含至少一个包含甲基化碱基(例如，5-甲基-胞嘧啶、6-O-甲基-鸟嘌呤或7-甲基-鸟嘌呤)的CG或GC二核苷酸序列。在某些实施方案中，CG或GC二核苷酸序列中的胞嘧啶被甲基化(例如，5-甲基胞嘧啶)。在某些实施方案中，CG或GC二核苷酸序列中的鸟嘌呤被甲基化(例如，6-O-甲基鸟嘌呤或7-甲基鸟嘌呤)。在某些实施方案中，CG或GC二核苷酸序列中的胞嘧啶和鸟嘌呤被甲基化。在某些实施方案中，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，包含多个包含甲基化碱基(例如，5-甲基-胞嘧啶、6-O-甲基-鸟嘌呤或7-甲基-鸟嘌呤)的CG或GC二核苷酸序列。在某些实施方案中，多个包含甲基化碱基(例如，5-甲基-胞嘧啶、6-O-甲基-鸟嘌呤或7-甲基-鸟嘌呤)的CG或GC二核苷酸序列是2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个或6个或更多个CG或GC二核苷酸序列。
在某些实施方案中，寡核苷酸(诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸)中的CG或GC二核苷酸序列是CG或GC磷酸酯二核苷酸序列。在某些实施方案中，寡核苷酸中的一个或多个CG或GC二核苷酸序列包含非天然的核苷间键(例如，硫代磷酸酯键)。在某些实施方案中，CG或GC二核苷酸是CG或GC硫代磷酸酯二核苷酸序列。在某些实施方案中，寡核苷酸中的两个或更多个CG或GC二核苷酸序列是硫代磷酸酯二核苷酸序列。在某些实施方案中，寡核苷酸中的所有CG或GC二核苷酸序列是硫代磷酸酯二核苷酸序列。在某些实施方案中，寡核苷酸中的CG或GC硫代磷酸酯二核苷酸序列中的一个或多个包含一个或两个甲基化碱基(例如，5-甲基-胞嘧啶、6-O-甲基-鸟嘌呤或7-甲基-鸟嘌呤)。在某些实施方案中，包含甲基化碱基的寡核苷酸中的一个或多个CG或GC二核苷酸序列是硫代磷酸酯二核苷酸序列。在某些实施方案中，包含甲基化碱基的寡核苷酸中的所有CG或GC二核苷酸序列是硫代磷酸酯二核苷酸序列。
在某些实施方案中，抗SMAD7 ODN是化学修饰的抗SMAD7 ODN。在某些实施方案中，化学修饰的抗SMAD7 ODN包含例如非天然存在的核苷间键、非天然存在的糖残基、非天然存在的碱基、标记(例如，荧光标记或同位素标记，诸如氘或氚标记)，或另一种修饰。
在某些实施方案中，根据如本文所述的合成方法制备的寡核苷酸可包含与来自任何哺乳动物生物的核苷酸序列的区域互补的核苷酸序列，所述任何哺乳动物生物是例如但不限于灵长类(例如，人、猴子、黑猩猩、猩猩或大猩猩)、猫、狗、兔子、农场动物(例如，牛、马、山羊、绵羊、猪)、或啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠或豚鼠)。例如，在某些实施方案中，根据如本文所述的合成方法制备的抗SMAD7 ODN可包含与来自任何哺乳动物生物的SMAD7核苷酸序列的区域互补的核苷酸序列，所述任何哺乳动物生物是例如但不限于灵长类动物(例如，人、猴子、黑猩猩、猩猩或大猩猩)、猫、狗、兔子、农场动物(例如，牛、马、山羊、绵羊、猪)或啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠或豚鼠)。
在某些实施方案中，抗SMAD7 ODN包含与人SMAD7中的区域互补的核苷酸序列。在某些实施方案中，抗SMAD7 ODN包含与人SMAD7的8个或更多个、10个或更多个、12个或更多个、14个或更多个、16个或更多个、18个或更多个、或20个或更多个核苷酸的区域互补的核苷酸序列。在某些实施方案中，抗SMAD7 ODN包含与包含核苷酸序列SEQ ID NO:1的人SMAD7序列互补的核苷酸序列，或相应的RNA序列。
SEQ ID NO:1(编码序列：NM_005904.3的CDS(288-1568)；智人SMAD家族成员7(SMAD7)，转录变体1，mRNA)(加下划线的区域108-128)：
Figure BDA0002426454580000261
在某些实施方案中，可使用如本文所述的方法合成的寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，包含与人SMAD7序列SEQ ID NO:1的一部分或区域互补的核苷酸序列，或相应的RNA序列。
在某些实施方案中，本文提供的方法可用于合成与SMAD7mRNA的含多态性区域杂交的抗SMAD7寡核苷酸。参见，例如国际申请号PCT/EP2015/074066，该专利的全部内容由此以引用方式并入。
在某些实施方案中，可使用入本文所述的方法合成的寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，包含与人SMAD7核苷酸序列SEQ ID NO:1的区域108-128互补的核苷酸序列，或相应的RNA序列。
在某些实施方案中，可使用如本文所述的方法合成的寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，包含与人SMAD7核苷酸序列SEQ ID NO:1的包含核苷酸403、233、294、295、296、298、299或533的区域互补的核苷酸序列，或相应的RNA序列。
在某些实施方案中，可使用如本文所述的方法合成的寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，包含是以下核酸序列(SEQ ID NO：2)的至少10个核苷酸长(例如11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个，或20个或更多个核苷酸)长的一部分，由该核酸序列的至多21个核苷酸长组成，或包含该核酸序列的至多21个核苷酸长：
5'-GTXYCCCCTTCTCCCXYCAGC-3'
其中：
X独立地表示包含选自由胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶和2'-O-甲基胞嘧啶组成的组的含氮碱基的核苷酸，并且
Y独立地表示包含选自由鸟嘌呤、5-甲基鸟嘌呤或2'-O-甲基鸟嘌呤组成的组的含氮碱基的核苷酸
条件是核苷酸X或Y中的至少一个包含甲基化的含氮碱基；
或它们的互补序列。
在某些实施方案中，对于具有包含SEQ ID NO:2或由SEQ ID NO:2组成的序列的寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，至少一个核苷间键是硫代磷酸酯键(即，O,O-连接的硫代磷酸酯)。在某些实施方案中，对于具有包含SEQ ID NO:2或由SEQ ID NO:2组成的序列的寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，核苷间键中的至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个是O,O-连接的硫代磷酸酯。在某些实施方案中，对于具有包含SEQ ID NO:2或由SEQ ID NO:2组成的序列的寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，所有核苷间键都是O,O-连接的硫代磷酸酯。
在某些实施方案中，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，具有如美国专利9,279,126中所述的序列，该美国专利以引用方式整体并入本文。
在某些实施方案中，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，包含以下序列(SEQ ID NO:3)或其互补序列或由以下序列(SEQ ID NO:3)：
5'-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAGC-3'
或其互补序列组成；
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷(“5-Me-dC”)，并且其中至少一个核苷间键，例如核苷间键中的至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或所有核苷间键是O,O-连接的硫代磷酸酯键。例如，在某些实施方案中，寡核苷酸包含SEQ ID NO:3或其互补序列或由SEQ ID NO:3或其互补序列组成；其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷(“5-Me-dC”)，并且其中20个核苷酸间键中的每一个均是O,O-连接的硫代磷酸酯键。
在某些实施方案中，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，包含以下序列(SEQ ID NO:4)或其互补序列或由以下序列(SEQ ID NO:4)：
5'-GTCGCCCCTTCTCCCCGCAG-3'
或其互补序列组成；
其中至少一个核苷间键，例如核苷间键中的至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或所有核苷间键是O,O-连接的硫代磷酸酯键。
在某些实施方案中，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，包含以下序列(SEQ ID NO:5)或其互补序列或由以下序列(SEQ ID NO:5)：
5'-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAG-3'
或其互补序列组成；
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷(“5-Me-dC”)，并且其中至少一个核苷间键，例如核苷间键中的至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或所有核苷间键是O,O-连接的硫代磷酸酯键。
在某些实施方案中，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，包含以下序列(SEQ ID NO:6)或其互补序列或由以下序列(SEQ ID NO:6)：
5'-GTTTGGTCCTGAACATGC-3'
或其互补序列组成；
其中至少一个核苷间键，例如核苷间键中的至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或所有核苷间键是O,O-连接的硫代磷酸酯键。
在某些实施方案中，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，包含以下序列(SEQ ID NO:7)或其互补序列或由以下序列(SEQ ID NO:7)：
5'-GTTTGGTCCTGAACAT-3'
或其互补序列组成；
其中至少一个核苷间键，例如核苷间键中的至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或所有核苷间键是O,O-连接的硫代磷酸酯键。
在某些实施方案中，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，包含以下序列(SEQ ID NO:8)或其互补序列或由以下序列(SEQ ID NO:8)：
5'-GTTTGGTCCTGAACATG-3'
或其互补序列组成；
其中至少一个核苷间键，例如核苷间键中的至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或所有核苷间键是O,O-连接的硫代磷酸酯键。
在某些实施方案中，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，包含以下序列(SEQ ID NO:9)或其互补序列或由以下序列(SEQ ID NO:9)：
5'-AGCACCGAGTGCGTGAGC-3'
或其互补序列组成；
其中至少一个核苷间键，例如核苷间键中的至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或所有核苷间键是O,O-连接的硫代磷酸酯键。
在某些实施方案中，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，包含以下序列(SEQ ID NO:10)或其互补序列或由以下序列(SEQ ID NO:10)：
5'-CGAACATGACCTCCGCAC-3'
或其互补序列组成；
其中至少一个核苷间键，例如核苷间键中的至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或所有核苷间键是O,O-连接的硫代磷酸酯键。
在某些实施方案中，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，包含以下序列(SEQ ID NO:11)或其互补序列或由以下序列(SEQ ID NO:11)：
5'-GATCGTTTGGTCCTGAA-3'
或其互补序列组成；
其中至少一个核苷间键，例如核苷间键中的至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或所有核苷间键是O,O-连接的硫代磷酸酯键。
在某些实施方案中，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，包含以下序列(SEQ ID NO:12)或其互补序列或由以下序列(SEQ ID NO:12)：
5'-ATCGTTTGGTCCTGAAC-3'
或其互补序列组成；
其中至少一个核苷间键，例如核苷间键中的至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或所有核苷间键是O,O-连接的硫代磷酸酯键。
SEQ ID NO.1-12中的每一个的序列表还在表7中提供。
如本文所述的方法可用于合成如美国专利9,279,126所述的寡核苷酸。
在某些实施方案中，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，可包含至少一个非天然的核苷，例如脱氧胞苷和/或5-甲基-2'-脱氧胞苷。在某些实施方案中，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，可包含至少一个非天然的核苷酸，例如5-甲基-2'-脱氧胞苷-5'-单磷酸酯或5-甲基-2'-脱氧胞苷-5'-单硫代磷酸酯。在某些实施方案中，寡核苷酸可以包括2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个脱氧胞苷和/或5-甲基2'-脱氧胞苷。在某些实施方案中，寡核苷酸中至少5％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的核苷酸可包含脱氧胞苷和/或5-甲基-2'-脱氧胞苷。在某些实施方案中，寡核苷酸可以包括至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个脱氧胞苷和/或5-甲基2'-脱氧胞苷。在某些实施方案中，寡核苷酸可包含一个或多个脱氧胞苷，并且不包含5-甲基2'-脱氧胞苷。在某些实施方案中，寡核苷酸可包含一个或多个5-甲基2'-脱氧胞苷，并且不包含脱氧胞苷。
在某些实施方案中，使用如本文所述的方法合成的寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，可包含位于寡核苷酸的5'末端和/或3'末端的甲基膦酸酯键。
在某些实施方案中，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，可包含药学上可接受的盐或溶剂化物。在某些实施方案中，溶剂化物是水合物。在某些实施方案中，寡核苷酸，诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸，包含或是碱金属盐(例如钠盐)或碱土金属盐(例如镁盐)，诸如包含核酸序列SEQ ID NO:3的寡核苷酸，所述寡核苷酸可以任选地包含1至20个O,O-连接的硫代磷酸酯核苷酸间键。使用如本文所述方法合成的寡核苷酸(诸如抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸)的预期盐可以包括完全中和的寡核苷酸，例如，每个硫代磷酸酯键与碱金属离子(诸如Na+)缔合。在某些实施方案中，寡核苷酸是仅部分中和的，例如，少于所有的硫代磷酸酯键与碱金属离子或碱土金属离子缔合(例如，少于99％、少于95％、少于90％、少于85％、少于80％、少于85％、少于80％、少于75％、少于70％、少于65％、少于60％、少于55％、少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、小于3％或少于1％被中和)。
5.3可靠的支撑物和接头
在某些实施方案中，适于如本文所公开的制备寡核苷酸的方法的固体支撑物可以是交联聚苯乙烯或可控孔度玻璃。例如，在某些实施方案中，固体支撑物是连接有接头的交联聚苯乙烯，或连接有接头的多孔、多分散的二乙烯基苯交联聚苯乙烯，所述接头是例如包含受保护的羟基的接头，诸如UNYLINKER。在某些实施方案中，例如，交联的聚苯乙烯固体支撑物是NITTOPHASE-HL，诸如NITTOPHASE UNYLINKER 350或高负载的NITTOPHASEUNYLINKER 350，或者是预先加载有核苷酸(诸如2'-脱氧胞苷)的NITTOPHASE固体支撑物。在某些实施方案中，例如，多孔的、多分散的二乙烯基苯交联的聚苯乙烯固体支撑物是PRIMER SUPPORT 5G，其中接头可以是基于琥珀酰基的接头。固体支撑物(诸如连接有接头的固体支撑物)的负载能力(或合成规模)是指可反应以制备寡核苷酸，例如等摩尔量的寡核苷酸的固体支撑物(诸如连接有接头的固体支撑物)的摩尔量。例如，所制备的寡核苷酸的量等于连接有接头的固体支撑物的负载能力，被认为是理论量。利用连接有接头的固体支撑物，根据本文公开的方法制备的寡核苷酸的实际量可以与理论量相同，或可以小于理论量。例如，在某些实施方案中，根据本文公开的方法利用连接有接头的固体支撑物制备的寡核苷酸的实际量小于理论量，例如是理论量的95％，诸如理论量的90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％，或例如理论量的介于40-98％之间、介于40-95％之间、介于40-90％之间、介于40-85％之间、介于40-80％之间、介于40-75％之间、介于40-70％之间、介于50-98％之间、介于50-95％之间、介于50-90％之间、介于50-85％之间、介于50-80％之间、介于50-75％之间、介于50-70％之间、介于60-98％之间、介于60-95％之间、介于60-90％之间、介于60-85％之间、介于60-80％之间、介于60-75％之间或介于60-70％之间。在某些实施方案中，在本文公开的方法中利用的连接有接头的固体支撑物具有足以制备在300-5,400mmol范围内的量的寡核苷酸，例如制备在300-4,500mmol、300-4,000mmol、300-3,600mmol、300-3,000mmol、600-3,000mmol、700-3,600mmol、700-2,700mmol、700-2,500mmol、700-2,400mmol、700-2,000mmol、700-1,900mmol、700-1,800mmol、700-1,700mmol、700-1,600mmol、700-1,500mmol、700-1,400mmol、700-1,300mmol、700-1,200mmol、700-1,100mmol、700-1,000mmol、700-900mmol、800-1,200mmol、800-1,000mmol、900-1,600mmol、900-1,800mmol、900-2,400mmol、900-2,700mmol、900-3,600mmol、1,800-2,700mmol、1,800-3,600mmol、1,000-3,000mmol、1,000-2,500mmol、1,000-2,000mmol、1,000-1,500mmol、1,250-1,750mmol、1,500-3,000mmol、1,500-2,500mmol、1,500-2,000mmol、1,600-2,400mmol、2,000-3,000mmol、2,500-3,000mmol、2,700-3,600mmol、2,700-4,500mmol、3,000-4,000mmol、3,600-4,500mmol或3,600-5,400mmol范围内的量的寡核苷酸的负载能力。在某些实施方案中，在本文公开的方法中利用的连接有接头的固体支撑物具有足以制备至少300mmol量的寡核苷酸，例如制备至少300mmol，诸如至少400mmol、至少500mmol、至少600mmol、至少700mmol、至少800mmol、至少900mmol、至少1,000mmol、至少1,100mmol、至少1,200mmol、至少1,300mmol、至少1,400mmol、至少1,600mmol、至少1,800mmol、至少2,400mmol、至少2,700mmol、至少3,000mmol、至少3,600mmol，或至少4,500mmol的量的寡核苷酸的负载能力。在某些实施方案中，在本文公开的方法中利用的连接有接头的固体支撑物具有足以制备300mmol、400mmol、500mmol、600mmol、700mmol、800mmol、900mmol、1,000mmol、1,100mmol、1,200mmol、1,300mmol、1,400mmol、1,500mmol、1,600mmol、1,700mmol、1,800mmol、1,900mmol、2,000mmol、2,100mmol、2,200mmol、2,300mmol、2,400mmol、2,500mmol、2,600mmol、2,700mmol、2,800mmol、2,900mmol、3,000mmol、3,400mmol、3,600mmol、4,000mmol、4,200mmol、4,500mmol、5,000mmol或5,400mmol的量的寡核苷酸的负载能力。
在某些实施方案中，相对于根据本文公开的方法制备的寡核苷酸化合物的合成期间所利用的固体支撑物的量，连接至所述固体支撑物的接头的负载密度处于300-400微摩尔接头/克固体支撑物的范围内，例如负载密度在300-375微摩尔接头/克固体支撑物的范围内，诸如在300-350微摩尔接头/克固体支撑物、300-350微摩尔接头/克固体支撑物、300-325微摩尔接头/克固体支撑物、325-400微摩尔接头/克固体支撑物、325-375微摩尔接头/克固体支撑物、350-400微摩尔接头/克固体支撑物、或350-375微摩尔接头/克固体支撑物的范围内。在某些实施方案中，相对于根据本文公开的方法制备的寡核苷酸化合物的合成期间所利用的固体支撑物的量，连接至所述固体支撑物的接头的负载密度是至少300微摩尔接头/克固体支撑物，例如至少320微摩尔接头/克固体支撑物、至少325微摩尔接头/克固体支撑物、至少330微摩尔接头/克固体支撑物、至少340微摩尔接头/克固体支撑物、至少350微摩尔接头/克固体支撑物，或至少360微摩尔接头/克固体支撑物。
在某些实施方案中，在本文公开的方法中利用的容纳连接有接头的固体支撑物的柱的柱内径在介于35-100cm之间的范围内，例如内径在介于50-100cm之间、介于50-75cm之间、介于60-80cm之间、介于55-75cm之间，或介于75-100cm之间的范围内，诸如内径是35cm、40cm、50cm、60cm、70cm、80cm、90cm，或100cm。在某些实施方案中，在本文公开的方法中利用的连接有接头的固体支撑物的床高度在介于4-20cm之间的范围内，例如床高度在介于7-20cm之间、介于7-15cm之间、介于7-10cm之间、介于7.5-8.5cm之间、介于8-20cm之间、介于8-15cm之间、介于8-10cm之间、介于8-9cm之间、介于8-8.5cm之间，或介于8.5-9cm之间的范围内，诸如床高度是4cm、5cm、6cm、7cm、7.25cm、7.34cm、7.5cm、7.66cm、7.75cm、8cm、8.25cm、8.34cm、8.5cm、8.66cm、8.75cm、9cm、9.25cm、9.34cm、9.5cm、9.66cm、9.75cm、10cm、10.25cm、10.34cm、10.5cm、10.66cm、10.75cm，或11cm。在某些实施方案中，在本文公开的方法中使用的容纳连接有接头的固体支撑物的柱的内径在介于35-100cm之间的范围内，例如内径是35cm、40cm、50cm、60cm、70cm、80cm、90cm，或100cm，并且床高在介于4-20cm之间的范围内，例如床高在介于7-20cm之间、介于7-15cm之间、介于7-10cm之间、介于7.5-8.5之间、介于8-20cm之间、介于8-15cm之间、介于8-10cm之间、介于8-9cm之间、介于8-8.5cm之间，或介于8.5-9cm之间的范围内。例如，在某些实施方案中，在本文公开的方法中利用的容纳连接有接头的固体支撑物的柱的内径是60cm，并且所述固体支撑物的床高是7cm、7.34cm、7.5cm、7.66cm、8cm、8.34cm、8.5cm、8.66cm、9cm、9.34cm、9.5cm、9.66cm，或10cm；或容纳所述固体支撑物的柱的内径是70cm，并且所述固体支撑物的床高是7cm、7.34cm、7.5cm、7.66cm、8cm、8.34cm、8.5cm、8.66cm、9cm、9.34cm、9.5cm、9.66cm，或10cm；或容纳所述固体支撑物的柱的内径是80cm，并且所述固体支撑物的床高是7cm、7.34cm、7.5cm、7.66cm、8cm、8.34cm、8.5cm、8.66cm、9cm、9.34cm、9.5cm、9.66cm，或10cm；或者容纳固体支撑物的柱的内径是90cm，并且所述固体支撑物的床高是7cm、7.34cm、7.5cm、7.66cm、8cm、8.34cm、8.5cm、8.66cm、9cm、9.34cm、9.5cm、9.66cm，或10cm。
在某些实施方案中，在本文公开的方法中使用的容纳连接有接头的固体支撑物的柱的内径是60cm，所述固体支撑物的床高是7cm、7.34cm、7.5cm、7.66cm、8cm、8.34cm、8.5cm、8.66cm、9cm、9.34cm、9.5cm、9.66cm，或10cm，并且所述固体支撑物具有足以制备至少600mmol，例如至少700mmol、至少900mmol、至少1,600mmol、至少2,400mmol、至少2,700mmol、至少3,000mmol、至少3,600mmol或至少4,500mmol量的寡核苷酸的负载能力。在某些实施方案中，在本文公开的方法中使用的容纳连接有接头的固体支撑物的柱的内径是80cm，所述固体支撑物的床高是7cm、7.34cm、7.5cm、7.66cm、8cm、8.34cm、8.5cm、8.66cm、9cm、9.34cm、9.5cm、9.66cm，或10cm，并且所述固体支撑物具有足以制备至少600mmol，例如至少700mmol、至少900mmol、至少1,600mmol、至少2,400mmol、至少2,700mmol、至少3,000mmol、至少3,600mmol或至少4,500mmol量的寡核苷酸的负载能力。在某些实施方案中，在本文公开的方法中利用的容纳连接有接头的固体支撑物的柱的内径在介于50-100cm之间的范围内，例如内径是50cm、60cm、70cm、80cm、90cm，或100cm，并且柱体积在介于20-35L之间的范围内，例如柱体积在介于20-25L之间、介于23.5-30L之间、介于25-30L之间、介于30-35L之间，或介于20-30L之间的范围内，诸如柱体积是21L、22L、23L、24L、25L、26L、27L、28L、29L、30L、31L、32L、33L、34L，或35L。
在某些实施方案中，本文所述的连接至固体支撑物的接头上的羟基的羟基保护基可包括诸如以下保护基：乙酰基、异丁酰基、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氢吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、对氯苯基、2,4-二硝基苯基、苄基、2,6-二氯苄基、二苯基甲基、对硝基苄基、双(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、2-三甲基甲硅烷基乙基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、[(三异丙基甲硅烷基)氧基]甲基(TOM)、苯甲酰基甲酸酯、氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、新戊酰基、苯甲酰基、对苯基苯甲酰基、9-芴基甲基碳酸酯、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三苯基甲基(三苯甲基)、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基(DMT)、三甲氧基三苯甲基、1(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(FPMP)、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)和9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。在某些实施方案中，连接至固体支撑物的接头上的羟基保护基可包括三苯甲基和二甲氧基三苯甲基(DMT)，例如羟基保护基是二甲氧基三苯甲基(DMT)。
5.4使接头脱保护
在某些实施方案中，根据本文公开的制备寡核苷酸的方法使接头的受保护的羟基脱保护，从而产生脱保护的羟基。例如，在某些实施方案中，用质子酸(例如二氯乙酸，诸如在芳族溶剂中的二氯乙酸，例如在甲苯中的二氯乙酸)使接头的受保护的羟基脱保护。在某些实施方案中，用3-15重量％的二氯乙酸在芳族溶剂中的溶液(v/v)，例如5重量％或10重量％的二氯乙酸在芳族溶剂中的溶液(v/v)，诸如3-15重量％的二氯乙酸在甲苯中的溶液(v/v)，例如5重量％或10重量％的二氯乙酸在甲苯中的溶液(v/v)使接头的受保护的羟基脱保护。在某些实施方案中，用于使接头的受保护的羟基脱保护的质子酸(诸如5重量％或10重量％的二氯乙酸甲苯溶液(v/v))的体积在介于1-10个柱体积之间的范围内，例如在介于1-7个柱体积之间、介于1-6个柱体积之间、介于1-5个柱体积之间、介于1-4个柱体积之间、介于1-3个柱体积之间、介于2-5个柱体积之间、介于2-4个柱体积之间、介于2-3个柱体积之间、介于3-5个柱体积之间，或介于3-4个柱体积之间的范围内。在某些实施方案中，在使接头的受保护的羟基脱保护之后，将与支撑物结合的脱保护材料用溶剂(诸如乙腈)洗涤，以准备用于方法的下一步骤，诸如在固体支撑物上的下一反应，例如支撑物可以用介于1-7个柱体积之间、介于1-5个柱体积之间、介于1-4个柱体积之间、介于1-3个柱体积之间、或介于2-4个柱体积之间洗涤，以准备用于方法的下一步骤。
5.5核苷亚磷酰胺偶联
在某些实施方案中，根据本文公开的制备寡核苷酸的方法，将接头的脱保护的羟基或来自反应循环的先前迭代的核苷的脱保护的羟基偶联至核苷亚磷酰胺，从而产生亚磷酸三酯连接的核苷，诸如受保护的亚磷酸酯三酯连接的核苷。在某些实施方案中，偶联涉及将核苷亚磷酰胺提供到固体支撑物上，由此接头的脱保护的5'-羟基或来自反应循环的先前迭代的核苷的脱保护的5'-羟基与核苷亚磷酰胺反应，或偶联到核苷亚磷酰胺。在某些实施方案中，本文描述的方法的偶联步骤导致形成亚磷酸酯三酯连接的核苷，例如受保护的亚磷酸酯三酯连接的核苷，诸如包含2-氰基乙氧基保护基的亚磷酸酯三酯连接的核苷，诸如2-氰基乙氧基保护的亚磷酸三酯连接的核苷。在某些实施方案中，在提供核苷亚磷酰胺之前，该方法还包括任选地预溶胀支撑物，诸如任选地用极性非质子溶剂(诸如二甲基甲酰胺(DMF))预溶胀支撑物。在某些实施方案中，在提供核苷亚磷酰胺之前不对支撑物进行预溶胀。在某些实施方案中，该方法还可包括在偶联步骤完成之后和在硫醇化(或氧化)步骤之前，任选地用非质子溶剂(诸如乙腈)洗涤支撑物。例如，在某些实施方案中，在完成偶联步骤之后并且在硫醇化(或氧化)步骤之前，可以用介于1-10个柱体积之间，诸如介于1-7个柱体积之间、介于1-6个柱体积之间、介于1-5个柱体积之间、介于1-4个柱体积之间、介于1-3个柱体积之间，或介于2-4个柱体积之间洗涤支撑物。
在某些实施方案中，偶联包括向核苷亚磷酰胺提供活化剂，诸如将核苷亚磷酰胺和活化剂提供作为预混合溶液，诸如核苷亚磷酰胺与活化剂的预混合溶液，或例如单独提供核苷亚磷酰胺溶液和活化剂溶液。在某些实施方案中，活化剂是二氰基咪唑(DCI)。在某些实施方案中，用于制备核苷亚磷酰胺与活化剂的预混合溶液，或核苷亚磷酰胺和活化剂的单独溶液中的每一者的溶剂是非质子溶剂，诸如乙腈。在某些实施方案中，在该方法的偶联步骤期间提供的活化剂的量是相对于固体支撑物的当量在2-8当量的范围内，例如相对于固体支撑物的当量在3-8当量、4-8当量、5-8当量、6-8当量、6-7当量、或4-7当量的范围内。
在某些实施方案中，偶联步骤包括提供过量的核苷亚磷酰胺。在某些实施方案中，核苷亚磷酰胺是受保护的核苷亚磷酰胺，诸如包含5'-羟基保护基和3'-羟基保护基的受保护的核苷亚磷酰胺。
在某些实施方案中，提供的核苷亚磷酰胺的5'-羟基保护基可包括诸如以下保护基：乙酰基、异丁酰基、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氢吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、对氯苯基、2,4-二硝基苯基、苄基、2,6-二氯苄基、二苯基甲基、对硝基苄基、双(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、2-三甲基甲硅烷基乙基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、[(三异丙基甲硅烷基)氧基]甲基(TOM)、苯甲酰基甲酸酯、氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、新戊酰基、苯甲酰基、对苯基苯甲酰基、9-芴基甲基碳酸酯、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三苯基甲基(三苯甲基)、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基(DMT)、三甲氧基三苯甲基、1(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(FPMP)、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)和9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。在某些实施方案中，羟基保护基可包括苄基、2,6-二氯苄基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、苯甲酰基、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、二甲氧基三苯甲基(DMT)、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)和9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。在某些实施方案中，羟基保护基可包括乙酰基、异丁酰基和二甲氧基三苯甲基(DMT)。在某些实施方案中，羟基保护基是异丁酰基。在某些实施方案中，羟基保护基是二甲氧基三苯甲基(DMT)。
在某些实施方案中，提供的核苷亚磷酰胺的3'-羟基保护基是亚磷酰胺基，诸如(2-氰基乙基)-N,N-二异丙基-亚磷酰胺基。
例如，在某些实施方案中，在偶联步骤中提供的核苷亚磷酰胺可以选自由以下项组成的组：
3'-O-[(N,N-二异丙基氨基)-2-氰基乙氧基氧膦基]-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-N6-苯甲酰脱氧腺苷(dA-(Bz)或Bz-dA-亚磷酰胺)；
3'-O-[(N,N-二异丙基氨基)-2-氰基乙氧基氧膦基]-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-N4-苯甲酰基脱氧胞苷(dC-(Bz)或Bz-dC-亚磷酰胺)；
3'-O-[(N,N-二异丙基氨基)-2-氰基乙氧基氧膦基]-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-N2-异丁酰基脱氧鸟苷(dG-(iBu)或i-Bu-dG-亚磷酰胺)；
3'-O-[(N,N-二异丙氨基氨基)-2-氰基乙氧基氧膦基]-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-胸苷(dT或dT-亚磷酰胺)；以及
3'-O-[(N,N-二异丙基氨基)-2-氰基乙氧基氧膦基]-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-N4-苯甲酰基-5-甲基脱氧胞苷(d5MeC-(Bz)或5-Me-dC-亚磷酰胺)。
在某些实施方案中，在该方法的偶联步骤期间提供的核苷亚磷酰胺的量相对于固体支撑物的当量是过量的当量。在某些实施方案中，在该方法的偶联步骤期间提供的核苷亚磷酰胺的量是相对于固体支撑物的当量在1-8当量的范围内，例如在该方法的偶联步骤期间提供的核苷亚磷酰胺的量是相对于固体支撑物的当量在1-7当量的范围内，诸如相对于固体支撑物的当量在1-6当量、1-5当量、1-4当量、1-3当量、1-2当量、1.1-2当量、1.1-1.75当量、1.2-1.75当量、1.5-1.75当量、1.5-2当量、1.5-2.5当量、2-3当量、2-4当量或2-5当量的范围内。在某些实施方案中，在该方法的偶联步骤期间提供的核苷亚磷酰胺的量是相对于固体支撑物的当量在1-4当量的范围内，例如在该方法的偶联步骤期间提供的核苷亚磷酰胺的量是相对于固体支撑物的当量为1当量，诸如相对于固体支撑物的当量为1.1当量、1.2当量、1.25当量、1.5当量、1.75当量、2当量、2.25当量、2.5当量、2.75当量、3当量、3.5当量或4当量。在某些实施方案中，在该方法的偶联步骤期间提供的核苷亚磷酰胺的量相对于提供的活化剂的当量在0.1-1当量的范围内，例如相对于提供的活化剂的当量在0.1-0.9当量、0.1-0.8当量、0.1-0.7当量、0.1-0.6当量、0.1-0.5当量、0.1-0.4当量、0.1-0.3当量、0.1-0.2当量、0.25-0.9当量、0.25-0.75当量、0.25-0.5当量、0.3-0.8当量、0.3-0.75当量、或0.5-1当量的范围内。在某些实施方案中，在该方法的偶联步骤期间提供的核苷亚磷酰胺的量相对于提供的活化剂的当量在0.05-1当量的范围内，例如在该方法的偶联步骤期间提供的核苷亚磷酰胺的量相对于提供的活化剂的当量为0.1当量，诸如相对于提供的活化剂的当量为0.1当量、0.2当量、0.25当量、0.3当量、0.4当量、0.5当量、0.6当量、0.7当量、0.75当量、0.8当量、0.9当量或1当量。在某些实施方案中，核苷亚磷酰胺作为非质子溶液(诸如乙腈溶液)提供，其中核苷亚磷酰胺选自由以下项组成的组：dA-(Bz)、dC-(Bz)、dG-(iBu)、dT，以及d5MeC-(Bz)。
在某些实施方案中，偶联包括以1-5:1的摩尔比，例如以2-5:1，诸如3-5:1、4:1或3.5:1的摩尔比提供活化剂和核苷亚磷酰胺。
5.6硫醇化或氧化
在某些实施方案中，根据本文公开的制备寡核苷酸的方法，将受保护的亚磷酸三酯键，诸如来自反应循环的先前迭代的受保护的亚磷酸三酯键，进行硫醇化，从而产生受保护的硫代磷酸酯键。在某些实施方案中，用硫醇化剂将受保护的亚磷酸三酯键(诸如2-氰基乙氧基保护的亚磷酸三酯连接的核苷)硫醇化，从而形成受保护的硫代磷酸酯键，诸如2-氰基乙氧基保护的硫代磷酸酯键。在某些实施方案中，硫醇化剂是以相对于固体支撑物的当量在1-8当量的范围内的量提供的，例如以相对于固体支撑物的当量在2-8当量、3-8当量、4-8当量、5-8当量、5-7当量、5-6当量、1-5当量或3-6当量的范围内的量提供的。在某些实施方案中，该硫醇化剂可以是氢化黄原素(XH)(诸如吡啶中的氢化黄原素)、二硫化物(诸如磺酸的苯基乙酰基二硫化物(或二(苯基乙酰基)二硫化物)或二硫化物)、四乙基高铀二硫化物、二苯甲酰基四硫化物、1,2,4-二噻唑啉-5-酮(DtsNH)、3-乙氧基-1,2,4-二噻唑啉-5-酮(EDITH)、硫代亚磷酸化合物、Beaucage试剂，或3-芳基-1,2,4-二噻唑啉-5-酮(如在美国专利号6,500,944中所公开，该美国专利以引用方式整体并入本文)。在某些实施方案中，该方法还可包括在硫醇化步骤完成后，任选地用非质子溶剂(例如乙腈)洗涤支撑物。例如，在某些实施方案中，在硫醇化步骤完成之后，可以介于1-10个柱体积之间，诸如介于1-7个柱体积之间、介于1-6个柱体积之间、介于1-5个柱体积之间、介于1-4个柱体积之间、介于1-3个柱体积之间，或介于2-4个柱体积之间洗涤支撑物。
在某些实施方案中，根据本文公开的制备寡核苷酸的方法，氧化受保护的亚磷酸三酯键，诸如来自反应循环的先前迭代的受保护的亚磷酸三酯键，从而产生受保护的磷酸酯键。在某些实施方案中，用氧化剂氧化受保护的亚磷酸三酯键，诸如2-氰基乙氧基保护的亚磷酸三酯连接的核苷，从而形成受保护的磷酸酯键，诸如2-氰基乙氧基保护的磷酸酯键。在某些实施方案中，氧化剂是以相对于固体支撑物的当量在1-8当量范围内的量提供的，例如以相对于固体支撑物的当量在2-8当量的范围内，诸如在3-8当量、4-8当量、5-8当量、5-7当量、5-6当量、1-5当量、或3-6当量的范围内的量提供的。在某些实施方案中，氧化剂可以是碘或叔丁基过氧化氢。在某些实施方案中，该方法还可包括在氧化步骤完成后，任选地用非质子溶剂(例如乙腈)洗涤支撑物。例如，在某些实施方案中，在氧化步骤完成之后，可以介于1-10个柱体积之间，诸如介于1-7个柱体积之间、介于1-6个柱体积之间、介于1-5个柱体积之间、介于1-4个柱体积之间、介于1-3个柱体积之间，或介于2-4个柱体积之间洗涤支撑物。
5.7加帽
在某些实施方案中，根据本文公开的制备寡核苷酸的方法对来自反应循环的先前迭代的未反应的脱保护的羟基加帽(保护)，从而产生加帽的羟基。在某些实施方案中，用酰基对未反应的脱保护的羟基加帽，诸如用烷基酰基加帽。在某些实施方案中，烷基酰基为异丁基酰基。在某些实施方案中，对来自反应循环的先前迭代的未反应的脱保护的羟基加帽，包括提供包含N-甲基咪唑(NMI)、吡啶和乙腈的第一加帽溶液(Cap A)，以及提供包含加帽剂和乙腈的第二加帽溶液(Cap B)。在某些实施方案中，对来自反应循环的先前迭代的未反应的脱保护羟基加帽，包括提供包含10-30％的N-甲基咪唑(NMI)、20-40％的吡啶和40-60％乙腈(v/v/v)的第一加帽溶液(Cap A)(例如，包含20％N-甲基咪唑(NMI)、30％的吡啶和50％的乙腈(v/v/v)的第一加帽溶液(Cap A))，以及提供包含10-30％的加帽剂乙腈溶液(v/v)的第二加帽溶液(Cap B)(例如，包含20％的加帽剂乙腈溶液(v/v)的第二加帽溶液(Cap B)。在某些实施方案中，将第一加帽溶液(Cap A)和第二加帽溶液(Cap B)预混合，然后引入到固体支撑物中以对来自反应循环的先前迭代的未反应的脱保护的羟基加帽。在某些实施方案中，将单一的加帽溶液引入到固体支撑物中，以对来自反应循环的先前迭代的未反应的脱保护的羟基加帽，所述单一的加帽溶液包含N-甲基咪唑(NMI)、吡啶、加帽剂和乙腈。在某些实施方案中，加帽剂是烷基酯或烷基酸酐。在某些实施方案中，加帽剂是烷基酯，例如，加帽剂是烷基甲基酯，诸如异丙基甲基酯。在某些实施方案中，加帽剂是烷基酸酐，例如，加帽剂是异丁酸酐。在某些实施方案中，在对来自反应循环的先前迭代的未反应的脱保护的羟基加帽之前，该方法还包括任选地预溶胀支撑物，诸如任选地用极性非质子溶剂(诸如二甲基甲酰胺(DMF))预溶胀支撑物。在某些实施方案中，在对来自反应循环的先前迭代的将未反应的脱保护的羟基加帽之前，不对支撑物进行预溶胀。在某些实施方案中，该方法还可包括在加帽步骤完成后，任选地用非质子溶剂(例如乙腈)洗涤支撑物。例如，在某些实施方案中，在加帽步骤完成之后，可以介于1-10个柱体积之间，诸如介于1-7个柱体积之间、介于1-6个柱体积之间、介于1-5个柱体积之间、介于1-4个柱体积之间、介于1-3个柱体积之间，或介于2-4个柱体积之间洗涤支撑物。
5.8使5'-末端核苷脱保护
在某些实施方案中，根据本文公开的制备寡核苷酸的方法，使核苷的受保护的羟基(诸如来自反应循环的先前迭代的核苷的受保护的羟基)脱保护，从而产生脱保护的羟基。例如，在某些实施方案中，将核苷的受保护的羟基(诸如寡核苷酸的5'-末端核苷的受保护的5'-羟基)用质子酸(例如二氯乙酸，诸如二氯乙酸在芳族溶剂中的溶液(例如二氯乙酸在甲苯中的溶液)或二氯乙酸在卤化溶剂(诸如二氯甲烷)中的溶液)脱保护。在某些实施方案中，将寡核苷酸的5'-末端核苷的受保护的5'-羟基用2-15重量％的质子酸脱保护，例如用2-10重量％、3-10重量％的质子酸，诸如3-10重量％、5-10重量％、3-15重量％、10-15重量％、3-5重量％、5-8重量％、或3-7重量％的质子酸脱保护。在某些实施方案中，将寡核苷酸的5'-末端核苷的受保护的5'-羟基用2-15重量％的二氯乙酸在芳族溶剂中的溶液(v/v)，诸如3-10重量％，例如3重量％的二氯乙酸在芳族溶剂中的溶液(v/v)脱保护。例如，在某些实施方案中，将寡核苷酸的5'-末端核苷的受保护的5'-羟基用2-15重量％的二氯乙酸在甲苯中的溶液(v/v)，诸如3-10重量％，例如3重量％、5重量％、7重量％或10重量％的二氯乙酸在甲苯中的溶液(v/v)脱保护。在某些实施方案中，用于使寡核苷酸的5'-末端核苷的受保护的5'-羟基脱保护的质子酸(例如2-15重量％的二氯乙酸在甲苯中的溶液(v/v)，诸如3-10重量％的二氯乙酸在甲苯中的溶液(v/v)，例如5重量％或10重量％的二氯乙酸在甲苯中的溶液(v/v))的体积在介于1-10个柱体积之间的范围内，例如在介于1-7个柱体积之间、介于1-6个柱体积之间、介于1-5个柱体积之间、介于1-4个柱体积之间、介于1-3个柱体积之间、介于2-5个柱体积之间、介于2-4个柱体积之间、介于2-3个柱体积之间、介于3-5个柱体积之间，或介于3-4个柱体积之间的范围内。在某些实施方案中，用于使寡核苷酸的5'-末端核苷的受保护的5'-羟基脱保护的质子酸的体积可以在制备靶寡核苷酸的不同合成循环之间变化，诸如在制备寡核苷酸的工艺中增大体积或减小体积。例如，作为说明，在制备21聚体的寡核苷酸期间，用于使寡核苷酸的5'-末端核苷的受保护的5'-羟基脱保护的质子酸(例如2-15重量％的二氯乙酸在甲苯中的溶液(v/v)，诸如3-10重量％的二氯乙酸在甲苯中的溶液(v/v)，例如5重量％或10重量％的二氯乙酸在甲苯中的溶液(v/v))的体积可以是在第一循环期间在介于3-4个柱体积之间的范围内，在第2-16个循环期间在介于2-3个柱体积之间的范围内，以及在第17-21个循环期间在2-3个柱体积之间的范围内。在某些实施方案中，在使寡核苷酸的5'-末端核苷的受保护的5'-羟基脱保护之后，用溶剂(诸如乙腈)洗涤与支撑物结合的脱保护的材料，以准备用于方法的下一步骤，诸如在固体支撑物上的下一步反应，例如，可以用介于1-10个柱体积之间，诸如介于1-7个柱体积之间、介于1-6个柱体积之间、介于1-5个柱体积之间、介于1-4个柱体积之间、介于1-3柱体积之间或介于2-4个柱体积之间洗涤支撑物，以准备用于方法的下一步骤。
5.9反应循环迭代
在某些实施方案中，根据本文公开的制备寡核苷酸的方法，将提供和偶联核苷亚磷酰胺、硫醇化(或氧化)所形成的亚磷酸三酯键，任选地对未反应的脱保护的羟基加帽，以及任选地使寡核苷酸的5'-末端核苷的受保护的5'-羟基脱保护的步骤重复预定次数(反应循环迭代)，以提供与固体支撑物结合的寡核苷酸。在某些实施方案中，根据本文公开的制备寡核苷酸的方法，将偶联核苷亚磷酰胺、硫醇化(或氧化)所形成的亚磷酸三酯键，任选地对未反应的脱保护的羟基加帽，以及任选地使寡核苷酸的5'-末端核苷的受保护的5'-羟基脱保护的步骤重复达预定次数(反应循环迭代)，以提供与固体支撑物结合的寡核苷酸。在某些实施方案中，根据本文公开的制备寡核苷酸的方法的预定次数(反应循环迭代)不包括在最后一次反应循环迭代期间执行任选的对未反应的脱保护的羟基加帽的步骤和任选的使寡核苷酸的5'-末端核苷的受保护的5'-羟基脱保护的步骤。在某些实施方案中，根据本文公开的制备寡核苷酸的方法，预定次数的循环(反应循环迭代)中的一个或多个循环执行对未反应的脱保护的羟基加帽并使寡核苷酸的5'-末端核苷的受保护的5'-羟基脱保护的步骤，并且不包括在最后一次反应循环迭代期间执行加帽步骤和脱保护步骤。在某些实施方案中，在重复的预定步骤中的至少一者之后，用溶剂(诸如乙腈)洗涤与支撑物结合的材料，以准备用于下一反应。在某些实施方案中，在初始反应循环迭代例如直至前3-10个反应循环迭代，诸如直至前7个反应循环迭代期间重复的预定步骤中的每一步骤之后，用溶剂(诸如乙腈)洗涤与支撑物结合的材料，以准备用于下一反应。在某些实施方案中，在重复的预定步骤中的每一者之后，用溶剂(诸如乙腈)洗涤与支撑物结合的材料，以准备用于下一反应。
在某些实施方案中，将执行提供和偶联核苷亚磷酰胺、硫醇化(或氧化)形成的亚磷酸酯三酯键、任选地对未反应的脱保护的羟基加帽，以及任选地使寡核苷酸的5'-末端核苷的受保护的5'-羟基脱保护的步骤的反应循环重复9-99次以提供与固体支撑物结合的寡核苷酸，例如重复9-89次，诸如9-79次、9-69次、9-59次、9-49次、9-39次、9-29次、9-24次、9-20次、10-30次、15-25次、20-30次、14-24次、14-20次或10-24次。在某些实施方案中，将执行提供/偶联核苷亚磷酰胺、硫醇化(或氧化)形成的亚磷酸三酯键的、任选地对未反应的脱保护的羟基加帽，以及任选地使寡核苷酸的5'-末端核苷的受保护的5'-羟基脱保护的步骤的反应循环重复9-99次以提供与固体支撑物结合的寡核苷酸，其中在最后一次反应循环迭代期间不包括任选的对未反应的脱保护的羟基加帽的步骤和任选的使寡核苷酸的5'-末端核苷的受保护的5'-羟基脱保护的步骤，例如重复9-89次，诸如9-79次、9-69次、9-59次、9-49次、9-39次、9-29次、9-24次、9-20次、14-24次、14-20次或10-24次，其中在最后一次反应循环迭代期间不包括任选的对未反应的脱保护的羟基加帽的步骤和任选的使寡核苷酸的5'-末端核苷的受保护的5'-羟基脱保护的步骤。在某些实施方案中，将执行提供/偶联核苷亚磷酰胺、硫醇化(或氧化)形成的亚磷酸三酯键的、任选地对未反应的脱保护的羟基加帽，以及任选地使寡核苷酸的5'-末端核苷的受保护的5'-羟基脱保护的步骤的反应循环重复预定的次数以提供具有10-100个单体亚基，例如具有10-90个单体亚基、10-80个单体亚基、10-70个单体亚基、10-60个单体亚基、10-50个单体亚基、10-40个单体亚基、10-30个单体亚基、10-25个单体亚基、15-25个单体亚基、20-30个单体亚基、20-25个单体亚基、20-90个单体亚基、30-90个单体亚基或40-70个单体亚基的与固体支撑物结合的寡核苷酸，其中在最后一次反应循环迭代期间不包括任选的对未反应的脱保护的羟基加帽的步骤和任选的使寡核苷酸的5'-末端核苷的受保护的5'-羟基脱保护的步骤。在某些实施方案中，将执行提供/偶联核苷亚磷酰胺、硫醇化(或氧化)形成的亚磷酸三酯键的、任选地对未反应的脱保护的羟基加帽，以及任选地使寡核苷酸的5'-末端核苷的受保护的5'-羟基脱保护的步骤的反应循环重复14次以提供与固体支撑物结合的寡核苷酸，例如重复15次，诸如16次、17次、18次、19次、20次、21次、22次、23次、24次、25次、26次、27次、28次、29次或30次，其中在最后一次反应循环迭代期间不包括任选的对未反应的脱保护的羟基加帽的步骤和任选的使寡核苷酸的5'-末端核苷的受保护的5'-羟基脱保护的步骤。在某些实施方案中，将执行提供/偶联核苷亚磷酰胺、硫醇化(或氧化)形成的亚磷酸三酯键的、任选地对未反应的脱保护的羟基加帽，以及任选地使寡核苷酸的5'-末端核苷的受保护的5'-羟基脱保护的步骤的反应循环重复预定次数以提供具有15个单体亚基，例如具有16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个单体亚基的与固体支撑物结合的寡核苷酸，其中在最后一次反应循环迭代期间不包括任选的对未反应的脱保护的羟基加帽的步骤和任选的使寡核苷酸的5'-末端核苷的受保护的5'-羟基脱保护的步骤。
