CN111139217A - 一种基于临床应用的表皮黑素细胞分离培养及冻存方法和黑素细胞的冻存液 - Google Patents
一种基于临床应用的表皮黑素细胞分离培养及冻存方法和黑素细胞的冻存液 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111139217A CN111139217A CN202010062560.5A CN202010062560A CN111139217A CN 111139217 A CN111139217 A CN 111139217A CN 202010062560 A CN202010062560 A CN 202010062560A CN 111139217 A CN111139217 A CN 111139217A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- melanocyte
- melanocytes
- cryopreservation
- culture medium
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 138
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title abstract description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 44
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 32
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims abstract description 21
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 25
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 21
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 13
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 12
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 10
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 9
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 6
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 230000007774 longterm Effects 0.000 claims description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 5
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 4
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims description 3
- 238000007664 blowing Methods 0.000 claims description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 3
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 claims description 3
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 claims description 3
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 claims description 3
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 claims description 2
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000010009 beating Methods 0.000 claims description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims description 2
- 238000010008 shearing Methods 0.000 claims description 2
- 238000009966 trimming Methods 0.000 claims description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 abstract description 18
- 230000008014 freezing Effects 0.000 abstract description 18
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 10
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 8
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 abstract description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 3
- 208000003367 Hypopigmentation Diseases 0.000 abstract description 2
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000003425 hypopigmentation Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 2
- 206010047642 Vitiligo Diseases 0.000 abstract 1
- 230000008099 melanin synthesis Effects 0.000 abstract 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 abstract 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 abstract 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 210000001787 dendrite Anatomy 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 2
- 239000000592 Artificial Cell Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229960004502 levodopa Drugs 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000003507 refrigerant Substances 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
- C12N5/0626—Melanocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种基于临床应用的表皮黑素细胞分离培养及冻存方法和黑素细胞的冻存液，包括黑素细胞从表皮的分离培养及冻存方法。本发明采用分散酶消化，所获得的黑素细胞具有良好的增殖能力、优良的黑色素表达能力。黑素细胞冻存液主要包括黑素细胞完全培养基、胎牛血清、二甲基亚砜，采用梯度冻存方法。该方法可用于培养增殖能力、迁移能力和黑素合成能力强的表皮黑素细胞，可以使患者的黑素细胞在体外更好的生长及分化，可用于临床白癜风或色素减退患者治疗及其相关研究。
Description
技术领域
本发明涉及细胞体外培养技术，具体是一种基于临床应用的表皮黑素细胞分离培养及冻存方法黑素细胞的冻存液。
背景技术
传统的白癜风治疗手段包括药物治疗、紫外线照射、外科手术治疗，目前自体黑素细胞移植成为白癜风治疗的研究和发展方向之一，但需要短时间内在体外大量扩增提高纯度的黑素细胞。为此，很多适合黑素细胞生长的培养基和纯化方法被报道，包括使用高浓度的胎牛血清培养基促进细胞生长。
冷冻保存在细胞的短期和长期保存中起着重要作用，对组织和细胞建库具有十分重要的意义。利用库存组织的基于细胞的治疗也越来越多地被用于再生医学的其他领域，借助冷冻保存技术，种子细胞可通过细胞库而及时提供，对临床研究及应用意义重大。冷冻保存降低了研发周期及成本，使得需要的种子细胞在严密监控的条件下进行生产和保存，且复苏后不影响其性能。
通常在冻存后由于冻存液的配方及冻存方法不合适，黑素细胞的活性及增值能力大大降低，严重影响其色素修复效果。细胞冻存除了报道添加冷冻剂外，也有文献增加细胞载体，一方面要考虑细胞载体厚度超过150um，有足够的机械稳定性使得在解冻后可控地将构建体转移进入机体中。另一方面要求细胞在合成的细胞载体中不发生整合，或仅在有限的程度上可能发生。
发明内容
本发明的第一个目的在于克服现有技术中存在的上述不足，提供一种基于临床应用的表皮黑素细胞分离培养及冻存方法。为实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种黑素细胞的分离培养及冻存方法，其特征在于黑素细胞的分离培养包括以下步骤：
1).用PBS清洗表皮组织，医用酒精浸泡，PBS中含有或不含有双抗；
2).酒精浸泡好的表皮组织转入装有PBS的培养皿中，清洗数次后剪去皮下组织；
3).将处理好的皮肤组织用PBS清洗后，用消化酶消化，将皮肤组织修剪成一定大小的组织块；
4).分离的表皮用PBS清洗后剪碎，加入胰蛋白酶消化；
5).在步骤4)消化后的组织中加入培养基，吹打获得细胞悬液，过滤，PBS清洗，离心，黑素细胞培养基为黑素细胞基础培养基加生长因子；
6).适量黑素细胞培养基重悬细胞后，置于生化培养箱继续培养；
7).黑素细胞贴壁至50-80％融合时，用胰蛋白酶消化提纯黑素细胞；
8).适量黑素细胞培养基重悬黑素细胞后离心，PBS清洗后再次离心。
9).黑素细胞培养基重悬黑素细胞后接种到培养瓶中；
黑素细胞的冻存液配方中包含二甲基亚砜(DMSO)，包含或不包含黑素细胞培养基，包含或不包含胎牛血清；
黑素细胞的冻存包括以下步骤：
10).待黑素细胞贴壁生长至80％-90％，PBS清洗后胰蛋白酶消化；
11).将收集的黑素细胞进行离心，PBS重悬清洗后再次离心收集黑素细胞；
12).将收集的黑素细胞用配制好的冻存液重悬后转移到冻存管中；
13).按照梯度冻存方法冻存黑素细胞。
