CN111135169A - 一种促进小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1凋亡的药物组合 - Google Patents

一种促进小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1凋亡的药物组合 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种促进小鼠垂体腺瘤细胞AtT‑20、GT1‑1凋亡的药物组合物，该药物组合物由丙戊酸钠和替莫唑胺组成，丙戊酸钠：替莫唑胺＝1.6mM:16mM。本发明采用TMZ与VPA联合作用小鼠垂体腺瘤细胞AtT‑20、GT1‑1，在体外环境下，TMZ与VPA均表现出对小鼠垂体腺瘤细胞的增殖抑制作用，且具有明显的时间依赖性与剂量依赖性，并且TMZ与VPA能够在体外环境中通过促进凋亡相关蛋白的表达，同时抑制抗凋亡相关蛋白的表达，进而发挥对小鼠垂体腺瘤细胞活性的抑制作用以及细胞凋亡的促进作用，并且当TMZ与VPA联合应用时能够显著增强这种作用效果。本发明为临床治疗垂体腺瘤提供了新的思路与治疗方法，并为其提供理论依据，使TMZ与VPA联合应用治疗垂体腺瘤成为一种新的行之有效的治疗方案。

Description

一种促进小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1凋亡的药物组合
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种促进小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1凋亡的药物组合物。
背景技术
垂体腺瘤(pituitary adenoma，PA)是颅内常见的良性肿瘤，大多数起源于垂体前叶(腺垂体)。垂体腺瘤在所有颅内肿瘤中发病率仅次于脑膜瘤与胶质瘤，位列颅内肿瘤发生率的第三位，约占所有颅内肿瘤的9.6％，尸检发生率更高，30-40岁较多见，未见明显男女差异。由于垂体是人体内最重要的内分泌腺，可以分泌诸如生长激素、促甲状腺激素以及促肾上腺皮质激素等多种重要激素，因此，在症状上，垂体腺瘤患者除可发生占位效应外，还可引起激素分泌异常等一系列临床症状，严重影响着患者的健康。目前，垂体瘤的治疗方法主要包括手术治疗、放射治疗以及药物治疗，其中手术治疗是大多数垂体瘤的首选治疗方案。然而，完全切除肿瘤的手术风险较高，且有时全切困难，若有肿瘤组织残留则极易复发；放射治疗通常作为垂体瘤治疗的三线方案，主要应用于手术后残留及复发，或者不耐受手术的患者，对于缩小肿瘤体积有一定效果，但是可能发生不可逆转的垂体功能减退。有研究表明，无功能性垂体腺瘤患者在接受放射治疗后垂体功能减退的发生率约40％，在功能性腺瘤患者中，这一比例高达70％；近年来，药物治疗垂体腺瘤逐渐得到广泛认可。
尽管如此，使用传统药物治疗垂体腺瘤仍然存在较大局限性。包括溴隐亭、卡麦角林在内的多巴胺受体激动剂仅对泌乳素瘤疗效较确切，其他类型的垂体腺瘤如非功能性垂体腺瘤、生长激素瘤、促肾上腺皮质激素瘤等，手术治疗仍是首选方案。
尽管垂体腺瘤是一种良性肿瘤，然而其中有约30-40％的垂体腺瘤具有一定恶性肿瘤的生物学特点，呈侵袭性生长并常常侵犯周围组织，包括视神经、海绵窦以及鞍底与斜坡，还可能出现包绕颈内动脉等重要结构，称为侵袭性垂体腺瘤(Invasive pituitaryadenoma，IPA)。由于侵袭性垂体腺瘤生长迅速，与周围组织关系密切，手术难度较大，复发率较高。世界卫生组织发布了新的关于垂体瘤的分型，提出了难治性垂体腺瘤(refractorypituitary adenoma)的概念，根据《欧洲内分泌协会难治性垂体腺瘤和垂体腺癌诊治指南》所推荐的概念，将难治性垂体腺瘤定义为：经过正规的标准治疗(手术、放疗和常规药物治疗)，仍不能控制的腺瘤(肿瘤复发或肿瘤快速生长)。因此，除部分侵袭性无功能大腺瘤全切预后较好、部分巨大侵袭性泌乳素瘤对多巴胺受体激动剂较敏感外，大部分的侵袭性大腺瘤均属于难治性垂体腺瘤。对于难治性垂体腺瘤，除了手术、放疗与常规药物治疗外，指南中推荐替莫唑胺应作为一线治疗药物。