在某些实施方案中，将执行提供/偶联核苷亚磷酰胺、硫醇化(或氧化)形成的亚磷酸三酯键、任选地对未反应的脱保护的羟基加帽，以及任选地使寡核苷酸的5'-末端核苷的受保护的5'-羟基脱保护的步骤的反应循环重复预定次数以提供300mmol或更大的量(例如基于连接有接头的固体支撑物的合成规模或负载能力的理论量)，例如600mmol或更大、700mmol或更大、800mmol或更大、900mmol或更大、1,000mmol或更大、1,100mmol或更大、1,200mmol或更大、1,300mmol或更大、1,400mmol或更大、1,500mmol或更大、1,600mmol或更大、1,700mmol或更大、1,800mmol或更大、1,900mmol或更大、2,000mmol或更大、2,100mmol或更大、2,200mmol或更大、2,300mmol或更大、2,400mmol或更大、2,500mmol或更大、2,600mmol或更大、2,700mmol或更大、2,800mmol或更大、2,900mmol或更大、3,000mmol或更大、3,200mmol或更大、3,400mmol或更大、3,600mmol或更大、4,000mmol或更大、4,200mmol或更大、4,500mmol或更大、5,000mmol或更大，或5,400mmol或更大，或例如在介于300-5,400mmol之间，例如在介于300-4,500mmol、300-4,000mmol、300-3,600mmol、300-3,000mmol、600-3,000mmol、700-3,600mmol、700-2,700mmol、700-2,500mmol、700-2,400mmol、700-2,000mmol、700-1,900mmol、700-1,800mmol、700-1,700mmol、700-1,600mmol、700-1,500mmol、700-900mmol、800-1,200mmol、800-1,000mmol、900-1,600mmol、900-1,800mmol、900-2,400mmol、900-2,700mmol、900-3,600mmol、1,800-2,700mmol、1,800-3,600mmol、1,000-3,000mmol、1,000-2,500mmol、1,000-2,000mmol、1,000-1,500mmol、1,250-1,750mmol、1,500-3,000mmol、1,500-2,500mmol、1,500-2,000mmol、1,600-2,400mmol、2,000-3,000mmol、2,500-3,000mmol、2,700-3,600mmol、2,700-4,500mmol、3,000-4,000mmol、3,600-4,500mmol，或3,600-5,400mmol之间的范围内的量的与固体支撑物结合的寡核苷酸，其中在最后一次反应循环迭代期间不包括任选的对未反应的脱保护的羟基加帽的步骤和任选的使寡核苷酸的5'-末端核苷的受保护的5'-羟基脱保护的步骤。在某些实施方案中，将执行提供/偶联核苷亚磷酰胺、硫醇化(或氧化)形成的亚磷酸三酯键的、任选地对未反应的脱保护的羟基加帽，以及任选地使寡核苷酸的5'-末端核苷的受保护的5'-羟基脱保护的步骤的反应循环重复预定次数以提供300mmol、400mmol、500mmol、600mmol、700mmol、800mmol、900mmol、1,000mmol、1,100mmol、1,200mmol、1,300mmol、1,400mmol、1,500mmol、1,600mmol、1,700mmol、1,800mmol、1,900mmol、2,000mmol、2,100mmol、2,200mmol、2,300mmol、2,400mmol、2,500mmol、2,600mmol、2,700mmol、2,800mmol、2,900mmol、3,000mmol、3,400mmol、3,600mmol、4,000mmol、4,200mmol、4,500mmol、5,000mmol，或5,400mmol的量(例如基于连接有接头的固体支撑物的合成规模或负载能力的理论量)的与固体支撑物结合的寡核苷酸，其中在最后一次反应循环迭代期间不包括任选的对未反应的脱保护的羟基加帽的步骤和任选的使寡核苷酸的5'-末端核苷的受保护的5'-羟基脱保护的步骤。
5.10使硫代磷酸酯键脱保护
在某些实施方案中，根据本文公开的制备寡核苷酸的方法，将与固体支撑物结合的寡核苷酸的受保护的硫代磷酸酯键脱保护。例如，在某些实施方案中，与固体支撑物结合的寡核苷酸的2-氰基乙氧基保护的硫代磷酸酯键被脱保护。在某些实施方案中，用胺将与固体支撑物结合的寡核苷酸的受保护的硫代磷酸酯键(诸如2-氰基乙氧基保护的硫代磷酸酯键)脱保护。在某些实施方案中，将受保护的硫代磷酸酯键用胺，例如三乙胺，例如10-50％的三乙胺在非质子溶剂中的溶液(v/v)，例如用10-30％的三乙胺在非质子溶剂中的溶液(v/v)，诸如用20％的三乙胺在乙腈中的溶液(v/v)脱保护。在某些实施方案中，使受保护的硫代磷酸酯键脱保护的步骤形成了硫代磷酸酯键，例如，未保护的硫代磷酸酯键或硫代磷酸酯键的胺盐形式，诸如硫代磷酸酯键的三乙胺盐形式。在某些实施方案中，使受保护的硫代磷酸酯键脱保护的步骤形成了具有硫代磷酸酯键的与固体支撑物结合的寡核苷酸，诸如具有未保护的硫代磷酸酯键的与固体支撑物结合的寡核苷酸。在某些实施方案中，在脱保护步骤之后，用溶剂(诸如乙腈)洗涤与支撑物结合的脱保护的材料，以准备用于下一反应，例如可以用介于1-10个柱体积之间，诸如介于1-7个柱体积之间、介于1-6个柱体积之间、介于1-5个柱体积之间、介于1-4个柱体积之间、介于1-3柱体积之间或介于2-4个柱体积之间洗涤支撑物，以准备用于方法的下一步骤。
5.11从固体支撑物上切割和洗脱
在某些实施方案中，根据本文公开的制备寡核苷酸的方法，将具有未保护的硫代磷酸酯键的与固体支撑物结合的寡核苷酸从固体支撑物上切割下来。在某些实施方案中，本文公开的方法的切割步骤包括提供氢氧化铵溶液，例如加热的氢氧化铵溶液，诸如温度为40-70℃或40-60℃(诸如温度为40℃、50℃、60℃或65℃)的加热溶液，例如提供加热的氢氧化铵溶液并使所述加热的氢氧化铵溶液通过柱壳再循环以从固体支撑物上切割下所述脱保护的与固体支撑物结合的寡核苷酸。在某些实施方案中，本文公开的方法的切割步骤包括提供28-30％的氨水溶液(w/w)，例如加热的28-30％的氨水溶液(w/w)，诸如温度为40-70℃或40-60℃(诸如温度为40℃、50℃、60℃或65℃)的加热的溶液，例如提供加热的28-30％的氨水溶液(w/w)并使所述加热的氨水溶液通过柱壳再循环以从固体支撑物上切割下所述脱保护的与固体支撑物结合的寡核苷酸。在某些实施方案中，将加热的溶液再循环通过支撑物8-36小时，诸如24小时。在某些实施方案中，将加热的溶液再循环通过支撑物并与所述支撑物接触8-36小时，例如12-36小时，诸如24小时。
在某些实施方案中，该方法的切割步骤进一步使具有未保护的硫代磷酸酯键的与固体支撑物结合的寡核苷酸的环外氨基保护基、具有未保护的硫代磷酸酯键的经切割的寡核苷酸的环外氨基保护基、或两者的环外氨基保护基脱保护。在某些实施方案中，环外氨基保护基包含苯甲酰基和异丁酰基。在某些实施方案中，切割步骤进一步使具有未保护的硫代磷酸酯键的与固体支撑物结合的寡核苷酸的苯甲酰基氨基保护基和异丁酰基氨基保护基、具有未保护的硫代磷酸酯键的经切割的寡核苷酸的苯甲酰基氨基保护基和异丁酰基氨基保护基、或两者的苯甲酰基氨基保护基和异丁酰基氨基保护基脱保护。
在某些实施方案中，经切割的寡核苷酸包含5'-羟基保护基，例如经切割的寡核苷酸的末端核苷包含5'-羟基保护基。在某些实施方案中，经切割的寡核苷酸的5'-羟基保护基可包括诸如以下保护基：乙酰基、异丁酰基、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氢吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、对氯苯基、2,4-二硝基苯基、苄基、2,6-二氯苄基、二苯基甲基、对硝基苄基、双(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、2-三甲基甲硅烷基乙基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、[(三异丙基甲硅烷基)氧基]甲基(TOM)、苯甲酰基甲酸酯、氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、新戊酰基、苯甲酰基、对苯基苯甲酰基、9-芴基甲基碳酸酯、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三苯基甲基(三苯甲基)、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基(DMT)、三甲氧基三苯甲基、1(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(FPMP)、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)和9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。在某些实施方案中，经切割的寡核苷酸的羟基保护基可包括三苯甲基或二甲氧基三苯甲基(DMT)。在某些实施方案中，经切割的寡核苷酸的羟基保护基是二甲氧基三苯甲基(DMT)。
在某些实施方案中，切割与固体支撑物结合的寡核苷酸提供了300mmol或更大的量(例如基于连接有接头的固体支撑物的合成规模或负载能力的理论量)，例如600mmol或更大、700mmol或更大、800mmol或更大、900mmol或更大、1,000mmol或更大、1,100mmol或更大、1,200mmol或更大、1,300mmol或更大、1,400mmol或更大、1,500mmol或更大、1,600mmol或更大、1,700mmol或更大、1,800mmol或更大、1,900mmol或更大、2,000mmol或更大、2,100mmol或更大、2,200mmol或更大、2,300mmol或更大、2,400mmol或更大、2,500mmol或更大、2,600mmol或更大、2,700mmol或更大、2,800mmol或更大、2,900mmol或更大、3,000mmol或更大、3,200mmol或更大、3,400mmol或更大、3,600mmol或更大、4,000mmol或更大、4,200mmol或更大、4,500mmol或更大、5,000mmol或更大，或5,400mmol或更大，或例如在介于300-5,400mmol之间，例如在介于300-4,500mmol、300-4,000mmol、300-3,600mmol、300-3,000mmol、600-3,000mmol、700-3,600mmol、700-2,700mmol、700-2,500mmol、700-2,400mmol、700-2,000mmol、700-1,900mmol、700-1,800mmol、700-1,700mmol、700-1,600mmol、700-1,500mmol、700-900mmol、800-1,200mmol、800-1,000mmol、900-1,600mmol、900-1,800mmol、900-2,400mmol、900-2,700mmol、900-3,600mmol、1,800-2,700mmol、1,800-3,600mmol、1,000-3,000mmol、1,000-2,500mmol、1,000-2,000mmol、1,000-1,500mmol、1,250-1,750mmol、1,500-3,000mmol、1,500-2,500mmol、1,500-2,000mmol、1,600-2,400mmol、2,000-3,000mmol、2,500-3,000mmol、2,700-3,600mmol、2,700-4,500mmol、3,000-4,000mmol、3,600-4,500mmol，或3,600-5,400mmol之间的范围内的量的经切割的寡核苷酸，诸如在末端核苷上包含5'-羟基保护基的经切割的寡核苷酸。在某些实施方案中，切割与固体支撑物结合的寡核苷酸提供了300mmol、400mmol、500mmol、600mmol、700mmol、800mmol、900mmol、1,000mmol、1,100mmol、1,200mmol、1,300mmol、1,400mmol、1,500mmol、1,600mmol、1,700mmol、1,800mmol、1,900mmol、2,000mmol、2,100mmol、2,200mmol、2,300mmol、2,400mmol、2,500mmol、2,600mmol、2,700mmol、2,800mmol、2,900mmol、3,000mmol、3,400mmol、3,600mmol、4,000mmol、4,200mmol、4,500mmol、5,000mmol或5,400mmol的量(例如基于连接有接头的固体支撑物的合成规模或负载能力的理论量)的经切割的寡核苷酸，诸如在末端核苷上包含5'-羟基保护基的经切割的寡核苷酸。
在某些实施方案中，根据本文公开的制备寡核苷酸的方法，从固体支撑物上洗脱经切割的寡核苷酸。在某些实施方案中，从固体支撑物上洗脱经切割的寡核苷酸，例如在末端核苷上包含5'-羟基保护基的经切割的寡核苷酸，包括用水，例如用水或缓冲水溶液洗涤支撑物。
在某些实施方案中，从固体支撑物上洗脱经切割的寡核苷酸提供了在介于300-5,400mmol之间的范围内，例如在介于300-4,500mmol、300-4,000mmol、300-3,600mmol、300-3,000mmol、600-3,000mmol、700-3,600mmol、700-2,700mmol、700-2,500mmol、700-2,400mmol、700-2,000mmol、700-1,900mmol、700-1,800mmol、700-1,700mmol、700-1,600mmol、700-1,500mmol、700-900mmol、800-1,200mmol、800-1,000mmol、900-1,600mmol、900-1,800mmol、900-2,400mmol、900-2,700mmol、900-3,600mmol、1,800-2,700mmol、1,800-3,600mmol、1,000-3,000mmol、1,000-2,500mmol、1,000-2,000mmol、1,000-1,500mmol、1,250-1,750mmol、1,500-3,000mmol、1,500-2,500mmol、1,500-2,000mmol、1,600-2,400mmol、2,000-3,000mmol、2,500-3,000mmol、2,700-3,600mmol、2,700-4,500mmol、3,000-4,000mmol、3,600-4,500mmol，或3,600-5,400mmol之间的范围内的量(例如基于连接有接头的固体支撑物的合成规模或负载能力的理论量)的寡核苷酸，诸如在末端核苷上包含5'-羟基保护基的经切割的寡核苷酸。在某些实施方案中，从固体支撑物上洗脱经切割的寡核苷酸提供了300mmol、400mmol、500mmol、600mmol、700mmol、800mmol、900mmol、1,000mmol、1,100mmol、1,200mmol、1,300mmol、1,400mmol、1,500mmol、1,600mmol、1,700mmol、1,800mmol、1,900mmol、2,000mmol、2,100mmol、2,200mmol、2,300mmol、2,400mmol、2,500mmol、2,600mmol、2,700mmol、2,800mmol、2,900mmol、3,000mmol、3,400mmol、3,600mmol、4,000mmol、4,200mmol、4,500mmol、5,000mmol或5,400mmol的量(例如基于连接有接头的固体支撑物的合成规模或负载能力的理论量)的经切割的寡核苷酸，诸如在末端核苷上包含5'-羟基保护基的经切割的寡核苷酸。
5.12离子交换纯化
在某些实施方案中，根据本文公开的制备寡核苷酸的方法，使用离子交换色谱纯化包含从固体支撑物上切割的寡核苷酸的寡核苷酸洗脱物。根据本文公开的方法用于通过离子交换色谱纯化寡核苷酸的离子交换柱的容量或纯化规模是指离子交换柱中可用于纯化寡核苷酸的离子交换容量的摩尔量。因此，与所利用的离子交换柱的容量或纯化规模等同的纯化寡核苷酸的量被认为是理论量。利用离子交换柱根据本文公开的方法纯化的寡核苷酸的实际量可以与理论量相同，或者可以小于理论量。例如，在某些实施方案中，根据本文公开的方法利用离子交换柱纯化的寡核苷酸的实际量小于理论量，例如是理论量的95％，诸如理论量的90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％，或例如理论量的介于40-98％之间、介于40-95％之间、介于40-90％之间、介于40-85％之间、介于40-80％之间、介于40-75％之间、介于40-70％之间、介于50-98％之间、介于50-95％之间、介于50-90％之间、介于50-85％之间、介于50-80％之间、介于50-75％之间、介于50-70％之间、介于60-98％之间、介于60-95％之间、介于60-90％之间、介于60-85％之间、介于60-80％之间、介于60-75％之间或介于60-70％之间。
在某些实施方案中，使用离子交换色谱(例如阴离子交换色谱)纯化经切割的寡核苷酸洗脱物(例如在末端核苷上包含5'-羟基保护基的经切割的寡核苷酸洗脱物)包括使用盐梯度(例如，氯化钠梯度)或利用碱性盐梯度(例如，碱性氯化钠梯度)进行纯化。在某些实施方案中，经由离子交换色谱进行的纯化步骤包括将经切割的寡核苷酸洗脱物直接加载到离子交换色谱柱上，或者替代地在加载到离子交换色谱柱上之前用水性缓冲液稀释经切割的寡核苷酸洗脱物。在某些实施方案中，包含在待纯化的经切割的寡核苷酸洗脱物中的经切割的寡核苷酸的末端核苷的5'-羟基在加载到离子交换柱上的步骤期间保持受保护。在某些实施方案中，在加载到离子交换柱上的经切割的寡核苷酸洗脱物中所包含的经切割的寡核苷酸的末端核苷的5'-羟基是在所述加载的寡核苷酸洗脱物上受保护的唯一基团。例如，在某些实施方案中，经切割的寡核苷酸(诸如加载到离子交换柱上的经切割的寡核苷酸)的5'-羟基保护基团可包括三苯甲基或二甲氧基三苯甲基(DMT)。在某些实施方案中，经切割的寡核苷酸或加载的经切割的寡核苷酸的5'-羟基保护基是二甲氧基三苯甲基(DMT)。
在某些实施方案中，在加载到离子交换柱上的经切割的寡核苷酸洗脱物中所包含的经切割的寡核苷酸(诸如在末端核苷上包含5'-羟基保护基的经切割的寡核苷酸)的量可以是300mmol或更大，例如量是600mmol或更大、700mmol或更大、800mmol或更大、900mmol或更大、1,000mmol或更大、1,100mmol或更大、1,200mmol或更大、1,300mmol或更大、1,400mmol或更大、1,500mmol或更大、1,600mmol或更大、1,700mmol或更大、1,800mmol或更大、1,900mmol或更大、2,000mmol或更大、2,100mmol或更大、2,200mmol或更大、2,300mmol或更大、2,400mmol或更大、2,500mmol或更大、2,600mmol或更大、2,700mmol或更大、2,800mmol或更大、2,900mmol或更大、3,000mmol或更大、3,200mmol或更大、3,400mmol或更大、3,600mmol或更大、4,000mmol或更大、4,200mmol或更大、4,500mmol或更大、5,000mmol或更大，或5,400mmol或更大，或例如可以在介于300-5,400mmol(例如，就纯化规模而言)之间，例如在介于300-4,500mmol、300-4,000mmol、300-3,600mmol、300-3,000mmol、600-3,000mmol、700-3,600mmol、700-2,700mmol、700-2,500mmol、700-2,400mmol、700-2,000mmol、700-1,900mmol、700-1,800mmol、700-1,700mmol、700-1,600mmol、700-1,500mmol、700-900mmol、800-1,200mmol、800-1,000mmol、900-1,600mmol、900-1,800mmol、900-2,400mmol、900-2,700mmol、900-3,600mmol、1,800-2,700mmol、1,800-3,600mmol、1,000-3,000mmol、1,000-2,500mmol、1,000-2,000mmol、1,000-1,500mmol、1,250-1,750mmol、1,500-3,000mmol、1,500-2,500mmol、1,500-2,000mmol、1,600-2,400mmol、2,000-3,000mmol、2,500-3,000mmol、2,700-3,600mmol、2,700-4,500mmol、3,000-4,000mmol、3,600-4,500mmol，或3,600-5,400mmol之间的范围内。在某些实施方案中，在加载到离子交换柱上的经切割的寡核苷酸洗脱物中所包含的经切割的寡核苷酸(诸如在末端核苷上包含5'-羟基保护基的经切割的寡核苷酸)的量可以是300mmol(就纯化规模而言)，诸如400mmol、500mmol、600mmol、700mmol、800mmol、900mmol、1,000mmol、1,100mmol、1,200mmol、1,300mmol、1,400mmol、1,500mmol、1,600mmol、1,700mmol、1,800mmol、1,900mmol、2,000mmol、2,100mmol、2,200mmol、2,300mmol、2,400mmol、2,500mmol、2,600mmol、2,700mmol、2,800mmol、2,900mmol、3,000mmol、3,400mmol、3,600mmol、4,000mmol、4,200mmol、4,500mmol、5,000mmol或5,400mmol的量。
在某些实施方案中，在加载到离子交换柱上的经切割的寡核苷酸洗脱物中所包含的经切割的寡核苷酸(诸如在末端核苷上包含5'-羟基保护基的经切割的寡核苷酸)的量是从至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个寡核苷酸合成柱(或利用一个或多个合成柱的合成轮次)合并的量，或例如是从介于1-10个之间的寡核苷酸合成柱(或利用一个或多个合成柱的合成轮次)，诸如介于1-8个之间、介于2-10个之间、介于3-9个之间、介于4-7个之间、介于4-6个之间、介于6-10个之间、或介于8-10个之间的寡核苷酸合成柱(或利用一个或多个合成柱的合成轮次)合并的量。在某些实施方案中，从单个、多个或每个寡核苷酸合成柱(或利用一个或多个合成柱的合成轮次)产生的经切割的寡核苷酸的独立量(所述独立量将在加载到离子交换柱上或通过离子交换柱纯化之前合并)可以是以下量：300mmol或更大的经切割的寡核苷酸，例如可以是600mmol或更大、700mmol或更大、800mmol或更大、900mmol或更大、1,000mmol或更大、1,100mmol或更大、1,200mmol或更大、1,300mmol或更大、1,400mmol或更大、1,500mmol或更大、1,600mmol或更大、1,700mmol或更大、1,800mmol或更大、1,900mmol或更大、2,000mmol或更大、2,100mmol或更大、2,200mmol或更大、2,300mmol或更大、2,400mmol或更大、2,500mmol或更大、2,600mmol或更大、2,700mmol或更大、2,800mmol或更大、2,900mmol或更大、3,000mmol或更大、3,200mmol或更大、3,400mmol或更大、3,600mmol或更大、4,000mmol或更大、4,200mmol或更大、4,500mmol或更大、5,000mmol或更大，或5,400mmol或更大的经切割的寡核苷酸，或例如可以是在介于300-5,400mmol之间，例如在介于300-4,500mmol、300-4,000mmol、600-3,000mmol、700-3,600mmol、700-3,000mmol、700-2,700mmol、700-2,400mmol、700-2,000mmol、700-1,500mmol、700-1,000mmol、700-900mmol、800-1,000mmol、900-1,600mmol、900-2,400mmol、1,000-3,000mmol、1,000-2,000mmol、1,500-2,000mmol、1,600-2,400mmol、1,500-2,500mmol、1,500-3,000mmol、2,000-3,000mmol、2,000-2,500mmol、2,500-3,000mmol、2,600-2,800mmol、2,700-3,000mmol、900-2,000mmol、900-2,500mmol、900-2,700mmol、900-3,600mmol、1,000-4,000mmol、1,500-3,500mmol、1,800-3,600mmol、2,000-4,000mmol、2,500-3,500mmol、2,700-3,600mmol、2,700-4,500mmol、3,000-4,000mmol、3,600-4,500mmol或3,600-5,400mmol之间的范围内的经切割的寡核苷酸。
在某些实施方案中，在本文公开的方法中利用的单个、多个或每个离子交换柱具有足以提供在300-5,400mmol范围内的量的纯化和完全脱保护的寡核苷酸，例如提供在300-4,500mmol、300-4,000mmol、300-3,600mmol、300-3,000mmol、600-3,000mmol、700-2,500mmol、700-2,400mmol、700-2,000mmol、700-1,900mmol、700-1,800mmol、700-1,700mmol、700-1,600mmol、700-1,500mmol、700-1,400mmol、700-1,300mmol、700-1,200mmol、700-1,100mmol、700-1,000mmol、700-900mmol、800-1,200mmol、800-1,000mmol、900-1,600mmol、900-1,800mmol、900-2,400mmol、900-2,700mmol、900-3,600mmol、1,800-2,700mmol、1,800-3,600mmol、1,000-3,000mmol、1,000-2,500mmol、1,000-2,000mmol、1,000-1,500mmol、1,250-1,750mmol、1,500-3,000mmol、1,500-2,500mmol、1,500-2,000mmol、1,600-2,400mmol、2,000-3,000mmol、2,500-3,000mmol、2,700-3,600mmol、2,700-4,500mmol、3,000-4,000mmol、3,600-4,500mmol或3,600-5,400mmol范围内的量的纯化和完全脱保护的寡核苷酸的负载能力(或离子交换能力)。在某些实施方案中，在本文公开的方法中利用的单个、多个或每个离子交换柱具有足以提供至少300mmol的量的纯化和完全脱保护的寡核苷酸，例如提供至少300mmol，诸如至少400mmol、至少500mmol、至少600mmol、至少700mmol、至少800mmol、至少900mmol、至少1,000mmol、至少1,100mmol、至少1,200mmol、至少1,300mmol、至少1,400mmol、至少1,600mmol、至少1,800mmol、至少2,400mmol、至少2,700mmol、至少3,000mmol、至少3,600mmol，或至少4,500mmol的量的纯化的和完全脱保护的寡核苷酸的负载能力。在某些实施方案中，在本文公开的方法中利用的单个、多个或每个离子交换柱具有足以提供300mmol，诸如400mmol、500mmol、600mmol、700mmol、800mmol、900mmol、1,000mmol、1,100mmol、1,200mmol、1,300mmol、1,400mmol、1,500mmol、1,600mmol、1,700mmol、1,800mmol、1,900mmol、2,000mmol、2,100mmol、2,200mmol、2,300mmol、2,400mmol、2,500mmol、2,600mmol、2,700mmol、2,800mmol、2,900mmol、3,000mmol、3,100mmol、3,200mmol、3,300mmol、3,400mmol、3,500mmol、3,600mmol、4,000mmol、4,200mmol、4,500mmol、5,000mmol或5,400mmol的量的纯化和完全脱保护的寡核苷酸的负载能力(或离子交换能力)。
在某些实施方案中，根据本文公开的制备寡核苷酸的方法使用离子交换色谱的纯化步骤是阴离子交换色谱，并且包括利用盐梯度，诸如氯化钠梯度。在某些实施方案中，离子交换色谱柱包括使用Q Sepharose FF作为支撑介质。
在某些实施方案中，将经切割的寡核苷酸洗脱物加载到离子交换色谱柱上，然后首先用碱性溶液洗涤，例如首先用氢氧化钠溶液洗涤，以完成加载到离子交换柱上的步骤。
在某些实施方案中，将经切割的寡核苷酸洗脱物加载到离子交换色谱柱上，随后洗涤加载了经切割的寡核苷酸的柱，例如用碱性溶液洗涤加载了经切割的寡核苷酸的柱，诸如随后首先用氢氧化钠溶液洗涤加载了经切割的寡核苷酸的柱，然后用盐梯度(例如碱性盐梯度，诸如包含不同量的氯化钠溶液和氢氧化钠溶液的梯度)洗涤加载了经切割的寡核苷酸的柱，以完成加载到离子交换柱上的步骤。
在某些实施方案中，将经切割的寡核苷酸洗脱物加载到离子交换色谱柱上，随后洗涤加载了经切割的寡核苷酸的柱，例如用碱性溶液洗涤加载了经切割的寡核苷酸的柱，诸如随后首先用氢氧化钠溶液洗涤加载了经切割的寡核苷酸的柱，然后用盐梯度(例如碱性盐梯度，诸如包含不同量的氯化钠溶液和氢氧化钠溶液的梯度)洗涤加载了经切割的寡核苷酸的柱，然后用碱性溶液进一步洗涤加载了经切割的寡核苷酸的柱，例如用氢氧化钠溶液进一步洗涤加载了经切割的寡核苷酸的柱，以完成加载到离子交换柱上的步骤。
在某些实施方案中，根据本文公开的寡核苷酸的制备方法，使加载到离子交换柱上的经切割的寡核苷酸的末端核苷上的羟基保护基团脱保护，例如使加载到阴离子交换柱上的经切割的寡核苷酸的末端核苷上的5'-羟基保护基团脱保护，然后进行洗涤。例如，在某些实施方案中，可以通过将质子酸(诸如乙酸溶液，例如80％的乙酸水溶液)引入离子交换柱中来实现对5'-羟基保护基团从加载到所述离子交换柱上的经切割的寡核苷酸的末端核苷的脱保护。在某些实施方案中，可以通过以下方式来实现对5'-羟基保护基团从加载到离子交换柱上的经切割的寡核苷酸的末端核苷的脱保护：将质子酸溶液(诸如乙酸溶液，例如80％的乙酸水溶液)提供到离子交换柱中，使质子酸溶液的流动保持一段时间，然后重新启动溶液通过离子交换柱的流动，以完成5'-羟基保护基团从加载到离子交换柱上的经切割的寡核苷酸的末端核苷的脱保护。在某些实施方案中，用于使5'-羟基保护基团从加载到离子交换柱上的经切割的寡核苷酸的末端核苷脱保护的质子酸的体积可以是至少10L，例如在介于10-40L之间，诸如介于20-40L、10-30L、25-35L或15-25L之间的范围内。在某些实施方案中，用于使5'-羟基保护基团从加载到离子交换柱上的经切割的寡核苷酸的末端核苷脱保护的质子酸的体积可以是至少1个柱体积，例如在介于1-5个柱体积之间，诸如在介于1-3个柱体积之间、介于2-4个柱体积之间、介于3-5个柱体积之间或介于1-4个柱体积之间的范围内。在某些实施方案中，被脱保护的加载到离子交换柱上的经切割的寡核苷酸的5'-羟基保护基团是三苯甲基或二甲氧基三苯甲基(DMT)。在某些实施方案中，保留在离子交换柱上的所得脱保护的寡核苷酸没有保护基。
在某些实施方案中，在用盐梯度从离子交换柱洗脱之前，首先用碱性溶液，例如用25-200mM氢氧化钠溶液，例如用0.1M氢氧化钠溶液中和离子交换柱上加载的完全脱保护的寡核苷酸。
在某些实施方案中，根据本文公开的制备寡核苷酸的方法，使用盐梯度将保留在离子交换柱(诸如阴离子交换柱)上的所得脱保护的寡核苷酸从柱上洗脱。例如，在某些实施方案中，用于从离子交换柱洗脱所得脱保护的寡核苷酸的盐梯度可以是氯化钠梯度，例如碱性盐梯度，诸如包含变化量的氯化钠溶液和氢氧化钠溶液的梯度。在某些实施方案中，根据本文公开的制备寡核苷酸的方法，将保留在离子交换柱上的所得脱保护的寡核苷酸首先用水洗涤，然后使用盐梯度从离子交换色谱柱洗脱。在某些实施方案中，将保留在离子交换柱上的所得脱保护的寡核苷酸首先用水洗涤，其次用碱性溶液(诸如氢氧化钠水溶液)洗涤以调节柱的pH，最后使用盐梯度(诸如氯化钠梯度或碱性盐梯度，诸如包含变化量的氯化钠溶液和氢氧化钠溶液的梯度)从离子交换色谱柱上洗脱，从而完成所得脱保护的寡核苷酸从离子交换柱上的洗脱。在某些实施方案中，用于从离子交换柱上洗脱所得脱保护的寡核苷酸的盐梯度范围为0.1至2M的盐水溶液，例如碱性盐水溶液，诸如范围为0.1至2M的包含氯化钠的碱性水溶液的盐梯度，诸如在碱性水溶液中的范围为0.2至1.8M的氯化钠的盐梯度。在某些实施方案中，用于从离子交换柱洗脱所得脱保护的寡核苷酸的盐梯度的范围是在10-50nM氢氧化钠水溶液中0.1-2M的氯化钠，诸如盐梯度为在10-50nM氢氧化钠水溶液中0.2-1.8M的氯化钠。在某些实施方案中，从离子交换柱洗脱的所得寡核苷酸是完全脱保护的寡核苷酸。
在某些实施方案中，从离子交换柱洗脱的完全脱保护的寡核苷酸的量可以在介于300-5,400mmol之间的范围内，例如在介于300-4,500mmol、300-4,000mmol、300-3,600mmol、300-3,000mmol、600-3,000mmol、700-3,600mmol、700-2,700mmol、700-2,500mmol、700-2,400mmol、700-2,000mmol、700-1,900mmol、700-1,800mmol、700-1,700mmol、700-1,600mmol、700-1,500mmol、700-900mmol、800-1,200mmol、800-1,000mmol、900-1,600mmol、900-1,800mmol、900-2,400mmol、900-2,700mmol、900-3,600mmol、1,800-2,700mmol、1,800-3,600mmol、1,000-3,000mmol、1,000-2,500mmol、1,000-2,000mmol、1,000-1,500mmol、1,250-1,750mmol、1,500-3,000mmol、1,500-2,500mmol、1,500-2,000mmol、1,600-2,400mmol、2,000-3,000mmol、2,500-3,000mmol、2,700-3,600mmol、2,700-4,500mmol、3,000-4,000mmol、3,600-4,500mmol，或3,600-5,400mmol之间的范围内。在某些实施方案中，从离子交换柱洗脱的完全脱保护的寡核苷酸的量可以是300mmol，诸如400mmol、500mmol、600mmol、700mmol、800mmol、900mmol、1,000mmol、1,100mmol、1,200mmol、1,300mmol、1,400mmol、1,500mmol、1,600mmol、1,700mmol、1,800mmol、1,900mmol、2,000mmol、2,100mmol、2,200mmol、2,300mmol、2,400mmol、2,500mmol、2,600mmol、2,700mmol、2,800mmol、2,900mmol、3,000mmol、3,400mmol、3,600mmol、4,000mmol、4,200mmol、4,500mmol、5,000mmol或5,400mmol的量。
在某些实施方案中，从合成开始直到使用离子交换色谱从纯化步骤收集寡核苷酸，根据本文公开的方法制备寡核苷酸的总产率是至少50％，如通过260nm波长下的光密度/mL(OD/mL)确定的，例如在介于55-100％之间，诸如在介于55-95％之间、在介于55-90％之间、在介于55-85％之间、在介于55-80％之间、在介于55-75％之间、在介于60-100％之间、在介于60-90％之间、在介于60-80％之间、在介于50-75％之间、在介于70-100％之间、在介于80-90％之间、在介于85-95％之间、在介于90-100％或在介于95-100％之间的范围内，如通过260nm波长下的OD/mL确定的。在某些实施方案中，从合成开始直到使用离子交换色谱从纯化步骤收集寡核苷酸，根据本文公开的方法制备的寡核苷酸的纯度是至少50％，例如纯度在介于50-100％之间，诸如介于50-95％之间、介于50-85％之间、介于50-75％之间、介于60-90％之间、介于60-80％之间、介于80-100％之间、介于90-100％之间、介于85-95％之间或介于95-100％之间的范围内，如通过RP-HPLC确定的。
5.13超滤和/或渗滤(UFDF)工艺
在某些实施方案中，根据本文公开的制备寡核苷酸的方法，通过超滤和/或渗滤工艺将包含来自离子交换柱的完全脱保护的寡核苷酸的洗脱物脱盐。在某些实施方案中，根据本文公开的制备寡核苷酸的方法，在经由超滤和/或渗滤工艺进行脱盐之前，任选地用稀碱溶液(诸如稀氢氧化钠溶液)或用稀酸溶液(诸如稀盐酸溶液)或用它们的组合中和来自离子交换柱的包含完全脱保护的寡核苷酸的洗脱物，以将pH调节至中性(例如，pH在6-8的范围内，诸如6.5-7.5)。例如，可以任选地用稀碱溶液(例如稀氢氧化钠溶液(例如0.1-1M氢氧化钠))或用稀酸溶液(诸如稀盐酸溶液(例如，0.1-1M盐酸))或用它们的组合中和从离子交换柱得到的包含完全脱保护的寡核苷酸的洗脱物，以将pH调节至中性(例如，在6-8的范围内，诸如6.5-7.5的pH)。在某些实施方案中，根据本文公开的制备寡核苷酸的方法，经由超滤和/或渗滤工艺使从离子交换柱得到的包含完全脱保护的寡核苷酸的洗脱物(可以任选地被中和)脱盐，然后浓缩所得脱盐的完全脱保护的寡核苷酸保留物溶液，诸如通过薄膜蒸发进行浓缩，或者通过薄膜蒸发浓缩之后进行冷冻干燥。
在某些实施方案中，经由超滤和/或渗滤工艺使完全脱保护的寡核苷酸脱盐的工艺，例如在浓缩(例如，诸如通过薄膜蒸发进行浓缩)之前脱盐，利用pH在5-8的范围内的水溶液以提供脱盐的完全脱保护的寡核苷酸保留物溶液，例如利用pH在5.5-8，诸如6-8、6.5-8、6.8-8、5.5-7.5、6-7.5、6.5-7.5、6.8-7.5、5.5-7、6-7、6.5-7、6.8-8、6.8-7.5或6.8-7.3的范围内的水溶液以提供脱盐的完全脱保护的寡核苷酸保留物溶液。在某些实施方案中，通过利用pH在6.8-7.3范围内的水溶液开始脱盐步骤，并且通过利用pH在6.5-7.5范围内的水溶液结束脱盐步骤，以提供脱盐的完全脱保护的寡核苷酸保留物溶液。在某些实施方案中，经由超滤和/或渗滤工艺使完全脱保护的寡核苷酸脱盐的工艺利用蒸馏水或蒸馏去离子水，以提供脱盐的完全脱保护的寡核苷酸保留物溶液。
在某些实施方案中，经由超滤和/或渗滤工艺使包含完全脱保护的寡核苷酸的洗脱物脱盐的工艺，例如在浓缩(例如，诸如通过薄膜蒸发进行浓缩)之前脱盐，利用再生纤维素膜(诸如截留分子量为1,000-3,000Da的再生纤维素膜)来完成脱盐工艺。
在某些实施方案中，经由超滤和/或渗滤工艺使完全脱保护的寡核苷酸洗脱物脱盐的有效性是通过以下方式确定的：对所得渗透物(即，来自超滤和/或渗滤工艺的滤液)进行电导率测量，以作为确定所得脱盐的完全脱保护的寡核苷酸保留物溶液的盐浓度的手段。例如，在某些实施方案中，经由超滤和/或渗滤工艺使完全脱保护的寡核苷酸洗脱物脱盐而得到的渗透物(有时称为渗滤液(diafiltrate))的电导率小于900uS/cm，诸如小于800uS/cm、小于700uS/cm、小于600uS/cm、小于500uS/cm、小于400uS/cm、小于300uS/cm、小于200uS/cm、小于100uS/cm，或小于75uS/cm。在某些实施方案中，从经由超滤和/或渗滤工艺使完全脱保护的寡核苷酸洗脱物脱盐而得到的渗透物的电导率在介于40-900uS/cm之间，例如在介于40-850uS/cm之间、介于40-750uS/cm之间、介于40-650uS/cm之间、介于40-550uS/cm之间、介于40-450uS/cm之间、介于40-350uS/cm之间、介于40-250uS/cm之间、介于40-150uS/cm之间、介于40-100uS/cm之间，或介于40-75uS/cm之间的范围内。在某些实施方案中，经由超滤和/或渗滤工艺使完全脱保护的寡核苷酸洗脱物脱盐的有效性导致所得脱盐的完全脱保护的寡核苷酸保留物溶液的钠含量达到在介于6-8重量％之间，例如介于6-7重量％之间、介于7-8重量％之间，或介于6.5-7.5重量％之间的范围内的水平。
在某些实施方案中，经由超滤和/或渗滤工艺脱盐(例如，在浓缩(例如，诸如通过薄膜蒸发进行浓缩)之前脱盐)的来自离子交换柱的洗脱物中的完全脱保护的寡核苷酸的量可以在介于300-5,400mmol之间的范围内，例如在介于300-4,500mmol之间、介于300-4,000mmol之间、介于300-3,600mmol之间、介于300-3,000mmol之间、介于600-3,000mmol之间、介于700-3,600mmol之间、介于700-2,700mmol之间、介于700-2,500mmol之间、介于700-2,400mmol之间、介于700-2,000mmol之间、介于700-1,900mmol之间、介于700-1,800mmol之间、介于700-1,700mmol之间、介于700-1,600mmol之间、介于700-1,500mmol之间、介于700-900mmol之间、介于800-1,200mmol之间、介于800-1,000mmol之间、介于900-1,600mmol之间、介于900-1,800mmol之间、介于900-2,400mmol之间、介于900-2,700mmol之间、介于900-3,600mmol之间、介于1,800-2,700mmol之间、介于1,800-3,600mmol之间、介于1,000-3,000mmol之间、介于1,000-2,500mmol之间、介于1,000-2,000mmol之间、介于1,000-1,500mmol之间、介于1,250-1,750mmol之间、介于1,500-3,000mmol之间、介于1,500-2,500mmol之间、介于1,600-2,400mmol之间、介于1,500-2,000mmol之间、介于2,000-3,000mmol之间、介于2,500-3,000mmol之间、介于2,700-3,600mmol之间、介于2,700-4,500mmol之间、介于3,000-4,000mmol之间、介于3,600-4,500mmol之间，或者介于3,600-5,400mmol之间的范围内。在某些实施方案中，经由超滤和/或渗滤工艺脱盐(例如，在浓缩(例如，诸如通过薄膜蒸发进行浓缩)之前脱盐)的来自离子交换柱的洗脱物中的完全脱保护的寡核苷酸的量可以是300mmol、400mmol、500mmol、600mmol、700mmol、800mmol、900mmol、1,000mmol、1,100mmol、1,200mmol、1,300mmol、1,400mmol、1,500mmol、1,600mmol、1,700mmol、1,800mmol、1,900mmol、2,000mmol、2,100mmol、2,200mmol、2,300mmol、2,400mmol、2,500mmol、2,600mmol、2,700mmol、2,800mmol、2,900mmol、3,000mmol、3,400mmol、3,600mmol、4,000mmol、4,200mmol、4,500mmol、5,000mmol或5,400mmol的量。
在某些实施方案中，经由超滤和/或渗滤工艺脱盐(例如，在浓缩(例如，诸如通过薄膜蒸发进行浓缩)之前脱盐)的经由离子交换色谱纯化后的完全脱保护的寡核苷酸的量是从至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个离子交换色谱纯化柱(或利用一个或多个离子交换色谱纯化柱进行的纯化轮次)合并的量，或例如是从介于1-10个之间的离子交换色谱纯化柱(或利用一个或多个离子交换色谱纯化柱进行的纯化轮次)，诸如介于1-8个之间、介于2-10个之间、介于3-9个之间、介于4-7个之间、介于4-6个之间、介于6-10个之间、或介于8-10个之间的离子交换色谱纯化柱(或利用一个或多个离子交换色谱纯化柱进行的纯化轮次)合并的量。在某些实施方案中，从单个、多个或每个离子交换色谱纯化柱(或利用一个或多个离子交换色谱纯化柱纯化进行的纯化轮次)产生的完全脱保护并纯化的寡核苷酸的独立量(所述独立量将在经由超滤和/或渗滤工艺脱盐之前合并)可以是700mmol或更大的量的完全脱保护并纯化的寡核苷酸，例如可以是800mmol或更大、900mmol或更大、1,000mmol或更大、1,100mmol或更大、1,200mmol或更大、1,300mmol或更大、1,400mmol或更大、1,500mmol或更大、1,600mmol或更大、1,700mmol或更大、1,800mmol或更大、1,900mmol或更大、2,000mmol或更大、2,100mmol或更大、2,200mmol或更大、2,300mmol或更大、2,400mmol或更大、2,500mmol或更大、2,600mmol或更大、2,700mmol或更大、2,800mmol或更大、2,900mmol或更大、3,000mmol或更大、3,200mmol或更大、3,400mmol或更大、3,600mmol或更大、4,000mmol或更大、4,200mmol或更大、4,500mmol或更大、5,000mmol或更大，或5,400mmol或更大的量的完全脱保护并纯化的寡核苷酸，或例如可以是在介于700-5,400mmol之间，诸如介于700-4,500mmol之间、介于700-4,000mmol之间、介于800-4,000mmol之间、介于900-4,000mmol之间、介于900-3,000mmol之间、介于900-3,600mmol之间、介于900-3,000mmol之间、介于900-2,700mmol之间、介于900-2,500mmol之间、介于900-2,400mmol之间、介于900-2,000mmol之间、介于900-1,600mmol之间、介于900-1,500mmol之间、介于900-1,000mmol之间、介于700-1,000mmol之间、介于1,000-3,000mmol之间、介于1,000-2,000mmol之间、介于1,500-2,000mmol之间、介于1,600-2,400mmol之间、介于1,500-2,700mmol之间、介于1,500-3,000mmol之间、介于2,000-3,000mmol之间、介于2,000-2,500mmol之间、介于2,500-3,000mmol之间、介于2,600-2,800mmol之间、介于2,700-3,000mmol之间、介于2,700-3,600mmol之间、介于1,000-4,000mmol之间、介于1,500-3,500mmol之间、介于2,000-4,000mmol之间、介于2,500-3,500mmol之间、介于2,700-4,500mmol之间、介于3,000-4,000mmol之间、介于3,600-4,500mmol之间，或介于3,600-5,400mmol之间的范围内的量的完全脱保护并纯化的寡核苷酸。
在某些实施方案中，本文公开的方法中利用的超滤和/或渗滤工艺具有足以提供在300-5,400mmol的范围内的量的脱盐的完全脱保护的寡核苷酸，例如提供在300-4,500mmol、300-4,000mmol、300-3,600mmol、300-3,000mmol、600-3,000mmol、700-3,600mmol、700-2,700mmol、700-2,500mmol、700-2,400mmol、700-2,000mmol、700-1,900mmol、700-1,800mmol、700-1,700mmol、700-1,600mmol、700-1,500mmol、700-1,400mmol、700-1,300mmol、700-1,200mmol、700-1,100mmol、700-1,000mmol、700-900mmol、800-1,200mmol、800-1,000mmol、900-1,600mmol、900-1,800mmol、900-2,400mmol、900-2,700mmol、900-3,600mmol、1,800-2,700mmol、1,800-3,600mmol、1,000-3,000mmol、1,000-2,500mmol、1,000-2,000mmol、1,000-1,500mmol、1,250-1,750mmol、1,500-3,000mmol、1,500-2,500mmol、1,500-2,000mmol、1,600-2,400mmol、2,000-3,000mmol、2,500-3,000mmol、2,700-3,600mmol、2,700-4,500mmol、3,000-4,000mmol、3,600-4,500mmol或3,600-5,400mmol范围内的量的脱盐的完全脱保护的寡核苷酸的负载能力。在某些实施方案中，本文公开的方法中利用的超滤和/或渗滤工艺具有足以提供至少300mmol的量的脱盐的完全脱保护的寡核苷酸，例如提供至少300mmol，诸如至少400mmol、至少500mmol、至少600mmol、至少700mmol、至少800mmol、至少900mmol、至少1,000mmol、至少1,100mmol、至少1,200mmol、至少1,300mmol、至少1,400mmol、至少1,600mmol、至少1,800mmol、至少2,400mmol、至少2,700mmol、至少3,000mmol、至少3,600mmol，或至少4,500mmol的量的脱盐的完全脱保护的寡核苷酸的负载能力。在某些实施方案中，本文公开的方法中使用的超滤和/或渗滤工艺具有足以提供300mmol、400mmol、500mmol、600mmol、700mmol、800mmol、900mmol、1,000mmol、1,100mmol、1,200mmol、1,300mmol、1,400mmol、1,500mmol、1,600mmol、1,700mmol、1,800mmol、1,900mmol、2,000mmol、2,100mmol、2,200mmol、2,300mmol、2,400mmol、2,500mmol、2,600mmol、2,700mmol、2,800mmol、2,900mmol、3,000mmol、3,100mmol、3,200mmol、3,300mmol、3,400mmol、3,500mmol、3,600mmol、4,000mmol、4,200mmol、4,500mmol、5,000mmol或5,400mmol的量的脱盐的完全脱保护的寡核苷酸的负载能力。