步骤1)中，双抗含量优选0％-5％，酒精浸泡时间优选10-200s；步骤3)中，将皮肤组织修剪成宽为0.5-10mm的组织块，消化酶优选中性蛋白酶，消化条件优选4℃，消化时间优选8-18h；步骤4)中，消化条件优选37℃，消化时间优选40-60min；步骤5)中，优选100-200目不锈钢网筛进行过滤，离心条件优选1000-2000rmp，离心时间优选3-10min；步骤6)中，培养条件为37℃、5％CO2、饱和湿度，每24-48h换液一次；步骤7)中，采用梯度消化法提纯黑素细胞，消化条件优选10-30℃，消化时间优选2-3min；步骤8)中，离心条件优选1000-2000rmp，离心时间优选3-10min；步骤9)中，细胞接种密度优选1×103-1×105个/cm2；步骤10)中，消化条件优选10-30℃，消化时间优选2-3min；步骤10)中，离心条件优选1000-2000rmp，离心时间优选3-10min。
步骤5)中，生长因子可为自主研发的，也可以为商用的生长因子，如Gibcao的HMGS-2，黑素细胞基础培养基可为自主研发的黑素细胞培养基，也可为商用培养基，如GibcaoM254。
步骤13)中的梯度冻存方法优选4℃→-20℃→-80℃→液氮的方式，其中细胞在不同温度下的优选放置时间分别为20-40min、40-70min、10-20h、长期，梯度冻存的方式可使用程序降温的细胞冻存盒，也可以利用冰箱人工操作。
本发明的另一个目的是，提供一种黑素细胞的冻存液，使得黑素细胞在冷冻复苏后，仍然能够保持良好的活性和增值能力。为此，本发明采用以下技术方案：
黑素细胞的冻存液，其特征在于包含二甲基亚砜(DMSO)，包含或不包含黑素细胞培养基，包含或不包含胎牛血清。
进一步地，黑素细胞培养基﹕DMSO﹕胎牛血清的比例优选0～92﹕7～10﹕0～93。
进一步地，黑素细胞培养基﹕DMSO﹕胎牛血清的比例最优选比例是0﹕8﹕92。
本发明具有的有益效果是：通过本发明分离培养及冻存获得的黑素细胞具有以下显著优点：
此方法操作简单，黑素细胞纯度较高，无角质细胞和成纤维细胞污染(如图2)，可操作性强；黑素细胞传代后获得的黑素细胞存活率较高，具有良好的增殖能力、优良的黑色素表达能力(如图3)；应用本发明提供的冻存配方成分简单，无需添加冷冻剂等物质，梯度冻存的方式灵活，可根据自身条件自行选择，解决了黑素细胞不易冻存的难点，且该冻存配方复苏后细胞存活率较高，生长状态、增殖能力、黑色素表达能力较好(如图4)，冻存配方的发明降低了研发周期及成本，对临床白癜风或色素减退患者的治疗及其相关研究意义重大。
附图说明
图1为实施例1的黑素细胞(含少量角质细胞)显微镜观察图；
图2为实施例1的黑素细胞(纯化后)显微镜观察图；
图3为实施例1的黑素细胞左旋多巴安染色后显微镜观察图；
图4为实施例4的黑素细胞冻存复苏后显微镜观察图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：一种黑素细胞的分离培养方法
用含1％双抗的PBS清洗表皮组织，75％医用酒精浸泡100s，转入含1％双抗的PBS培养皿中，清洗数次后剪去皮下组织(脂肪，微血管等)，再次用PBS清洗后，剪成1mm宽的组织块，分散酶中消化，4℃消化16h。用眼科镊将表皮和真皮分离，表皮用PBS清洗后剪碎，加入胰蛋白酶，37℃消化60min。在消化后的组织中加入适量黑素细胞培养基(Gibco M254+1％HMGS-2)，吹打获得细胞悬液，200目不锈钢网筛过滤，1000rmp离心5min，PBS重悬清洗后再次1000rmp离心5min。适量黑素细胞培养基重悬离心所得的细胞继续培养，置于生化培养箱37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养，24h后换一次液，之后每48h换液一次；
黑素细胞贴壁至50-80％融合时，用胰蛋白酶消化提纯黑素细胞，消化条件25℃，消化时间2-3min。适量黑素细胞培养基加入培养瓶中，收集黑素细胞后1000rmp离心5min，PBS重悬清洗后再次1000rmp离心5min。黑素细胞培养基重悬黑素细胞后接种到培养瓶中，细胞接种密度优选1×104个/cm2。
结果分析：按照上述方法1-6步操作，获得的原代黑素细胞细长，每个细胞有2-5个树突，但含有少量角质细胞(如图1)，随后经方法7-9步提纯后，可获得纯度较高的黑素细胞，且黑素细胞存活率较高，具有良好的增殖能力、优良的黑色素表达能力(如图2)。经左旋多巴安染色后，黑素细胞胞浆及树突被染成黑灰色呈阳性(如图3)，经支原体试剂盒检验后，结果为阴性，说明此方法提取的黑素细胞无支原体污染。
实施例2：黑素细胞的冻存方法
1).配制黑素细胞的冻存液配方：1mL冻存液＝900μl黑素细胞完全培养基(GibcoM254+1％HMGS-2)+100μl二甲基亚砜(DMSO)；
2).黑素细胞的梯度冻存方法：
待黑素细胞贴壁生长至80％-90％，PBS清洗后胰蛋白酶消化，25℃消化2-3min。适量黑素细胞培养基加入培养瓶中，收集黑素细胞后1000rmp离心5min，PBS重悬清洗后再次1000rmp离心5min。将收集的黑素细胞用配制好的冻存液重悬后转移到冻存管中。按照梯度冻存方法冻存黑素细胞，即4℃30min→-20℃1h→-80℃过夜→液氮长期保存；
实施例3：黑素细胞的冻存方法
1).配制黑素细胞的冻存液配方：1mL冻存液＝80μl二甲基亚砜(DMSO)+920μl胎牛血清；
2).黑素细胞的梯度冻存方法：
待黑素细胞贴壁生长至80％-90％，PBS清洗后胰蛋白酶消化，25℃消化2-3min。适量黑素细胞培养基加入培养瓶中，收集黑素细胞后1000rmp离心5min，PBS重悬清洗后再次1000rmp离心5min。将收集的黑素细胞用步骤1)中配制好的冻存液重悬后转移到冻存管中。按照梯度冻存方法冻存黑素细胞，即4℃30min→-20℃1h→-80℃过夜→液氮长期保存；
