CN111394461B

CN111394461B - 宫颈鳞癌的分子靶标及其在诊断和治疗中的应用

Info

Publication number: CN111394461B
Application number: CN202010259611.3A
Authority: CN
Inventors: 彭雪
Original assignee: West China Second University Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Second University Hospital of Sichuan University
Priority date: 2020-04-03
Filing date: 2020-04-03
Publication date: 2020-12-22
Anticipated expiration: 2040-04-03
Also published as: CN111394461A

Abstract

本发明公开了宫颈鳞癌的分子靶标及其在诊断和治疗中的应用，通过QPCR检测首次发现了RNF167在宫颈鳞癌患者中表达下调，且以RNF167作为变量具有较高的敏感性和特异性，说明RNF167可以作为分子标志物应用于宫颈鳞癌的诊断，通过过表达RNF167，发现宫颈癌细胞的增殖和侵袭能力受到明显的影响，说明RNF167可以作为分子靶标应用于宫颈鳞癌的治疗。

Description

宫颈鳞癌的分子靶标及其在诊断和治疗中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及宫颈鳞癌的分子靶标及其在诊断和治疗中的应用。

背景技术

宫颈癌(Cervical cancer,CC)是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤(Chen,W.,etal.,Cancer statistics in China,2015.CA Cancer J Clin,2016.66(2):p115-32.)，其发病率在妇科恶性肿瘤中居第2位，世界卫生组织(WHO)的数据表明，每年新增约53000例宫颈癌患者，且有高达25000例患者因宫颈癌而死亡(周琦.宫颈癌诊断与治疗指南(第四版).中国实用妇科与产科杂志，2018，34(6):613-622.)。西方发达国家由于宫颈癌筛查的普及，宫颈癌发病率已缓慢下降，而发展中国家的情况却不容忽视，其宫颈癌的发病率高占全球的80％，中国作为发展中国家的一员，在宫颈癌的筛查预防和治疗上虽然取得了不错的成就，但是近年来宫颈癌的发病率仍然居高不下，每年新增宫颈癌病例约14万，死亡约3.7万，且发病趋于年轻化。宫颈癌的发生与高危型HPV(人乳头状瘤病毒)感染密切相关(陈丽梅.宫颈癌筛查技术发展及最新筛查指南.上海医药，2018，39(1):3-7.)，约90％的宫颈癌的发生由HPV持续感染引起，近年来，随着HPV疫苗的推广，早期筛查诊断被提到了更重要的地位，虽然目前存在一些相关指南，但能够兼顾敏感性和特异性，操作简便，价格合适的理想的筛查方式仍需进一步研究和探索。当宫颈癌进一步发展到中晚期阶段时，手术切除癌变组织结合同步放化疗治疗的效果并不是很理想，转移和复发率仍较高。近年来随着分子生物学的大力发展，分子靶向治疗也逐渐成为妇科恶性肿瘤的研究热点，对晚期宫颈癌患者的分子治疗仍是临床工作的重点和难点，因此探索宫颈癌的分子标志物，为宫颈癌的治疗开辟新的路径具有十分重要的意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供与宫颈鳞癌相关的分子诊断标志物，通过检测或靶向该标志物，进而实现患者的个性化诊疗。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测RNF167水平的试剂在制备诊断宫颈鳞癌的产品中的应用。相比正常对照，若待检测样本中RNF167的水平显著下调，则表示该受试者患有宫颈鳞癌或者存在患宫颈鳞癌的风险。

进一步，所述产品包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术、蛋白免疫技术检测样本中RNF167水平的试剂。

进一步，所述试剂包括针对RNF167的探针、引物或抗体。

进一步，针对RNF167的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

本发明提供了一种诊断宫颈鳞癌的产品，所述产品包括检测样本中RNF167水平。

进一步，所述产品包括芯片、试剂盒或核酸膜条。

进一步，所述芯片包括基因芯片、蛋白芯片，所述基因芯片包括用于检测RNF167基因转录水平的针对RNF167基因的寡核苷酸探针，所述蛋白芯片包括RNF167蛋白的特异性结合剂；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测RNF167基因转录水平的试剂或芯片，所述蛋白检测试剂盒包括用于检测RNF167蛋白表达水平的试剂或芯片。