5.14液体组合物浓缩工艺
在某些实施方案中，根据本文公开的制备寡核苷酸的方法，将来自离子交换柱的完全脱保护的寡核苷酸洗脱物浓缩，诸如用薄膜蒸发(TFE)工艺进行浓缩。在某些实施方案中，根据本文公开的制备寡核苷酸的方法，将来自超滤和/或渗滤工艺的脱盐的完全脱保护的寡核苷酸保留物溶液浓缩，例如用薄膜蒸发工艺进行浓缩。
在某些实施方案中，例如，浓缩完全脱保护的寡核苷酸洗脱物或浓缩来自超滤和/或渗滤工艺的脱盐的完全脱保护的寡核苷酸保留物溶液，是通过利用30℃或更高，例如在30-95℃的范围内，例如在30-90℃、60-90℃、60-85℃、60-80℃、60-75℃、65-90℃、65-85℃、65-80℃、65-75℃、70-90℃、70-85℃、70-80℃或85-95℃的范围内，例如30℃、40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、或95℃的薄膜蒸发夹套温度进行薄膜蒸发而进行的。在某些实施方案中，浓缩完全脱保护的寡核苷酸洗脱物或浓缩来自超滤和/或渗滤工艺的脱盐的完全脱保护的寡核苷酸保留物溶液，是通过在5-100托范围内，例如在20-80托、20-75托、20-70托、20-60托、20-50托、30-100托、30-80托、30-75托、30-65托、30-55托、30-50托或40-50托的范围内，诸如5托、10托、15托、20托、25托、30托、35托、40托、45托、50托、55托、60托、65托、70托、75托、80托、85托、90托、95托或100托的压力下进行薄膜蒸发而进行的。在某些实施方案中，浓缩完全脱保护的寡核苷酸洗脱物或浓缩来自超滤和/或渗滤工艺的脱盐的完全脱保护的寡核苷酸保留物溶液，是通过利用在60-90℃的范围内的薄膜蒸发夹套温度和在20-80托之间的范围内的压力进行薄膜蒸发而进行的。
在某些实施方案中，例如，来自离子交换纯化的洗脱物中包含的完全脱保护的寡核苷酸的量，或来自超滤和/或渗滤工艺的保留物溶液中包含的脱盐的完全脱保护的寡核苷酸的量(所述量被浓缩，诸如通过薄膜蒸发被浓缩)，可以是300mmol或更大，例如量是600mmol或更大、700mmol或更大、800mmol或更大、900mmol或更大、1,000mmol或更大、1,100mmol或更大、1,200mmol或更大、1,300mmol或更大、1,400mmol或更大、1,500mmol或更大、1,600mmol或更大、1,700mmol或更大、1,800mmol或更大、1,900mmol或更大、2,000mmol或更大、2,100mmol或更大、2,200mmol或更大、2,300mmol或更大、2,400mmol或更大、2,500mmol或更大、2,600mmol或更大、2,700mmol或更大、2,800mmol或更大、2,900mmol或更大、3,000mmol或更大、3,200mmol或更大、3,400mmol或更大、3,600mmol或更大、4,000mmol或更大、4,200mmol或更大、4,500mmol或更大、5,000mmol或更大，或5,400mmol或更大，或例如可以在介于300-5,400mmol之间，例如在300-4,500mmol、300-4,000mmol、300-3,600mmol、300-3,000mmol、600-3,000mmol、700-3,600mmol、700-2,700mmol、700-2,500mmol、700-2,400mmol、700-2,000mmol、700-1,900mmol、700-1,800mmol、700-1,700mmol、700-1,600mmol、700-1,500mmol、700-900mmol、800-1,200mmol、800-1,000mmol、900-1,600mmol、900-1,800mmol、900-2,400mmol、900-2,700mmol、900-3,600mmol、1,800-2,700mmol、1,800-3,600mmol、1,000-3,000mmol、1,000-2,500mmol、1,000-2,000mmol、1,000-1,500mmol、1,250-1,750mmol、1,500-3,000mmol、1,500-2,500mmol、1,500-2,000mmol、1,600-2,400mmol、2,000-3,000mmol、2,500-3,000mmol、2,700-3,600mmol、2,700-4,500mmol、3,000-4,000mmol、3,600-4,500mmol，或3,600-5,400mmol的范围内。在某些实施方案中，来自离子交换纯化的洗脱物中包含的完全脱保护的寡核苷酸的量，或来自超滤和/或渗滤工艺的保留物溶液中包含的脱盐的完全脱保护的寡核苷酸的量(所述量被浓缩，诸如通过薄膜蒸发被浓缩)，可以是300mmol、400mmol、500mmol、600mmol、700mmol、800mmol、900mmol、1,000mmol、1,100mmol、1,200mmol、1,300mmol、1,400mmol、1,500mmol、1,600mmol、1,700mmol、1,800mmol、1,900mmol、2,000mmol、2,100mmol、2,200mmol、2,300mmol、2,400mmol、2,500mmol、2,600mmol、2,700mmol、2,800mmol、2,900mmol、3,000mmol、3,400mmol、3,600mmol、4,000mmol、4,200mmol、4,500mmol、5,000mmol或5,400mmol的量。
在某些实施方案中，例如，来自离子交换纯化的洗脱物中包含的完全脱保护的寡核苷酸的量，或来自超滤和/或渗滤工艺的保留物溶液中包含的脱盐的完全脱保护的寡核苷酸的量(所述量被浓缩，诸如通过薄膜蒸发被浓缩)，在260nm的波长下可以在介于800-7,000OD/mL之间的范围内，例如在260nm的波长下在介于800-6,500OD/mL之间、介于800-6,000OD/mL之间、介于800-6,500OD/mL之间、介于800-6,000OD/mL之间、介于800-5,500OD/mL之间、介于800-5,000OD/mL之间、介于800-4,500OD/mL之间、介于800-4,000OD/mL之间、介于800-3,500OD/mL之间、介于800-3,000OD/mL之间、介于800-2,500OD/mL之间、介于800-2,000OD/mL之间、介于800-1,500OD/mL之间、介于800-1,000OD/mL之间、介于1,000-7,000OD/mL之间、介于1,000-6,500OD/mL之间、介于1,000-6,000OD/mL之间、介于1,000-5,500OD/mL之间、介于1,000-5,000OD/mL之间、介于1,000-4,500OD/mL之间、介于1,000-4,000OD/mL之间、介于1,000-3,500OD/mL之间、介于1,000-3,000OD/mL之间、介于2,000-6,000OD/mL之间、介于3,000-7,000OD/mL之间、介于4,000-6,500OD/mL，或介于5,000-7,000OD/mL之间的范围内。在某些实施方案中，例如，来自离子交换纯化的洗脱物中包含的完全脱保护的寡核苷酸的量，或来自超滤和/或渗滤工艺的保留物溶液中包含的脱盐的完全脱保护的寡核苷酸的量(所述量被浓缩，诸如通过薄膜蒸发被浓缩)，在260nm的波长下可以是800OD/mL的量，例如在260nm的波长下是900OD/mL、1,000OD/mL、1,500OD/mL、2,000OD/mL、2,500OD/mL、3,000OD/mL、3,500OD/mL、4,000OD/mL、4,500OD/mL、5,000OD/mL、5,500OD/mL、6,000OD/mL、6,500OD/mL，或7,000OD/mL的量。
在某些实施方案中，例如，来自超滤和/或渗滤工艺的所得脱盐的完全脱保护的寡核苷酸溶液(所述溶液被浓缩，诸如通过薄膜蒸发被浓缩)的水含量可以是至多25重量％的水，例如水含量是至多20重量％的水，诸如至多15重量％的水、至多10重量％的水、或至多5重量％的水，或例如水含量在介于25-5重量％之间的水，诸如介于25-10重量％之间的水、介于25-15重量％之间的水、介于25-20重量％之间的水、介于20-15重量％之间的水，或介于20-10重量％之间的水的范围内。
5.15冷冻干燥工艺
在某些实施方案中，根据本文公开的制备寡核苷酸的方法，将浓缩的寡核苷酸，诸如从薄膜蒸发工艺产生的浓缩的寡核苷酸，进一步进行冷冻干燥工艺。
在某些实施方案中，将浓缩的寡核苷酸，诸如从薄膜蒸发工艺得到的浓缩的寡核苷酸，进一步进行冷冻干燥工艺，其中冷冻干燥工艺利用在介于1-500毫托之间的范围内，诸如在介于1-450毫托之间、介于1-400毫托之间、介于1-350毫托之间、介于1-300毫托之间、介于1-250毫托之间、介于1-200毫托之间、介于1-150毫托之间、介于1-100毫托之间、介于1-50毫托之间、介于100-500毫托之间、介于100-400毫托之间、介于50-300毫托之间、或介于25-250毫托之间的范围内的真空，并且处于介于-50℃至35℃之间的范围内，诸如在-50℃至-30℃、-45℃至30℃、-45℃至20℃、-45℃至15℃、-45℃至10℃、-45℃至5℃、-45℃至0℃、-45℃至-5℃、-45℃至-20℃、-40℃至20℃、-40℃至15℃、-40℃至10℃、-40℃至5℃、-40℃至0℃、-40℃至-5℃、-35℃至20℃、-35℃至15℃、-35℃至10℃、-35℃至5℃、-35℃至0℃、-10℃至20℃、15-25℃，或-35℃至-5℃的范围内的温度下。
在某些实施方案中，进一步进行冷冻干燥工艺的浓缩寡核苷酸(诸如从薄膜蒸发工艺产生的浓缩寡核苷酸)的量，可以在介于300-5,400mmol之间的范围内，例如在介于300-4,500mmol、300-4,000mmol、300-3,600mmol、300-3,000mmol、600-3,000mmol、700-3,600mmol、700-2,700mmol、700-2,500mmol、700-2,400mmol、700-2,000mmol、700-1,900mmol、700-1,800mmol、700-1,700mmol、700-1,600mmol、700-1,500mmol、700-900mmol、800-1,200mmol、800-1,000mmol、900-1,600mmol、900-1,800mmol、900-2,400mmol、900-2,700mmol、900-3,600mmol、1,800-2,700mmol、1,800-3,600mmol、1,000-3,000mmol、1,000-2,500mmol、1,000-2,000mmol、1,000-1,500mmol、1,250-1,750mmol、1,500-3,000mmol、1,500-2,500mmol、1,500-2,000mmol、1,600-2,400mmol、2,000-3,000mmol、2,500-3,000mmol、2,700-3,600mmol、2,700-4,500mmol、3,000-4,000mmol、3,600-4,500mmol，或3,600-5,400mmol之间的范围内。在某些实施方案中，进一步进行冷冻干燥工艺的浓缩寡核苷酸(诸如从薄膜蒸发工艺产生的浓缩寡核苷酸)的量，可以是300mmol、400mmol、500mmol、600mmol、700mmol、800mmol、900mmol、1,000mmol、1,100mmol、1,200mmol、1,300mmol、1,400mmol、1,500mmol、1,600mmol、1,700mmol、1,800mmol、1,900mmol、2,000mmol、2,100mmol、2,200mmol、2,300mmol、2,400mmol、2,500mmol、2,600mmol、2,700mmol、2,800mmol、2,900mmol、3,000mmol、3,400mmol、3,600mmol、4,000mmol、4,200mmol、4,500mmol、5,000mmol或5,400mmol。
在某些实施方案中，进一步进行冷冻干燥工艺的浓缩寡核苷酸(诸如从薄膜蒸发工艺产生的浓缩寡核苷酸)的量，在260nm的波长下可以在介于800-7,000OD/mL之间的范围内，例如在260nm的波长下在介于800-6,500OD/mL之间、介于800-6,000OD/mL之间、介于800-6,500OD/mL之间、介于800-6,000OD/mL之间、介于800-5,500OD/mL之间、介于800-5,000OD/mL之间、介于800-4,500OD/mL之间、介于800-4,000OD/mL之间、介于800-3,500OD/mL之间、介于800-3,000OD/mL之间、介于800-2,500OD/mL之间、介于800-2,000OD/mL之间、介于800-1,500OD/mL之间、介于800-1,000OD/mL之间、介于1,000-7,000OD/mL之间、介于1,000-6,500OD/mL之间、介于1,000-6,000OD/mL之间、介于1,000-5,500OD/mL之间、介于1,000-5,000OD/mL之间、介于1,000-4,500OD/mL之间、介于1,000-4,000OD/mL之间、介于1,000-3,500OD/mL之间、介于1,000-3,000OD/mL之间、介于2,000-6,000OD/mL之间、介于3,000-7,000OD/mL之间、介于4,000-6,500OD/mL，或介于5,000-7,000OD/mL之间的范围内。在某些实施方案中，进一步进行冷冻干燥工艺的浓缩寡核苷酸(例如从薄膜蒸发工艺产生的浓缩寡核苷酸)的量，在260nm的波长下可以在800-7,000OD/mL的范围内，例如在260nm的波长下是800OD/mL、900OD/mL、1,000OD/mL、1,500OD/mL、2,000OD/mL、2,500OD/mL、3,000OD/mL、3,500OD/mL、4,000OD/mL、4,500OD/mL、5,000OD/mL、5,500OD/mL、6,000OD/mL、6,500OD/mL，或7,000OD/mL的量。
在某些实施方案中，由冷冻干燥工艺产生的浓缩寡核苷酸的量可以在介于300-5,400mmol之间的范围内，例如在介于300-4,500mmol、300-4,000mmol、300-3,600mmol、300-3,000mmol、600-3,000mmol、700-3,600mmol、700-2,700mmol、700-2,500mmol、700-2,400mmol、700-2,000mmol、700-1,900mmol、700-1,800mmol、700-1,700mmol、700-1,600mmol、700-1,500mmol、700-900mmol、800-1,200mmol、800-1,000mmol、900-1,600mmol、900-1,800mmol、900-2,400mmol、900-2,700mmol、900-3,600mmol、1,800-2,700mmol、1,800-3,600mmol、1,000-3,000mmol、1,000-2,500mmol、1,000-2,000mmol、1,000-1,500mmol、1,250-1,750mmol、1,500-3,000mmol、1,500-2,500mmol、1,500-2,000mmol、1,600-2,400mmol、2,000-3,000mmol、2,500-3,000mmol、2,700-3,600mmol、2,700-4,500mmol、3,000-4,000mmol、3,600-4,500mmol，或3,600-5,400mmol之间的范围内。在某些实施方案中，由冷冻干燥工艺产生的浓缩寡核苷酸的量可以是300mmol、400mmol、500mmol、600mmol、700mmol、800mmol、900mmol、1,000mmol、1,100mmol、1,200mmol、1,300mmol、1,400mmol、1,500mmol、1,600mmol、1,700mmol、1,800mmol、1,900mmol、2,000mmol、2,100mmol、2,200mmol、2,300mmol、2,400mmol、2,500mmol、2,600mmol、2,700mmol、2,800mmol、2,900mmol、3,000mmol、3,400mmol、3,600mmol、4,000mmol、4,200mmol、4,500mmol、5,000mmol或5,400mmol
在某些实施方案中，从冷冻干燥工艺产生的浓缩的寡核苷酸的水含量可以是至多25重量％的水，例如水含量是至多20重量％的水，诸如至多15重量％的水、至多10重量％的水、或至多5重量％的水，或例如水含量在介于25-5重量％之间的水，诸如介于25-10重量％之间的水、介于25-15重量％之间的水、介于25-20重量％之间的水、介于20-15重量％之间的水、介于20-10重量％之间的水、介于10-5重量％之间的水，或介于6-8重量％之间的水的范围内。
5.16合成规模、水含量和分子量特征
在某些实施方案中，寡核苷酸组合物，诸如单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物，可以包含以下物质或由以下物质组成：至少300mmol的寡核苷酸(例如，使用如本文所述的方法合成的抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸；例如，这样的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含具有序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中的任何一个的序列的至少10个核苷酸长的一部分，由所述序列的至多21个核苷酸组成，或包含所述序列的至多21个核苷酸长，具有所述序列)；以及至多25重量％的水。例如，在某些实施方案中，组合物可包含以下物质或由以下物质组成：至少400mmol的寡核苷酸，诸如至少500mmol、至少600mmol、至少700mmol、至少800、至少900mmol、至少1,000mmol、至少1,100mmol、至少1,200mmol、至少1,300mmol、至少1,400mmol、至少1,500mmol、至少1,600mmol、至少1,700mmol、至少1,800mmol、至少1,900mmol、至少2,000mmol、至少2,100mmol、至少2,200mmol、至少2,300mmol、至少2,400mmol、至少2,500mmol、至少2,600mmol、至少2,700mmol、至少2,800mmol、至少2,900mmol、至少3,000mmol、至少3,600mmol，或至少4,500mmol的寡核苷酸，例如在介于300-5,400mmol之间的范围内的寡核苷酸，诸如在介于300-4,500mmol之间、介于300-4,000mmol之间、介于300-3,600mmol之间、介于300-3,000mmol之间、介于600-3,000mmol之间、介于700-3,600mmol之间、介于700-3,000mmol之间、介于700-2,700mmol之间、介于700-2,500mmol之间、介于700-2,400mmol之间、介于700-2,000mmol之间、介于700-1,500mmol之间、介于700-1,000mmol之间、介于700-900mmol之间、介于800-1,000mmol之间、介于900-1,600mmol之间、介于900-2,400mmol之间、介于1,000-3,000mmol之间、介于900-3,600mmol之间、介于1,000-2,000mmol之间、介于1,500-2,000mmol之间、介于1,600-2,400mmol之间、介于1,500-2,500mmol之间、介于1,500-3,000mmol之间、介于1,800-3,600mmol之间、介于2,000-3,000mmol之间、介于2,000-2,500mmol之间、介于2,500-3,000mmol之间、介于2,600-2,800mmol之间、介于2,700-3,000mmol之间、介于900-2,000mmol之间、介于900-2,500mmol之间、介于900-2,700mmol之间、介于1,000-4,000mmol之间、介于1,500-3,500mmol之间、介于2,000-4,000mmol之间、介于2,500-3,500mmol之间、介于2,700-3,600mmol之间、介于2,700-4,500mmol之间、介于3,000-4,000mmol之间、介于3,600-4,500mmol之间，或介于3,600-5,400mmol之间的范围内的寡核苷酸；以及至多25重量％的水，诸如至多24重量％、至多23重量％、至多22重量％、至多21重量％、至多20重量％、至多19重量％、至多18重量％、至多17重量％、至多16重量％、至多15重量％、至多10重量％、至多9重量％、至多8重量％、至多7重量％、至多6重量％、至多5重量的水，或在介于25-5重量％之间的范围内的水，例如在介于25-20重量％之间的水，诸如在介于20-15重量％之间、介于20-10重量％之间、介于15-10重量％之间、介于15-5重量％之间，或介于10-5重量％之间的范围内的水。
在某些实施方案中，寡核苷酸组合物，诸如单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物，可以包含以下物质或由以下物质组成：至少300mmol，诸如至少700mmol的寡核苷酸(例如，使用如本文所述的方法合成的抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸；例如，这样的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含具有序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中的任何一个的序列的至少10个核苷酸长的一部分，由所述序列的至多21个核苷酸组成，或包含所述序列的至多21个核苷酸长，具有所述序列)；以及至多25重量％的水，其中寡核苷酸的分子量为至少3,000Da，其中所述分子量是质子化的分子量、碱金属分子量(诸如钠盐形式的分子量)或碱土金属分子量(诸如镁盐形式的分子量)。例如，在某些实施方案中，寡核苷酸的组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：至少300mmol，诸如至少700mmol的寡核苷酸和至多25重量％的水，其中寡核苷酸的分子量为至少3500Da，诸如分子量为至少4,000Da、至少4,500Da、至少5,000Da、至少5,500Da、至少6,000Da、至少6,500Da、至少7,000Da、至少7,500Da、至少8,000Da、至少8,500Da、至少9,000Da、至少9,500Da或至少10,000Da，例如分子量在介于3,000-20,000Da之间的范围内，诸如分子量在介于3,000-17,000Da之间、介于3,000-15,000Da之间、介于3,000-12,000Da之间、介于3,000-10,000Da之间、介于3,000-8,000Da之间、介于3,000-5,000Da之间、介于5,000-20,000Da之间、介于5,000-15,000Da之间、介于5,000-13,000Da之间、介于5,000-10,000Da之间、介于5,000-9,000Da之间、介于5,000-7,000Da之间、介于6,000-20,000Da之间、介于6,000-16,000Da之间、介于6,000-11,000Da之间、介于6,000-9,000Da之间、介于6,500-7,500Da之间、介于10,000-20,000Da之间、介于10,000-15,000Da之间、介于12,000-18,000Da之间或介于15,000-20,000Da之间的范围内，其中分子量是质子化的分子量、碱金属分子量(如钠盐形式的分子量)或碱土金属分子量(如镁盐形式的分子量)。
在某些实施方案中，本文公开的方法提供寡核苷酸组合物，诸如单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或寡核苷酸组合物，其中产率是至少2g/mmol的至少700mmol的合成规模(例如，具有足以提供至少700mmol正在合成的寡核苷酸的负载能力的寡核苷酸合成柱)的寡核苷酸(例如，使用如本文所述的方法合成的抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸；例如，这样的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含具有序列SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中的任何一个的序列的至少10个核苷酸长的一部分，由所述序列的至多21个核苷酸组成，或包含所述序列的至多21个核苷酸长，具有所述序列)；以及至多25重量％的水，其中产率可以通过在260nm波长下的光密度/mL(OD/mL)来确定，或者可以通过针对制备寡核苷酸的合成规模进行水分含量校正的寡核苷酸组合物的干重来确定。例如，在某些实施方案中，根据本文公开的方法制备的组合物的产率可以是至少2.25g/mmol的至少700mmol合成规模的寡核苷酸，其中所述产率可以通过在260nm波长下的光密度/mL(OD/mL)来确定，或者可以通过针对制备寡核苷酸的合成规模进行水分含量校正的寡核苷酸组合物的干重来确定，诸如至少2.5g/mmol、至少2.75g/mmol、至少3g/mmol、至少3.25g/mmol、至少3.3g/mmol、至少3.4g/mmol、至少3.5g/mmol、至少3.6g/mmol、至少3.7g/mmol、至少3.75g/mmol、至少3.8g/mmol、至少3.9g/mmol、至少4g/mmol、至少4.25g/mmol、至少4.5g/mmol、至少4.75g/mmol、至少5g/mmol、至少5.5g/mmol、至少6g/mmol、至少6.5g/mmol、至少7g/mmol、至少7.5g/mmol、至少8g/mmol、至少8.5g/mmol、至少9g/mmol、至少9.5g/mmol、至少10g/mmol、至少10.5g/mmol、至少11g/mmol、至少11.5g/mmol、至少12g/mmol、至少12.5g/mmol、至少13g/mmol、至少13.5g/mmol、至少14g/mmol、至少14.5g/mmol，或至少15g/mmol的至少700mmol合成规模的寡核苷酸，例如在介于2-25g/mmol之间的范围内的合成规模的寡核苷酸，诸如在介于2-20g/mmol之间、介于2-15g/mmol之间、介于2-12.5g/mmol之间、介于2-10g/mmol之间、介于2-8g/mmol之间、介于2-6g/mmol之间、介于2-5.5g/mmol之间、介于2-5g/mmol之间、介于2-4.5g/mmol之间、介于2-4.25g/mmol之间、介于2-4g/mmol之间、介于3.5-4.5g/mmol之间、介于3.5-4.25g/mmol之间、介于3.5-4g/mmol之间、介于5-20g/mmol之间、介于5-15g/mmol之间、介于5-12.5g/mmol之间、介于5-10g/mmol之间、介于5-7.5g/mmol之间、介于6-8g/mmol之间、介于6-10g/mmol之间、介于6-15g/mmol之间、介于6-20g/mmol之间、介于7-10g/mmol之间、介于8-12g/mmol之间、介于10-15g/mmol之间、介于10-20g/mmol之间、介于20-30g/mmol之间，或介于15-25g/mmol之间的范围内的至少700mmol合成规模的寡核苷酸，其中所述产率可以通过在260nm波长下的光密度/mL(OD/mL)来确定，或者可以通过针对制备寡核苷酸的合成规模进行水分含量校正的寡核苷酸组合物的干重来确定；以及至多25重量％的水，诸如至多24重量％，至多23重量％、至多22重量％、至多21重量％、至多20重量％、至多19重量％、至多18重量％、至多17重量％、至多16重量％、至多15重量％、至多10重量％、至多9重量％、至多8重量％、至多7重量％、至多6重量％、至多5重量％的水，或在介于25-5％重量之间的水的范围内，例如在介于25-20％重量之间的水的范围内，诸如介于20-15％重量之间，介于20-10重量％之间、介于15-10重量％之间、介于15-5重量％之间，或介于10-5重量％之间的范围内的水。
在某些实施方案中，本文公开的方法提供寡核苷酸组合物，诸如单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或寡核苷酸组合物，其中产率是至少2g/mmol的至少700mmol的合成规模(例如，具有足以提供至少700mmol正在合成的寡核苷酸的负载能力的寡核苷酸合成柱)的寡核苷酸(例如，使用如本文所述的方法合成的抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸；例如，这样的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含具有序列SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中的任何一个的序列的至少10个核苷酸长的一部分，由所述序列的至多21个核苷酸组成，或包含所述序列的至多21个核苷酸长，具有所述序列)；以及至多25重量％的水，其中寡核苷酸的分子量是至少3,000Da，其中分子量是质子化的分子量、碱金属分子量(诸如钠盐形式的分子量)，或碱土金属分子量(诸如镁盐形式的分子量)，其中产率可以通过在260nm波长下的光密度/mL(OD/mL)来确定，或者可以通过针对制备寡核苷酸的合成规模进行水分含量校正的寡核苷酸组合物的干重来确定。例如，在某些实施方案中，根据本文公开的方法制备的组合物的产率可以是至少2g/mmol的至少700mmol合成规模的寡核苷酸和至多25重量％的水，其中产率可以通过在260nm波长下的光密度/mL(OD/mL)来确定，或者可以通过针对制备寡核苷酸的合成规模进行水分含量校正的寡核苷酸组合物的干重来确定，其中所述寡核苷酸的分子量为至少3500Da，诸如分子量为至少4,000Da、至少4,500Da、至少5,000Da、至少5,500Da、至少6,000Da、至少6,500Da、至少7,000Da、至少7,500Da、至少8,000Da、至少8,500Da、至少9,000Da、至少9,500Da或至少10,000Da，例如分子量在介于3,000-20,000Da之间的范围内，诸如分子量在介于3,000-17,000Da之间、介于3,000-15,000Da之间、介于3,000-12,000Da之间、介于3,000-10,000Da之间、介于3,000-8,000Da之间、介于3,000-5,000Da之间、介于5,000-20,000Da之间、介于5,000-15,000Da之间、介于5,000-13,000Da之间、介于5,000-10,000Da之间、介于5,000-9,000Da之间、介于5,000-7,000Da之间、介于6,000-20,000Da之间、介于6,000-16,000Da之间、介于6,000-11,000Da之间、介于6,000-9,000Da之间、介于6,500-7,500Da之间、介于10,000-20,000Da之间、介于10,000-15,000Da之间、介于12,000-18,000Da之间或介于15,000-20,000Da之间的范围内，并且其中分子量是质子化的分子量、碱金属分子量(如钠盐形式的分子量)或碱土金属分子量(如镁盐形式的分子量)。
在某些实施方案中，本文公开的方法提供寡核苷酸组合物，诸如单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或寡核苷酸组合物，其中产率是至少2.0g/mmol的至少700mmol的合成规模(例如，具有足以提供至少700mmol正在合成的寡核苷酸的负载能力的寡核苷酸合成柱)或两个或更多个合并的至少700mmol合成规模制备的寡核苷酸(例如，使用如本文所述的方法合成的抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸；例如，这样的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含具有序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:12中的任何一个的序列的至少10个核苷酸长的一部分，由所述序列的至多21个核苷酸组成，或包含所述序列的至多21个核苷酸长，具有所述序列)；以及至多25重量％的水，其中产率可以通过在260nm波长下的光密度/mL(OD/mL)来确定，或者可以通过针对制备寡核苷酸的合成规模进行水分含量校正的寡核苷酸组合物的干重来确定。例如，在某些实施方案中，根据本文公开的方法制备的组合物的产率可以为至少2.0g/mmol，诸如至少2.25g/mmol、2.5g/mmol、2.75g/mmol、3.0g/mmol、3.25g/mmol、3.3g/mmol、3.4g/mmol、3.5g/mmol、3.6g/mmol、3.7g/mmol、3.8g/mmol、3.9g/mmol或至少4.0g/mmol的至少700mmol合成规模制备或两个或更多个合并的至少700mmol合成规模制备，诸如3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个合并的至少700mmol合成规模制备的寡核苷酸，其中产率可以通过在260nm波长下的光密度/mL(OD/mL)来确定，或者可以通过针对制备寡核苷酸的合成规模进行水分含量校正的寡核苷酸组合物的干重来确定，例如在介于2.0-25g/mmol之间的范围内的合成规模的寡核苷酸，诸如在介于2-25g/mmol之间、介于2-20g/mmol之间、介于2-15g/mmol之间、介于2-12.5g/mmol之间、介于2-10g/mmol之间、介于2-8g/mmol之间、介于2-6g/mmol之间、介于2-5.5g/mmol之间、介于2-5g/mmol之间、介于2-4.5g/mmol之间、介于2-4.25g/mmol之间、介于2-4g/mmol之间、介于3.5-4.5g/mmol之间、介于3.5-4.25g/mmol之间、介于3.5-4g/mmol之间、介于5-20g/mmol之间、介于5-15g/mmol之间、介于5-12.5g/mmol之间、介于5-10g/mmol之间、介于5-7.5g/mmol之间、介于6-8g/mmol之间、介于6-10g/mmol之间、介于6-15g/mmol之间、介于6-20g/mmol之间、介于7-10g/mmol之间、介于8-12g/mmol之间、介于10-15g/mmol之间、介于10-20g/mmol之间、介于20-30g/mmol之间，或介于15-25g/mmol之间的范围内的合成规模的寡核苷酸，其中产率可以通过在260nm波长下的光密度/mL(OD/mL)来确定，或者可以通过针对制备寡核苷酸的合成规模进行水分含量校正的寡核苷酸组合物的干重来确定；以及至多25重量％的水，例如至多20重量％、至多15重量％、至多10重量％、至多9重量％、至多8重量％、至多7重量％、至多6重量％或至多5重量％的水，或在介于25-5重量％之间的水的范围内，例如在介于20-5重量％之间的水、介于15-5重量％之间的水、介于10-5重量％之间的水、介于9-5重量％之间的水的范围内，诸如介于8-5重量％之间、介于7-5重量％之间、介于6-5重量％之间、介于9-6重量％之间、或介于8-7重量％之间的水。在某些实施方案中，根据本文公开的方法制备的组合物的产率可以为至少2.0g/mmol，诸如至少2.25g/mmol、2.5g/mmol、2.75g/mmol、3.0g/mmol、3.25g/mmol、3.3g/mmol、3.4g/mmol、3.5g/mmol、3.6g/mmol、3.7g/mmol、3.8g/mmol、3.9g/mmol或至少4.0g/mmol的至少700mmol合成规模，或合并在一起的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个的至少700mmol寡核苷酸合成规模制备，例如合并在一起的介于1-10个之间的至少700mmol寡核苷酸合成规模制备，诸如合并在一起的介于1-8个之间、介于2-10个之间、介于3-9个之间、介于4-7个之间、介于4-6个之间、介于6-10个之间、或介于8-10个之间的至少700mmol寡核苷酸合成规模制备，诸如至少800mmol、至少900mmol、至少1,000mmol、至少1,100mmol、至少1,200mmol、至少1,300mmol、至少1,400mmol、至少1,600mmol、至少1,800mmol、至少2,400mmol、至少2,700mmol、至少3,000mmol、至少3,600mmol或至少4,500mmol的寡核苷酸合成规模制备，或在介于300-5,400mmol之间的范围内，诸如在介于300-4,500mmol之间、介于300-4,000mmol之间、介于300-3,600mmol之间、介于300-3,000mmol之间、介于600-3,000mmol之间、介于700-3,600mmol之间、介于700-3,000mmol之间、介于700-2,700mmol之间、介于700-2,500mmol之间、介于700-2,400mmol之间、介于700-2,000mmol之间、介于700-1,500mmol之间、介于700-1,000mmol之间、介于700-900mmol之间、介于800-1,000mmol之间、介于900-1,600mmol之间、介于900-2,400mmol之间、介于900-3,600mmol之间、介于1,000-3,000mmol之间、介于1,000-2,000mmol之间、介于1,500-2,000mmol之间、介于1,600-2,400mmol之间、介于1,500-2,500mmol之间、介于1,500-3,000mmol之间、介于1,800-3,600mmol之间、介于2,000-3,000mmol之间、介于2,000-2,500mmol之间、介于2,500-3,000mmol之间、介于2,600-2,800mmol之间、介于2,700-3,000mmol之间、介于900-2,000mmol之间、介于900-2,500mmol之间、介于900-2,700mmol之间、介于1,000-4,000mmol之间、介于1,500-3,500mmol之间、介于2,000-4,000mmol之间、介于2,500-3,500mmol之间、介于2,700-3,600mmol之间、介于2,700-4,500mmol之间、介于3,000-4,000mmol之间、介于3,600-4,500mmol之间，或介于3,600-5,400mmol之间的范围内的寡核苷酸合成规模制备。
在某些实施方案中，本文公开的方法提供寡核苷酸组合物，诸如单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或寡核苷酸组合物，其中产率是至少2.0g/mmol的至少700mmol的合成规模(例如，具有足以提供至少700mmol正在合成的寡核苷酸的负载能力的寡核苷酸合成柱)或两个或更多个合并的至少700mmol的合成规模制备的寡核苷酸(例如，使用如本文所述的方法合成的抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸；例如，这样的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含具有序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中的任何一个的序列的至少10个核苷酸长的一部分，由所述序列的至多21个核苷酸组成，或包含所述序列的至多21个核苷酸长，具有所述序列)；以及至多25重量％的水，其中寡核苷酸的分子量是至少3,000Da，其中分子量是质子化的分子量、碱金属分子量(诸如钠盐形式的分子量)，或碱土金属分子量(诸如镁盐形式的分子量)，其中产率可以通过在260nm波长下的光密度/mL(OD/mL)来确定，或者可以通过针对制备寡核苷酸的合成规模进行水分含量校正的寡核苷酸组合物的干重来确定。例如，在某些实施方案中，根据本文公开的方法制备的组合物的产率可以是至少2.0g/mmol，诸如至少2.25g/mmol、2.5g/mmol、2.75g/mmol、3.0g/mmol、3.25g/mmol、3.3g/mmol、3.4g/mmol、3.5g/mmol、3.6g/mmol、3.7g/mmol、3.8g/mmol、3.9g/mmol或至少4.0g/mmol，例如在介于2.0-25g/mmol之间的范围内的合成规模的寡核苷酸，诸如在介于2-25g/mmol之间、介于2-20g/mmol之间、介于2-15g/mmol之间、介于2-12.5g/mmol之间、介于2-10g/mmol之间、介于2-8g/mmol之间、介于2-6g/mmol之间、介于2-5.5g/mmol之间、介于2-5g/mmol之间、介于2-4.5g/mmol之间、介于2-4.25g/mmol之间、介于2-4g/mmol之间、介于3.5-4.5g/mmol之间、介于3.5-4.25g/mmol之间、介于3.5-4g/mmol之间、介于5-20g/mmol之间、介于5-15g/mmol之间、介于5-12.5g/mmol之间、介于5-10g/mmol之间、介于5-7.5g/mmol之间、介于6-8g/mmol之间、介于6-10g/mmol之间、介于6-15g/mmol之间、介于6-20g/mmol之间、介于7-10g/mmol之间、介于8-12g/mmol之间、介于10-15g/mmol之间、介于10-20g/mmol之间、介于20-30g/mmol之间，或介于15-25g/mmol之间的至少700mmol寡核苷酸合成规模，或合并在一起的两个或更多个至少700mmol寡核苷酸合成规模制备，诸如合并在一起的3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个至少700mmol寡核苷酸合成规模制备，例如至少800mmol、至少900mmol、至少1,000mmol、至少1,100mmol、至少1200mmol、至少1,300mmol、至少1,400mmol、至少1,600mmol、至少1,800mmol、至少2,400mmol、至少2,700mmol、至少3,000mmol、至少3,600mmol或至少4,500mmol的寡核苷酸合成规模制备，或在介于300-5,400mmol之间的范围内，诸如在介于300-3,600mmol之间、介于300-3,000mmol之间、介于600-3,000mmol之间、介于700-3,600mmol之间、介于700-3,000mmol之间、介于700-2,700mmol之间、介于700-2,500mmol之间、介于700-2,400mmol之间、介于700-2,000mmol之间、介于700-1,500mmol之间、介于700-1,000mmol之间、介于700-900mmol之间、介于800-1,000mmol之间、介于900-1,600mmol之间、介于900-2,400mmol之间、介于900-3,600mmol之间、介于1,000-3,000mmol之间、介于1,000-2,000mmol之间、介于1,500-2,000mmol之间、介于1,600-2,400mmol之间、介于1,500-2,500mmol之间、介于1,500-3,000mmol之间、介于1,800-3,600mmol之间、介于2,000-3,000mmol之间、介于2,000-2,500mmol之间、介于2,500-3,000mmol之间、介于2,600-2,800mmol之间、介于2,700-3,000mmol之间、介于900-2,000mmol之间、介于900-2,500mmol之间、介于900-2,700mmol之间、介于1,000-4,000mmol之间、介于1,500-3,500mmol之间、介于2,000-4,000mmol之间、介于2,500-3,500mmol之间、介于2,700-3,600mmol之间、介于2,700-4,500mmol之间、介于3,000-4,000mmol之间、介于3,600-4,500mmol之间或介于3,600-5,400mmol之间的寡核苷酸合成规模制备；以及至多25重量％的水，其中产率可以通过在260nm波长下的光密度/mL(OD/mL)来确定，或者可以通过针对制备寡核苷酸的合成规模进行水分含量校正的寡核苷酸组合物的干重来确定，其中所述寡核苷酸的分子量为至少3500Da，诸如分子量为至少4,000Da、至少4,500Da、至少5,000Da、至少5,500Da、至少6,000Da、至少6,500Da、至少7,000Da、至少7,500Da、至少8,000Da、至少8,500Da、至少9,000Da、至少9,500Da或至少10,000Da，例如分子量在介于3,000-20,000Da之间的范围内，诸如分子量在介于3,000-17,000Da之间、介于3,000-15,000Da之间、介于3,000-12,000Da之间、介于3,000-10,000Da之间、介于3,000-8,000Da之间、介于3,000-5,000Da之间、介于5,000-20,000Da之间、介于5,000-15,000Da之间、介于5,000-13,000Da之间、介于5,000-10,000Da之间、介于5,000-9,000Da之间、介于5,000-7,000Da之间、介于6,000-20,000Da之间、介于6,000-16,000Da之间、介于6,000-11,000Da之间、介于6,000-9,000Da之间、介于6,500-7,500Da之间、介于10,000-20,000Da之间、介于10,000-15,000Da之间、介于12,000-18,000Da之间或介于15,000-20,000Da之间的范围内，并且其中分子量是质子化的分子量、碱金属分子量(如钠盐形式的分子量)或碱土金属分子量(如镁盐形式的分子量)。
在某些实施方案中，寡核苷酸组合物，诸如单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物，可以包含以下物质或由以下物质组成：至少2kg的寡核苷酸(例如，使用如本文所述的方法合成的抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸；例如，这样的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含具有序列SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中的任何一个的序列的至少10个核苷酸长的一部分，由所述序列的至多21个核苷酸组成，或包含所述序列的至多21个核苷酸长，具有所述序列)；以及至多25重量％的水。例如，在某些实施方案中，组合物可包含以下物质或由以下物质组成：至少2.5kg的寡核苷酸，诸如至少3kg、至少3.5kg、至少4kg、至少4.5kg、至少5kg、至少5.5kg、至少6kg、至少6.5kg、至少7kg、至少7.5kg、至少8kg、至少8.5kg、至少9kg、至少9.5kg、至少10kg、至少11kg、至少12kg、至少13kg、至少14kg，或至少15kg的寡核苷酸，例如在介于2-15kg之间的范围内的寡核苷酸，诸如在介于2-12.5kg之间、介于2-10kg之间、介于2-7.5kg之间、介于2-5kg之间、介于3-15kg之间、介于3-12.5kg之间、介于3-10kg之间、介于3-8kg之间、介于3-6kg之间、介于5-15kg之间、介于5-13kg之间、介于5-10kg之间、介于5-7.5kg之间、介于6-15kg之间、介于6-10kg之间、介于8-15kg之间、介于8-12kg之间，或介于10-15kg之间的范围内的寡核苷酸；以及至多25重量％的水，诸如至多24重量％、至多23重量％、至多22重量％、至多21重量％、至多20重量％、至多19重量％、至多18重量％、至多17重量％、至多16重量％、至多15重量％、至多10重量％、至多9重量％、至多8重量％、至多7重量％、至多6重量％、至多5重量的水，或在介于25-5重量％之间的范围内的水，例如在介于25-20重量％之间的水，诸如在介于20-15重量％之间、介于20-10重量％之间、介于15-10重量％之间、介于15-5重量％之间，或介于10-5重量％之间的范围内的水。
在某些实施方案中，寡核苷酸组合物，诸如单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物，可以包含以下物质或由以下物质组成：至少2kg的寡核苷酸(例如，使用如本文所述的方法合成的抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸；例如，这样的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含具有序列SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中的任何一个的序列的至少10个核苷酸长的一部分，由所述序列的至多21个核苷酸组成，或包含所述序列的至多21个核苷酸长，具有所述序列)；以及至多25重量％的水，其中寡核苷酸的分子量为至少3,000Da，其中所述分子量是质子化的分子量、碱金属分子量(诸如钠盐形式的分子量)或碱土金属分子量(诸如镁盐形式的分子量)。例如，在某些实施方案中，组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：至少2kg的寡核苷酸和至多25重量％的水，其中寡核苷酸的分子量为至少3500Da，诸如分子量为至少4,000Da、至少4,500Da、至少5,000Da、至少5,500Da、至少6,000Da、至少6,500Da、至少7,000Da、至少7,500Da、至少8,000Da、至少8,500Da、至少9,000Da、至少9,500Da或至少10,000Da，例如分子量在介于3,000-20,000Da之间的范围内，诸如分子量在介于3,000-17,000Da之间、介于3,000-15,000Da之间、介于3,000-12,000Da之间、介于3,000-10,000Da之间、介于3,000-8,000Da之间、介于3,000-5,000Da之间、介于5,000-20,000Da之间、介于5,000-15,000Da之间、介于5,000-13,000Da之间、介于5,000-10,000Da之间、介于5,000-9,000Da之间、介于5,000-7,000Da之间、介于6,000-20,000Da之间、介于6,000-16,000Da之间、介于6,000-11,000Da之间、介于6,000-9,000Da之间、介于6,500-7,500Da之间、介于10,000-20,000Da之间、介于10,000-15,000Da之间、介于12,000-18,000Da之间或介于15,000-20,000Da之间的范围内，其中分子量是质子化的分子量、碱金属分子量(如钠盐形式的分子量)或碱土金属分子量(如镁盐形式的分子量)。