实施例4：黑素细胞的冻存方法
1).配制黑素细胞的冻存液配方：1mL冻存液＝100μl二甲基亚砜(DMSO)+900μl胎牛血清；
2).黑素细胞的梯度冻存方法：
待黑素细胞贴壁生长至80％-90％，PBS清洗后胰蛋白酶消化，25℃消化2-3min。适量黑素细胞培养基加入培养瓶中，收集黑素细胞后1000rmp离心5min，PBS重悬清洗后再次1000rmp离心5min。将收集的黑素细胞用步骤1)中配制好的冻存液重悬后转移到冻存管中。按照梯度冻存方法冻存黑素细胞，即4℃30min→-20℃50min→-80℃过夜→液氮长期保存；
结果分析：按照实例2，3，4冻存的黑素细胞冻存后进行复苏，经观察发现，复苏后的黑素细胞存活率均较高，黑素细胞生长状态较好(如图4)，且黑素细胞的增殖能力、黑色素的表达能力与原代细胞无明显区别。其中实例3中冻存液配方为最优配方，即冻存液＝8％二甲基亚砜(DMSO)+92％胎牛血清。
以上所述仅是本发明的部分实施方式，本发明的保护范围不仅仅局限于上述实施例，并不代表本发明构思下的全部技术方案。应当指出，对于本领域技术人员来说，凡在本专利构思及具体实施案例启发下，在不脱离本发明原理前提下的若干增加及改动，也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种黑素细胞的分离培养及冻存方法，其特征在于黑素细胞的分离培养包括以下步骤：
1).用PBS清洗表皮组织，医用酒精浸泡，PBS中含有或不含有双抗；
2).酒精浸泡好的表皮组织转入装有PBS的培养皿中，清洗数次后剪去皮下组织；
3).将处理好的皮肤组织用PBS清洗后，用消化酶消化，将皮肤组织修剪成一定大小的组织块；
4).分离的表皮用PBS清洗后剪碎，加入胰蛋白酶消化；
5).在步骤4)消化后的组织中加入培养基，吹打获得细胞悬液，过滤，PBS清洗，离心，黑素细胞培养基为黑素细胞基础培养基加生长因子；
6).适量黑素细胞培养基重悬细胞后，置于生化培养箱继续培养；
7).黑素细胞贴壁至50-80％融合时，用胰蛋白酶消化提纯黑素细胞；
8).适量黑素细胞培养基重悬黑素细胞后离心，PBS清洗后再次离心；
9).黑素细胞培养基重悬黑素细胞后接种到培养瓶中；
黑素细胞的冻存液配方中包含二甲基亚砜(DMSO)，包含或不包含黑素细胞培养基，包含或不包含胎牛血清；
黑素细胞的冻存包括以下步骤：
10).待黑素细胞贴壁生长至80％-90％，PBS清洗后胰蛋白酶消化；
11).将收集的黑素细胞进行离心，PBS重悬清洗后再次离心收集黑素细胞；
12).将收集的黑素细胞用配制好的冻存液重悬后转移到冻存管中；
13).按照梯度冻存方法冻存黑素细胞。
2.如权利要求1所述的一种黑素细胞的分离培养及冻存方法，其特征在于步骤1)中，双抗含量优选0％-5％，酒精浸泡时间优选10-200s；步骤3)中，将皮肤组织修剪成宽为0.5-10mm的组织块，消化酶优选中性蛋白酶，消化条件优选4℃，消化时间优选8-18h；步骤4)中，消化条件优选37℃，消化时间优选40-60min；步骤5)中，优选100-200目不锈钢网筛进行过滤，离心条件优选1000-2000rmp，离心时间优选3-10min；步骤6)中，培养条件为37℃、5％CO2、饱和湿度，每24-48h换液一次；步骤7)中，采用梯度消化法提纯黑素细胞，消化条件优选10-30℃，消化时间优选2-3min；步骤8)中，离心条件优选1000-2000rmp，离心时间优选3-10min；步骤9)中，细胞接种密度优选1×103-1×105个/cm2；步骤10)中，消化条件优选10-30℃，消化时间优选2-3min；步骤10)中，离心条件优选1000-2000rmp，离心时间优选3-10min。
3.如权利要求1所述的一种黑素细胞的分离培养及冻存方法，其特征在于黑素细胞培养基﹕DMSO﹕胎牛血清的比例优选0～92﹕7～10﹕0～93，最优选比例：0﹕8﹕92。
4.如权利要求1所述的一种黑素细胞的分离培养及冻存方法，其特征在于步骤13)中的梯度冻存方法优选4℃→-20℃→-80℃→液氮的方式，其中细胞在不同温度下的优选放置时间分别为20-40min、40-70min、10-20h、长期，梯度冻存的方式可使用程序降温的细胞冻存盒，也可以利用冰箱人工操作。
5.黑素细胞的冻存液，其特征在于包含二甲基亚砜(DMSO)，包含或不包含黑素细胞培养基，包含或不包含胎牛血清。
6.如权利要求5所述的黑素细胞的冻存液，其特征在于黑素细胞培养基﹕DMSO﹕胎牛血清的比例优选0～92﹕7～10﹕0～93。
7.如权利要求6所述的黑素细胞的冻存液，其特征在于黑素细胞培养基﹕DMSO﹕胎牛血清的比例最优选比例是0﹕8﹕92。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010062560.5A CN111139217A (zh) | 2020-01-20 | 2020-01-20 | 一种基于临床应用的表皮黑素细胞分离培养及冻存方法和黑素细胞的冻存液 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010062560.5A CN111139217A (zh) | 2020-01-20 | 2020-01-20 | 一种基于临床应用的表皮黑素细胞分离培养及冻存方法和黑素细胞的冻存液 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111139217A true CN111139217A (zh) | 2020-05-12 |
Family
ID=70526800