本发明提供了RNF167在制备治疗宫颈鳞癌的药物中的应用。

进一步，所述药物包括RNF167的促进剂。

进一步，所述促进剂促进RNF167的表达水平。

进一步，所述促进剂为含有RNF167的载体。

本发明提供了一种治疗宫颈鳞癌的药物，所述药物包括RNF167的促进剂。

进一步，所述药物包括RNF167的促进剂。

进一步，所述促进剂促进RNF167的表达水平。

进一步，所述促进剂为含有RNF167的载体。

本发明提供了一种筛选治疗宫颈鳞癌的候选药物的方法，所述方法包括：

用待筛选物质处理表达或含有RNF167基因或其编码的蛋白的培养体系；和检测所述体系中RNF167基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质促进RNF167基因的水平或表达活性时，该待筛选物质是治疗宫颈鳞癌的候选药物。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现RNF167在宫颈鳞癌中呈现显著性差异表达，通过检测RNF167的表达水平可以判断受试者是否患有宫颈鳞癌或者是否存在患宫颈鳞癌的风险，通过改变RNF167的表达水平可以改变宫颈鳞癌细胞的增殖，进而可以实现宫颈鳞癌的治疗。

附图说明

图1是RNF167基因在宫颈鳞癌组织中的表达情况图；

图2是以RNF167作为检测变量的ROC曲线图；

图3是转染后RNF167的表达情况图；

图4是RNF167对宫颈癌细胞增殖能力的影响图；

图5是RNF对宫颈癌细胞侵袭能力的影响图。

发明详述

本发明通过检测宫颈鳞癌患者和正常人中的差异表达的基因，寻找可用于表征宫颈鳞癌的标志物。本发明通过分析，首次发现了RNF167在宫颈鳞癌患者中呈现差异性表达，提示RNF167可作为检测指标应用于宫颈鳞癌的临床诊断以及作为分子靶标应用于宫颈鳞癌的临床治疗。

在本发明中，RNF167(gene ID：26001)包括人RNF167基因及其所编码的蛋白的野生型、突变型或其片段，其位于人17号染色体上。目前已经公开的RNF167存在20个转录本，一种代表性的RNF167的核酸序列如NM_001320356.2所示，相对应的氨基酸序列如NP_001307285.1所示。

本发明的实用性并不局限于对本发明的靶标基因的任何特定变体的基因表达进行定量。本领域技术人员知道，进行生物信息学分析时，通常会将测序序列和已知的基因进行比对，只要有关序列可以比对到相关基因上，就可以看做是该基因的表达，因此，在提及差异表达的基因时，该基因的不同的转录本、突变型或其片段也包含在本发明中。

本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因的表达水平。

本发明的RNF167使用本领域普通技术人员已知的多种核酸以及蛋白技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、蛋白免疫技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

核酸测序技术的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序。

核酸杂交技术的示例性非限制性实例包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

核酸扩增技术的示例性非限制性实施例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。

蛋白免疫技术包括夹心免疫测定，例如夹心ELISA，其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测；放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。可例如在微量滴定板或条的形式中实施免疫法。

芯片、试剂盒、核酸膜条

在本发明中芯片包括基因芯片、蛋白芯片；所述基因芯片包括固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于RNF167所示的部分或全部序列。所述蛋白芯片包括固相载体，以及固定在固相载体上的RNF167编码的蛋白的特异性结合剂。所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

特异性结合剂是例如蛋白质RNF167的受体、结合蛋白质RNF167的凝集素、针对蛋白质RNF167的抗体、针对蛋白质RNF167的肽抗体(peptidebody)、双特异性双重结合剂或双特异性抗体形式。

“抗体”在本文中以最广义使用，而且明确覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、自至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现期望的生物学活性。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2、和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及自抗体片段形成的多特异性抗体。