在某些实施方案中，寡核苷酸组合物，诸如单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物，可包含以下物质或由以下物质组成：至少50mol％的来自至少一个300mmol或更大的寡核苷酸合成柱(即，具有提供至少一个300mmol或更大的正在合成的寡核苷酸的负载能力的寡核苷酸合成柱)诸如来自至少一个700mmol或更大的寡核苷酸合成柱的寡核苷酸输出；以及至多25重量％的水，其中所述寡核苷酸如本文所公开，诸如使用如本文所述的方法合成的抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸；例如，这样的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含具有序列SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中的任何一个的序列的至少10个核苷酸长的一部分，由所述序列的至多21个核苷酸组成，或包含所述序列的至多21个核苷酸长，具有所述序列，其中所述输出是通过在260nm波长下的光密度/mL(OD/mL)来确定的，或者可以通过针对制备寡核苷酸的合成规模进行水分含量校正的寡核苷酸组合物的干重来确定。在某些实施方案中，组合物可包含以下物质或由以下物质组成：至少50mol％的寡核苷酸输出(如通过光密度/mL(OD/mL)确定的或通过针对制备寡核苷酸的合成规模进行水分含量校正的寡核苷酸组合物的干重而确定的)，例如至少55mol％、至少60mol％、至少65mol％、至少70mol％、至少75mol％、至少80mol％、至少85mol％、至少90mol％、至少95mol％、至少97mol％、至少98mol％、或至少99mol％的寡核苷酸输出，诸如在介于50-99mol％之间、介于60-99mol％之间、介于70-99mol％之间、介于80-99mol％之间、介于90-99mol％之间、介于95-99mol％之间、介于75-95mol％之间、介于80-97mol％之间、介于85-95mol％之间，或介于70-90mol％之间的范围内的来自至少一个300mmol或更大的寡核苷酸合成柱(诸如至少一个700mmol或更大的寡核苷酸合成柱)的寡核苷酸输出；以及至多25重量％的水。在某些实施方案中，寡核苷酸输出是从至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个300mmol或更大的寡核苷酸合成柱，例如从介于1-10个之间的300mmol或更大的寡核苷酸合成柱，诸如介于1-8个之间、介于2-10个之间、介于3-9个之间、介于4-7个之间、介于4-6个之间、介于6-10个之间或介于8-10个之间的300mmol或更大的寡核苷酸合成柱，诸如从600mmol或更大、700mmol或更大、800mmol或更大、900mmol或更大、1,000mmol或更大、1,100mmol或更大、1,200mmol或更大、1,300mmol或更大、1,400mmol或更大、1,500mmol或更大、1,600mmol或更大、1,700mmol或更大、1,800mmol或更大、1,900mmol或更大、2,000mmol或更大、2,100mmol或更大、2,200mmol或更大、2,300mmol或更大、2,400mmol或更大、2,500mmol或更大、2,600mmol或更大、2,700mmol或更大、2,800mmol或更大、2,900mmol或更大、3,000mmol或更大、3,200mmol或更大、3,400mmol或更大、3,600mmol或更大、4,000mmol或更大、4,200mmol或更大、4,500mmol或更大、5,000mmol或更大，或5,400mmol或更大的寡核苷酸合成柱，或从在介于300-5,400mmol之间的范围内，诸如在介于300-4,500mmol之间、介于300-4,000mmol之间、介于300-3,600mmol之间、介于300-3,000mmol之间、介于600-3,000mmol之间、介于700-3,600mmol之间、介于700-3,000mmol之间、介于700-2,700mmol之间、介于700-2,500mmol之间、介于700-2,400mmol之间、介于700-2,000mmol之间、介于700-1,500mmol之间、介于700-1,000mmol之间、介于700-900mmol之间、介于800-1,000mmol之间、介于900-1,600mmol之间、介于900-2,400mmol之间、介于900-3,600mmol之间、介于1,000-3,000mmol之间、介于1,000-2,000mmol之间、介于1,500-2,000mmol之间、介于1,600-2,400mmol之间、介于1,500-2,500mmol之间、介于1,500-3,000mmol之间、介于1,800-3,600mmol之间、介于2,000-3,000mmol之间、介于2,000-2,500mmol之间、介于2,500-3,000mmol之间、介于2,600-2,800mmol之间、介于2,700-3,000mmol之间、介于900-2,000mmol之间、介于900-2,500mmol之间、介于900-2,700mmol之间、介于1,000-4,000mmol之间、介于1,500-3,500mmol之间、介于2,000-4,000mmol之间、介于2,500-3,500mmol之间、介于2,700-3,600mmol之间、介于2,700-4,500mmol之间、介于3,000-4,000mmol之间、介于3,600-4,500mmol之间，或介于3,600-5,400mmol之间的范围内的寡核苷酸合成柱合并的；以及至多25重量％的水。在某些实施方案中，所述组合物可包含以下物质或由以下物质组成：至少50mol％的来自至少一个300mmol或更大的寡核苷酸合成柱(如通过光密度/mL(OD/mL)确定的或通过针对制备寡核苷酸的合成规模进行水分含量校正的寡核苷酸组合物的干重而确定的)，诸如至少一个700mmol或更大的寡核苷酸合成柱，例如至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，或在介于1-10个之间、介于1-8个之间、介于2-10个之间、介于3-9个之间、介于4-7个之间、介于4-6个之间、介于6-10个之间或介于8-10个之间的范围内的300mmol或更大的寡核苷酸合成柱，诸如至少一个700mmol或更大的寡核苷酸合成柱的寡核苷酸输出；以及至多25重量％的水，诸如至多25重量％的水，诸如至多24重量％、至多23重量％、至多22重量％、至多21重量％、至多20重量％、至多19重量％、至多18重量％、至多17重量％、至多16重量％、至多15重量％、至多10重量％、至多9重量％、至多8重量％、至多7重量％、至多6重量％、至多5重量的水，或在介于25-5重量％之间的范围内的水，例如在介于25-20重量％之间的水，诸如在介于20-15重量％之间、介于20-10重量％之间、介于15-10重量％之间、介于15-5重量％之间或介于10-5重量％之间的范围内的水，其中寡核苷酸的分子量是至少3,000Da，例如分子量是至少3500Da，诸如至少4,000Da、至少4,500Da、至少5,000Da、至少5,500Da、至少6,000Da、至少6,500Da、至少7,000Da、至少7,500Da、至少8,000Da、至少8,500Da、至少9,000Da、至少9,500Da，或至少10,000Da，例如分子量在介于3,000-20,000Da之间的范围内，诸如分子量在介于3,000-17,000Da之间、介于3,000-15,000Da之间、介于3,000-12,000Da之间、介于3,000-10,000Da之间、介于3,000-8,000Da之间、介于3,000-5,000Da之间、介于5,000-20,000Da之间、介于5,000-15,000Da之间、介于5,000-13,000Da之间、介于5,000-10,000Da之间、介于5,000-9,000Da之间、介于5,000-7,000Da之间、介于6,000-20,000Da之间、介于6,000-16,000Da之间、介于6,000-11,000Da之间、介于6,000-9,000Da之间、介于6,500-7,500Da之间、介于10,000-20,000Da之间、介于10,000-15,000Da之间、介于12,000-18,000Da之间，或介于15,000-20,000Da之间的范围内，其中分子量是质子化的分子量、碱金属分子量(如钠盐形式的分子量)或碱土金属分子量(如镁盐形式的分子量)。
在某些实施方案中，包含寡核苷酸(例如，使用如本文所述的方法合成的抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸；例如，这样的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含具有序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中的任何一个的序列的至少10个核苷酸长的一部分，由所述序列的至多21个核苷酸组成，或包含所述序列的至多21个核苷酸长，具有所述序列)或由所述寡核苷酸组成的寡核苷酸组合物(诸如单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物，或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物)的纯度可以是60％或更高(如例如通过RP-HPLC确定的)，诸如纯度是65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、97％或更高，或99％或更高，诸如纯度在介于50-99％之间，例如介于60-99％之间、介于70-99％之间、介于80-99％之间、介于90-99％之间、介于95-99％之间、介于75-95％之间、介于80-97％之间、介于85-95％，或介于70-90％之间(如例如通过RP-HPLC确定的)的范围内，其中所述组合物中的所述寡核苷酸的分子量是至少3,000Da，诸如分子量是至少3500Da，诸如至少4,000Da、至少4,500Da、至少5,000Da、至少5,500Da、至少6,000Da、至少6,500Da、至少7,000Da、至少7,500Da、至少8,000Da、至少8,500Da、至少9,000Da、至少9,500Da，或至少10,000Da，例如分子量在介于3,000-20,000Da之间的范围内，诸如分子量在介于3,000-17,000Da之间、介于3,000-15,000Da之间、介于3,000-12,000Da之间、介于3,000-10,000Da之间、介于3,000-8,000Da之间、介于3,000-5,000Da之间、介于5,000-20,000Da之间、介于5,000-15,000Da之间、介于5,000-13,000Da之间、介于5,000-10,000Da之间、介于5,000-9,000Da之间、介于5,000-7,000Da之间、介于6,000-20,000Da之间、介于6,000-16,000Da之间、介于6,000-11,000Da之间、介于6,000-9,000Da之间、介于6,500-7,500Da之间、介于10,000-20,000Da之间、介于10,000-15,000Da之间、介于12,000-18,000Da之间，或介于15,000-20,000Da之间的范围内，其中分子量是质子化的分子量、碱金属分子量(如钠盐形式的分子量)或碱土金属分子量(如镁盐形式的分子量)。
在某些实施方案中，被设计为具有预定数目的核苷酸(N)的寡核苷酸(例如，使用如本文所述的方法合成的抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸；例如，这样的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含具有序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中的任何一个的序列的至少10个核苷酸长的一部分，由所述序列的至多21个核苷酸组成，或包含所述序列的至多21个核苷酸长，具有所述序列)的寡核苷酸组合物(诸如单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物)可以含有相对于组合物的重量不超过4重量％的量的具有(N+1)个核苷酸的寡核苷酸，例如相对于组合物的重量不超过3.5重量％(诸如相对于被设计成具有预定数量的核苷酸(N)的单批寡核苷酸组合物的重量不超过3.0重量％、不超过2.5重量％、不超过2.0重量％、不超过1.5重量％、不超过1.0重量％，或不超过0.5重量％)的量的具有(N+1)个核苷酸的寡核苷酸。例如，在某些实施方案中，被设计成具有预定数目的核苷酸(N＝21)的寡核苷酸的组合物可以含有相对于被设计成具有预定数目的核苷酸(N＝21，或21聚体)的寡核苷酸的组合物的重量不超过4重量％的量的具有(N+1)个核苷酸(即，N+1＝22，或22聚体)的寡核苷酸。
在某些实施方案中，寡核苷酸组合物，诸如单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物，可以包含其中5'末端核苷的5'-羟基被保护的寡核苷酸(例如，使用如本文所述的方法合成的受保护的抗SMAD7寡核苷酸或化学修饰的抗SMAD7寡核苷酸；例如，这样的受保护的寡核苷酸，所述受保护的寡核苷酸包含具有序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中的任何一个的序列的至少10个核苷酸长的一部分，由所述序列的至多21个核苷酸组成，或包含所述序列的至多21个核苷酸长，具有所述序列)或由其中5'末端核苷的5'-羟基被保护的寡核苷酸组成。例如，在某些实施方案中，组合物可以包含受保护的寡核苷酸或由受保护的寡核苷酸组成，其中仅5'-末端核苷的5'-羟基被保护。在某些实施方案中，所述组合物可以包含在从合成柱切割和洗脱后获得的受保护的寡核苷酸或由所述寡核苷酸组成，其中5'-末端核苷的5'-羟基被保护。在某些实施方案中，包含具有受保护的5'末端核苷的5'羟基的受保护的寡核苷酸或由所述寡核苷酸组成的组合物的纯度是60％或更高(如例如通过RP-HPLC确定的)，诸如纯度是65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、97％或更高，或99％或更高，诸如纯度在介于50-99％之间、介于60-99％之间、介于70-99％之间、介于80-99％之间、介于90-99％之间、介于95-99％之间、介于75-95％之间、介于80-97％之间、介于85-95％，或介于70-90％之间(如例如通过RP-HPLC确定的)的范围内，其中基本上纯的寡核苷酸组合物中的具有受保护的5'末端核苷的5'羟基的受保护的寡核苷酸的分子量是至少3,000Da，诸如分子量是至少3500Da，诸如至少4,000Da、至少4,500Da、至少5,000Da、至少5,500Da、至少6,000Da、至少6,500Da、至少7,000Da、至少7,500Da、至少8,000Da、至少8,500Da、至少9,000Da、至少9,500Da，或至少10,000Da，例如分子量在介于3,000-20,000Da之间的范围内，诸如分子量在介于3,000-17,000Da之间、介于3,000-15,000Da之间、介于3,000-12,000Da之间、介于3,000-10,000Da之间、介于3,000-8,000Da之间、介于3,000-5,000Da之间、介于5,000-20,000Da之间、介于5,000-15,000Da之间、介于5,000-13,000Da之间、介于5,000-10,000Da之间、介于5,000-9,000Da之间、介于5,000-7,000Da之间、介于6,000-20,000Da之间、介于6,000-16,000Da之间、介于6,000-11,000Da之间、介于6,000-9,000Da之间、介于6,500-7,500Da之间、介于10,000-20,000Da之间、介于10,000-15,000Da之间、介于12,000-18,000Da之间，或介于15,000-20,000Da之间的范围内，其中分子量是质子化的分子量、碱金属分子量(如钠盐形式的分子量)或碱土金属分子量(如镁盐形式的分子量)。
在某些实施方案中，寡核苷酸组合物，诸如单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物，可以来源于来自至少一个或多个具有固体支撑物以及指定量的负载能力的寡核苷酸合成柱(或合成轮次)的寡核苷酸合成输出，其中所述寡核苷酸合成输出可：(1)提供作为液体寡核苷酸组合物或固体寡核苷酸组合物的单批组合物(或单批寡核苷酸组合物)；或(2)进行合并或组合(以使所得合并/组合的寡核苷酸组合物具有一致的特性和性质，例如物理和化学性质分布在整个所述所得的合并/组合的寡核苷酸组合物中)，以提供作为液体寡核苷酸组合物或固体寡核苷酸组合物的单批组合物(或单批寡核苷酸组合物)。在某些实施方案中，寡核苷酸组合物，诸如单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物，可以来源于来自至少一个或多个具有固体支撑物以及指定量的负载能力的寡核苷酸合成柱(或合成轮次)的寡核苷酸合成输出，其中所述寡核苷酸合成输出可：(1)通过至少一个另外的工艺以单次迭代或多次并行迭代(不一定同时进行)进行处理，所述至少一个另外的工艺包括：寡核苷酸化学转化工艺(例如，寡核苷酸脱保护或从固体支撑物上切割)、寡核苷酸纯化工艺(例如，离子交换色谱)、寡核苷酸脱盐工艺(例如，超滤和/或渗滤)、液体组合物浓缩工艺(例如，薄膜蒸发)或干燥工艺(例如，冷冻干燥)，或它们的组合；(2)进行合并或组合(以使所得合并/组合的寡核苷酸组合物具有一致的特性和性质，例如物理和化学性质分布在整个所述所得的合并/组合的寡核苷酸组合物中)：(a)然后通过至少一个另外的工艺(或它们的组合)以单次迭代或多次并行迭代(不一定同时进行)进行处理；或(b)随后将所得合并/组合的寡核苷酸组合物分成更小的部分，然后通过至少一个另外的工艺(或它们的组合)以多次并行迭代(不一定同时进行)进行处理；或(3)分成更小的部分，然后通过至少一个另外的工艺(或它们的组合)以多个并行迭代(不一定同时进行)进行处理。在某些实施方案中，寡核苷酸组合物，诸如单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物，可以来源于来自至少一个或多个具有固体支撑物以及指定量的负载能力的寡核苷酸合成柱(或合成轮次)的寡核苷酸合成输出，其中所述寡核苷酸合成输出可通过至少一个另外的工艺以单次迭代或多次并行迭代(不一定同时进行)进行处理，所述至少一个另外的工艺包括：寡核苷酸化学转化工艺(例如，寡核苷酸脱保护或从固体支撑物上切割)、寡核苷酸纯化工艺(例如，离子交换色谱)、寡核苷酸脱盐工艺(例如，超滤和/或渗滤)、液体组合物浓缩工艺(例如，薄膜蒸发)或干燥工艺(例如，冷冻干燥)，或它们的组合；其中：(1)寡核苷酸合成输出可以：(a)进行合并或组合(以使所得合并/组合的寡核苷酸组合物具有一致的特性和性质，例如物理和化学性质分布在整个所述所得合并/组合的寡核苷酸组合物中)：(i)然后通过至少一个另外的工艺(或它们的组合)以单次迭代或多次并行迭代(不一定同时进行)进行处理；或者(ii)随后将所得的合并/组合的寡核苷酸组合物分成更小的部分，然后通过至少一个另外的工艺(或它们的组合)以多次并行迭代(不一定同时进行)进行处理；或者(b)分成更小的部分，然后通过至少一个另外的工艺(或它们的组合)以多次并行迭代(不一定同时进行)进行处理；和/或(2)从至少一个另外的工艺中的任意一个、多个或每一个所产生的输出可以：(a)提供作为液体寡核苷酸组合物或固体寡核苷酸组合物的单批组合物(或单批寡核苷酸组合物)；(b)进行合并或组合(以使所得合并/组合的寡核苷酸组合物具有一致的特性和性质，例如物理和化学性质分布在整个所得的合并/组合的寡核苷酸组合物中)：(i)提供作为液体寡核苷酸组合物或固体寡核苷酸组合物的单批组合物(或单批寡核苷酸组合物)；(ii)然后通过第二个、下一个、或下游的(参见例如，图1)至少一个另外的工艺(或它们的组合)以单次迭代或多次并行迭代(不一定同时进行)进行处理；或(iii)随后将所得合并/组合的寡核苷酸组合物分成更小的部分，然后通过第二个、下一个、或下游的(参见例如，图1)至少一个另外的工艺(或它们的组合)以多次并行迭代(不一定同时进行)进行处理；或者(c)分成更小的部分，然后通过第二个、下一个、或下游的(参见例如，图1)至少一个另外的工艺(或它们的组合)以多次并行迭代(不一定同时进行)进行处理。
在某些实施方案中，寡核苷酸组合物，诸如单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物，可以来源于以下方式(或通过以下方式制备)：使寡核苷酸合成输出(例如至少一个、多个、分割的、或合并的(或组合的)寡核苷酸合成输出)以单次迭代或多次并行迭代(不一定同时进行)经受寡核苷酸化学转化工艺(例如，寡核苷酸脱保护或从固体支撑物上切割)，并且其中来自单次或多次并行迭代的化学转化的寡核苷酸输出可：(1)进行合并或组合(以使所得合并/组合的寡核苷酸组合物具有一致的特性和性质，例如，物理和化学性质分布在整个所述所得的合并/组合的寡核苷酸组合物中)：(a)提供作为液体寡核苷酸组合物的单批组合物(或单批寡核苷酸组合物)；(b)然后通过至少一个另外的工艺以单次迭代或多次并行迭代(不一定同时进行)进行处理，所述至少一个另外的工艺包括：寡核苷酸纯化、寡核苷酸脱盐工艺、液体组合物浓缩工艺、或干燥工艺，或它们的组合；或者(c)随后将所得合并/组合的寡核苷酸组合物分成更小的部分，然后通过至少一个另外的工艺(或它们的组合)以多个并行迭代(不一定同时进行)进行处理；(2)通过至少一个另外的工艺(或它们的组合)以单次迭代或多次并行迭代(不一定同时进行)进一步处理；或(3)分成更小的部分，然后通过至少一个另外的工艺(或它们的组合)以多个并行迭代(不一定同时进行)进行处理。
在某些实施方案中，寡核苷酸组合物，诸如单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物，可以来源于以下方式(或通过以下方式制备)：使化学转化的寡核苷酸输出(例如至少一个、多个、分割的、或合并的(或组合的)化学转化的寡核苷酸输出)以单次迭代或多次并行迭代(不一定同时进行)经受寡核苷酸纯化工艺(例如，离子交换色谱)，并且其中来自单次或多次并行迭代的纯化的寡核苷酸输出可：(1)进行合并或组合(以使所得合并/组合的寡核苷酸组合物具有一致的特性和性质，例如，物理和化学性质分布在整个所述所得的合并/组合的寡核苷酸组合物中)：(a)提供作为液体寡核苷酸组合物的单批组合物(或单批寡核苷酸组合物)；(b)然后通过至少一个另外的工艺以单次迭代或多次并行迭代(不一定同时进行)进行处理，所述至少一个另外的工艺包括：寡核苷酸脱盐工艺、液体组合物浓缩工艺、或干燥工艺，或它们的组合；或者(c)随后将所得合并/组合的寡核苷酸组合物分成更小的部分，然后通过至少一个另外的工艺(或它们的组合)以多个并行迭代(不一定同时进行)进行处理；(2)通过至少一个另外的工艺(或它们的组合)以单次迭代或多次并行迭代(不一定同时进行)进一步处理；或(3)分成更小的部分，然后通过至少一个另外的工艺(或它们的组合)以多个并行迭代(不一定同时进行)进行处理。在某些实施方案中，寡核苷酸纯化工艺(例如，离子交换色谱)可以单次迭代进行，诸如利用具有足以纯化指定量的离子交换能力的单个离子交换柱，或者可以多次并行迭代进行，诸如利用具有足以纯化指定量的离子交换能力的多个离子交换柱或在具有足以纯化指定量的离子交换能力的一个或多个并行或彼此相邻(不一定同时进行)的柱上进行多个轮次，例如可以利用1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个或60个具有足以纯化指定量的离子交换能力的离子交换柱或在具有足以纯化指定量的离子交换能力的离子交换柱上进行的纯化轮次(例如，在并行或彼此相邻的柱上进行的轮次)，例如不超过介于1-60个之间、介于1-55个之间、介于1-50个之间、介于1-45个之间、介于1-40个之间、介于1-35个之间、介于1-30个之间、介于1-25个之间、介于1-20个之间、介于1-15个之间、介于1-10个之间、介于1-9个之间、介于1-8个之间、介于1-7个之间、介于1-6个之间、介于1-5个之间、介于1-4个之间、介于1-3个之间、介于1-2个之间、介于3-10个之间、介于3-8个之间、介于3-5个之间、介于4-6个之间、介于5-10个之间、介于10-60个之间、介于10-50个之间、介于10-40个之间、介于10-30个之间、介于10-25个之间、介于10-20个之间、介于10-15个之间、介于20-50个之间、介于30-60个之间，或介于40-55个之间的具有足以纯化指定量的离子交换能力的离子交换柱或在具有足以纯化指定量的离子交换能力的离子交换柱上进行的纯化轮次(例如，在并行或彼此相邻的柱上进行的轮次)进行。
在某些实施方案中，寡核苷酸组合物，诸如单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物，可以来源于以下方式(或通过以下方式制备)：使纯化的寡核苷酸输出(例如至少一个、多个、分割的、或合并的(或组合的)纯化的寡核苷酸输出)以单次迭代或多次并行迭代(不一定同时进行)经受寡核苷酸脱盐工艺(例如，超滤和/或渗滤)，并且其中来自单次或多次并行迭代的脱盐的寡核苷酸输出可：(1)进行合并或组合(以使所得合并/组合的寡核苷酸组合物具有一致的特性和性质，例如，物理和化学性质分布在整个所述所得的合并/组合的寡核苷酸组合物中)：(a)提供作为液体寡核苷酸组合物的单批组合物(或单批寡核苷酸组合物)；(b)然后通过至少一个另外的工艺以单次迭代或多次并行迭代(不一定同时进行)进行处理，所述至少一个另外的工艺包括：液体组合物浓缩工艺、或干燥工艺，或它们的组合；或者(c)随后将所得合并/组合的寡核苷酸组合物分成更小的部分，然后通过至少一个另外的工艺(或它们的组合)以多个并行迭代(不一定同时进行)进行处理；(2)通过至少一个另外的工艺(或它们的组合)以单次迭代或多次并行迭代(不一定同时进行)进一步处理；或(3)分成更小的部分，然后通过至少一个另外的工艺(或它们的组合)以多个并行迭代(不一定同时进行)进行处理。
在某些实施方案中，寡核苷酸组合物，诸如单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物，可以来源于以下方式(或通过以下方式制备)：使脱盐的寡核苷酸输出(例如至少一个、多个、分割的、或合并的(或组合的)脱盐的寡核苷酸输出)以单次迭代或多次并行迭代(不一定同时进行)经受液体组合物浓缩工艺(例如，薄膜蒸发)，并且其中来自单次或多次并行迭代的浓缩的寡核苷酸液体组合物输出可：(1)进行合并或组合(以使所得合并/组合的寡核苷酸组合物具有一致的特性和性质，例如，物理和化学性质分布在整个所述所得的合并/组合的寡核苷酸组合物中)：(a)提供作为液体寡核苷酸组合物的单批组合物(或单批寡核苷酸组合物)；(b)然后通过干燥工艺以单次迭代或多次并行迭代(不一定同时进行)进行处理；或者(c)随后将所得合并/组合的寡核苷酸组合物分成更小的部分，然后通过干燥工艺以多个并行迭代(不一定同时进行)进行处理；(2)通过干燥工艺以单次迭代或多次并行迭代(不一定同时进行)进一步处理；或(3)分成更小的部分，然后通过干燥工艺以多个并行迭代(不一定同时进行)进行处理。
在某些实施方案中，寡核苷酸组合物，诸如单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物，可以来源于以下方式(或通过以下方式制备)：使浓缩的寡核苷酸液体组合物输出(例如至少一个、多个、分割的、或合并的(或组合的)浓缩的寡核苷酸液体组合物输出)以单次迭代或多次并行迭代(不一定同时进行)经受干燥工艺(例如，冷冻干燥)，并且其中来自单次或多次并行迭代的干燥的寡核苷酸固体组合物输出可进行合并(或组合)，以使所得合并/组合的寡核苷酸组合物具有一致的特性和性质，例如，物理和化学性质分布在整个所述所得的合并/组合的寡核苷酸组合物中，以提供作为固体寡核苷酸组合物的单批组合物(或单批寡核苷酸组合物)。
在某些实施方案中，输出寡核苷酸组合物中所含的寡核苷酸的量，例如寡核苷酸合成输出或来自一个或多个另外的工艺的输出(诸如化学转化的寡核苷酸输出、纯化的寡核苷酸输出、脱盐的寡核苷酸输出、浓缩的寡核苷酸液体组合物输出，和/或干燥的寡核苷酸组合物输出)可以是指定量。在某些实施方案中，输出寡核苷酸组合物(例如寡核苷酸合成输出或来自一个或多个其他工艺的输出)可以是至少一个输出、合并或组合的输出、或分割的输出。在某些实施方案中，所述指定量可以是至少100mmol，诸如至少150mmol、至少200mmol、至少250mmol、至少300mmol、至少500mmol、至少600mmol、至少700mmol、至少800mmol、至少900mmol、至少1,000mmol、至少1,200mmol、至少1,400mmol、至少1,600mmol、至少1,800mmol、至少2,000mmol、至少2500mmol、至少3,000mmol、至少3,500mmol、至少4,000mmol或至少5,000mmol，例如，指定的量可以在介于300-5,400mmol之间的范围内，诸如在介于300-4,500mmol之间、介于300-4,000mmol之间、介于300-3,600mmol之间、介于300-3,000mmol之间、介于600-3,000mmol之间、介于700-3,600mmol之间、介于700-2,700mmol之间、介于700-2,500mmol之间、介于700-2,400mmol之间、介于700-2,000mmol之间、介于700-1,900mmol之间、介于700-1,800mmol之间、介于700-1,700mmol之间、介于700-1,600mmol之间、介于700-1,500mmol之间、介于700-1,400mmol之间、介于700-1,300mmol之间、介于700-1,200mmol之间、介于700-1,100mmol之间、介于700-1,000mmol之间、介于700-900mmol之间、介于800-1,200mmol之间、介于800-1,000mmol之间、介于900-1,600mmol之间、介于900-1,800mmol之间、介于900-2,400mmol之间、介于900-2,700mmol之间、介于900-3,600mmol之间、介于1,800-2,700mmol之间、介于1,800-3,600mmol之间、介于1,000-3,000mmol之间、介于1,000-2,500mmol之间、介于1,000-2,000mmol之间、介于1,000-1,500mmol之间、介于1,250-1,750mmol之间、介于1,500-3,000mmol之间、介于1,500-2,500mmol之间、介于1,500-2,000mmol之间、介于1,600-2,400mmol之间、介于2,000-3,000mmol之间、介于2,500-3,000mmol之间、介于2,700-3,600mmol之间、介于2,700-4,500mmol之间、介于3,000-4,000mmol之间、介于3,600-4,500mmol之间、或介于3,600-5,400mmol之间的范围内。
在某些实施方案中，多次并行迭代(不一定同时进行)，诸如涉及寡核苷酸化学转化工艺(例如，寡核苷酸脱保护或从固体支撑物上切割)、寡核苷酸纯化工艺(例如，离子交换色谱)、寡核苷酸脱盐工艺(例如，超滤和/或渗滤)、液体组合物浓缩工艺(例如，薄膜蒸发)或干燥工艺(例如，冷冻干燥)的多次并行迭代，可以是不超过2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个或至多60个并行迭代，例如不超过介于2-60个、2-55个、2-50个、2-45个、2-40个、2-35个、2-30个、2-25个、2-20个、2-15个、2-10个、2-9个、2-8个、2-7个、2-6个、2-5个、2-4个、2-3个、3-10个、3-8个、3-5个、4-6个、5-10个、10-60个、10-50个、10-40个、10-30个、10-25个、10-20个、10-15个、20-50个、30-60个或40-55个之间的并行迭代。在某些实施方案中，可以按照以下顺序在合成工艺的下游进行另外的工艺：寡核苷酸化学转化工艺(例如，寡核苷酸脱保护或从固体支撑物上切割)、寡核苷酸纯化工艺(例如，离子交换色谱)、寡核苷酸脱盐工艺(例如，超滤和/或渗滤)、液体组合物浓缩工艺(例如，薄膜蒸发)，以及干燥工艺(例如，冷冻干燥)。在某些实施方案中，可以按照以下顺序在合成工艺的下游进行另外的工艺：寡核苷酸化学转化工艺(例如，寡核苷酸脱保护或从固体支撑物上切割)、寡核苷酸纯化工艺(例如，离子交换色谱)、和寡核苷酸脱盐工艺(例如，超滤和/或渗滤)；其中所述顺序之后可以进行液体组合物浓缩工艺(例如，薄膜蒸发)和/或干燥工艺(例如，冷冻干燥)；或其中所述顺序可不包括液体组合物浓缩工艺(例如，薄膜蒸发)和/或干燥工艺(例如，冷冻干燥)。
在某些实施方案中，本文公开的单批组合物可源自以下工艺序列(每个工艺以单次迭代、多次并行迭代(不一定同时进行)或它们的组合进行)：寡核苷酸合成工艺、合成的寡核苷酸的纯化工艺、纯化的寡核苷酸的脱盐工艺、脱盐的寡核苷酸的液体浓缩工艺，以及浓缩的寡核苷酸的干燥工艺，以提供作为固体组合物的单批组合物。在某些实施方案中，本文公开的单批组合物可涉及合并特定工艺步骤的多个迭代(或轮次)的输出，然后行进到下一个工艺步骤(如果有的话)，例如合并多个寡核苷酸合成柱(或合成轮次)的输出、合成寡核苷酸的多个离子交换纯化柱(或纯化轮次)的输出、多次经由超滤和/或渗滤工艺使纯化的寡核苷酸脱盐的输出，和/或多次对脱盐的寡核苷酸进行液体浓缩(诸如经由多次薄膜蒸发工艺)的输出，然后行进到下一个工艺步骤。在某些实施方案中，本文公开的单批组合物可以是源自合并多次干燥(诸如经由多次冷冻干燥工艺)经液体浓缩、经脱盐的寡核苷酸的输出的固体组合物。在某些实施方案中，本文公开的单批组合物可以是液体组合物，诸如浓缩的液体组合物，在这种情况下，推导出单批组合物不包括干燥工艺(例如，不包括冷冻干燥工艺)。
在某些实施方案中，本文公开的单批料组合物可涉及分割特定工艺步骤的输出，然后行进到下一个工艺步骤(如果有的话)，所述下一个工艺步骤将以多个并行迭代(或轮次，不一定同时)进行，例如分割寡核苷酸合成柱(或合成轮次)的输出、合成寡核苷酸的离子交换纯化柱(或纯化轮次)的输出、经由超滤和/或渗滤工艺使纯化的寡核苷酸脱盐的输出，和/或对脱盐的寡核苷酸进行液体浓缩(诸如经由多次薄膜蒸发工艺)的输出，然后行进到下一个工艺步骤(如果有的话)，所述下一个工艺步骤将以多个并行迭代(或轮次，不一定同时)进行。在某些实施方案中，本文公开的单批组合物可以是源自分割多次干燥(诸如经由多次冷冻干燥工艺)经液体浓缩、经脱盐的寡核苷酸的输出的固体组合物。在某些实施方案中，本文公开的单批组合物可以是液体组合物，诸如浓缩的液体组合物，在这种情况下，推导出单批组合物不包括干燥工艺(例如，不包括冷冻干燥工艺)。
在某些实施方案中，本文公开的单批组合物可涉及直接行进到在下一个工艺步骤(如果有的话)中处理特定工艺步骤的输出，而不包括合并或分割来自特定工艺步骤的输出，其中所述下一个工艺步骤可涉及仅处理来自特定工艺步骤的单个输出，或者可涉及以一系列并行迭代(或轮次，不一定同时)处理来自特定步骤的多个输出，例如直接行进到在下一个工艺步骤(如果有的话)中处理寡核苷酸合成柱(或合成轮次)的输出、合成寡核苷酸的离子交换纯化柱(或纯化轮次)的输出、经由超滤和/或渗滤工艺使纯化的寡核苷酸脱盐的输出、和/或对脱盐的寡核苷酸进行液体浓缩(诸如经由多次薄膜蒸发工艺)的输出，所述下一个工艺步骤可以单次或多次并行迭代(或轮次，不一定同时)进行。在某些实施方案中，本文公开的单批组合物可以是来源于直接行进到(诸如经由单个或多个冷冻干燥工艺)干燥经液体浓缩、经脱盐的寡核苷酸的单个输出或多个输出的固体组合物。
在某些实施方案中，本文公开的单批组合物可源自以下工艺序列(每个工艺以单次迭代、多次并行迭代(不一定同时进行)或它们的组合进行)：寡核苷酸合成工艺、合成的寡核苷酸的纯化工艺、纯化的寡核苷酸的脱盐工艺、脱盐的寡核苷酸的液体浓缩工艺，以及浓缩的寡核苷酸的干燥工艺，以提供作为固体组合物的单批组合物；其中序列中特定步骤的输出可以进行合并，然后行进到下一个工艺步骤(如果有的话)；可以进行分割，然后行进到下一个工艺步骤(如果有的话)；或者可以在下一个工艺步骤(如果有的话)中直接进行处理，而不包括合并或分割来自特定工艺步骤的输出，或它们的组合(例如，一些工艺步骤可涉及合并，而其他工艺步骤直接处理先前步骤的输出，而不包括合并或分割)。
图1中提供了在制备如本文所用的单批寡核苷酸组合物中的某些实施方案的示意图。例如，图1左侧上的方框列说明了用于制备作为固体组合物的单批组合物的一系列一般工艺步骤，以及进行所述一系列一般工艺步骤的特定顺序：寡核苷酸合成工艺、合成寡核苷酸的纯化工艺、纯化的寡核苷酸的脱盐工艺、脱盐的寡核苷酸的液体浓缩工艺，以及浓缩的寡核苷酸的干燥工艺。图1左侧的第二列方框说明了一种特定类型的工艺，所述特定类型的工艺可用于实现特定的一般工艺步骤(例如，可利用具有固体支撑物以及指定量的负载能力的寡核苷酸合成柱来实现寡核苷酸合成工艺；可利用离子交换色谱柱来实现纯化工艺；可利用超滤和/或渗滤工艺来实现脱盐工艺；可利用薄膜蒸发工艺来实现液体浓缩工艺；并且可利用冷冻干燥工艺来实现干燥工艺)。图1右侧上的剩余方框列分别说明了单批寡核苷酸组合物的3×900mmol、4×900mmol和5×900mmol规模的制备(例如，对于图1所示的特定实施方案，合成步骤：利用具有固体支撑物以及900mmol负载能力的寡核苷酸合成柱，其中3个、4个或5个寡核苷酸合成柱可以并行运行，或作为单一柱连续运行3次、4次或5次，或它们的组合，以实现3×900mmol、4×900mmol和5×900mmol规模的合成；纯化步骤：利用具有离子交换能力的离子交换色谱柱来纯化含有900mmol寡核苷酸的寡核苷酸组合物，其中来自寡核苷酸合成柱(例如，来自3个、4个或5个柱)的寡核苷酸合成输出直接行进到纯化步骤(不包括合并或分割合成输出)，并且其中3个、4个或5个离子交换色谱柱可并行运行或作为单一柱连续运行3次、4次或5次，或它们的组合，以实现3×900mmol、4×900mmol和5×900mmol规模的纯化；脱盐步骤：利用具有使包含2,700mmol、3,600mmol或4,500mmol寡核苷酸的合并的寡核苷酸组合物脱盐的能力的超滤和/或渗滤工艺，以实现3×900mmol、4×900mmol和5×900mmol规模的脱盐，其中合并的寡核苷酸组合物是通过合并来自3个、4个或5个离子交换色谱柱(并行或顺序地运行)的输出而提供的)，然后行进到脱盐工艺；液体浓缩步骤：利用具有浓缩包含2,700mmol、3,600mmol或4,500mmol寡核苷酸的经脱盐的液体寡核苷酸组合物的能力的薄膜蒸发工艺，以实现3×900mmol、4×900mmol和5×900mmol规模的液体浓度，其中来自UF/DF工艺的脱盐输出直接行进到液体浓缩步骤(不包括合并或分割脱盐输出)；以及干燥步骤：利用具有干燥含有2,700mmol、3,600mmol或4,500mmol的寡核苷酸的经浓缩的液体组合物的能力的冷冻干燥工艺，以实现3×900mmol、4×900mmol和5×900mmol规模的干燥，其中来自TFE工艺的液体浓缩输出直接行进到干燥步骤(不包括合并或分割经浓缩的液体输出)。
在某些实施方案中，寡核苷酸组合物，诸如单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物，可以来源于一系列工艺，所述一系列工艺包括寡核苷酸合成工艺、寡核苷酸纯化工艺、寡核苷酸脱盐工艺、寡核苷酸液体组合物浓缩工艺，以及任选的寡核苷酸干燥工艺，其中所述系列中的至少一个工艺以不超过一个单次迭代进行，并且所述系列中的所有其余下游工艺(如果有的话)以不超过一个单次迭代进行，以从所述至少一个工艺产生单一输出，从而提供经纯化、经脱盐并经浓缩(并且任选地经干燥)的寡核苷酸组合物。
在某些实施方案中，寡核苷酸组合物，诸如单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物，可以来源于一系列工艺，其中所述系列中的一个或多个工艺可以以多次迭代进行，并且所述系列中在以多次迭代进行的工艺下游的至少一个工艺以不超过单次迭代进行，并且组合(或合并)先前以多次迭代进行的工艺的所有输出，以便产生来自至少一个下游工艺的单一输出，从而提供经纯化、经脱盐并经浓缩(并且任选地经干燥)的寡核苷酸组合物。
在某些实施方案中，寡核苷酸组合物，诸如单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物，可以来源于一系列工艺，所述一系列工艺包括寡核苷酸合成工艺的单次迭代、寡核苷酸纯化工艺的单次迭代、寡核苷酸脱盐工艺的单次迭代和寡核苷酸液体组合物浓缩工艺的单次迭代，以及任选的寡核苷酸干燥工艺的单次迭代，从而提供经纯化、经脱盐并且经浓缩(并且任选地经干燥)的寡核苷酸组合物。
在某些实施方案中，寡核苷酸组合物，诸如单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物，可以来源于一系列工艺，所述一系列工艺包括寡核苷酸合成工艺的多次迭代、寡核苷酸纯化工艺的多次迭代、通过对来自寡核苷酸纯化工艺的多次迭代的组合或合并的输出进行脱盐而进行的寡核苷酸脱盐工艺的单次迭代，和寡核苷酸液体组合物浓缩工艺的单次迭代，以及任选的寡核苷酸干燥工艺的单次迭代，从而提供经纯化、经脱盐并经浓缩(并且任选地经干燥)的寡核苷酸组合物。
在某些实施方案中，寡核苷酸组合物，诸如单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物，可以来源于一系列工艺，所述一系列工艺包括单个寡核苷酸合成工艺的多次迭代，之后是单个寡核苷酸纯化工艺，通过对来自单个寡核苷酸合成工艺的多次迭代的组合或合并的输出进行脱盐而进行的寡核苷酸脱盐工艺的单次迭代，之后是单个寡核苷酸纯化工艺，和寡核苷酸液体组合物浓缩工艺的单次迭代，以及任选的寡核苷酸干燥工艺的单次迭代，从而提供经纯化、经脱盐并经浓缩(并且任选地经干燥)的寡核苷酸组合物。
在某些实施方案中，寡核苷酸组合物，诸如单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物，可以来源于不包括任选的寡核苷酸干燥工艺的一系列工艺，以提供液体寡核苷酸组合物。在某些实施方案中，寡核苷酸组合物，诸如单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物，可以来源于包括任选的寡核苷酸干燥工艺的一系列工艺，以提供固体寡核苷酸组合物。
在某些实施方案中，寡核苷酸组合物，诸如单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物可以包含以下寡核苷酸或由以下寡核苷酸组成：同源性程度为至少65％，诸如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，诸如同源性程度在介于65-99％之间、介于70-99％之间、介于75-99％之间、介于80-99％之间、介于85-99％之间、介于90-99％之间、介于95-99％之间、介于65-95％之间、介于70-95％之间、介于75-95％之间、介于80-97％之间或介于85-95％之间的范围内的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸可以是抗SMAD7寡核苷酸，例如具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的核酸序列或其互补序列的寡核苷酸，诸如Mongersen(以前称为GED-0301)。在某些实施方案中，同源性程度可以通过RP-HPLC确定。例如，在某些实施方案中，寡核苷酸组合物，诸如单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物可以包含以下寡核苷酸或由以下寡核苷酸组成：至少700mmol，或至少2kg的同源性程度为至少65％，诸如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，诸如同源性程度在介于65-99％之间、介于70-99％之间、介于75-99％之间、介于80-99％之间、介于85-99％之间、介于90-99％之间、介于95-99％之间、介于65-95％之间、介于70-95％之间、介于75-95％之间、介于80-97％之间或介于85-95％之间的范围内的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸可以是抗SMAD7寡核苷酸，例如具有SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的核酸序列或其互补序列的寡核苷酸，诸如Mongersen(以前称为GED-0301)。
5.17寡核苷酸的制剂和用途
根据本文提供的方法合成的寡核苷酸，诸如从单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物获得的寡核苷酸，参见例如如在第5-5.16小节中所述，可以配制成药物组合物，参见例如如在第5.18小节中所述，以及公布的国际公开案WO 2016/105516，该公布的国际公开案的全部内容以引用方式并入本文。例如，可配制成药物组合物的寡核苷酸可以是SMAD7反义寡核苷酸或化学修饰的SMAD7反义寡核苷酸，例如包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中的任何一个的核酸序列的至少10个核苷酸长的一部分，由所述核酸序列的至多21个核苷酸组成，或包含所述核酸序列的至多21个核苷酸长，具有所述核酸序列，优选具有核酸序列：SEQID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')的寡核苷酸，其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷；或从单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的组合物获得的寡核苷酸。这些寡核苷酸和药物组合物可以用于治疗有需要的患者的适应症，诸如炎性适应症，例如炎症性肠病(IBD)(诸如克罗恩氏病(CD)或溃疡性结肠炎(UC))，参见例如如在第5.18-5.19小节中所述，以及公布的国际公开案WO 2016/105516。
5.18药物组合物
本节所述的药物组合物可用于本文提供的使用方法。参见，例如，如第5.19节中所述。在某些实施方案中，药物组合物(诸如口服剂型)包含根据本文提供的方法合成的寡核苷酸，诸如从单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物获得的寡核苷酸；以及药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。在某些实施方案中，药物组合物是口服药物组合物。在某些实施方案中，药物组合物包含肠溶包衣以将单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物的寡核苷酸局部递送至IBD患者的末端回肠和/或右结肠。在某些实施方案中，药物组合物是抗胃炎颗粒制剂。
设想的SMAD7反义寡核苷酸包含针对SMAD7作用并且可以口服施用的寡核苷酸。当向患有炎症性肠病(IBD)的受试者口服施用时，所公开的疗法可以将有效量的SMAD7反义寡核苷酸递送至患者的肠道系统，例如将有效量的SMAD7反义寡核苷酸递送至患者的末端回肠和/或右结肠。
在本文提供的治疗IBD的方法的某些实施方案中，抗SMAD7疗法(例如，包含SMAD7反义寡核苷酸的疗法)可适于口服递送SMAD7反义寡核苷酸，例如包含肠溶包衣(例如，抗胃炎包衣)的片剂，使得所述组合物可将反义化合物递送至患者的例如末端回肠和右结肠。例如，这种施用可产生局部作用，从而将反义化合物基本上局部直接施用于受试者的肠的受影响部分。在某些实施方案中，此类施用可以基本上避免反义化合物的不必要的全身吸收。
例如，用于口服施用的片剂可包含颗粒(例如，至少部分由颗粒形成)，所述颗粒包含公开的SMAD7反义寡核苷酸和药学上可接受的赋形剂。这种片剂可用肠溶包衣进行包衣。考虑的片剂可包含药学上可接受的赋形剂，如填充剂、粘合剂、崩解剂和/或润滑剂，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂(如冬青、橙、木糖醇、山梨糖醇、果糖和麦芽糖糊精)，以及芳香剂、防腐剂和/或抗氧化剂。在某些实施方案中，药物组合物，诸如口服剂型(例如，如本文公开的片剂或包衣片剂)，包括将包含公开的SMAD7反义寡核苷酸(例如根据本文提供的方法合成的寡核苷酸)的单批组合物的一部分与药学上可接受的佐剂和/或赋形剂一起配制(诸如组合、混合或共混)。例如，在某些实施方案中，SMAD7反义寡核苷酸具有SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中的任何一个的核酸序列，优选具有核酸序列：SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
在某些实施方案中，设想的药物制剂包含颗粒内相，所述颗粒内相包含设想的SMAD7反义寡核苷酸或药学上可接受的盐，以及药学上可接受的填充剂。例如，寡核苷酸是根据本文提供的方法合成的寡核苷酸，诸如从SMAD7反义寡核苷酸或化学修饰的SMAD7反义单批寡核苷酸组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物获得的寡核苷酸；例如，这样的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中的任何一个的核酸序列的至少10个核苷酸长的一部分，由所述核酸序列的至多21个核苷酸组成，或包含所述核酸序列的至多21个核苷酸长，具有所述核酸序列，优选具有核酸序列：SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCCXGC AGC-3')的寡核苷酸，其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷，并且填充剂可以与任选的其它赋形剂共混在一起，并形成颗粒。在某些实施方案中，可以使用湿法制粒来形成颗粒内相，例如，将液体(例如，水)加入到经共混的反义化合物和填充剂中，然后将所述组合干燥、研磨和/或过筛以产生颗粒。本领域的技术人员将理解，可使用其他工艺来实现颗粒内相。