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010062560.5A Pending CN111139217A (zh) | 2020-01-20 | 2020-01-20 | 一种基于临床应用的表皮黑素细胞分离培养及冻存方法和黑素细胞的冻存液 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111139217A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103891709A (zh) * | 2012-12-24 | 2014-07-02 | 深圳先进技术研究院 | 细胞冻存液及细胞冻存方法 |
| CN107663512A (zh) * | 2016-07-29 | 2018-02-06 | 长沙华山白癜风医院有限公司 | 白癜风自体表皮黑色素移植细胞水分成活方法 |
| CN110447637A (zh) * | 2019-08-26 | 2019-11-15 | 广东博溪生物科技有限公司 | 黑素细胞冻存液 |
-
2020
- 2020-01-20 CN CN202010062560.5A patent/CN111139217A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103891709A (zh) * | 2012-12-24 | 2014-07-02 | 深圳先进技术研究院 | 细胞冻存液及细胞冻存方法 |
| CN107663512A (zh) * | 2016-07-29 | 2018-02-06 | 长沙华山白癜风医院有限公司 | 白癜风自体表皮黑色素移植细胞水分成活方法 |
| CN110447637A (zh) * | 2019-08-26 | 2019-11-15 | 广东博溪生物科技有限公司 | 黑素细胞冻存液 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 李燕, 世界图书出版西安有限公司 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106754674B (zh) | 从人胎盘羊膜制备羊膜间充质干细胞的方法及其应用 | |
| US7939323B2 (en) | Method of isolating cells from umbilical cord | |
| US5656478A (en) | Smooth muscle tissue formation in vivo using cultured smooth muscle cells combined with an extracellular matrix | |
| WO2019161591A1 (zh) | 间充质干细胞的分离培养方法及冻存、复苏方法 | |
| US20070238175A1 (en) | Standardization of processes for culturing primary cells | |
| CN103275922B (zh) | 一种细毛羊毛囊干细胞分离培养方法 | |
| CN106359368A (zh) | 细胞冻存液及冻存方法 | |
| CN101757691A (zh) | 一种组织工程角膜的制备方法 | |
| WO2022217878A1 (zh) | 一种壁蜕膜间充质干细胞的制备方法、复苏方法 | |
| CN109699634A (zh) | 一种间充质干细胞的超低温冻存与复苏方法 | |
| CN113430163A (zh) | 一种培养间充质干细胞提取外泌体的方法、外泌体冻干剂及制备方法 | |
| US20200149005A1 (en) | The method of autologous primary hair follicles preparation in 3d culture | |
| CN110218695A (zh) | 一种人羊膜上皮细胞的提取制备方法 | |
| CN113041207A (zh) | 一种人间充质干细胞培养上清液冻干粉的制备及复苏方法 | |
| CN115418341B (zh) | 成纤维细胞向毛乳头细胞转分化的方法及其应用 | |
| CN104789522A (zh) | 一种人毛囊干细胞库的构建方法 | |
| CN111139217A (zh) | 一种基于临床应用的表皮黑素细胞分离培养及冻存方法和黑素细胞的冻存液 | |
| CN105695401B (zh) | 一种脐带动脉和静脉血管周干细胞的制备和保存方法 | |
| CN108812642B (zh) | 一种依结构层次制备胎盘组织及冻存的系统方法和应用 | |
| CN111518743A (zh) | 一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法及其应用 | |
| JPH11180878A (ja) | 発毛誘導剤および発毛方法 | |
| CN111662864A (zh) | 一种体外诱导脐带间充质干细胞分化为真皮干细胞的方法 | |
| CN115161269A (zh) | 一种乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法 | |
| CN109771697A (zh) | 一种真皮成纤维细胞皮片及其构建方法和应用 | |
| RU2695364C1 (ru) | Способ лечения нерубцовой алопеции |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20200512 |