CN111135287B - 一种多肽在治疗骨髓增生异常综合症中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多肽在治疗骨髓增生异常综合症中的应用，属于生物医药技术领域。本发明筛选得到了能够有效抑制转录因子TWIST1及DNMT3a结合的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该多肽与其他激酶抑制剂类药物相比，还可增强细胞对地西他滨的敏感性，经动物实验证实，该多肽与地西他滨联用可以有效抑制血液肿瘤的生长，抑制率可达80％，并提高小鼠的生存率，由25％提高至75％。

Description

一种多肽在治疗骨髓增生异常综合症中的应用

技术领域

本发明涉及一种多肽在治疗骨髓增生异常综合症中的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic Syndrome，MDS)是由全能干细胞水平上的恶性变化导致的分化障碍的一组克隆性、异质性造血干细胞病，其特点为无效造血、外周血细胞减少和骨髓造血细胞的形态学变异。在早期/低危MDS患者中，骨髓细胞具备凋亡的能力，存在较低水平的恶性增殖倾向。随着MDS的进一步发展，凋亡现象随之平行下降，克隆细胞获得增强的恶性增殖能力，并加速向急性骨髓性白血病(Acute myeloid leukemia，AML)转化。MDS的病理生理学特征为：可能发生基因突变的细胞遗传学改变和在晚期阶段广泛的基因超甲基化。研究表明MDS中基因的表达受到了DNA甲基化(DNA methylation)的抑制，同时伴随着高水平表达的DNA甲基转移DNMT(DNA(Cytosine-5-)-Methyltransferase)，包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b，其中DNMT3b的表达增强程度低于DNMT1和DNMT3a。DNA甲基化为DNA化学修饰的一种形式，也是表观遗传编码(epigenetic code)的一部分。DNA甲基化过程会使甲基添加到DNA分子中胞嘧啶环的5'碳上，在不改变DNA序列的前提下改变遗传表现。DNA甲基化状态的改变是引发肿瘤的一个重要因素,这种变化包括基因组整体甲基化水平降低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高,从而导致基因组的不稳定(如染色体的不稳定、可移动遗传因子的激活、原癌基因的表达)和抑癌基因的不表达等。

骨髓移植是目前唯一能够治愈MDS的方法，能使无病生存期延长35-50％。但其成功率低，许多患者并发症和功能受损导致治疗效果不佳，且毒副作用使其在老年MDS患者中使用受限。密集化疗主要使用蒽环霉素和阿糖胞苷的联用，但在高风险骨髓增生异常综合症中密集化疗有受限制的迹象。与上述传统的治疗方法相比，去甲基化疗法相对有效且风险低，为有效治疗MDS提供了新的思路。去甲基化药物治疗是指用药物抑制启动子区域的甲基化，激活沉默的抑癌基因，达到治疗肿瘤的目的。临床上常使用DNA甲基转移酶抑制剂(DNA methyltransferase inhibitors，DMNTI)达到去甲基的疗效，这类药物能有效延长MDS患者的生存期。现阶段运用较为广泛的药物是5-氮杂胞苷(Azacitidine，AZA)和地西他滨(Decitabine,5-Aza-2′-deoxycytidine)(分别于2004和2006在美国批准上市，中国也于2009年批准免临床试验)。虽然DNA甲基化已经被认为在MDS发病机理中处于关键的地位，而且5-阿扎胞苷和地西他滨在临床上使用也颇有疗效，但是依然存在部分患者去甲基化治疗后，病情无法得到缓解或二次复发。

发明内容

针对现有技术中存在的细胞对地西他滨等药物耐药的问题，本发明设计了一段多肽，该多肽可以有效抑制转录因子TWIST1及DNMT3a的结合，增强细胞对地西他滨的敏感性，并且在NSG免疫缺陷鼠异源移植中证实该多肽与地西他滨联用可以有效抑制血液肿瘤的生长，提高小鼠的生存率。

本发明的第一个目的是提供一种多肽在制备预防或治疗骨髓增生异常综合症和/或急性髓系白血病的药物或药物组合物方面的应用；所述多肽含有如SEQ ID NO.1或SEQID NO.3所示的氨基酸序列。