替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)是一种口服烷化剂，在临床上作为一种治疗多形性胶质母细胞瘤的一线用药，其疗效已经得到广泛的认可。在进入人体以后，TMZ经过一系列的细胞水解作用，最终转变为活性产物3-甲基-(三嗪-1-)咪唑-4-甲酰胺(MTIC)，该活性产物能够使DNA鸟嘌呤发生甲基化，导致DNA双螺旋结构裂解，从而诱导肿瘤细胞凋亡，达到杀伤肿瘤的目的。因为血脑屏障的存在，使得许多大分子药物不能穿过血脑屏障而达到颅内，但是由于TMZ的脂溶性小分子特性，它能够穿过血脑屏障，在颅内达到满意的血药浓度。尽管TMZ目前是胶质瘤的一线化疗药物，对于某些胶质瘤能够起到较满意的疗效，然而TMZ较少用于治疗垂体腺瘤。因此，本发明试图阐明TMZ对于非侵袭性的垂体腺瘤同样具有治疗作用，为药物治疗垂体腺瘤提供新的用药方案并提供理论依据。
丙戊酸钠(Valproic acid，VPA)是含有8个碳原子的脂肪酸，作为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，临床上常用于治疗各种原因引起的癫痫，其治疗效果得到广泛认可。在使用丙戊酸钠治疗恶性胶质瘤所引起的癫痫时，医生们意外的发现丙戊酸钠可以使肿瘤体积变小，这使得人们开始意识到丙戊酸钠具有一定的抗肿瘤作用，这也使得利用VPA治疗肿瘤的相关研究越来越多，包括通过丙戊酸钠治疗慢性淋巴细胞白血病以及胃癌等。已经有研究证实，VPA能够通过促进胶质瘤细胞凋亡从而抑制恶性胶质瘤细胞。尽管如此，VPA在临床中仍然是作为抗癫痫药物使用，其抗肿瘤作用未被广泛认可与实践，尤其是使用VPA治疗垂体腺瘤，相关研究报道较少，这使得VPA在药物治疗垂体腺瘤中具有非常广阔的前景。
因此，本研究旨在探讨TMZ、VPA是否能够抑制垂体腺瘤细胞的增殖、抑制肿瘤细胞活性并促进其凋亡，以及TMZ与VPA联合应用能否发生协同作用，实现治疗垂体腺瘤的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种促进小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1凋亡的药物组合物，由丙戊酸钠和替莫唑胺组成。
优选地，丙戊酸钠：替莫唑胺＝(1-2)mM:(10-20)mM。
优选地，丙戊酸钠：替莫唑胺＝1.6mM:16mM。
本发明的另一个目的是提供所述的促进小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1凋亡的药物组合物在制备治疗垂体腺瘤的药物中的应用。
本发明的有益效果为：本发明首次发现TMZ与VPA均能促进小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1凋亡，本发明采用TMZ与VPA联合作用小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1，在体外环境下，TMZ与VPA均表现出对小鼠垂体腺瘤细胞的增殖抑制作用，且具有明显的时间依赖性与剂量依赖性，并且TMZ与VPA能够在体外环境中通过促进凋亡相关蛋白的表达，同时抑制抗凋亡相关蛋白的表达，进而发挥对小鼠垂体腺瘤细胞活性的抑制作用以及细胞凋亡的促进作用，并且当TMZ与VPA联合应用时能够显著增强这种作用效果。
TMZ和VPA在体外治疗垂体瘤细胞时,p53蛋白的表达水平显著升高，从而促进肿瘤细胞凋亡的发生，达到抑制肿瘤的目的，因此该药物组合物在制备治疗垂体腺瘤的药物中具有广阔的应用开发前景。
本发明为临床治疗垂体腺瘤提供了新的思路与治疗方法，并为其提供理论依据，使TMZ与VPA联合应用治疗垂体腺瘤成为一种新的行之有效的治疗方案。
附图说明
图1为TMZ(A、B、C)与VPA(D、E、F)的不同作用浓度以及不同作用时间对小鼠垂体瘤细胞AtT-20、GT1-1细胞增殖的影响；
图2为TMZ、VPA单独使用及联合应用处理细胞后培养基上清中LDH的含量(*p＜0.05vs.对照组，#p＜0.05vs.TMZ组，△p＜0.05vs.VPA组)；
图3为TMZ、VPA单独使用及联合应用处理细胞后TUNEL染色，带有绿色荧光的细胞为TUNEL染色阳性(100×)；
图4为TMZ、VPA单独使用及联合应用处理细胞后Hoechst33258染色，蓝色荧光均匀弥散的细胞为活细胞核，凋亡细胞核表现为浓染致密的颗粒块状荧光(100×)；
图5为TMZ、VPA单独使用及联合应用处理细胞后进行Annexin V-FITC/PI双染，并通过流式细胞计数检测AtT-20(B)、GT1-1(C)各组细胞凋亡率，A为流式细胞计数所检测出的两种细胞经过药物处理后，存活细胞、坏死细胞、早期凋亡与晚期凋亡细胞所占的比例(*p＜0.05vs.对照组，#p＜0.05vs.TMZ组，△p＜0.05vs.VPA组)；