“双抗体”(diabody)指具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段在同一条多肽链(VH-VL)中包含相连接的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对并创建两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测RNF167基因或蛋白的表达水平，包含用于RNF167检测和/或定量的引物、寡核苷酸探针、配体、和/或芯片。选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对疾病发展进行判断、对治疗方案进行选择。

试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

在本发明中，核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的特异性识别RNF167的探针；所述基底可以是任何适于固定探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。

本发明中诊断宫颈鳞癌的产品可用于检测包括RNF167基因在内的多个基因(例如，与宫颈鳞癌相关的多个基因)的表达水平，将宫颈鳞癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高宫颈鳞癌诊断的准确率。

药物

本发明提供了一种治疗宫颈鳞癌的药物，所述药物包括RNF167的促进剂。所述的RNF167的促进剂是指任何可提高RNF167基因或表达产物稳定性、上调RNF167的表达、增加RNF167的有效作用时间或促进RNF167基因的转录或翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于上调RNF167基因的表达有用的物质，从而可用于预防或治疗宫颈鳞癌。

本发明的药物还包括药学上可接受的载体，所述载体可以是一种也可以是多种，所述载体包括但不限于稀释剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；粘合剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁等；填充剂如甘露醇(粒状或粉状)、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠等；崩解剂如交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖等。

所述的药物组合物可以使用不同的添加剂进行制备，例如稳定剂、抑菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂。

稳定剂包括人类血清蛋白、L-氨基酸、糖及纤维素衍生物。L-氨基酸还可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一个。糖类包括单糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等；糖醇，例如甘露醇、纤维醇、木糖醇等；二糖，例如蔗糖、麦芽糖、乳糖等；多聚糖，例如葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、透明质酸等及它们的衍生物。纤维素衍生物包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羟甲基纤维素钠。

表面活性剂包括离子或非离子表面活性剂，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖单酰基酯、脂肪酸甘油酯。

添加剂缓冲剂可以包括硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、谷氨酸及相应的盐(它们的碱金属或碱性稀土金属盐，例如钠盐、钾盐、钙盐及镁盐)。等渗剂包括氯化钾、氯化钠、糖及甘油。螯合剂包括乙二胺四乙酸钠及柠檬酸。

本发明的携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。病毒载体可以是慢病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺伴随病毒、痘苗病毒、杆状病毒、甲病毒属、流感病毒及其他具有合适的细胞向性的重组病毒。

本发明中RNF167蛋白或编码RNF167蛋白的核酸可以通过脂质体给予，所述脂质体的作用是将药物靶向于特定的组织，以及增加药物的半衰期。脂质体包括乳化剂、起泡剂、液态脂质、固态脂质、不溶性单层、磷脂分散剂、表面活性剂等。所述的脂质体中还可以包括能与靶向的细胞中的受体分子结合或其他治疗性或免疫原性组合物。

本发明的药物还可与其他治疗宫颈鳞癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分(例如，RNF167的促进剂)同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分(如RNF167促进剂)的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1 QPCR检测RNF167基因的表达

1、样品收集

收集33例宫颈鳞癌组织和相对应的癌旁组织，所有病例术前未做任何免疫抑制剂治疗、放疗以及化疗。

2、RNA提取

使用TRIZOL法提取组织总RNA。

1)用剪刀组织剪碎，加入1ml Trizol,振荡器上震荡1min；常温放置10min，使核蛋白体完全分解。

2)加入200μl三氯甲烷(氯仿)，盖紧管盖，剧烈震荡15s，常温静置10min。

3)4℃，11000rpm离心15min。

4)将水样层转移到一个新的离心管中，加入500μl异丙醇；颠倒混匀后，常温静置10min。

5)4℃，11000rpm离心15min。

6)用枪小心吸走液体，留沉淀在管底，加入1ml 75％的乙醇，在振荡器上震荡5s，洗涤沉淀一次。

7)4℃，8000rpm离心5min。

8)将上清小心去掉，干燥沉淀10min，加入适量的水溶解沉淀10min。

9)检测RNA浓度，鉴定RNA的产量和纯度。

3、实时定量PCR检测

1)逆转录：使用TAKARA公司的反转录试剂盒(Takara code：DRR047A)进行操作。

a.去除基因组DNA

在试管中加入5×gDNA Eraser Bμffer 2.0μl，gDNA Eraser 1.0μl，总RNA 1μg，加Rnase Free ddH₂O使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热2min。