在某些实施方案中，预期的制剂包含颗粒外相，所述颗粒外相可以包含一种或多种药学上可接受的赋形剂，并且所述颗粒外相可以与颗粒内相共混以形成公开的制剂。
抗SMAD7疗法制剂可包含含有填充剂的颗粒内相。示例性填充剂包括但不限于，纤维素、明胶、磷酸钙、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇、微晶纤维素、果胶、聚丙烯酸酯、右旋糖、乙酸纤维素、羟丙基甲基纤维素、部分预胶化淀粉、碳酸钙以及包括它们的组合在内的其他填充剂。
在某些实施方案中，抗SMAD7疗法制剂可包含颗粒内相和/或颗粒外相，所述颗粒外相包含粘合剂，所述粘合剂通常可用于将药物制剂的成分保持在一起。示例性粘合剂包括例如以下各项：淀粉、糖、纤维素或改性的纤维素(如羟丙基纤维素)、乳糖、预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、低取代的羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、糖醇以及包括它们的组合在内的其他粘合剂。
设想的例如包含颗粒内相和/或颗粒外相的抗SMAD7疗法制剂可包含崩解剂，诸如但不限于淀粉、纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、羟基乙酸淀粉钠、羧甲基纤维素钠、藻酸盐、玉米淀粉、交联羧甲基纤维素钠、交联羧甲基纤维素、低取代的羟丙基纤维素、阿拉伯树胶以及包括它们的组合在内的其他崩解剂。例如，颗粒内相和/或颗粒外相可包含崩解剂。
在某些实施方案中，设想的抗SMAD7疗法制剂包含颗粒内相和颗粒外相，所述颗粒内相包含公开的反义化合物和选自以下的赋形剂：甘露醇、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素和羟基乙酸淀粉钠，或它们的组合，所述颗粒外相包含以下中的一种或多种：微晶纤维素、羟基乙酸淀粉钠和硬脂酸镁，或它们的混合物。
在某些实施方案中，设想的抗SMAD7疗法制剂可以包含润滑剂，例如颗粒外相可以包含润滑剂。润滑剂包括但不限于滑石、二氧化硅(silica)、脂肪、硬脂、硬脂酸镁、磷酸钙、二氧化硅(silicone dioxide)、硅酸钙、磷酸钙、胶态二氧化硅、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、苯甲酸钠、聚乙二醇、乙酸钠、硬脂酸钙、月桂基硫酸钠、氯化钠、月桂基硫酸镁、滑石，以及硬脂酸。
在某些实施方案中，药物制剂包含肠溶包衣。通常，肠溶包衣为口服药物产生屏障，所述屏障控制药物沿消化道吸收的位置。肠溶包衣可包含根据pH以不同速率崩解的聚合物。肠溶包衣可包含例如邻苯二甲酸醋酸纤维素、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、醋酸琥珀酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸共聚物、C型甲基丙烯酸共聚物、聚乙酸乙烯酯-邻苯二甲酸酯，以及邻苯二甲酸醋酸纤维素。
在某些实施方案中，肠溶包衣包含基于甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯/丙烯酸酯或它们的衍生物的阴离子、阳离子或中性共聚物。在某些实施方案中，肠溶包衣包含丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸共聚物。商购可得的肠溶包衣包括
Figure BDA0002426454580000911
AMB、
Figure BDA0002426454580000912
在某些实施方案中，按重量计，肠溶包衣占设想片剂的约5％至约10％、约5％至约20％、约8％至约15％、约8％至约18％、约10％至约12％，或约12％至约16％。
例如，提供片剂形式的抗SMAD7疗法，所述片剂包含以下物质或基本上由以下物质组成：约0.5重量％至约70重量％，例如约0.5重量％至约10重量％或约1重量％至约20重量％的SMAD7反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐。这种片剂可包含例如约0.5重量％至约60重量％的甘露醇，例如约30重量％至约50重量％的甘露醇，例如约40重量％的甘露糖醇；和/或约20重量％至约40重量％的微晶纤维素或约10重量％至约30重量％的微晶纤维素。例如，设想的片剂可以包含颗粒内相，所述颗粒内相包含按重量计约30％至约60％，例如约45％至约65％，或按重量计约5％至约10％的根据本文提供的方法合成的寡核苷酸，诸如从单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物获得的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中的任何一个的核酸序列，优选具有核酸序列：SEQ ID NO:3：(5'-GTXGCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷；按重量计约30％至约50％，或约5％至约15％的甘露醇；约5％至约15％的微晶纤维素；约0％至约4％、或约1％至约7％的羟丙基甲基纤维素；以及按重量计约0％至约4％，例如约2％至约4％的羟基乙酸淀粉钠。
示例性抗SMAD7疗法制剂包含这样的剂型，所述剂型包含约10mg至约500mg的SMAD7反义寡核苷酸或基本上由约10mg至约500mg的SMAD7反义寡核苷酸组成，所述SMAD7反义寡核苷酸是根据本文提供的方法合成的，诸如是从单批组合物、基本纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物获得的，其中所述寡核苷酸具有核酸序列SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷，例如，本文设想了包含介于约30mg与约310mg之间、介于约50mg与约290mg之间、介于约70mg与约270mg之间、介于约70mg与约250mg之间、介于约90mg与约230mg之间、介于约110mg与约210mg之间，或介于130mg与约190mg之间，或介于150mg与约170mg之间的SMAD7反义寡核苷酸的片剂。在某些实施方案中，所述片剂包含介于约5mg与约90mg之间、介于约10mg与约70mg之间，或介于约30mg与约50mg之间的SMAD7反义寡核苷酸，所述SMAD7反义寡核苷酸是根据本文提供的方法合成的，诸如是从单批组合物、基本纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物获得的，其中所述寡核苷酸具有核酸序列SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。在某些实施方案中，所述片剂包含约20mg、约40mg、约60mg、约80mg、约100mg、约120mg、约140mg、约160mg、约180mg、约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg或约300mg的SMAD7反义寡核苷酸，所述SMAD7反义寡核苷酸是根据本文提供的方法合成的，诸如是从单批组合物、基本纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物获得的，其中所述寡核苷酸具有核酸序列SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
在一个实施方案中，抗SMAD7疗法可以是用于口服使用的片剂，所述片剂包含：按重量计约0.5％至约10％的SMAD7反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐，所述SMAD7反义寡核苷酸是根据本文提供的方法合成的，诸如是从单批组合物、基本纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物获得的，其中所述寡核苷酸具有核酸序列SEQID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷；按重量计约30％至约50％的甘露醇；以及按重量计约10％至约30％的微晶纤维素。
在本发明的示例性实施方案中，提供了用于口服施用的药学上可接受的片剂，所述药学上可接受的片剂包含颗粒内相和颗粒外相，所述颗粒内相可包含按重量计约50％的SMAD7反义寡核苷酸(或其盐)，所述SMAD7反义寡核苷酸是根据本文提供的方法合成的，诸如是从单批组合物、基本纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物获得的，其中所述寡核苷酸具有核酸序列SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCCXGC AGC-3')，其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷；按重量计约11.5％的甘露醇、按重量计约10％的微晶纤维素、按重量计约3％的羟丙基甲基纤维素，以及按重量计约2.5％的羟基乙酸淀粉钠；所述颗粒外相可包含按重量计约20％的微晶纤维素、按重量计约2.5％的羟基乙酸淀粉钠和按重量计约0.5％的硬脂酸镁。片剂还可包含肠溶包衣。
在另一个示例性的实施方案中，提供了用于口服施用的药学上可接受的片剂，所述药学上可接受的片剂包含颗粒内相和颗粒外相或基本上由颗粒内相和颗粒外相组成：所述颗粒内相可包含按重量计约5％至约10％、例如约8％的SMAD7反义寡核苷酸或基本上由按重量计约5％至约10％、例如约8％的SMAD7反义寡核苷酸组成，所述SMAD7反义寡核苷酸是根据本文提供的方法合成的，诸如是从单批组合物、基本纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物获得的，其中所述寡核苷酸具有核酸序列SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷；按重量计约40％的甘露醇、按重量计约8％的微晶纤维素、按重量计约5％的羟丙基甲基纤维素和按重量计约2％的羟基乙酸淀粉钠；所述颗粒外相可包含按重量计约17％的微晶纤维素、按重量计约2％的羟基乙酸淀粉钠和按重量计约0.4％的硬脂酸镁。
设想的片剂还可包含肠溶包衣，例如公开的片剂可包含按重量计约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％或约18％的肠溶包衣，例如丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸共聚物(例如，
Figure BDA0002426454580000931
)。
在某些实施方案中，片剂是包衣片剂，并且所述包衣片剂包含按重量计约11％的肠溶包衣，例如丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸共聚物(例如，
Figure BDA0002426454580000941
)，以及约40mg或160mg的SMAD7反义寡核苷酸，所述SMAD7反义寡核苷酸是根据本文提供的方法合成的，诸如是从单批组合物、基本纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物获得的，其中所述寡核苷酸具有核酸序列SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。例如，抗SMAD7疗法可以是用于口服使用的药学上可接受的片剂的形式，所述药学上可接受的片剂包含颗粒内相和颗粒外相，其中例如，所述颗粒内相包含按重量计约5％至约10％(例如按重量计约8％)的SMAD7反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐，所述SMAD7反义寡核苷酸是根据本文提供的方法合成的，诸如是从单批组合物、基本纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物获得的，其中所述寡核苷酸具有核酸序列SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷；按重量计约40％的甘露醇、按重量计约8％的微晶纤维素、按重量计约5％的羟丙基甲基纤维素和按重量计约2％的羟基乙酸淀粉钠；并且例如，所述颗粒外相包含按重量计约17％的微晶纤维素、按重量计约2％的羟基乙酸淀粉钠和按重量计约0.4％的硬脂酸镁，其中所述片剂还可包含肠溶包衣。
在某些实施方案中，根据本文提供的方法合成的寡核苷酸，诸如从单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的方法制备的寡核苷酸组合物获得的寡核苷酸，参见例如如在第5-5.16小节中所述，可以根据本文公开的方法配制成一系列药物组合物，例如口服剂型(例如，如本文所述的片剂或包衣片剂)。例如，在某些实施方案中，制备一系列片剂(例如，包衣片剂)的方法包括将单批寡核苷酸组合物分成适于口服剂量的部分，所述单批组合物包含至少700mmol的寡核苷酸(例如至少700mmol的寡核苷酸)和至多25重量％的水；以及将所述部分与药学上可接受的佐剂和/或赋形剂组合；其中所述寡核苷酸是SMAD7反义寡核苷酸，例如其中所述寡核苷酸具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中的任何一个的核酸序列，优选具有核酸序列：SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。例如，在某些实施方案中，制备一系列片剂(例如，包衣片剂)的方法包括将单批寡核苷酸组合物分成适于口服剂量的一个或多个部分，所述单批组合物包含至少2g/mmol的至少700mmol合成规模的寡核苷酸，例如至少2g/mmol的至少700mmol合成规模的寡核苷酸和至多25重量％的水；以及将所述一个或多个部分中的至少一个或每一个与药学上可接受的佐剂和/或赋形剂组合；其中所述寡核苷酸是SMAD7反义寡核苷酸，例如其中所述寡核苷酸具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中的任何一个的核酸序列，优选具有核酸序列：SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。例如，在某些实施方案中，制备一系列片剂(例如，包衣片剂)的方法包括将单批寡核苷酸组合物分成适于口服剂量的一个或多个部分，所述单批组合物包含至少2kg的寡核苷酸，例如包含至少2kg的寡核苷酸和至多25重量％的水；以及将所述一个或多个部分中的至少一个或每一个与药学上可接受的佐剂和/或赋形剂组合；其中所述寡核苷酸是SMAD7反义寡核苷酸，例如其中所述寡核苷酸具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中的任何一个的核酸序列，优选具有核酸序列：SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。例如，在某些实施方案中，制备一系列片剂(例如，包衣片剂)的方法包括将单批寡核苷酸组合物分成适于口服剂量的一个或多个部分，所述单批组合物包含至少50mol％的来自至少一个700mmol或更大的寡核苷酸合成柱的寡核苷酸输出，例如包含至少50mol％的来自至少一个700mmol或更大的寡核苷酸合成柱的寡核苷酸输出和至多25重量％的水；以及将所述部分中的至少一个或每一个与药学上可接受的佐剂和/或赋形剂组合；其中所述寡核苷酸是SMAD7反义寡核苷酸，例如其中所述寡核苷酸具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中的任何一个的核酸序列，优选具有核酸序列：SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCCCCT TCT CCC XGC AGC-3')，其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。在某些实施方案中，一系列片剂(例如，包衣片剂)是至少100片(或包衣片)，例如至少500片，诸如至少1,000片、至少2,000片、至少5,000片、至少10,000片、至少20,000片、至少50,000片、至少100,000片或至少200,000片(或包衣片)，例如介于100-1,000,000片(或包衣片)之间，诸如介于1,000-1,000,000片之间、介于10,000-1,000,000片之间、介于50,000-1,000,000片之间、介于100,000-1,000,000片之间，或介于500-1,000,000片(或包衣片)之间。在某些实施方案中，在制备一系列片剂的方法中使用的单批组合物符合分别在21CFR 210.3(2)和21 CFR 210.3(10)下定义的术语批或批次。在某些实施方案中，在制备一系列片剂的方法中利用根据本文公开的方法制备的单批组合物中的一种或多种，诸如多种，例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种单批组合物。
在某些实施方案中，提供了药物组合物批料，所述药物组合物批料包含如本文所公开的单批组合物或基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据如本文所公开的制备方法制备的寡核苷酸组合物中的至少一部分，参见例如如在第5-5.16小节中所述；以及药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。例如，在某些实施方案中，所述药物组合物批料包含至少10重量％、至少20重量％、至少30重量％、至少40重量％、至少50重量％、至少60重量％、至少70重量％、至少80重量％、至少90重量％、至少95重量％或100重量％的如本文所公开的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据制备方法制备的寡核苷酸组合物。在某些实施方案中，例如，药物组合物批料包含至少一种口服剂型(例如，如本文所述的片剂或包衣片剂)，例如一系列口服剂型，诸如一系列片剂或一系列包衣片剂。在某些实施方案中，药物组合物批料是通过将如本文所公开的单批组合物或基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据如本文所公开的制备方法制备的寡核苷酸组合物中的至少一部分与药学上可接受的佐剂和/或赋形剂一起配制(组合)而制备的，参见例如如在第5-5.16小节中所述。在某些实施方案中，例如，药物组合物批料包含单批寡核苷酸组合物的至少一部分，所述单批组合物包含至少700mmol的寡核苷酸，例如至少700mmol的寡核苷酸和至多25重量％的水，以及药学上可接受的佐剂和/或赋形剂；其中所述寡核苷酸是SMAD7反义寡核苷酸，例如其中所述寡核苷酸具有SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中的任何一个的核酸序列，优选具有核酸序列：SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。例如，在某些实施方案中，药物组合物批料包含单批寡核苷酸组合物的至少一部分，所述单批组合物包含至少2g/mmol的至少700mmol合成规模的寡核苷酸的寡核苷酸，例如至少2g/mmol的至少700mmol合成规模的寡核苷酸和至多25重量％的水，以及药学上可接受的佐剂和/或赋形剂；其中所述寡核苷酸是SMAD7反义寡核苷酸，例如其中所述寡核苷酸具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中的任何一个的核酸序列，优选具有核酸序列：SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGCAGC-3')，其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。例如，在某些实施方案中，药物组合物批料包含单批寡核苷酸组合物的至少一部分，所述单批组合物包含至少2kg的寡核苷酸，例如包含至少2kg的寡核苷酸和至多25重量％的水，以及药学上可接受的佐剂和/或赋形剂；其中所述寡核苷酸是SMAD7反义寡核苷酸，例如其中所述寡核苷酸具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中的任何一个的核酸序列，优选具有核酸序列：SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。例如，在某些实施方案中，药物组合物批料包含单批寡核苷酸组合物的至少一部分，所述单批组合物包含至少50mol％的来自至少一个700mmol或更大的寡核苷酸合成柱的寡核苷酸输出的寡核苷酸，例如包含至少50mol％的来自至少一个700mmol或更大的寡核苷酸合成柱的寡核苷酸输出和至多25重量％的水，以及药学上可接受的佐剂和/或赋形剂；其中所述寡核苷酸是SMAD7反义寡核苷酸，例如其中所述寡核苷酸具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中的任何一个的核酸序列，优选具有核酸序列：SEQID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。在某些实施方案中，药物组合物批料包含或是一系列口服剂型(例如，片剂或包衣片剂)。例如，在某些实施方案中，药物组合物批料包含或是一系列至少100片(或包衣片)，例如至少500片，诸如至少1,000片、至少2,000片、至少5,000片、至少10,000片、至少20,000片、至少50,000片、至少100,000片或至少200,000片(或包衣片)，例如介于100-1,000,000片(或包衣片)之间，诸如介于1,000-1,000,000片之间、介于10,000-1,000,000片之间、介于50,000-1,000,000片之间、介于100,000-1,000,000片之间，或介于500-1,000,000片(或包衣片)之间。在某些实施方案中，药物组合物批料、或包含在药物组合物批料中或用于制备药物组合物批料的单批组合物符合分别在21 CFR 210.3(2)和21 CFR 210.3(10)下定义的术语批或批次。在某些实施方案中，在药物组合物批料中包含或在制备药物组合物批料中利用根据本文公开的方法制备的单批组合物中的一种或多种，诸如多种，例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种单批组合物。
在某些实施方案中，当口服施用于患者时，设想的制剂(例如，片剂或包衣片剂)可导致患者体内最低的寡核苷酸血浆浓度。在另一个实施方案中，当口服适于患者时，考虑的制剂局部递送至患者的末端回肠和/或右结肠，例如递送至患者的受影响或患病的肠部位。
5.19治疗方案
5.19.1施用方案
在一个方面中，本文提供了一种用于治疗或管理患有炎症性肠病(IBD)的患者的IBD的方法，其中所述方法包括(a)在第一治疗期期间以第一剂量向患者施用SMAD7反义寡核苷酸；以及(b)在第二治疗期期间以第二剂量向患者施用SMAD7反义寡核苷酸。
在某些实施方案中，在第一治疗期期间施用的抗SMAD7治疗的剂量高于在第二治疗期期间施用的剂量。
第一治疗期和第二治疗期各自的持续时间是几周、几个月或几年。所述第一时期和第二时期的时长可取决于例如IBD患者是否对抗SMAD7治疗有反应，取决于患者反应的强烈程度(例如，临床反应的程度或缓解的发生)，或取决于先前对抗SMAD7疗法有反应的患者是否复发来调节。
在某些实施方案中，炎症性肠病(IBD)是克罗恩氏病(CD)。在某些实施方案中，炎症性肠病(IBD)是溃疡性结肠炎(UC)。
5.19.2 IBD的治疗和管理
本小节所述的方法可用于治疗或管理患有IBD的患者或受试者的IBD，所述IBD包括例如轻度、中度或重度形式的IBD(例如，轻度、中度或重度形式的克罗恩氏病(CD)或溃疡性结肠炎(UC))，例如如由临床活性参数或生物标志物水平确定的。在某些实施方案中，所述方法可用于预防例如有患上IBD的风险的患者的IBD，例如如由患者中的某些风险因素的存在而确定的，所述风险因素是本领域已知的(例如，遗传、环境或生活方式因素)。在某些实施方案中，本文提供的方法可用于预防先前已接受失败的IBD治疗(例如，氨基水杨酸盐治疗或类固醇治疗)的患者中，或正在经历具有很少或没有临床症状的慢性疾病的初治患者中IBD的复发。
在某些实施方案中，治疗或管理IBD包括减少IBD的一种或多种临床症状。在某些实施方案中，治疗或管理IBD包括减少CD的症状，诸如腹痛(包括例如痉挛、触痛、持续疼痛)、腹泻(包括例如便血)、食欲不振、发烧、体重减轻、贫血、肠道炎症或感染(例如，脓肿)、肛裂、关节痛、眼睛问题、皮疹或肝病。在某些实施方案中，治疗或管理IBD包括减少UC的一种或多种症状，诸如肠肿胀、肠炎症、大肠(结肠)内层溃疡、腹泻、腹痛或直肠出血。在某些实施方案中，治疗或管理IBD包括在疾病的慢性阶段期间减少一种或多种IBD症状。在某些实施方案中，治疗或管理IBD包括在疾病的急性阶段(例如，在疾病“发作”期间)减少一种或多种IBD症状。在某些实施方案中，治疗或管理IBD包括延长对诸如抗SMAD7疗法(例如，SMAD7反义寡核苷酸)等IBD治疗有反应的IBD患者的复发时间。
在某些实施方案中，治疗或管理IBD包括降低疾病突发的强度。在某些实施例中，治疗或管理IBD包括降低IBD患者疾病突发的频率。
在某些实施方案中，治疗或管理IBD包括改善IBD患者的生活质量(例如，如通过患者调查确定的)，例如通过减轻IBD患者的疼痛、改善IBD患者的食欲，或改善IBD患者的睡眠(例如，不间断睡眠的时长)。
5.19.3预防
在某些实施方案中，预防IBD或预防IBD复发包括部分或完全地预防IBD的一种或多种临床症状的发生或复发。在某些实施方案中，预防IBD或预防IBD复发包括预防CD症状的发生或复发，所述CD症状是诸如腹痛(包括例如痉挛、触痛、持续疼痛)、腹泻(包括例如便血)、食欲不振、发烧、体重减轻、贫血、肠道炎症或感染(例如，脓肿)、肛裂、关节痛、眼睛问题、皮疹或肝病。在某些实施方案中，预防IBD或预防IBD复发包括预防UC的一种或多种症状的发生或复发，所述UC的一种或多种症状是诸如肠肿胀、肠炎症、大肠(结肠)内层溃疡、腹泻、腹痛或直肠出血。在某些实施方案中，预防IBD或预防IBD复发包括在疾病的慢性阶段期间预防一种或多种IBD症状。在某些实施方案中，预防IBD或预防IBD复发包括在疾病的急性阶段(例如，在疾病“发作”期间)减少一种或多种IBD症状。在某些实施方案中，预防IBD复发包括延长对诸如抗SMAD7疗法(例如，SMAD7反义寡核苷酸)等IBD治疗有反应的IBD患者的复发时间。
在某些实施方案中，预防IBD或预防IBD复发包括预防疾病突发或某种强度的疾病发作的发生或复发。在某些实施方案中，预防IBD或预防IBD复发包括以某一频率(例如，在施用IBD治疗方案之前在患有IBD的患者中直接观察到的频率，或在未治疗的IBD患者的对照组中观察到的(例如，中值、平均或均值)频率)预防发作的发生或复发。
在某些实施方案中，预防IBD或预防IBD复发包括预防IBD患者的生活质量(例如，如通过患者调查确定的)(进一步)恶化，例如通过预防IBD患者的疼痛增大、预防IBD患者的(进一步)食欲丧失，或预防IBD患者的失眠恶化。
5.19.4患者群体
在某些实施方案中，用本文提供的方法治疗的IBD患者是UC患者或CD患者。在某些实施方案中，患有IBD的患者在初始筛查期或第一治疗期之前至少3个月被诊断为患有CD或UC。在某些实施方案中，患有IBD的患者在筛查期或第一治疗期之前的2年内被诊断为患有回肠炎或回结肠炎，例如如通过内窥镜、射线照相或其它成像方法(例如，磁共振成像[MRI]、计算机断层扫描[CT])所确定的。在某些实施方案中，患者患有涉及末端至中间横结肠的IBD。在某些实施方案中，患者患有广泛结肠炎。
在对本文变量的任何定义中叙述一列要素包括将那个变量定义为任何单一要素或所列要素的组合(或亚组合)。对本文实施方案的叙述包括那个实施方案呈任何单一实施方案形式或与任何其它实施方案或其部分组合。
本说明书中提到的所有专利和出版物的全部内容以引用方式并入本文，并入的程度如同每个独立的专利和出版物被具体地和单独地指出为全部内容以引用方式并入一样。
以下实施例是以说明而非限制方式提供的。
实施例
实施例1-制备具有核酸序列SEQ ID NO:3的21聚体寡核苷酸
制备的寡核苷酸：具有以下核酸序列的脱氧核糖核苷酸：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷，并且其中所有核苷酸间键是O,O-连接的硫代磷酸酯。
规模：进行3×900mmol规模和5×900mmol规模的靶向的21聚体寡核苷酸的制备。具体地，将寡核苷酸的合成和离子交换纯化各自以一定规模进行，以产生900mmol的靶向的21聚体寡核苷酸，并且将合成和离子交换纯化工艺整体再以900mmol规模(即，每个合成柱的负载能力，以及单独地，每个离子交换纯化柱的离子交换能力，均是900mmol，从而能够产生理论量分别为2,700-4,500mmol的靶向的21聚体寡核苷酸)重复2-4次。然后将来自离子交换纯化工艺的所得寡核苷酸产物合并，随后经由超滤/渗滤工艺进行脱盐，所述脱盐是分别以2,700-4,500mmol规模进行的。用于去除水，从而浓缩最终寡核苷酸产物的溶液的薄膜蒸发工艺是分别以2,700-4,500mmol规模进行的。最后，以2,700-4,500mmol的规模进行冷冻干燥工艺，以去除水并浓缩最终的21聚体寡核苷酸产物，以形成固体产物。如下文所详述的3×900mmol规模和5×900mmol规模制备在图1中示意性地示出，其中进行任选的干燥步骤以提供靶向的21聚体寡核苷酸的固体单批组合物。
合成仪和柱：使用1454合成仪、使用内径为50-80cm的合成柱来进行具有核酸序列SEQ ID NO:3的寡核苷酸的合成，所述合成柱加载有900mmol的交联聚苯乙烯固体支撑物(例如，NITTOPHASE-HL或PRIMER SUPPORT 5G)，所述固体支撑物连接有接头，所述接头含有被4,4'-二甲氧基三苯甲基基团(DMT)保护的羟基，所述接头当被脱保护时可用于启动靶向寡核苷酸(例如，UNYLINKER)的装配。为了实现将900mmol的与接头结合的支撑物加载到合成柱中的负载能力，将介于2000-3000g之间的与接头结合的支撑物(具有330-370微摩尔/克的与接头结合的固体支撑物可用于与受保护的核苷亚磷酰胺反应以装配靶向的寡核苷酸)加载到合成柱中，直至填充密度为8-11mL/g(0.08-0.15g/ml)，床高是7-10cm，并且柱体积是22-25L。
合成程序：以下合成程序利用亚磷酰胺化学来制备具有序列SEQ ID NO:3的21聚体寡核苷酸：
A)脱三苯甲基化：在合成开始时，通过将10％DCA的甲苯溶液引入到与接头结合的固体支撑物中(通过440nm处的UV监测)，对高负载的NITTOPHASE UNYLINKER 350进行酸催化，以从UNYLINKER的5'-羟基上去除4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)保护基。用1-2个柱体积的乙腈洗涤脱三苯甲基化的与接头结合的固体支撑物。对于合成的其余部分，在每次反应循环迭代后，通过利用3％DCA的甲苯溶液从与支撑物结合的寡核苷酸的5'-氧原子上去除相应的DMT保护基来开始新的反应循环迭代(利用6-7个柱体积并且在440nm下进行UV监测)。用1-2个柱体积的乙腈洗涤脱三苯甲基化的与支撑物结合的寡核苷酸。
B)偶联：通过在活化剂存在下，经由使脱三苯甲基化的固体支撑物(用于第一偶联)或脱三苯甲基化的与支撑物结合的寡核苷酸的5'-羟基(用于第一偶联之后)与过量的受保护的核苷亚磷酰胺溶液反应来延伸寡核苷酸链，以将寡核苷酸从3'末端装配到5'末端。
具体地，相对于900mmol的与接头结合的支撑物，在5-8当量的活化剂(0.5-1M二氰基咪唑(DCI)的乙腈溶液)的存在下，向脱三苯甲基化的与接头结合的固体支撑物(用于第一偶联)或脱三苯甲基化的与支撑物结合的寡核苷酸的5'-羟基(用于第一偶联之后)中引入过量的受保护的核苷亚磷酰胺的乙腈溶液(1.1-2当量的以下中的一者：0.2M dA-(Bz)、0.2M dC-(Bz)、0.2M dG-(iBu)、0.2M dT或0.2M d5MeC-(Bz))，从而提供为3-5:1的活化剂:酰胺的摩尔比。提供的偶联溶液的总体积介于14-17L之间。每个步骤所需的特定受保护的核苷亚磷酰胺由寡核苷酸序列SEQ ID NO:3确定。在留出足够的时间使偶联反应完全，从而形成亚磷酸三酯核苷酸间键后，用1-2倍柱体积的乙腈从柱上冲洗掉过量的亚磷酰胺和活化剂。
C)硫醇化：将氧化或硫醇化溶液输送到固体支撑物上；
然后通过引入0.2M氢化黄原素的吡啶溶液(约16-20L，相对于900mmol的与接头结合的支撑物提供2-6当量的XH)来硫醇化在偶联步骤期间形成的亚磷酸三酯核苷酸间键，以形成相应的硫代磷酸酯键。硫醇化完成后，通过用1-2倍柱体积的乙腈冲洗支撑物，从柱中去除过量的试剂。
D)加帽：为防止在任何给定的反应循环迭代期间未能与活化的亚磷酰胺偶联的任何5'-羟基在任何随后的反应循环中可进行反应，如下用酰基来对这些未反应的5'-羟基进行封闭(加帽)：将加帽试剂Cap A和Cap B的1:1混合物(Cap A：10-30％的N-甲基咪唑、20-40％的吡啶、40-60％的乙腈(v/v/v)；并且Cap B：10-30％异丁酸酐的乙腈溶液(v/v))引入到具有硫代磷酸酯键的与支撑物结合的寡核苷酸上，以形成5'-O-异丁酰化的(“加帽的”)与支撑物结合的寡核苷酸序列。加帽试剂Cap A和Cap B的混合物的总体积在介于0.5-2个柱体积之间。加帽完成后，通过用1-2倍柱体积的乙腈冲洗支撑物，从柱上去除过量的试剂。
E)使受保护的硫代磷酸酯键脱保护：在完成偶联、硫醇化、加帽和脱三苯甲基化达预定数目的反应循环迭代以形成具有序列SEQ ID NO:3的21聚体寡核苷酸(除了在最后一个反应循环迭代中不执行加帽和脱三苯甲基化步骤外)时，将与固体支撑物结合的粗制寡核苷酸用10-30％三乙胺的乙腈溶液(约3-5个柱体积)洗涤，以去除硫代磷酸酯键上的氰乙基保护基。脱保护完成后，通过用3-5倍柱体积的乙腈冲洗支撑物，从柱上去除过量的试剂。
F)从固体支撑物上切割粗制寡核苷酸：向与固体支撑物结合的粗制寡核苷酸中引入(并循环通过)加热的氢氧化铵溶液(28-30％氨水，加热至约40-60℃，约2-5个柱体积)达约16-40小时。这导致将粗制寡核苷酸从固体支撑物上切割下，同时使粗制寡核苷酸上的环外氨基(苯甲酰基和异丁酰基)脱保护。通过过滤将最终反应混合物从合成柱上去除，并将固体支撑物用水洗涤，以提供仅具有被4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)保护基保护的末端核苷的5'-羟基的粗制寡核苷酸。
以3×900mmol(1A、1B和1C)和5×900mmol(2A、2B、2C、2D和2E)规模合成具有序列SEQ ID NO:3的靶标21聚体寡核苷酸的结果分别在表1和表2中提供。
从合成柱切割并收集在滤液中的粗产物的量(“总粗OD”)是经由260nm波长下的光密度(OD)测量的。
从合成柱切割并收集的产物的粗产率(“粗产率(OD/umol)”)是如下确定的：[总粗OD/900mmol规模]/(1000umol/mmol)。
使用具有序列SEQ ID NO:3的靶标21聚体寡核苷酸的转化因子(即，21856.3OD/g)来确定从合成柱上切割并收集的产物的粗产率(“粗产率(g/mmol)”)，如下：[总粗OD/(转化因子(OD/g))]/(900mmol规模)。
转化因子特异于具有序列SEQ ID NO:3的靶标21聚体寡核苷酸(即，21856.3OD/g)。因此，在该工艺的合成阶段使用该特定的转化因子是估计或近似从合成柱上切割并收集的DMT保护的靶标寡核苷酸的量的手段。转化因子提供如下：[(靶标寡核苷酸在260nm波长下的消光系数(L*mol-1*cm-1))/(具有序列SEQ ID NO:3的靶标21聚体寡核苷酸的钠盐的分子量(g/mol))]×1000；其中具有序列SEQ ID NO:3的靶标21聚体寡核苷酸的分子量是7044.05g/mol(作为钠盐)，并且在260nm波长下的消光系数是153957L*mol-1*cm-1。
所有回收的寡核苷酸产物的分步产率(mol.％)，即，该方法的合成部分的粗产率，是如下确定的：[(总粗OD)/[(900mmol规模)×(靶标寡核苷酸在260nm波长下的消光系数(L*mol-1*cm-1))]]×100；其中所述消光系数在260nm波长下为153957L*mol-1*cm-1。
从合成柱回收的粗产物中所含的特定DMT保护的靶标寡核苷酸的摩尔百分比值，被称为全长产物百分比(“％FLP(mol.％)”)，是经由反相离子对HPLC(“RPIP-HPLC”)确定的。
由合成柱产生的特定DMT保护的靶寡核苷酸的产率百分比，被称为全长产物产率(“FLP产率(mol.％)”)，是如下确定的：[(分步产率mol.％)×(％FLP mol.％)]/100。
表1
合成 1A 1B 1C
总粗OD 124162435 127914818 124751301
粗产率(OD/umol) 138 142 139
粗产率(g/mmol) 6.31 6.50 6.34
分步产率(mol.％) 90 92 90
％FLP(mol.％) 77.1 70.2 73.9
FLP产率(mol.％) 69 65 67
表2
Figure BDA0002426454580001031
纯化程序：使用1-4个柱体积的25mM氢氧化钠溶液将仅具有被4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)保护基保护的末端核苷的5'-羟基的经切割的粗制寡核苷酸的粗产率加载到阴离子交换柱(具有Q Sepharose FF柱介质，内径是60-100cm，床高是约17-25cm，并且柱体积是约100-120L)上，以实现约1000-1200OD/mL的柱负载。利用的纯化器是AktaProcess。一旦粗制寡核苷酸被加载到阴离子交换柱上，就用1-3个柱体积的25mM氢氧化钠溶液和2M氯化钠溶液的混合物进行洗涤，然后用1-3个柱体积的25mM氢氧化钠溶液进行洗涤。
为了从末端核苷的5'-羟基中去除4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)保护基，通过引入80％的乙酸水溶液(在1,000-1,200L/小时下为约1个柱体积)直到所得洗脱物的pH为约2或更低来对加载的粗制寡核苷酸进行脱三苯甲基化，从而形成完全脱保护的粗制寡核苷酸，现在将所述完全脱保护的粗制寡核苷酸加载到阴离子交换柱上。用0.025-0.20N氢氧化钠溶液(以1,000-1,200L/小时)将阴离子交换柱的pH重新调节至约10或更高，然后开始用碱性盐梯度进行纯化(使用5％-95％的含有20-30mM氢氧化钠和1-3M氯化钠的水溶液的梯度；其中梯度斜率为约10-20个柱体积，并且使用不超过1200L/小时的流速；在25nM氢氧化钠水溶液中从0.2到1.8M氯化钠的盐梯度)。用至少3个柱体积的包含20-50mM氢氧化钠和2-4M氯化钠的水溶液完成最终洗涤以回收纯化的寡核苷酸产物。
以3×900mmol(1A、1B和1C)和5×900mmol(2A、2B、2C、2D和2E)规模合成具有序列SEQ ID NO:3的靶标21聚体寡核苷酸的纯化结果分别在表3和表4中提供。
经由在260nm波长下的光密度(OD)来测量加载到阴离子交换柱上的经切割的被DMT保护的粗制靶标寡核苷酸的量，该量被报告为(“加载到柱上的OD”)。
经由在260nm波长下的光密度(OD)来测量从阴离子交换柱回收的纯化的靶标寡核苷酸产物的量，该量被报告为“从柱回收的总OD”。
从阴离子交换柱回收的纯化的靶标寡核苷酸产物的百分比被称为“％OD回收率(分步产率mol.％)”，是如下确定的：[(从柱回收的总OD)/(加载到柱上的OD)]×100。
从阴离子交换柱回收的纯化的靶标寡核苷酸产物的质量被称为“靶标寡核苷酸的预计质量(g)”，是如下确定的：[(从柱回收的总OD)/(转化因子(OD/g))]；其中转化因子特异于具有序列SEQ ID NO:3的靶标21聚体寡核苷酸(即，21856.3OD/g)。
从阴离子交换柱回收的纯化的靶标寡核苷酸产物的摩尔百分比值被称为全长产物百分比(“％FLP(mol.％)”)，是经由反相离子对HPLC(“RPIP-HPLC”)确定的。
从阴离子交换柱回收的纯化的靶标寡核苷酸产物的产率百分比被称为全长产物产率(“FLP产率(mol.％)”)，是如下确定的：[(％OD回收率(分步产率mol.％))×(％FLPmol.％)]/100。
表3
Figure BDA0002426454580001051
表4
Figure BDA0002426454580001052
超滤/渗滤程序：将来自3-4个合成/纯化轮次(每次以900mmol的规模)的纯化的寡核苷酸洗脱物合并在一起，并使用具有再生纤维素盒(截留分子量为3,000DA；其中盒面积是20-25m2(即8-10×2.5m2)的CUF-1系统，经由超滤/渗滤工艺进行脱盐。将以约650-750OD/mL的初始浓度加载并且具有约5-6L/min/m2的错流速度的合并的纯化寡核苷酸洗脱物通过中和至约6.5-7.5的pH(使用0.5-2M HCl和0.05-0.25M HCl以实现pH 6.5-7.5；如果必要的话则用0.05-0.25N NaOH溶液进行调节)来脱盐，然后用水进行渗滤达至少7次交换，直到渗透液(渗滤液)的电导率小于50μS/cm，并且保留物溶液中脱盐的寡核苷酸的所得浓度是至少1,000OD/mL。
在表5中提供了3×900mmol(“1(A-C)”，即合并的1A、1B和1C的超滤/渗滤)和5×900mmol(“2(A-E)”，即合并的2A、2B、2C、2D和2E的超滤/渗滤)规模合成的具有序列SEQ IDNO:3的靶标21聚体寡核苷酸的超滤/渗滤工艺的结果。
经由260nm波长下的光密度(OD)来测量经由超滤/渗滤工艺脱盐的纯化的靶标寡核苷酸产物的量，该量被报告为(“总OD负载”)。
经由260nm波长下的光密度(OD)来测量保留物溶液中包含的经脱盐、纯化的靶标寡核苷酸产物的量，该量被报告为(“最终保留物中的总OD”)。
经由超滤/渗滤工艺在保留物中包含的经脱盐的纯化的靶标寡核苷酸产物的百分比，被称为“％OD回收率(分步产率mol.％)”，是如下确定的：[(最终保留物中的总OD)/(加载的总OD)]×100。
在超滤/渗滤工艺结束时，渗透物(渗滤液)的电导率(“最终渗透物电导率(uS/cm)”)是直接从最终的渗透滤液测量的。
表5
超滤/渗滤 1(A-C) 2(A-E)
加载的总OD 270884000 426709000
最终保留物中的总OD 240841600 388870000
OD回收率(分步产率；mol.％) 89 91
最终渗透物的电导率(uS/cm) 45 48
经由薄膜蒸发和冷冻干燥工艺进行浓缩：最初将所得的脱盐的寡核苷酸保留物溶液经由使用约60-80℃的夹套温度、约30-100托的真空压力在TFE-280系统上进行薄膜蒸发而浓缩，以使2700mmol规模时的最终浓度达到至少3000OD/mL，并且3600mmol规模时的最终浓度达到至少4000OD/mL。
将从薄膜蒸发产生的经浓缩的脱盐的寡核苷酸进一步浓缩，并经由在Boc-Edwards冷冻干燥器或KTS冷冻干燥器上进行冷冻干燥工艺而干燥，加载温度为15-25℃，冷冻温度为-50℃至-30℃，在-50℃至-30℃和100-500毫托下抽真空，并在-10℃至20℃的温度和100-500至1毫托的压力下干燥，以获得具有核酸序列SEQ ID NO:3的靶标寡核苷酸的最终固体产物。
在表6中提供了3×900mmol(“1(A-C)”)和5×900mmol(“2(A-E)”)规模合成具有序列SEQ ID NO:3的靶标21聚体寡核苷酸的薄膜蒸发和冷冻干燥工艺的结果。
经由260nm波长下的光密度(OD)来测量经由薄膜蒸发工艺浓缩的脱盐的靶标寡核苷酸产物的量，该量被报告为(“总起始OD”)。
从冷冻干燥工艺中回收的浓缩的固体靶标寡核苷酸产物的量，被报告为(“总量:收获的固体(g)”)，是重量测量值。
从冷冻干燥工艺中回收的经水分含量校正的浓缩的固体靶标寡核苷酸产物的量，被报告为(“总量:收获的经水分校正的固体(g)”)，是通过水含量分析(诸如Karl Fischer滴定法)确定的。
从冷冻干燥工艺中回收的经水分校正的浓缩的固体靶标寡核苷酸产物的量以光密度(“总量:当量OD值(OD)”)报告，被如下确定：[(总量:收获的经水分校正的固体(g))×(转化因子(OD/g))]；其中转化因子特异于具有序列SEQ ID NO:3的靶标21聚体寡核苷酸(即，21856.3OD/g)。
从冷冻干燥工艺中回收的经水分校正的浓缩的固体靶标寡核苷酸产物的量以mmol(“总量：mmol”)报告，被如下确定：[(总量:收获的经水分校正的固体(g))/(具有序列SEQ ID NO:3的靶标21聚体寡核苷酸的钠盐的分子量(g/mol))×1000；其中具有序列SEQID NO:3的靶标21聚体寡核苷酸的分子量是7044.05g/mol(作为钠盐)。
用于提供从冷冻干燥工艺中回收的经水分校正的浓缩的固体靶标寡核苷酸产物的薄膜蒸发和冷冻干燥工艺的经水分校正的分步产率(mol.％)，被如下确定：[(总量:当量OD值(OD)/(总起始OD)]×100。
用于提供从冷冻干燥工艺中回收的经水分含量校正的浓缩的固体靶标寡核苷酸产物的整个工艺(即来自合成、纯化、脱盐并经由浓缩工艺(薄膜蒸发和冷冻干燥工艺))的经水分校正的总产率(g/mmol)，被报告为“经水分校正的总产率(分离的g/起始mmol)”，是如下确定的：[(总量:收获的经水分校正的固体(g))/[(900mmol)×(合并的迭代数)]]]；其中“合并的迭代数”对于“1(A-C)”为3，并且对于“2(A-E)”为5。
用于提供从冷冻干燥工艺中回收的经水分含量校正的浓缩的固体靶标寡核苷酸产物的整个工艺(即来自合成、纯化、脱盐并经由浓缩工艺(薄膜蒸发和冷冻干燥工艺))的经水分校正的总产率(mol.％)，被报告为“总产率(mol.％)”，是如下确定的：[(总量:mmol)/[(900mmol)×(合并的迭代数)]]×100；其中“合并的迭代数”对于“1(A-C)”为3，并且对于“2(A-E)”为5。
经由反相离子对HPLC(“RPIP-HPLC”)测量从整个工艺中回收的经水分含量校正的浓缩的纯化靶标寡核苷酸产物的量，该量被称为“靶标寡核苷酸(干重％)”。
经由电感耦合等离子体(ICP)测量从整个工艺中回收的浓缩、纯化的靶标寡核苷酸产物的钠含量，该钠含量被称为“钠含量(mol.％)”。
表6
Figure BDA0002426454580001081
示例性实施方案
在一个实施方案中，单批寡核苷酸组合物包含至少700mmol的寡核苷酸和至多25重量％的水。
在一个实施方案中，单批寡核苷酸组合物包含至少2kg的寡核苷酸和至多25重量％的水。
在一个实施方案中，单批寡核苷酸组合物包含至少50mol％的来自至少一个700mmol或更大的寡核苷酸合成柱的寡核苷酸输出和至多25重量％的水。
在一个实施方案中，单批寡核苷酸组合物包含至少700mmol的寡核苷酸，其中所述单批组合物是液体组合物。
在一个实施方案中，单批寡核苷酸组合物包含至少2kg的寡核苷酸，其中所述单批组合物是液体组合物。
在一个实施方案中，单批寡核苷酸组合物包含至少50mol％的来自至少一个700mmol或更大的寡核苷酸合成柱的寡核苷酸输出，其中所述单批组合物是液体组合物。
在一个实施方案中，寡核苷酸组合物包含多种至少700mmol规模的寡核苷酸单批合成制备物，其中所述寡核苷酸组合物具有至多25重量％的水。
在一个实施方案中，寡核苷酸组合物包含多种至少700mmol规模的寡核苷酸单批合成制备物，其中所述单批组合物是液体组合物。
在一个实施方案中，一种寡核苷酸的基本上纯的寡核苷酸组合物，其中5'-末端核苷的5'-羟基被保护。
在一个实施方案中，一种制备寡核苷酸的方法，其中所述方法包括：
a)提供连接到固体支撑物的接头，其中所述接头包含受保护的羟基；
b)使所述接头的受保护的羟基脱保护，从而产生脱保护的羟基；
c)独立地提供核苷亚磷酰胺，其中所述核苷亚磷酰胺包含受保护的羟基和受保护的亚磷酰胺；
d)将核苷亚磷酰胺独立地偶联至接头的脱保护的羟基，或来自所述反应循环的所述先前迭代的核苷的脱保护的羟基，从而产生亚磷酸三酯连接的核苷；
e)独立地硫醇化受保护的亚磷酸三酯键，从而产生受保护的硫代磷酸酯键；
f)任选地，对未反应的脱保护的羟基独立地加帽；
g)任选地，使核苷的受保护的羟基独立地脱保护；
h)重复所述提供、偶联、硫醇化、加帽和脱保护步骤(步骤c)至g))预定次数，以提供与固体支撑物结合的寡核苷酸；
i)使受保护的硫代磷酸酯键脱保护；
j)从固体支撑物上切割寡核苷酸；
k)从固体支撑物上洗脱寡核苷酸；
l)使用离子交换色谱柱纯化寡核苷酸洗脱物；以及
m)浓缩寡核苷酸化合物的溶液，诸如使用薄膜蒸发浓缩。
在一个实施方案中，一种寡核苷酸组合物，所述寡核苷酸组合物包含至少700mmol的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有至多25重量％的水和以下核酸序列：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，
其中：
1)X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷；并且
2)寡核苷酸是根据包括以下步骤的方法制备的：
a)提供连接到固体支撑物的接头，其中所述接头包含受保护的羟基；
b)使所述接头的受保护的羟基脱保护，从而产生脱保护的羟基；
c)独立地提供核苷亚磷酰胺，其中所述核苷亚磷酰胺包含受保护的羟基和受保护的亚磷酰胺；
d)将核苷亚磷酰胺独立地偶联至接头的脱保护的羟基，或来自反应循环的先前迭代的核苷的脱保护的羟基，从而产生亚磷酸三酯连接的核苷；
e)独立地硫醇化受保护的亚磷酸三酯键，从而产生受保护的硫代磷酸酯键；
f)任选地，对未反应的脱保护的羟基独立地加帽；
g)任选地，使核苷的受保护的羟基独立地脱保护；
h)重复所述提供、偶联、硫醇化、加帽和脱保护步骤(步骤c)至g)达预定次数以提供与固体支撑物结合的寡核苷酸；
i)使受保护的硫代磷酸酯键脱保护；
j)从固体支撑物上切割寡核苷酸；
k)从固体支撑物上洗脱寡核苷酸；
l)使用离子交换色谱柱纯化寡核苷酸洗脱物；以及
m)浓缩寡核苷酸化合物的溶液，诸如使用薄膜蒸发浓缩。
在某些实施方案中，以下另外的实施方案中的一个或多个(包括例如全部)可以包括所述另外的实施方案中的每一个，或其部分。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述纯化步骤l)包括：
1)将来自洗脱步骤k)的寡核苷酸洗脱物加载到离子交换色谱柱上；
2)使来自末端核苷的受保护的羟基脱保护；以及
3)使用盐梯度从离子交换色谱柱洗脱寡核苷酸。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述纯化步骤l)包括：
1)将来自洗脱步骤k)的寡核苷酸洗脱物加载到离子交换色谱柱上；
2)使来自末端核苷的受保护的羟基脱保护；
3)使用盐梯度从离子交换色谱柱洗脱寡核苷酸；以及