图6为TMZ、VPA单独使用及联合应用处理细胞后进行Western blot检测AtT-20、GT1-1各组细胞中凋亡相关蛋白表达水平(*p＜0.05vs.对照组，#p＜0.05vs.TMZ组，△p＜0.05vs.VPA组)。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1CCK-8法检测TMZ、VPA对小鼠垂体腺胞瘤细胞AtT-20、GT1-1增殖的影响。
试验方法：
(1)将小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1用PBS磷酸盐缓冲液清洗后以胰蛋白酶消化液消化，完成后使用FBS中和胰蛋白酶终止消化，离心后去上清并以含10％FBS的DMEM/High Glucose培养基重悬，得到单细胞悬液。将得到的细胞悬液轻轻吹打均匀后以1×105/ml密度接种于96孔细胞培养板中，每孔接种100μl，并置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。
(2)实验分组：将小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1各自分为48组，分别为：对照组、调零组、TMZ组(各组TMZ浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mM)以及VPA组(各组VPA浓度分别为2、4、8、16、32、64mM)，每组设置5个复孔。各组接种细胞后待次日细胞完全贴壁，按照分组加入TMZ与VPA，将96孔板放置于37℃、5％CO2条件下分别培养24、48、72h。药物处理后，将孔板中培养基吸出，PBS磷酸盐缓冲液洗1次后加入含10％FBS的DMEM/High Glucose培养基，向各组细胞中加入CCK-8检测试剂10μl，放置于37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育2h，最后使用酶标仪检测各孔在450nm波长处的吸光度值(optical density，OD)，并计算各组细胞存活率。
(3)细胞存活率计算公式为：
细胞存活率＝[(OD实验组-OD调零组)/(O对照组-OD调零组)]×100％计算结果绘制药物浓度-细胞存活率折线图。
实验结果：
分别给予AtT-20、GT1-1不同浓度梯度的TMZ与VPA作用相同时间后，随着药物浓度的增加，两组细胞的增殖活性随之降低，与对照组相比差异具有统计学意义(p＜0.05)；观察给予相同药物浓度而处理不同时间的各组细胞，可以发现随着处理时间的延长，各组细胞之间的增殖活性同样随之降低，差异具有统计学意义(p＜0.05)(见图1)。
实施例2LDH法检测TMZ与与VPA联合应用对小鼠垂体腺胞瘤细胞AtT-20、GT1-1活性的影响。
试验方法：
(1)将小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1用PBS磷酸盐缓冲液清洗后以胰蛋白酶消化液消化，完成后使用FBS中和胰蛋白酶终止消化，离心后去上清并以含10％FBS的DMEM/High Glucose培养基重悬，得到单细胞悬液。将得到的细胞悬液轻轻吹打均匀后以1×105/ml密度接种于24孔细胞培养板中，每孔接种500μl，并置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。
(2)实验分组：将小鼠垂体瘤细胞AtT-20、GT1-1各自分为8组，分别为：
TMZ对照组，TMZ组(TMZ作用浓度为1.6mM)、VPA组(VPA作用浓度为16mM)以及TMZ+VPA组(TMZ与VPA作用浓度分别为1.6mM与16mM)，每组设置3个复孔。各组接种细胞后待次日细胞完全贴壁，按照分组加入TMZ与VPA，将24孔板放置于37℃、5％CO 2条件下分别培养72h。药物处理后，将孔板中培养基吸出，进行低温高速离心后(12000rpm，2min，4℃)取上清，依照说明书依次加入各试剂，混匀，室温放置5min，波长450nm，酶标仪测定吸光度，具体如表1：
表1 LDH检测试剂盒配制信息表
Figure BDA0002365496740000081