在一种实施方式中，所述多肽的氨基酸序列如LRKIIPTLPSDKLSKIQTLKLAA所示。

在一种实施方式中，所述应用还包括增强细胞对药物敏感性，或减弱细胞的耐药性。

在一种实施方式中，所述应用是增强细胞对去甲基化类药物的敏感性。

在一种实施方式中，所述去甲基化类药物包括但不限于地西他滨(Decitabine，5-阿扎-2-脱氧胞苷)、5-氮杂胞苷(Azacitidine，5-阿扎胞苷)。

在一种实施方式中，所述细胞包括但不限于人骨髓增生异常综合征(MDS)细胞。

本发明的第二个目的是提供一种药物组合物，含有地西他滨和氨基酸序列如SEQID NO.1或SEQ ID NO.3所示的多肽。

在一种实施方式中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述多肽与地西他滨的质量比为1:0.05～0.15。

在一种实施方式中，所述多肽与地西他滨的有效剂量分别为10mg/kg与0.8mg/kg。

在一种实施方式中，所述药物组合物还含有药物上可接受的载体。

在一种实施方式中，所述药物组合物为液体注射剂或冻干注射剂。

在一种实施方式中，所述冻干注射剂还含有右旋糖酐、聚乙二醇1000、聚乙二醇1500、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000或聚乙二醇6000。

有益效果：本发明筛选得到了能够有效抑制转录因子TWIST1及DNMT3a结合的多肽，该多肽与其他激酶抑制剂类药物相比，还可增强细胞对地西他滨的敏感性，经动物实验证实，该多肽与地西他滨联用可以有效抑制血液肿瘤的生长，抑制率可达80％，并提高小鼠的生存率，由25％提高至75％。

附图说明

图1为多肽阵列芯片显色点定量分析(A)；ELISA实验验证TWIST1与DNMT3a的结合位点(B)；ELISA实验验证多肽抑制TWIST1与DNMT3a的结合能力(C)；蛋白印迹实验验证多肽抑制TWIST1与DNMT3a的结合能力(D)；其中，KG1a-TWIST+53-57多肽为KG1a-TWIST1细胞用53-57多肽处理48h；KG1a-TWIST+66-70号多肽为KG1a-TWIST1细胞用66-70号多肽处理48h。

图2为多肽与地西他滨共同处理对MDS细胞增殖的影响。

图3为NSG小鼠异源移植模型示意图(A)；地西他滨或地西他滨与多肽未处理小鼠外周血中KG1a-TWIST1细胞含量的检测(B)；地西他滨或地西他滨与多肽处理3次后小鼠外周血中KG1a-TWIST1细胞含量的检测(C)；小鼠生存期分析(D)。

具体实施方式

实施例1多肽阵列芯片检测TWIST1和DNMT3a的结合位点

在NCBI上检索得到TWIST1蛋白序列，TWIST1蛋白共含有202个氨基酸，以15个氨基酸为一个单位合成一条多肽，下一条多肽向后两个氨基酸，与上一条多肽重叠13个氨基酸，以此类推，共将TWIST1分为95条多肽(1～95)，多肽序列如表1所示。

表1多肽阵列芯片信息

将这些多肽固定在PVDF膜上，之后将2mL，1mg/mL纯化的His-DNMT3a蛋白与PVDF膜室温孵育1h；用1×TBST缓冲液(50mL 1M，pH 7.5的Tris-HCL，8g NaCl，0.2g KCl，0.5mL吐温，蒸馏水定容至1L)洗涤PVDF膜3次，每次5min，以体积比1：1000的比例加入His抗体，室温孵育2h；用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次5min，以体积比1：5000的比例加入偶联HRP的二抗，室温孵育1h；用1×TBST缓冲液洗涤PVDF膜4次，每次5min，用Pro-Light HRP化学发光检测试剂(A液与B液1:1混合)淋在目的条带上，在Bio-Rad ChemiDocTM XRS+成像系统中显色，显色结果经ImageJ量化后，如图1(A)所示，发现4个连续显色区域19-23，53-57，60-64，66-70，说明这些多肽可以与His-DNMT3a结合。