b.反转录反应

将5×

Buffer 2 4.0μl，

RT Enzyme Mix I 1.0μl，RTPrimer Mix 1.0μl，RNase Free ddH₂O 4.0μl加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中37℃15min，85℃5s。

2)QPCR扩增

a.引物设计

根据RNF167和GADPH的基因序列设计引物，具体引物序列如下：

RNF167：

正向引物为5’-GACTTACCAAAGAGCAACT-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物为5’-TGGCACAGACATCATACT-3’(SEQ ID NO.2)。

GAPDH基因：

正向引物为5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO.4)。

b.QPCR扩增检验

用

Premix Ex Taq^TMII(Takara Code:DRR081)试剂盒配置PCR反应体系，在Thermal Cycler

Real Time System扩增仪上进行PCR扩增，反应结束后确认RealTime PCR的扩增曲线和溶解曲线，2^-ΔΔCT法进行相对定量。

配置25μl反应体系：

Premix Ex TaqTM II(2×)12.5μl，正(反)向引物各1μl，DNA模板2μl，灭菌蒸馏水8.5μl。

反应条件：95℃30s，(95℃5s，60℃30s)×40

4、统计学分析

实验采用3次重复实验，所有数据采用均数±标准差(mean±SD)表示。两组间比较采用双侧Student's t检验，三组及以上采用单因素方差分析。所有结果均采用GraphPadSoftware软件进行绘图，P<0.05定义为差异有统计学意义。对变量RNF167使用SPSS进行ROC分析，判断基因的诊断效能、灵敏度和特异性。

5、结果

QPCR结果如图1所示，以癌旁组织中的RNF167的相对表达水平设为1，RNF167在宫颈鳞癌组织中表达水平(0.217±0.0383)显著下调，下调约4.6倍(P<0.0001)，提示RNF167可应用于宫颈鳞癌的诊断。

ROC分析曲线及特征参数分别如图2和表1所示，本申请的基因RNF167作为变量时的AUC值分别为0.897，说明RNF167应用于宫颈鳞癌的诊断具有较高的特异性和敏感性，能够有效的区分宫颈鳞癌患者和正常人。

表1曲线下面积

检验结果变量:RNF167

a.在非参数假设下

b.零假设：实面积＝0.5

实施例2 RNF167对宫颈鳞癌细胞的影响

1、过表达载体的构建

根据NCBI中RNF167基因序列信息设计特异性引物，进行扩增获得相应基因，将基因片段胶回收后分别与表达载体pGL3 basic进行连接后转化入DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆经PCR和测序鉴定后获得pGL3 basic-RNF167重组质粒。

2、细胞培养

宫颈鳞癌细胞(Hela)用含10％胎牛血清和1％P/S的RPIM-1640培养基在37℃、5％CO₂的培养箱中培养，当细胞长至80％～90％时，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

3、转染

将实验分为3组，分别为对照组(Hela)、转染空载组(转染pGL3 basic)、实验组(转染pGL3 basic-RNF167)，按照invitrogen公司的lipofectamine 2000转染试剂说明书进行转染。分别用opti-MEM稀释质粒以及Lipo2000，轻轻混匀，将稀释好的质粒和Lipo2000轻轻吹打混匀，室温孵育20min形成复合物，将上述复合物逐滴加到更换新鲜培养基的24孔板中，边加边轻晃混匀，于37℃，5％CO₂培养相中培养6h后，更换成含血清和抗生素的常规培养基继续培养。