(3)培养基上清LDH活性计算公式：
培养基上清LDH活性(U/L)＝(测定OD值-对照OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度(0.2mmol/L)×100％
结果：
TMZ、VPA分别作用于AtT-20、GT1-1细胞72h后，TMZ组、VPA组培养基上清中的LDH含量与对照组相比明显升高，TMZ与VPA联合用后，TMZ+VPA组培养基上清中LDH的含量相比于TMZ组、VPA组进一步升高，差异具有统计学意义(p＜0.05)(见图2)。
实施例3TUNEL染色法检测TMZ与与VPA联合应用对小鼠垂体腺胞瘤细胞AtT-20、GT1-1凋亡的影响
试验方法：
(1)将小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1用PBS磷酸盐缓冲液洗涤后以胰蛋白酶消化液消化，完成后使用FBS中和胰蛋白酶终止消化，离心后去上清并以含10％FBS的DMEM/High Glucose培养基重悬，得到单细胞悬液。将得到的细胞悬液轻轻吹打均匀后以1×105/ml密度接种于放有细胞爬片的24孔细胞培养板中，每孔接种500μl，并置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。
(2)实验分组：将小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1各自分为8组，分别为：TMZ对照组，TMZ组(TMZ作用浓度为1.6mM)、VPA组(VPA作用浓度为16mM)以及TMZ+VPA组(TMZ与VPA作用浓度分别为1.6mM与16mM)，每组设置3个复孔，并设置阳性对照组，将各组细胞接种于含细胞爬片的24孔板中。次日细胞完全贴壁，按照分组加入TMZ与VPA，将24孔板放置于37℃、5％CO2条件下分别培养72h。药物处理后，进行TUNEL染色，具体步骤如下：
1)吸净培养基，使用PBS磷酸盐缓冲液清洗3次，每次5min，晾干；
2)各孔加入3％PBST溶液300μl，室温下透膜30min，透膜后PBS磷酸盐缓冲液清洗3次，每次5min；
3)使用Proteinase K工作液于37℃处理细胞30min，处理后PBS磷酸盐缓17冲液清洗3次，每次5min；
4)制作阳性片：向阳性对照组各孔中加入300μlDNase1，放置于37℃反应30min；
5)配制TUNEL反应混合液。各孔按照1:9配制300μl荧光素酶标记的dUTP液混匀，混匀后加入各孔中，放置于37℃避光孵育1h；
6)PBS磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5min；
7)使用镊子小心取出细胞爬片，向载玻片滴加含DAPI的封片剂后将细胞爬片倒置于载玻片上，晾干。
8)使用正置荧光显微镜观察并拍照。
结果：
图3显示，TMZ、VPA分别作用于AtT-20、GT1-1细胞72h后，TMZ组、VPA组中细胞TUNEL染色的阳性细胞数增多，TMZ与VPA组联合应用后，TMZ+VPA组中细胞TUNEL染色阳性细胞数进一步增多。
实施例4Hoechst 33258染色法检测TMZ、VPA对小鼠垂体腺胞瘤细胞AtT-20、GT1-1凋亡的影响。
试验方法：
(1)将小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1用PBS磷酸盐缓冲液清洗后以胰蛋白酶消化液消化，完成后使用FBS中和胰蛋白酶终止消化，离心后去上清并以含10％FBS的DMEM/High Glucose培养基重悬，得到单细胞悬液。将得到的细胞悬液轻轻吹打均匀后以1×105/ml密度接种于放有细胞爬片的24孔细胞培养板中，每孔接种500μl，并置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。
(2)实验分组：将小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1各自分为8组，分别为：TMZ对照组，TMZ组(TMZ作用浓度为1.6mM)、VPA组(VPA作用浓度为16mM)以及TMZ+VPA组(TMZ与VPA作用浓度分别为1.6mM与16mM)，每组设置3个复孔，将各组细胞接种于含细胞爬片的24孔板中。次日细胞完全贴壁，按照分组加入TMZ与VPA，将24孔板放置于37℃、5％CO2条件下分别培养72h。药物处理后，进行Hoechst 33258染色，具体步骤如下：