实施例2 ELISA检测上述多肽在体外影响TWIST1和DNMT3a结合的能力

本发明合成了77-81，19-23，53-57，60-64，66-70号多肽所覆盖的多肽链，氨基酸序列分别为ARYIDFLYQVLQSDELDSKMASC(SEQ ID NO.5)，RKRRSSRRSAGGGAGPGGAAGGG(SEQ IDNO.2)，ELQTQRVMANVRERQRTQSLNEA(SEQ ID NO.3)，QRTQSLNEAFAALRKIIPTLPSD(SEQ IDNO.4)，LRKIIPTLPSDKLSKIQTLKLAA(SEQ ID NO.1)，以显色较弱的区段77-81号多肽作为阴性对照，将100μL，1mg/mL的多肽加入联排孔板中4℃孵育过夜后，吸弃孔板中的溶液，并用1×PBST缓冲液洗涤孔板3次，每次5min；加入100μL，1mg/mL纯化的His-DNMT3a蛋白，4℃孵育8h后，并用1×TBST缓冲液洗涤孔板3次，每次5min；以体积比1：500的比例加入偶联HRP的二抗，室温孵育1h后，并用1×TBST缓冲液洗涤孔板3次，每次5min；用Pro-Light HRP化学发光检测试剂(A液与B液1:1混合)淋在目的条带上，在Bio-Rad ChemiDocTM XRS+成像系统中显色，显色结果经ImageJ量化后，结果如图1(B)所示，与阴性对照相比，53-57，60-64，66-70号多肽与DNMT3a的能力显著增强，增强强度分别为41％，26％和49％，而19-23号多肽与DNMT3a的结合能力与阴性对照没有显著差异。之后我们又通过ELISA检测53-57，60-64，66-70三条多肽抑制TWIST1和DNMT3a结合的能力，具体步骤为：首先将DNMT3a固定在孔板上，并在孔板中分别加入53-57，60-64，66-70号多肽至终浓度1mg/mL孵育1h，每孔加入纯化得到的TWIST1蛋白至终浓度1mg/mL孵育1h后，如图1(C)所示，53-57，60-64，66-70号多肽中，只有53-57、66-70号多肽可以竞争性抑制TWIST1和DNMT3a的结合，竞争性抑制率分别为21％和26％。综上所述，53-57、66-70号多肽上存在TWIST1和DNMT3a相互作用的结合位点。通过免疫共沉淀的方法检测53-57、66-70号多肽在细胞内抑制TWIST1和DNMT3a的结合能力，用终浓度1mg/mL的53-57、66-70号多肽分别处理细胞48h，收集细胞，并通过细胞裂解液(RIPA+1％蛋白酶抑制剂)提取细胞蛋白，取1mg蛋白液，并在蛋白液中以体积比1：100的比例加入TWIST1的抗体，4℃颠倒孵育12h后，加入20μL偶联琼脂糖凝珠的Protein A/G，4℃颠倒孵育4h，加入60μL的1×Loading buffer(50mM Tris-HCL(pH 6.8)，质量体积比为2％的SDS，质量体积比为0.1％的溴酚蓝，体积比为10％的甘油，体积比为1％的β-巯基乙醇)，沸水中加热10min，离心收集上清后，进行蛋白印迹检测，如图1(D)所示，两条多肽均可抑制TWIST1与DNMT3a的结合，66-70号多肽抑制TWIST1和DNMT3a结合的能力最强。

实施例3多肽在增强MDS细胞对地西他滨敏感性方面的应用

将1×10⁵的KG1a及KG1a-TWIST1细胞接种至六孔板中，分别用终浓度为100μg/mL的53-57、66-70号多肽处理细胞24h后，用20ng/mL的地西他滨继续处理细胞96h，加入EdU至终浓度为50mM，处理细胞12h，1000g离心收集细胞，用4％的多聚甲醛室温避光固定15min，PBS洗涤细胞3次，用体积浓度为0.2％的Triton室温避光通透15min，PBS洗涤细胞3次后，加入细胞增殖染色工作液(PBS 438μL,CuSO4 10μL，Andy Fluor 647azide 2.5μL，1×iClickE的U缓冲液50μL)室温避光孵育15min后，用体积浓度为0.2％的Triton洗涤细胞1次，进行流式细胞术细胞增殖检测。实验结果如图2所示，加入66-70号多肽可以有效抑制KG1a和KG1a-TWIST1的增殖，抑制率分别为41％和18％。