4、QPCR检测

细胞转染培养48h后收集细胞，使用Trizol法提取细胞总RNA，进行QPCR检测，QPCR检测步骤同实施例1。

5、CCK-8检测宫颈癌细胞的增殖能力

取对数生长期的细胞，配置成单细胞悬液，浓度为2×10⁴/ml，接种于96孔板中，每孔加100μl，每组设置5个复孔，培养72h后，96孔板中每孔加入10μl的CCK8试剂，晃动培养板3min，然后将培养板放入培养箱中继续培养，2h后取出，在酶标仪450nm波长处测定OD值。

6、Transwell检测宫颈癌的细胞的侵袭能力

将Matrigel凝胶溶解配置，4℃过夜，第二天将Matrigel跟培养基按照1:6的标准混合，每个24孔悬挂式小室底部膜上室面加稀释后的基质胶干燥。取转染后生长在对数期的细胞，配置成1×10⁶/ml的细胞悬液，取出小室，向培养板中添加含10％胎牛血清的培养基，随后向小室中添加100μl的细胞悬液，继续将其放入细胞培养箱中，培养24h，等到培养结束后，将小室从培养箱中取出，吸干剩余液体后，用95％的乙醇处理小室5min，用棉签擦去上室面的细胞；用0.5％结晶紫染色液对小室染色10min，PBS清洗两遍，显微镜下随机选取视野计数膜底面的细胞数。

7、统计学分析

所有数据采用均数±标准差(mean±SD)表示。两组间比较采用双侧Student's t检验，三组及以上采用单因素方差分析。所有结果均采用GraphPad Software软件进行分析，P<0.05定义为差异有统计学意义。

8、结果

QPCR检测基因的表达结果如图3显示，以对照组RNF167的表达水平作为参比设为1，相比对照组的RNF167的相对表达量与转染空载组的相对表达量(0.957±0.065)，实验组的RNF167的相对表达量(5.293±0.349)显著上调，差异具有统计学意义(实验组vs对照组，P＝0.0022；实验组vs转染空载组，P＝0.0014)，而转染空载组和对照组之间没有显著的差异(P＝0.368)。

CCK-8实验检测结果如图4显示，相比转染空载组的细胞增殖活性(OD值：1.436±0.1078)，实验组的细胞增殖活性(OD值：0.748±0.1031)显著降低(P＝0.0005)，说明RNF167影响宫颈鳞癌细胞的增殖，提示RNF167可作为分子靶标应用于宫颈鳞癌癌的治疗。

Transwell小室检测结果如图5显示，相比转染空载组的细胞穿膜数(166±10.82)，实验组的细胞穿膜数显著降低(86.67±10.69)，差异具有统计学意义(P＝0.0226)，说明改变RNF167的表达水平可以改变细胞的侵袭能力，提示RNF167可应用于宫颈鳞癌侵袭的治疗。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 四川大学华西第二医院

<120> 宫颈鳞癌的分子靶标及其在诊断和治疗中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gacttaccaa agagcaact 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tggcacagac atcatact 18

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aatcccatca ccatcttcca g 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagccccagc cttctccat 19

Claims

1.检测RNF167转录水平的试剂在制备诊断宫颈鳞癌的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测样本中RNF167转录水平的试剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括针对RNF167的探针、引物。

4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，针对RNF167的引物序列如SEQ ID NO.1~2所示。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片、试剂盒或核酸膜条。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述芯片为基因芯片，所述基因芯片包括用于检测RNF167基因转录水平的针对RNF167基因的寡核苷酸探针；所述试剂盒为基因检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测RNF167基因转录水平的试剂或芯片。

7.RNF167的促进剂在制备治疗宫颈鳞癌的药物中的应用，其特征在于，所述促进剂促进RNF167的转录水平。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述促进剂为含有RNF167的载体。

9.一种筛选治疗宫颈鳞癌的候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括：

用待筛选物质处理表达或含有RNF167基因的培养体系；和检测所述体系中RNF167基因转录水平；其中，当所述待筛选物质促进RNF167基因转录水平时，该待筛选物质是治疗宫颈鳞癌的候选药物。