1)吸净培养基，使用PBS磷酸盐缓冲液洗3次，每次5min，晾干；
2)向各孔中加入4％多聚甲醛，室温下固定细胞15min，使用PBS磷酸盐缓冲液洗3次，每次5min，晾干；
3)向各孔中加入少量Hoechst 33258染液，覆盖住细胞爬片即可；
4)使用PBS磷酸盐缓冲液仔细清洗，但要注意防止细胞脱落；
5)用镊子小心取出细胞爬片，将细胞爬片倒置于载玻片上，晾干；
6)使用正置荧光显微镜观察并拍照。
结果：
TMZ、VPA分别作用于AtT-20、GT1-1细胞72h后，TMZ组、VPA组细胞表现为均匀弥散染色的细胞核(活细胞核)数量减少，浓染致密的颗粒块状荧光(凋亡细胞核)数量增多，TMZ与VPA组联合应用后，TMZ+VPA组中活细胞核数量进一步减少，凋亡细胞核数量进一步增多(见图4)。
实施例5流式细胞计数检测TMZ、VPA对小鼠垂体腺胞瘤细胞AtT-20、GT1-1凋亡的影响
试验方法：
(1)将小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1用PBS磷酸盐缓冲液清洗后以胰蛋白酶消化液消化，完成后使用FBS中和胰蛋白酶终止消化，离心后去上清并以含10％FBS的DMEM/High Glucose培养基重悬，得到单细胞悬液。将得到的细胞悬液轻轻吹打均匀后以1×105/ml密度接种于6孔细胞培养板中，每孔接种2ml，并置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。
(2)实验分组：将小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1各自分为8组，分别为：TMZ对照组，TMZ组(TMZ作用浓度为1.6mM)、VPA组(VPA作用浓度为16mM)以及TMZ+VPA组(TMZ与VPA作用浓度分别为1.6mM与16mM)，每组设置3个复孔，将各组细胞接种于6孔板中。次日细胞完全贴壁，按照分组加入TMZ与VPA，将6孔板放置于37℃、5％CO2条件下分别培养72h。药物处理后，进行Annexin-FITC/PI双染并进行流式细胞计数,具体步骤如下：
1)吸去培养基，使用PBS磷酸盐缓冲液清洗3次，每次5min；
2)向各孔中加入1ml胰蛋白酶消化液，置于相差显微镜下观察，直至细胞完全消化；
3)向各孔中加入1ml完全培养基终止消化，离心(1000rpm，5min)后加入1ml完全培养基重悬，制成单细胞悬液；
4)将之前所吸去的培养基与细胞悬液按照分组分别重新转移至同一离心管，离心(1000rpm，5min)后弃上清，加入PBS磷酸盐缓冲液重悬，使用PBS磷酸盐缓冲液清洗细胞3次；
5)最后一次离心后弃上清，加入500μl Binding Buffer，重悬细胞；
6)加入10μl Annexin V-FITC，室温避光染色10min；
7)加入10μl PI，室温避光染色10min；
8)通过流式细胞计数仪检测各组细胞凋亡水平，并统计结果。
结果：
TMZ、VPA分别作用于AtT-20、GT1-1细胞72h后，TMZ组、VPA组细胞凋亡率升高，与对照组相比差异具有统计学意义(p＜0.05)；TMZ与VPA联合应用后，TMZ+VPA组细胞凋亡率相比于TMZ组与VPA组进一步升高，差异具有统计学意义(p＜0.05)(见图5)。
实施例6Western blot检测TMZ、VPA对小鼠垂体腺胞瘤细胞AtT-20、GT1-1凋亡相关蛋白表达及活化水平的影响
试验方法：
1.细胞处理
(1)将小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1用PBS磷酸盐缓冲液洗涤后以胰蛋白酶消化液消化，完成后使用FBS中和胰蛋白酶终止消化，离心后去上清并以含10％FBS的DMEM/High Glucose培养基重悬，得到单细胞悬液。将得到的细胞悬液轻轻吹打均匀后以1×105/ml密度接种于T25细胞培养瓶中，每孔接种4ml，并置于37℃、5％CO 2的细胞培养箱中培养。
(2)实验分组：将小鼠垂体瘤细胞AtT-20、GT1-1各自分为8组，分别为：TMZ对照组，TMZ组(TMZ作用浓度为1.6mM)、VPA组(VPA作用浓度为16mM)以及TMZ+VPA组(TMZ与VPA作用浓度分别为1.6mM与16mM)，将各组细胞接种于T25细胞培养瓶中。次日细胞完全贴壁，按照分组加入TMZ与VPA，将培养瓶放置于37℃、5％CO 2条件下分别培养72h。药物处理后，通过Western blot检测各组细胞凋亡相关蛋白表达及活化水平。