4)经由超滤和/或渗滤使来自离子交换柱的寡核苷酸洗脱物脱盐。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述浓缩步骤m)包括浓缩所述寡核苷酸化合物的所述脱盐溶液，诸如使用薄膜蒸发进行浓缩。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述浓缩步骤m)包括浓缩所述寡核苷酸化合物的脱盐溶液，诸如使用薄膜蒸发进行浓缩，以及进一步用冷冻干燥工艺浓缩所述溶液。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述方法还包括在反应循环迭代的一个或多个步骤之间用非质子溶剂(诸如乙腈)独立地洗涤所述支撑物，例如在反应循环迭代的一个或多个步骤之间用介于1-10个之间的柱体积，例如介于1-7个之间的柱体积或介于1-5个之间的柱体积，诸如介于2-4个之间的柱体积洗涤所述支撑物。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述组合物包含至少900mmol的寡核苷酸和至多25重量％的水。
在另一实施方案中，通过本文公开的方法提供了根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物，或寡核苷酸组合物，产率为至少2g/mmol的至少700mmol合成规模的寡核苷酸，或经由单个寡核苷酸合成柱(或合成轮次)进行的至少700mmol合成规模的寡核苷酸合成和经由寡核苷酸的单个离子交换色谱纯化柱(或纯化轮次)进行的至少700mmol纯化规模的合成寡核苷酸的纯化的合并的多个系列组合和至多25重量％的水，其中产率可以通过在260nm波长下的光密度/mL(OD/mL)来确定，或者可以通过针对制备寡核苷酸的合成规模进行水分含量校正的寡核苷酸组合物的干重来确定。
在另一实施方案中，通过本文公开的方法提供了根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物，或寡核苷酸组合物，产率为至少3g/mmol的至少700mmol合成规模的寡核苷酸，或经由单个寡核苷酸合成柱(或合成轮次)进行的至少700mmol合成规模的寡核苷酸合成和经由寡核苷酸的单个离子交换色谱纯化柱(或纯化轮次)进行的至少700mmol纯化规模的合成寡核苷酸的纯化的合并的多个系列组合和至多25重量％的水，其中产率可以通过在260nm波长下的光密度/mL(OD/mL)来确定，或者可以通过针对制备寡核苷酸的合成规模进行水分含量校正的寡核苷酸组合物的干重来确定。
在另一实施方案中，通过本文公开的方法提供了根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物，或寡核苷酸组合物，产率为至少3.5g/mmol的至少900mmol合成规模的寡核苷酸，或经由单个寡核苷酸合成柱(或合成轮次)进行的至少900mmol合成规模的寡核苷酸合成和经由寡核苷酸的单个离子交换色谱纯化柱(或纯化轮次)进行的至少900mmol纯化规模的合成寡核苷酸的纯化的合并的多个系列组合和至多25重量％的水，其中产率可以通过在260nm波长下的光密度/mL(OD/mL)来确定，或者可以通过针对制备寡核苷酸的合成规模进行水分含量校正的寡核苷酸组合物的干重来确定。
在另一实施方案中，通过本文公开的方法提供了根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物，或寡核苷酸组合物，产率为至少3.5g/mmol的至少900mmol合成规模的寡核苷酸，或经由单个寡核苷酸合成柱(或合成轮次)进行的至少900mmol合成规模的寡核苷酸合成和经由寡核苷酸的单个离子交换色谱纯化柱(或纯化轮次)进行的至少900mmol纯化规模的合成寡核苷酸的纯化的合并的多个系列组合和至多10重量％的水，其中产率可以通过在260nm波长下的光密度/mL(OD/mL)来确定，或者可以通过针对制备寡核苷酸的合成规模进行水分含量校正的寡核苷酸组合物的干重来确定。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述组合物包含至少3kg的寡核苷酸和至多25重量％的水。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述组合物包含至少50mol％，诸如介于70-99mol％之间的来自至少一个具有提供至少300mmol或更大，诸如至少700mmol、至少800mmol或至少900mmol或更大的被合成的寡核苷酸的能力的寡核苷酸合成柱的寡核苷酸输出；以及至多25重量％的水，其中输出是通过光密度/mL(OD/mL)确定的。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述组合物包含至少50mol％，诸如介于70-99mol％之间的来自介于4-10个之间的具有提供至少300mmol或更大，诸如至少700mmol、至少800mmol或至少900mmol或更大的被合成的寡核苷酸的能力的寡核苷酸合成柱的寡核苷酸输出(如通过光密度/mL(OD/mL)确定的)；以及至多25重量％的水。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述寡核苷酸的分子量是至少3,000Da，诸如分子量在介于3,000-20,000Da之间的范围内。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述寡核苷酸具有10-100个单体亚基，例如15-25个单体亚基，诸如20个、21个或22个单体亚基。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述寡核苷酸是抗SMAD7寡核苷酸。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述核苷酸序列具有SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的核酸序列或其互补序列。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述核苷酸序列具有以下核酸序列：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')；
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述寡核苷酸的核苷酸间键中的至少一个是O,O-连接的硫代磷酸酯。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述寡核苷酸的所有核苷酸间键是O,O-连接的硫代磷酸酯。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述分子量是质子化的分子量。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述分子量是碱金属分子量，诸如钠盐形式的分子量。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述分子量是碱土金属分子量，诸如镁盐形式的分子量。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述寡核苷酸组合物包含至多20重量％的水、至多15重量％的水，或至多10重量％的水，诸如包含在介于5-10重量％之间的范围内的水，例如在介于6-8％重量之间的范围内的水。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中仅5'末端核苷的5'羟基被保护。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中在从合成柱上切割和洗脱后获得了受保护的寡核苷酸。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述包含寡核苷酸的组合物的纯度是60％或更高(例如，如通过RP-HPLC确定的)。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述包含受保护的寡核苷酸的组合物的纯度是60％或更高(例如，如通过RP-HPLC确定的)。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述受保护的寡核苷酸的分子量是至少3,000Da，诸如分子量在介于3,000-20,000Da之间的范围内。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述连接有接头的固体支撑物是可控孔度玻璃。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述连接有接头的固体支撑物是交联聚苯乙烯。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述固体支撑物具有足以制备在300-3,000mmol范围内的量的寡核苷酸，例如制备在700-3,000mmol范围内的量的寡核苷酸，诸如制备至少600mmol、至少700mmol、至少900mmol、至少1,600mmol或至少2,400mmol的量的寡核苷酸的负载能力。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述固体支撑物的负载密度是至少300微摩尔接头/克固体支撑物，诸如325-375微摩尔接头/克固体支撑物。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中容纳所述固体支撑物的柱的柱内径在介于35-100cm之间，例如介于50-100cm之间的范围内，诸如内径是35cm、40cm、50cm、60cm、70cm、80cm、90cm或100cm。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述固体支撑物的床高在介于4-20cm之间，诸如介于7-20cm之间的范围内。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述固体支撑物的柱体积是至少20L，诸如柱体积在介于20-35L之间的范围内。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述连接有接头的固体支撑物是NITTOPHASE UNYLINKER 350。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述接头包含末端羟基。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述接头包含与核苷亚磷酰胺反应的末端羟基。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述接头包含受保护的末端羟基，所述受保护的末端羟基在脱保护时与核苷亚磷酰胺反应。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述接头是UNYLINKER。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述接头上的羟基保护基是二甲氧基三苯甲基(DMT)基团。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中将所述接头的受保护的羟基用质子酸来脱保护，所述质子酸是例如3-15重量％的二氯乙酸的甲苯溶液(v/v)，诸如2-10重量％的二氯乙酸的甲苯溶液(v/v)，例如10重量％的二氯乙酸的甲苯溶液(v/v)。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述偶联包括提供核苷亚磷酰胺，例如提供相对于固体支撑物的当量过量的核苷亚磷酰胺，诸如1-8当量的核苷亚磷酰胺。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述偶联包括为核苷亚磷酰胺提供活化剂，例如二氰基咪唑(DCI)。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述偶联包括提供相对于所提供的活化剂的当量为0.1-1当量的核苷亚磷酰胺。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述偶联包括以2-5:1的摩尔比提供活化剂和核苷亚磷酰胺。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述核苷亚磷酰胺是受保护的核苷亚磷酰胺，诸如包含5'-羟基保护基和3'-羟基保护基的受保护的核苷亚磷酰胺。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述受保护的核苷亚磷酰胺的5'-羟基保护基是二甲氧基三苯甲基(DMT)基团
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述受保护的核苷亚磷酰胺的3'-羟基保护基是亚磷酰胺基，诸如(2-氰基乙基)-N,N-二异丙基-亚磷酰胺基。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中用硫醇化剂将所述受保护的亚磷酸三酯键硫醇化形成了受保护的硫代磷酸酯键，诸如2-氰基乙氧基保护的硫代磷酸酯键。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述硫醇化剂是氢化黄原素(XH)，诸如在吡啶中的氢化黄原素(XH)。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中相对于固体支撑物的当量，提供1-8当量诸如5-8当量的氢化黄原素(XH)。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中将未反应的脱保护的羟基用酰基诸如烷基酰基加帽。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中对所述未反应的脱保护的羟基加帽包括添加：
a)第一加帽溶液(Cap A)，所述第一加帽溶液包含N-甲基咪唑(NMI)、吡啶和乙腈；以及
b)第二加帽溶液(Cap B)，所述第二加帽溶液包含加帽剂和乙腈。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述对所述未反应的脱保护的羟基加帽包括加入以下物质的预混合混合物：
a)第一加帽溶液(Cap A)，所述第一加帽溶液包含N-甲基咪唑(NMI)、吡啶和乙腈；以及
b)第二加帽溶液(Cap B)，所述第二加帽溶液包含加帽剂和乙腈。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述对所述未反应的脱保护的羟基加帽包括添加加帽溶液，所述加帽溶液包含N-甲基咪唑(NMI)、吡啶、加帽剂和乙腈。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述加帽剂是异丁酸酐。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中将寡核苷酸的5'末端核苷的受保护的5'羟基用质子酸，例如二氯乙酸，诸如3-10重量％的二氯乙酸的甲苯溶液(v/v)脱保护。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中将提供/偶联核苷亚磷酰胺、硫醇化(或氧化)形成的亚磷酸三酯键、任选地对未反应的脱保护的羟基加帽，以及任选地使寡核苷酸的5'末端核苷的受保护的5'羟基脱保护的步骤重复预定次数，例如重复9-99次、重复14-24次，诸如19、20或21次，以提供具有预定数目的单体亚基，例如具有10-100个单体亚基、具有15-25个单体亚基，诸如20个、21个、或22个单体亚基的与固体支撑物结合的寡核苷酸。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中将提供/偶联核苷亚磷酰胺、硫醇化(或氧化)形成的亚磷酸三酯键、任选地对未反应的脱保护的羟基加帽，以及任选地使寡核苷酸的5'末端核苷的受保护的5'羟基脱保护的步骤重复预定次数，例如重复9-99次、重复14-24次，诸如19、20或21次，以提供量在介于300-3,000mmol之间，例如介于700-3,000mmol之间的范围内的与固体支撑物结合的寡核苷酸。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中用胺，诸如三乙胺使与固体支撑物结合的寡核苷酸的受保护的硫代磷酸酯键，诸如2-氰基乙氧基保护基团脱保护。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中使受保护的硫代磷酸酯键，诸如2-氰基乙氧基保护的硫代磷酸酯键脱保护形成了未保护的硫代磷酸酯键。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中使受保护的硫代磷酸酯键，诸如2-氰基乙氧基保护的硫代磷酸酯键脱保护形成了硫代磷酸酯键的胺盐形式，诸如形成了硫代磷酸酯键的三乙胺盐形式。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中切割所述脱保护的与固体支撑物结合的寡核苷酸包括提供氢氧化铵溶液，例如提供加热的氢氧化铵溶液，诸如提供加热的氢氧化铵溶液并使所述加热的氢氧化铵溶液再循环通过容纳所述脱保护的与固体支撑物结合的寡核苷酸的柱。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述环外氨基保护基包括苯甲酰基和异丁酰基。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中提供和/或再循环所述加热的氢氧化铵溶液进一步使具有未保护的硫代磷酸酯键的与固体支撑物结合的寡核苷酸的苯甲酰氨基保护基和异丁酰氨基保护基脱保护。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述提供和/或再循环的加热的氢氧化铵溶液是28-30％的氨水溶液(w/w)。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述提供和/或再循环的加热的氢氧化铵溶液的温度是40-70℃或40-60℃，诸如温度是40℃、50℃、60℃，或65℃。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述加热的氢氧化铵溶液再循环通过所述支撑物达8-36小时，例如12-36小时，诸如24小时。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述切割的寡核苷酸包含5'-羟基保护的基团，诸如二甲氧基三苯甲基(DMT)基团
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中从支撑物上洗脱切割和脱保护的寡核苷酸包括用水溶液洗涤支撑物。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中从固体支撑物上洗脱的包含在末端核苷上的5'-羟基保护基的经切割的寡核苷酸的量在介于300-3,000mmol之间，例如介于600-3,000mmol之间、介于700-3,000mmol之间或介于1,000-3,000mmol之间的范围内。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中加载到离子交换色谱柱上的寡核苷酸洗脱物的量在介于300-3,000mmol之间，例如介于600-3,000mmol之间、介于700-3,000mmol之间，或介于1,000-3,000mmol之间的范围内。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中在将寡核苷酸洗脱物加载到离子交换色谱柱上之前，用水性缓冲液稀释所述寡核苷酸洗脱物。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中在加载步骤期间，所述加载的寡核苷酸洗脱物的末端核苷的5'羟基保持受保护。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述加载的寡核苷酸洗脱物的末端核苷的5'羟基，诸如二甲氧基三苯甲基(DMT)基团，是在所述加载的寡核苷酸洗脱物上唯一受保护的基团。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述离子交换色谱是阴离子交换色谱。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述离子交换色谱柱包含Q SepharoseFF作为支撑介质。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中将所述寡核苷酸洗脱物用碱性水溶液加载到离子交换色谱柱上，例如加载到离子交换色谱上并用碱性水溶液洗涤。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中将寡核苷酸洗脱物加载到离子交换色谱柱上，并用碱性水溶液和盐水溶液的混合物洗涤。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中用质子酸，例如用乙酸，诸如用80％的乙酸水溶液使加载的寡核苷酸洗脱物的末端核苷的受保护的5'羟基，诸如为二甲氧基三苯甲基(DMT)基团的5'-羟基保护基脱保护。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述加载到离子交换色谱柱上的脱保护的寡核苷酸没有保护基，即所述寡核苷酸是完全脱保护的寡核苷酸。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中将所述完全脱保护的寡核苷酸以盐梯度，例如碱性盐梯度，诸如碱性氯化钠梯度，从离子交换色谱柱上洗脱。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述碱性盐梯度是通过混合不同量的碱性水溶液和盐水溶液而形成的。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述碱性水溶液是氢氧化钠溶液。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述盐水溶液是氯化钠溶液。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述盐梯度是5％至95％的包含氯化钠的碱性水溶液。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中从离子交换色谱柱上洗脱的寡核苷酸是完全脱保护的寡核苷酸。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中根据所述方法，从合成开始直到使用离子交换色谱从纯化步骤收集寡核苷酸而制备的寡核苷酸的总产率是至少50％，如通过260nm波长下的OD/mL确定的，例如在介于55-100％之间的范围内，如通过260nm波长下的OD/mL确定的。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中根据所述方法，从合成开始直到使用离子交换色谱从纯化步骤收集寡核苷酸而制备的寡核苷酸的总产率是至少50％，如通过260nm波长下的光密度/mL(OD/mL)确定的，例如在介于50-95％之间的范围内，如通过260nm波长下的光密度/mL(OD/mL)确定的。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中根据所述方法，从合成开始直到使用离子交换色谱从纯化步骤收集寡核苷酸而制备的寡核苷酸的纯度是至少50％，如通过RP-HPLC确定的，例如在介于50-95％之间的范围内，如通过RP-HPLC确定的。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中经由超滤和/或渗滤工艺使完全脱保护的寡核苷酸脱盐。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述超滤和/或渗滤工艺利用再生纤维素，例如截留分子量为1,000-3,000Da的再生纤维素。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述超滤和/或渗滤工艺利用pH在5-8的范围内的水，例如pH在6.5-7.5的范围内的水，诸如pH在6.8-7.3的范围内的水。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中经由超滤和/或渗滤工艺脱盐的完全脱保护的寡核苷酸的量是从至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个离子交换色谱纯化柱(或利用一个或多个离子交换色谱纯化柱进行的纯化轮次)的输出合并的量，或例如是从介于1-10个之间的离子交换色谱纯化柱(或利用一个或多个离子交换色谱纯化柱进行的纯化轮次)，诸如介于1-8个之间、介于2-10个之间、介于3-9个之间、介于4-7个之间、介于4-6个之间、介于6-10个之间、或介于8-10个之间的离子交换色谱纯化柱(或利用一个或多个离子交换色谱纯化柱进行的纯化轮次)的输出合并的量。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中经由超滤和/或渗滤工艺脱盐的完全脱保护的寡核苷酸是从至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个离子交换色谱纯化柱(或利用一个或多个离子交换色谱纯化柱进行的纯化轮次)的输出合并的，或例如是从介于1-10个之间的离子交换色谱纯化柱(或利用一个或多个离子交换色谱纯化柱进行的纯化轮次)的输出合并的，并且其中所述离子交换纯化柱中的单个、多个或每一个具有足以提供700mmol或更大的纯化和完全脱保护的寡核苷酸的负载能力，例如具有足以提供在介于700-5,400mmol之间的范围内的被合成的纯化的寡核苷酸的负载能力。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中经由超滤和/或渗滤工艺脱盐的完全脱保护的寡核苷酸的量是从经由单个寡核苷酸合成柱(或合成轮次)的寡核苷酸合成和经由单个离子交换色谱纯化柱(或纯化轮次)的合成寡核苷酸的纯化的多个连续组合的输出合并的量，诸如合并经由单个寡核苷酸合成柱(或合成轮次)的寡核苷酸合成和经由单个离子交换色谱纯化柱(或纯化轮次)的合成寡核苷酸的纯化的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续组合，诸如介于1-8个之间、介于2-10个之间、介于3-9个之间、介于4-7个之间、介于4-6个之间、介于6-10个之间之间或介于8-10个之间的连续组合。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中经由超滤和/或渗滤工艺脱盐的完全脱保护的寡核苷酸的量是从经由单个寡核苷酸合成柱(或合成轮次)的寡核苷酸合成和经由单个离子交换色谱纯化柱(或纯化轮次)的合成寡核苷酸的纯化的多个连续组合的输出合并的量，诸如合并经由单个寡核苷酸合成柱(或合成轮次)的寡核苷酸合成和经由单个离子交换色谱纯化柱(或纯化轮次)的合成寡核苷酸的纯化的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续组合，并且其中寡核苷酸合成柱和/或离子交换纯化柱中的单个、多个或每一个具有足以提供700mmol或更大的纯化和完全脱保护的寡核苷酸的负载能力，例如具有足以提供介于700-5,400mmol之间的被合成的纯化的寡核苷酸的负载能力。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中从离子交换色谱纯化柱(或利用一个或多个离子交换色谱纯化进行的纯化轮次)中的单个、多个或每一个得到的、将在经由超滤和/或渗滤工艺进行脱盐之前合并的完全脱保护和纯化的寡核苷酸，是700mmol或更大的完全脱保护和纯化的寡核苷酸，例如900mmol或更大、1600mmol或更大、2,700mmol或更大、3,600mmol或更大、4,000mmol或更大、4,500mmol或更大、5,000mmol或更大，或5,400mm或更大的独立量，或者可以是在介于700-5,400mmol之间，例如介于700-4,500mmol之间、介于700-3,600mmol之间、介于900-1,600mmol之间、介于900-3,000mmol之间、介于900-2,700mmol之间、介于1,600-2,700mmol之间、介于2,700-3,600mmol之间、介于2,700-4,500mmol之间、介于3,000-4,000mmol之间、介于3,600-4,500mmol之间，或介于3,600-5,400mmol之间的范围内的完全脱保护和纯化的寡核苷酸的独立量。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中经由超滤和/或渗滤工艺脱盐的完全脱保护和纯化的寡核苷酸洗脱物的量是至少900mmol，例如至少1600mmol、至少2400mmol、至少2700mmol、至少3,000mmol、至少3,600mmol或至少4,500mmol，或在介于900-5,400mmol之间，例如介于900-4,500mmol之间、介于900-3,600mmol之间、介于900-3,000mmol之间、介于900-2,700mmol之间、介于1,600-2,700mmol之间、介于1,800-3,600mmol之间、介于1,600-2,700mmol之间、介于2,700-3,600mmol之间、介于2,700-4,500mmol之间、介于3,000-4,000mmol之间、介于3,600-4,500mmol之间，或介于3,600-5,400mmol之间的范围内。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中经由超滤和/或渗滤工艺脱盐的完全脱保护和纯化的寡核苷酸洗脱物的量是从至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个离子交换色谱纯化柱(或利用一个或多个离子交换色谱纯化柱进行的纯化轮次)合并的至少700mmol的量，例如从至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个离子交换色谱纯化柱(或利用一个或多个离子交换色谱纯化柱进行的纯化轮次)合并的至少900mmol、至少1600mmol、至少2400mmol、至少2,700mmol、至少3,600mmol或至少4,500mmol的量，或在介于700-4,000mmol之间，例如介于900-1,600mmol之间、介于900-3,000mmol之间、介于900-2,700mmol之间、介于1,600-2,700mmol之间、介于2,700-3,600mmol之间、介于2,700-4,500mmol之间、介于3,000-4,000mmol之间、介于3,600-4,500mmol之间，或介于3,600-5,400mmol之间的范围内的量。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述超滤和/或渗滤工艺有效地使完全脱保护和纯化的寡核苷酸洗脱物脱盐，使得所得的渗透液(渗滤物)的电导率小于900uS/cm，例如具有在介于40-900uS/cm之间，诸如介于40-150uS/cm之间、介于40-100uS/cm之间，或介于40-75uS/cm之间的范围内的电导率。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述超滤和/或渗滤工艺有效地使完全脱保护的和纯化的寡核苷酸洗脱物脱盐，使得所得脱盐的完全脱保护的寡核苷酸保留物溶液的钠含量在介于6-8重量％之间，例如介于6-7重量％之间、介于7-8重量％之间，或介于6.5-7.5重量％之间的范围内。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中将脱盐的完全脱保护的寡核苷酸保留物溶液浓缩。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中将脱盐的完全脱保护的寡核苷酸保留物溶液浓缩，诸如经由薄膜蒸发进行浓缩。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中薄膜蒸发夹套温度是30℃或更高，例如在30-95℃或60-90℃的范围内。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中薄膜蒸发压力是5-100托，例如30-100托或20-80托。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中被浓缩，诸如经由薄膜蒸发进行浓缩的来自超滤和/或渗滤工艺的脱盐的完全脱保护的寡核苷酸保留物溶液的量是至少900mmol，例如至少1600mmol、至少2,400mmol、至少2,700mmol、至少3,600mmol，或至少4,500mmol，或在介于900-5,400mmol之间，例如介于900-4,500mmol之间、介于900-4,000mmol之间、介于900-3,600mmol之间、介于900-3,000mmol之间、介于900-2,700mmol之间、介于1,600-2,700mmol之间、介于1,800-3,600mmol之间、介于2,700-3,600mmol之间、介于2,700-4,500mmol之间、介于3,000-4,000mmol之间、介于3,600-4,500mmol之间或介于3,600-5,400mmol之间的范围内。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中被浓缩，诸如经由薄膜蒸发进行浓缩的来自超滤和/或渗滤工艺的脱盐的完全脱保护的寡核苷酸保留物溶液的量在260nm波长下是至少800OD/mL，例如在260nm波长下在介于800-7,000OD/mL之间的范围内。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或寡核苷酸组合物是液体组合物，或其中所述制备方法导致制备液体组合物。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或寡核苷酸组合物不是从冷冻干燥工艺获得的，或者其中所述制备方法不包括冷冻干燥工艺。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中将浓缩的寡核苷酸，诸如经薄膜蒸发的寡核苷酸，进行冷冻干燥工艺。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或寡核苷酸组合物是固体组合物，或其中所述制备方法导致制备固体组合物。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述冷冻干燥工艺利用在1-500毫托范围内，例如1-300毫托或100-500毫托的真空。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述冷冻干燥工艺利用在-50℃至35℃，例如-50℃至-30℃、15-25℃、-10℃至20℃，或-45℃至20℃的范围内的温度。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中浓缩的寡核苷酸溶液的量，诸如通过冷冻干燥工艺进一步浓缩和/或干燥的来自薄膜蒸发工艺的浓缩的寡核苷酸溶液的量是至少900mmol，例如至少1,600mmol、至少2,400mmol、至少2,700mmol、至少3,600mmol或至少4,500mmol，或在介于900-5,400mmol之间，例如介于900-4,500mmol之间、介于900-4,000mmol之间、介于900-3,600mmol之间、介于900-3,000mmol之间、介于900-2,700mmol之间、介于1,600-2,700mmol之间、介于1,800-3,600mmol之间、介于2,700-3,600mmol之间、介于2,700-4,500mmol之间、介于3,000-4,000mmol之间、介于3,600-4,500mmol之间，或介于3,60 0-5,400mmol之间的范围内。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中浓缩寡核苷酸溶液的量，诸如通过冷冻干燥工艺进一步浓缩和/或干燥的来自薄膜蒸发工艺的浓缩寡核苷酸溶液的量在260nm波长下是至少800OD/mL，例如在260nm波长下在介于800-7,000OD/mL之间的范围内。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述方法还包括在至少一个反应循环迭代期间在提供核苷亚磷酰胺之前独立地将支撑物预溶胀。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中从冷冻干燥工艺产生的浓缩的寡核苷酸的水含量可以是至多25重量％的水，例如水含量是至多20重量％的水，至多15重量％的水、至多10重量％的水，或至多5重量％的水，或例如水含量在介于25-5重量％之间的水，例如介于25-10重量％之间的水、介于15-5重量％之间的水、介于10-5重量％之间的水，或介于6-8重量％之间的水的范围内。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述寡核苷酸是脱氧核糖核苷酸，例如抗SMAD7寡核苷酸，诸如具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:12的核酸序列的寡核苷酸或其互补序列，是脱氧核糖核苷酸。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述寡核苷酸是核糖核苷酸，例如抗SMAD7寡核苷酸，诸如具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:12的核酸序列的寡核苷酸或其互补序列，是脱氧核糖核苷酸。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述寡核苷酸的同源性程度是至少90％，诸如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，并且其中所述寡核苷酸可以是抗SMAD7寡核苷酸，例如具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的核酸序列的寡核苷酸，或其互补序列，诸如Mongersen(先前称为GED-0301)。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述方法固体支撑物不包括在至少一个反应循环迭代期间在提供核苷亚磷酰胺之前将支撑物预溶胀，例如不包括在每个反应循环迭代期间在提供核苷亚磷酰胺之前将支撑物预溶胀。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述预溶胀步骤包含预溶胀剂，诸如甲苯或二甲基甲酰胺。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述方法步骤以叙述它们的顺序执行。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中在最后一次反应循环迭代期间不包括任选的对未反应的脱保护的羟基加帽的步骤和任选的使寡核苷酸的5'-末端核苷的受保护的5'-羟基脱保护的步骤。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中在反应循环的每次迭代期间执行任选的对未反应的脱保护的羟基加帽的步骤和任选的使寡核苷酸的5'-末端核苷的受保护的5'-羟基脱保护的步骤，所述反应循环的每次迭代不包括最后一次迭代(即，不在最后一次迭代中执行)。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中所述寡核苷酸组合物是通过如本文公开的方法获得的。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中将所述寡核苷酸根据本文所述的方法施用，以用于治疗或管理患有炎症性肠病(IBD)的患者的IBD。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、寡核苷酸组合物、根据制备方法制备的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、或制备方法，其中将所述寡核苷酸与药学上可接受的佐剂和/或赋形剂组合配制成本文所述的药物组合物。
在一个实施方案中，一种药物组合物包含从根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的制备方法制备的寡核苷酸组合物获得的寡核苷酸，以及药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。
在一个实施方案中，一种药物组合物包含根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的制备方法制备的寡核苷酸组合物的至少一部分，以及药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的药物组合物，其中所述药物组合物是口服剂型，诸如片剂或包衣片剂。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的药物组合物，其中所述单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的制备方法制备的寡核苷酸组合物的至少一部分包含在介于10-500mg之间的范围内的具有以下核酸序列的寡核苷酸：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的药物组合物，其中所述单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的制备方法制备的寡核苷酸组合物的至少一部分包含约40mg或约160mg的具有以下核酸序列的寡核苷酸：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
在一个实施方案中，一种制备根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的药物组合物的方法，所述方法包括将从单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的制备方法制备的寡核苷酸组合物获得的寡核苷酸与药学上可接受的佐剂和/或赋形剂一起配制。
在一个实施方案中，一种制备根据上述实施方案中任一项和本文其他实施方案中的任何一项或多项的药物组合物的方法，所述方法包括将单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的制备方法制备的寡核苷酸组合物的至少一部分与药学上可接受的佐剂和/或赋形剂一起配制。
在一个实施方案中，一种制备一系列药物组合物(例如，如本文所述的口服剂型，片剂或包衣片剂)的方法，所述方法包括将单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据本文公开的制备方法制备的寡核苷酸组合分成适于口服剂量的一系列部分、量或剂量，以及将所述适于口服剂量的一系列部分、量或剂量中的适于口服剂量的每个部分、量或剂量与药学上可接受的佐剂和/或赋形剂组合。
在另一个实施方案中，制备根据以上实施方案中任一项和本文其他实施方案中任一项或多项的一系列药物组合物的方法，其中所述一系列药物组合物是至少100种药物组合物。
在另一个实施方案中，制备根据以上实施方案中任一项和本文其他实施方案中任一项或多项的一系列片剂的方法，其中所述一系列药物组合物是介于100-1,000,000种之间的药物组合物。
在另一个实施方案中，制备根据以上实施方案中任一项和本文其他实施方案中任一项或多项的一系列药物组合物的方法，其中所述适于口服剂量的一系列部分、量或剂量中的适于口服剂量的每个部分、量或剂量包含在介于10-500mg之间的范围内的具有以下核酸序列的寡核苷酸：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
在另一个实施方案中，制备根据以上实施方案中任一项和本文其他实施方案中任一项或多项的一系列药物组合物的方法，其中所述适于口服剂量的一系列部分、量或剂量中的适于口服剂量的每个部分、量或剂量包含在约40mg或约160mg的具有以下核酸序列的寡核苷酸：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
在另一个实施方案中，制备根据以上实施方案中任一项和本文其他实施方案中任一项或多项的一系列药物组合物的方法，其中所述一系列药物组合物是一系列片剂。
在另一个实施方案中，制备根据以上实施方案中任一项和本文其他实施方案中任一项或多项的一系列药物组合物的方法，其中所述一系列片剂是至少100片、至少500片、至少1,000片、至少2,000片、至少5,000片、至少10,000片、至少20,000片、至少50,000片、至少100,000片，或至少200,000片。
在另一个实施方案中，制备根据以上实施方案中任一项和本文其他实施方案中任一项或多项的一系列药物组合物的方法，其中所述一系列药物组合物是一系列片剂，其中所述一系列片剂是介于100-1,000,000片之间、介于1,000-1,000,000片之间、介于10,000-1,000,000片之间、介于50,000-1,000,000片之间、介于100,000-1,000,000片之间，或介于500-1,000,000片之间。
在另一个实施方案中，制备根据以上实施方案中任一项和本文其他实施方案中任一项或多项的一系列药物组合物的方法，其中所述一系列药物组合物是一系列包衣片剂。
在一个实施方案中，一种药物组合物批料，所述药物组合物批料包含如本文所公开的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据制备方法制备的寡核苷酸组合物的至少一部分，以及药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。
在另一个实施方案中，根据以上实施方案中任一项和本文其他实施方案中任一项或多项的药物组合物批料，其中所述药物组合物批料包含至少10重量％、至少20重量％、至少30重量％、至少40重量％、至少50重量％、至少60重量％、至少70重量％、至少80重量％、至少90重量％、至少95重量％或100重量％的如本文所公开的单批组合物、基本上纯的寡核苷酸组合物、或根据制备方法制备的寡核苷酸组合物。
在另一个实施方案中，根据以上实施方案中任一项和本文其他实施方案中任一项或多项的药物组合物批料，其中所述药物组合物批料包含至少一种口服剂型。
在另一个实施方案中，根据以上实施方案中任一项和本文其他实施方案中任一项或多项的药物组合物批料，其中所述至少一种口服剂型是片剂。
在另一个实施方案中，根据以上实施方案中任一项和本文其他实施方案中任一项或多项的药物组合物批料，其中所述药物组合物批料包含一系列口服剂型。
在另一个实施方案中，根据以上实施方案中任一项和本文其他实施方案中任一项或多项的药物组合物批料，其中所述一系列口服剂型是一系列片剂。
在另一个实施方案中，根据以上实施方案中任一项和本文其他实施方案中任一项或多项的药物组合物批料，其中所述一系列片剂是至少100片。
在另一个实施方案中，根据以上实施方案中任一项和本文其他实施方案中任一项或多项的药物组合物批料，其中所述一系列片剂是介于100-1,000,000片之间。
在另一个实施方案中，根据以上实施方案中任一项和本文其他实施方案中任一项或多项的药物组合物批料，其中所述药物组合物批料包含的片剂是包衣片剂。
在另一个实施方案中，根据以上实施方案中任一项和本文其他实施方案中任一项或多项的药物组合物批料，其中所述一系列片剂是一系列包衣片剂。
在另一个实施方案中，根据以上实施方案中任一项和本文其他实施方案中任一项或多项的药物组合物批料，其中所述至少一种口服剂型、所述至少一种片剂、所述至少一种包衣片剂、所述一系列口服剂型中的每一者，所述一系列片剂中的每一者，或所述一系列包衣片剂中的每一者均包含在介于10-500mg之间的范围内的具有以下核酸序列的寡核苷酸：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
在另一个实施方案中，根据以上实施方案中任一项和本文其他实施方案中任一项或多项的药物组合物批料，其中所述至少一种口服剂型、所述至少一种片剂、所述至少一种包衣片剂、所述一系列口服剂型中的每一者，所述一系列片剂中的每一者，或所述一系列包衣片剂中的每一者均包含约40mg或160mg的具有以下核酸序列的寡核苷酸：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
在一个实施方案中，根据以上实施方案中任一项和本文其他实施方案中任一项或多项的单批组合物、药物组合物批料、制备所述单批组合物的方法、制备所述药物组合物的方法、或制备所述一系列药物组合物的方法符合分别在21 CFR 210.3(2)和21 CFR 210.3(10)下定义的术语批或批次。
在另一个实施方案中，根据以上实施方案中任一项和本文其他实施方案中任一项或多项的单批组合物、药物组合物批料、药物组合物、制备一系列片剂的方法或治疗方法，其中所述寡核苷酸具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:12中的任一者的核酸序列。
在另一个实施方案中，根据以上实施方案中任一项和本文其他实施方案中任一项或多项的单批组合物、药物组合物批料、药物组合物、制备一系列片剂的方法或治疗方法，其中所述寡核苷酸具有核酸序列SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
在一个实施方案中，一种治疗或管理患有炎症性肠病(IBD)的患者的IBD的方法，所述方法包括施用根据以上实施方案中任一项和本文其他实施方案中任一项或多项的药物组合物。
在另一个实施方案中，根据以上实施方案中任一项和本文其他实施方案中任一项或多项的治疗或管理患有炎症性肠病(IBD)的患者的IBD的方法，其中所述炎症性肠病(IBD)是克罗恩氏病(CD)。
在另一个实施方案中，根据以上实施方案中任一项和本文其他实施方案中任一项或多项的治疗或管理患有炎症性肠病(IBD)的患者的IBD的方法，其中所述炎症性肠病(IBD)是溃疡性结肠炎(UC)。
尽管本文已示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员来说将显而易见，此类实施方案仅作为举例提供。以下权利要求书意图限定本发明的范围，并且这些权利要求范围内的方法和结构以及其等效物意图由其涵盖。
表7：序列表
Figure BDA0002426454580001371
Figure BDA0002426454580001381
Figure BDA0002426454580001391
Figure BDA0002426454580001401