实施例4

通过小鼠异源移植模型，检测66-70号多肽在体内对MDS恶性克隆细胞对地西他滨药物敏感性的影响。对NSG小鼠进行180cGy辐照处理，并在辐照12h后通过尾静脉注射的方式，将2×10⁶的KG1a-TWIST1细胞注射入小鼠体内，一周后，通过眼眶采集小鼠外周血，用裂解液充分裂解红细胞后，使用人源造血细胞标志物(hCD45)抗体对小鼠外周血中的KG1a-TWIST1进行标记，每个样品加入5μL抗体，室温避光孵育15min后，进行流式细胞术检测，如图3(B)所示，小鼠外周血中KG1a-TWIST1细胞的含量，检测发现KG1a-TWIST1细胞均可在小鼠体内增殖，并且所有小鼠外周血中KG1a-TWIST1的含量基本一致，约为20％。之后，随机将小鼠分为两组，一组注射地西他滨，剂量为0.8mg/kg，一组共同注射地西他滨与66-70多肽，地西他滨剂量为0.8mg/kg，66-70多肽剂量为10mg/kg，每周注射两次，注射三次后，采集小鼠外周血并检测其中KG1a-TWIST1的含量，如图3(C)所示，与只注射地西他滨组的小鼠相比，共同注射地西他滨与66-70多肽的小鼠的外周血中KG1a-TWIST1的含量显著降低，降低比率为80％，同时记录各组小鼠的生存情况并绘制生存曲线，图3(D)显示，地西他滨与66-70号多肽共同注射组的小鼠生存率显著高于只注射地西他滨组的小鼠，统计注射地西他滨或地西他滨与66-70多肽15天小鼠的生存率，发现只注射地西他滨组的小鼠生存率为25％，地西他滨与66-70多肽共同注射组的小鼠生存率可提高至75％。上述结果说明，66-70号多肽可以有效增强恶性克隆细胞对地西他滨的敏感性。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 西北大学

<120> 一种多肽在治疗骨髓增生异常综合症中的应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Leu Arg Lys Ile Ile Pro Thr Leu Pro Ser Asp Lys Leu Ser Lys Ile

1 5 10 15

Gln Thr Leu Lys Leu Ala Ala

20

<210> 2

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Arg Lys Arg Arg Ser Ser Arg Arg Ser Ala Gly Gly Gly Ala Gly Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ala Ala Gly Gly Gly

20

<210> 3

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Glu Leu Gln Thr Gln Arg Val Met Ala Asn Val Arg Glu Arg Gln Arg

1 5 10 15

Thr Gln Ser Leu Asn Glu Ala

20

<210> 4

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Gln Arg Thr Gln Ser Leu Asn Glu Ala Phe Ala Ala Leu Arg Lys Ile

1 5 10 15

Ile Pro Thr Leu Pro Ser Asp

20

<210> 5

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Ala Arg Tyr Ile Asp Phe Leu Tyr Gln Val Leu Gln Ser Asp Glu Leu

1 5 10 15

Asp Ser Lys Met Ala Ser Cys

20

Claims (10)

1.多肽和地西他滨在制备治疗骨髓增生异常综合症和/或急性髓系白血病的药物或药物组合物方面的应用，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用还包括增强细胞对药物敏感性，或减弱细胞的耐药性。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述对药物的敏感性是指对地西他滨或5-氮杂胞苷的敏感性。

4.一种药物组合物，其特征在于，含有地西他滨和多肽；所述多肽的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述地西他滨与多肽的质量比为（0.05~0.15）：1。

6.根据权利要求4或5所述的药物组合物，其特征在于，所述地西他滨替换为5-氮杂胞苷。

7.根据权利要求4或5所述的药物组合物，其特征在于，还含有药物上可接受的载体。

8.根据权利要求4或5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为液体注射剂或冻干注射剂。

9.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，还含有药物上可接受的载体。

10.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为液体注射剂或冻干注射剂。

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