Claims (55)

1.单批寡核苷酸组合物，所述单批寡核苷酸组合物包含至少700mmol的所述寡核苷酸和至多25重量％的水；其中所述寡核苷酸具有以下核酸序列：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
2.单批寡核苷酸组合物，所述单批寡核苷酸组合物包含至少2g/mmol的合成规模为至少700mmol的所述寡核苷酸和至多25重量％的水；其中所述寡核苷酸具有以下核酸序列：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
3.单批寡核苷酸组合物，所述单批寡核苷酸组合物包含至少2kg的所述寡核苷酸和至多25重量％的水；其中所述寡核苷酸具有以下核酸序列：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
4.单批寡核苷酸组合物，所述单批寡核苷酸组合物包含至少50mol％的来自至少一个700mmol或更大的寡核苷酸合成柱的所述寡核苷酸输出，以及至多25重量％的水；其中所述寡核苷酸具有以下核酸序列：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
5.如权利要求1-4中任一项所述的单批寡核苷酸组合物，其中所述寡核苷酸的核苷酸间键中的至少一个是O,O-连接的硫代磷酸酯。
6.如权利要求1-5中任一项所述的单批寡核苷酸组合物，其中所述寡核苷酸的所有核苷酸间键都是O,O-连接的硫代磷酸酯。
7.一种寡核苷酸的基本上纯的寡核苷酸组合物，其中5'-末端核苷的5'-羟基被保护；其中所述寡核苷酸具有以下核酸序列：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
8.如权利要求7所述的基本上纯的寡核苷酸组合物，其中仅所述5'-末端核苷的5'-羟基被保护。
9.如权利要求8所述的基本上纯的寡核苷酸组合物，其中所述受保护的寡核苷酸是在从合成柱上切割并洗脱后获得的。
10.如权利要求7-9中任一项所述的基本上纯的寡核苷酸组合物，其中所述组合物的纯度是60％或更高。
11.如权利要求7-10中任一项所述的基本上纯的寡核苷酸组合物，其中所述寡核苷酸的所述核苷酸间键中的至少一个是O,O-连接的硫代磷酸酯。
12.如权利要求7-11中任一项所述的基本上纯的寡核苷酸组合物，其中所述寡核苷酸的所有核苷酸间键都是O,O-连接的硫代磷酸酯。
13.如权利要求1-6中任一项所述的单批寡核苷酸组合物或如权利要求7-12中任一项所述的基本上纯的寡核苷酸组合物，其中所述寡核苷酸是根据包括以下步骤的方法制备的：
a)提供连接到固体支撑物的接头，其中所述接头包含受保护的羟基；
b)使所述接头的所述受保护的羟基脱保护，从而产生脱保护的羟基；
c)独立地提供核苷亚磷酰胺，其中所述核苷亚磷酰胺包含受保护的羟基和受保护的亚磷酰胺；
d)将所述核苷亚磷酰胺独立地偶联至所述接头的所述脱保护的羟基，或至来自所述反应循环的所述先前迭代的所述核苷的所述脱保护的羟基，从而产生亚磷酸三酯连接的核苷；
e)独立地硫醇化所述受保护的亚磷酸三酯键，从而产生受保护的硫代磷酸酯键；
f)任选地，对未反应的脱保护的羟基独立地加帽；
g)任选地，使所述核苷的所述受保护的羟基独立地脱保护；
h)重复所述提供、偶联、硫醇化、加帽和脱保护步骤(步骤c)至g))达预定次数以提供与固体支撑物结合的寡核苷酸；
i)使所述受保护的硫代磷酸酯键脱保护；
j)从所述固体支撑物上切割所述寡核苷酸；
k)从所述固体支撑物上洗脱所述寡核苷酸；
l)使用离子交换色谱柱纯化所述寡核苷酸洗脱物；以及
m)使用薄膜蒸发浓缩所述寡核苷酸化合物的溶液。
14.如权利要求13所述的寡核苷酸组合物，其中所述纯化步骤l)包括：
1)将来自洗脱步骤k)的所述寡核苷酸洗脱物加载到所述离子交换色谱柱上；
2)使来自所述末端核苷的所述受保护的羟基脱保护；以及
3)使用盐梯度从所述离子交换色谱柱上洗脱所述寡核苷酸。
15.如权利要求13所述的寡核苷酸组合物，其中所述纯化步骤l)包括：
1)将来自洗脱步骤k)的所述寡核苷酸洗脱物加载到所述离子交换色谱柱上；
2)使来自末端核苷的受保护的羟基脱保护；
3)使用盐梯度从离子交换色谱柱洗脱所述寡核苷酸；以及
4)经由超滤和/或渗滤使来自所述离子交换柱的所述寡核苷酸洗脱物脱盐。
16.如权利要求13-15中任一项所述的寡核苷酸组合物，其中所述连接有接头的固体支撑物是交联聚苯乙烯。
17.如权利要求13-16中任一项所述的寡核苷酸组合物，其中所述未反应的脱保护的羟基被用酰基加帽。
18.如权利要求13-17中任一项所述的寡核苷酸组合物，其中所述未反应的脱保护羟基的加帽包括添加：
a)第一加帽溶液(Cap A)，所述第一加帽溶液包含N-甲基咪唑(NMI)、吡啶和乙腈；以及
b)第二加帽溶液(Cap B)，所述第二加帽溶液包含加帽剂和乙腈。
19.如权利要求18所述的寡核苷酸组合物，其中所述加帽剂是异丁酸酐。
20.如权利要求13-19中任一项所述的寡核苷酸组合物，其中所述硫醇化剂是氢化黄原素(XH)。
21.如权利要求13-20中任一项所述的寡核苷酸组合物，其中所述切割所述脱保护的与固体支撑物结合的寡核苷酸包括提供氢氧化铵溶液。
22.如权利要求13-21中任一项所述的寡核苷酸组合物，其中所述离子交换色谱是阴离子交换色谱。
23.如权利要求13-22中任一项所述的寡核苷酸组合物，其中将所述寡核苷酸洗脱物用碱性水溶液加载到所述离子交换色谱柱上。
24.如权利要求13-23中任一项所述的寡核苷酸组合物，其中用80％乙酸水溶液使所述离子交换色谱柱上的所述加载的寡核苷酸洗脱物的所述5'-羟基保护基脱保护。
25.如权利要求13-24中任一项所述的寡核苷酸组合物，其中用碱性盐梯度从离子交换色谱柱上洗脱所述完全脱保护的寡核苷酸。
26.如权利要求13-25中任一项所述的寡核苷酸组合物，其中经由超滤和/或渗滤工艺使所述完全脱保护的寡核苷酸脱盐。
27.如权利要求13-26中任一项所述的寡核苷酸组合物，其中所述超滤和/或渗滤工艺利用pH在5-8范围内的水。
28.如权利要求13-27中任一项所述的寡核苷酸组合物，其中使用薄膜蒸发来浓缩所述完全脱保护的寡核苷酸洗脱物。
29.如权利要求13-28中任一项所述的寡核苷酸组合物，其中所述方法步骤按叙述它们的顺序执行。
30.如权利要求13-29中任一项所述的寡核苷酸组合物，其中在所述反应循环的每次迭代中执行对所述核苷的所述未反应的脱保护的羟基加帽的任选步骤和使所述核苷的所述受保护的羟基脱保护的任选步骤，所述反应循环的每次迭代不包括最后一次迭代。
31.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-6中任一项所述的单批寡核苷酸组合物、如权利要求7-12中任一项所述的基本上纯的寡核苷酸组合物或如权利要求13-30中任一项所述的寡核苷酸组合物的至少一部分，以及药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。
32.如权利要求31所述的药物组合物，其中所述药物组合物是口服剂型。
33.如权利要求32所述的药物组合物，其中所述药物组合物的口服剂型是片剂。
34.如权利要求33所述的药物组合物，其中所述片剂是包衣片剂。
35.如权利要求31-34中任一项所述的药物组合物，其中如权利要求1-6中任一项所述的单批寡核苷酸组合物、如权利要求7-12中任一项所述的基本上纯的寡核苷酸组合物或如权利要求13-30中任一项所述的寡核苷酸组合物中的所述至少一部分包含在介于10-500mg之间的范围内的具有以下核酸序列的所述寡核苷酸：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
36.如权利要求31-35中任一项所述的药物组合物，其中如权利要求1-6中任一项所述的单批寡核苷酸组合物、如权利要求7-12中任一项所述的基本上纯的寡核苷酸组合物或如权利要求13-30中任一项所述的寡核苷酸组合物的所述至少一部分包含约40mg或约160mg的具有以下核酸序列的所述寡核苷酸：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
37.一种治疗或管理患有炎症性肠病(IBD)的患者的IBD的方法，所述方法包括施用如权利要求31-36中任一项所述的药物组合物。
38.如权利要求37所述的治疗方法，其中所述炎症性肠病(IBD)是克罗恩氏病(CD)。
39.如权利要求37所述的治疗方法，其中所述炎症性肠病(IBD)是溃疡性结肠炎(UC)。
40.一种制备如权利要求31-36中任一项所述的药物组合物的方法，所述方法包括将如权利要求1-6中任一项所述的单批寡核苷酸组合物、如权利要求7-12中任一项所述的基本上纯的寡核苷酸组合物，或如权利要求13-30中任一项所述的寡核苷酸组合物的所述至少一部分与所述药学上可接受的佐剂和/或赋形剂一起配制。
41.一种制备一系列片剂的方法，所述方法包括将如权利要求1-6中任一项所述的单批寡核苷酸组合物、如权利要求7-12中任一项所述的基本上纯的寡核苷酸组合物或如权利要求13-30中任一项所述的寡核苷酸组合物分成适于口服剂量的一系列部分、量或剂量，以及将所述适于口服剂量的一系列部分、量或剂量中的适于口服剂量的每个部分、量或剂量与药学上可接受的佐剂和/或赋形剂组合。
42.如权利要求41所述的制备一系列片剂的方法，其中所述一系列片剂是至少100片。
43.如权利要求41所述的制备一系列片剂的方法，其中所述一系列片剂是介于100-1,000,000片之间。
44.如权利要求41-43所述的制备一系列片剂的方法，其中所述一系列片剂是一系列包衣片剂。
45.如权利要求41-44中任一项所述的制备一系列片剂的方法，其中适于口服剂量的所述一系列部分、量或剂量中的适于口服剂量的每个部分、量或剂量包含在介于10-500mg之间的范围内的具有以下核酸序列的所述寡核苷酸：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
46.如权利要求41-45中任一项所述的制备一系列片剂的方法，其中所述适于口服剂量的一系列部分、量或剂量中的适于口服剂量的每个部分、量或剂量包含约40mg或约160mg的具有以下核酸序列的所述寡核苷酸：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
47.药物组合物批料，所述药物组合物批料包含如权利要求1-6中任一项所述的单批寡核苷酸组合物、如权利要求7-12中任一项所述的基本上纯的寡核苷酸组合物或如权利要求13-30中任一项所述的寡核苷酸组合物的至少一部分，以及药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。
48.如权利要求47所述的药物批料组合物，其中所述药物组合物批料包含至少10重量％、至少20重量％、至少30重量％、至少40重量％、至少50重量％、至少60重量％、至少70重量％、至少80重量％、至少90重量％、至少95重量％或100重量％的如权利要求1-6中任一项所述的单批寡核苷酸组合物、如权利要求7-12中任一项所述的基本上纯的寡核苷酸组合物或如权利要求13-30中任一项所述的寡核苷酸组合物。
49.如权利要求48或48所述的药物批料组合物，其中所述药物组合物批料包含至少一种片剂或至少一种包衣片剂。
50.如权利要求48或48所述的药物批料组合物，其中所述药物组合物批料包含一系列片剂。
51.如权利要求50所述的药物批料组合物，其中所述一系列片剂是至少100片。
52.如权利要求50所述的药物批料组合物，其中所述一系列片剂是介于100-1,000,000片之间。
53.如权利要求50-52中任一项所述的药物批料组合物，其中所述一系列片剂是一系列包衣片剂。
54.如权利要求47-53中任一项所述的药物批料组合物，其中所述至少一种片剂、所述至少一种包衣片剂、所述一系列片剂中的每一者或所述一系列包衣片剂中的每一者包含在介于10-500mg之间的范围内的具有以下核酸序列的所述寡核苷酸：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
55.如权利要求47-54中任一项所述的药物批料组合物，其中所述至少一种片剂、所述至少一种包衣片剂、所述一系列片剂中的每一者或所述一系列包衣片剂中的每一者包含约40mg或160mg的具有以下核酸序列的所述寡核苷酸：
SEQ ID NO:3：(5'-GTX GCC CCT TCT CCC XGC AGC-3')，
其中X表示5-甲基-2'-脱氧胞苷。
CN201880062621.9A 2017-07-28 2018-07-26 制备寡核苷酸化合物的方法 Pending CN111148519A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762538504P 2017-07-28 2017-07-28
US62/538,504 2017-07-28
PCT/US2018/043867 WO2019023439A1 (en) 2017-07-28 2018-07-26 PROCESS FOR THE PREPARATION OF OLIGONUCLEOTIDE COMPOUNDS

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111148519A true CN111148519A (zh) 2020-05-12

Family

ID=65041406

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880062621.9A Pending CN111148519A (zh) 2017-07-28 2018-07-26 制备寡核苷酸化合物的方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20200392491A1 (zh)
EP (1) EP3658155A4 (zh)
JP (1) JP2020528910A (zh)
KR (1) KR20200042902A (zh)
CN (1) CN111148519A (zh)
WO (1) WO2019023439A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110468171A (zh) * 2019-09-20 2019-11-19 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 核酸的合成方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017147276A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Celgene Corporation Methods of treating intestinal fibrosis using smad7 inhibition
CN113474633A (zh) 2019-02-26 2021-10-01 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 寡核苷酸配制方法
JP7311642B2 (ja) * 2019-07-09 2023-07-19 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー オリゴヌクレオチドを脱保護するための方法
JP2023515485A (ja) * 2020-02-21 2023-04-13 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッド 限外濾過／透析濾過を用いたオリゴヌクレオチド組成物の調製方法
WO2024138152A1 (en) * 2022-12-23 2024-06-27 Asahi Kasei Bioprocess America, Inc. System for performing cleavage, deprotection, ultrafiltration, and diafiltration operations

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007050789A2 (en) * 2005-10-25 2007-05-03 Nëdken Corporation Glycosyl-oligonucleotide conjugates and methods
WO2014120861A2 (en) * 2013-01-31 2014-08-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Method of preparing oligomeric compounds using modified coupling protocols
WO2017055611A2 (en) * 2015-09-30 2017-04-06 Nogra Pharma Limited Methods of using smad7 antisense oligonucleotides based on biomarker expression
CN106573065A (zh) * 2014-05-09 2017-04-19 诺格尔制药有限公司 用于治疗炎症性肠病的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3207135A2 (en) * 2014-10-17 2017-08-23 Celgene Alpine Investment Company II, LLC Isotopologues of smad7 antisense oligonucleotides

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007050789A2 (en) * 2005-10-25 2007-05-03 Nëdken Corporation Glycosyl-oligonucleotide conjugates and methods
WO2014120861A2 (en) * 2013-01-31 2014-08-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Method of preparing oligomeric compounds using modified coupling protocols
CN106573065A (zh) * 2014-05-09 2017-04-19 诺格尔制药有限公司 用于治疗炎症性肠病的方法
WO2017055611A2 (en) * 2015-09-30 2017-04-06 Nogra Pharma Limited Methods of using smad7 antisense oligonucleotides based on biomarker expression

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110468171A (zh) * 2019-09-20 2019-11-19 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 核酸的合成方法
CN110468171B (zh) * 2019-09-20 2021-10-29 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 核酸的合成方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200042902A (ko) 2020-04-24
EP3658155A4 (en) 2021-06-30
EP3658155A1 (en) 2020-06-03
WO2019023439A1 (en) 2019-01-31
JP2020528910A (ja) 2020-10-01
US20200392491A1 (en) 2020-12-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111148519A (zh) 制备寡核苷酸化合物的方法
US20180162897A1 (en) Tricyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
TW201639962A (zh) Ｒｎａ干擾劑
EA008741B1 (ru) Аналоги олигонуклеотидов с-класса с улучшенной иммуностимулирующей эффективностью
CN1118140A (zh) 为提高在酸性pH的稳定性而改性的低聚核苷酸
US9249178B2 (en) Tricyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
WO2015011694A2 (en) Isotopologues of smad7 antisense oligonucleotides
EP3286203B1 (en) Methods of polynucleotide preparation using multivalent cation salt compositions
US11939581B2 (en) Methods and compositions for targeting PD-L1
US20210269797A1 (en) Methods and compositions for targeting pd-l1
JPH07501314A (ja) ３′−末端封鎖されたオリゴヌクレオチド
CN111321159B (zh) 用于免疫调节的嵌合核酸分子及其应用
US20230151363A1 (en) Modified short-interfering rna compositions and their use in the treatment of cancer
KR20240082367A (ko) 치료학적 물질로서 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드
CN118202053A (zh) 一种调节补体C3表达的siRNA、其缀合物和药物组合物及用途
TW202019944A (zh) 含有三硫代磷酸酯核苷間連接之寡核苷酸
JPH0834737A (ja) 新規抗ｈｉｖ剤

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20200810

Address after: Ai Erlandubailin

Applicant after: Nogra Pharma Ltd.

Address before: New jersey, USA

Applicant before: CELGENE Corp.

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20200512