2.细胞总蛋白的提取
(1)药物处理完毕后，将培养瓶取出置于冰上，吸去培养基，加入PBS磷酸盐缓冲液洗3次，每次5min，尽量晾干；
(2)向培养瓶中加入100μl RIPA高效细胞裂解液，并在加入前预先加入PMSF，加入的量为1:100(V/V)，使PMSF的工作浓度为1mM。加入裂解液后，将培养瓶置于冰上裂解30min；
(3)用细胞刮匙仔细将细胞刮下，并转移至新的1.5ml离心管中；
(4)将低温高速离心机预冷至4℃，对称放入离心管，离心(4℃，12000rpm，20min)；
(5)取出离心管，仔细吸取上清液并转移至新的离心管中。
3.BCA法检测细胞总蛋白浓度
(1)标准蛋白的配制:取30mg BSA标准蛋白，加入到1.2ml蛋白标准配制液中，充分溶解后即配制成为25mg/ml的蛋白标准溶液，配制后可立即使用，其余标准蛋白溶液分装后-20℃保存；
(2)稀释配制好的标准蛋白溶液，使其终浓度为2000μg/ml；
(3)根据样品数量，按照BCA试剂A:B＝50:1(V/V)配制BCA工作液，充分混匀，注意避光并置于冰上；
(4)采用倍比稀释法稀释蛋白样品:a.取8个200μl离心管，分别编号为1-8，向编号为2-8的离心管中各加入45μl标准蛋白稀释液，并取90μl浓度为2000mg/ml的标准蛋白溶液加入到1号离心管中；b.从1号离心管中吸取45μl标准蛋白溶液加入到2号离心管中，混匀，再从2号离心管中吸取45μl标准蛋白溶液加入到3号离心管中，以此类推，直至最后从6号离心管中吸取45μl标准蛋白溶液加入至7号离心管中并混匀，即可得到浓度分别为2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、0μg/ml的标准蛋白溶液；
(5)取20μl各浓度标准蛋白溶液加入到96孔板的标准品孔中；
(6)取2μl各样品加入到96孔板的样品孔中，并加入标准品稀释液将体积补足至20μl；
(7)向标准品孔及样品孔中加入200μlBCA工作液，置于37℃孵育30min；
(8)采用酶标仪检测各孔吸光度值，绘制标准曲线，并计算各样品中总蛋白浓度。
4.SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳
(1)将玻璃板与灌胶系统按照说明书进行正确组装备用，确保密封性以免漏胶；
(2)根据目的蛋白的分子量确定各板分离胶的配制浓度，每板分离胶配制5ml，按照配制Tris-甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶配制表依次将各组分加入至50ml离心管中，充分混匀；
(3)将混好的分离胶用移液器水平缓慢加入至灌胶系统中，在灌胶时尽量避免出现气泡，直至胶水平面达到目的线，平均每板灌胶量约4.5-5ml，并为压缩胶留足空间。灌胶完毕后迅速用移液器向灌胶系统内加入无水乙醇至玻璃板上缘，防止氧气抑制聚合反应，同时起到将胶压平整的作用，将灌胶系统放置于平整桌面保持20min；
(4)待分离胶完全凝聚后，检查胶平面是否平整，有无漏胶现象，将无水乙醇倒出并使用滤纸尽量将无水乙醇吸干；
(5)按照配制Tris-甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳压缩胶配置表，将各组分依次加入到小烧杯中，配制5％压缩胶，每板配制1ml，充分混匀，用移液器将压缩胶灌注于分离胶之上，灌注过程中应避免产生气泡，然后迅速将配套梳子插入到灌胶系统中，再次确认系统中无气泡，将灌胶系统放置于平整桌面进行聚合反应，约20min；
(6)待胶完全凝固后将玻璃板从灌胶系统中取下并按照说明妥善固定于电泳装置，注意检查密封性避免漏液；
(7)向电泳槽内倒入新鲜1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，垂直拔出梳子，检查加样孔是否完整，有无弯曲变形，然后继续加入电泳缓冲液直至充满电泳槽，并拨去表面气泡；
(8)将蛋白样品从-80℃冰箱取出，放置于室温融化，将蛋白样品与5×LoadingBuffer蛋白上样缓冲液按照4:1(V/V)比例充分混匀后置于沸水中加热10min，然后将蛋白样品置于低温高速离心机中离心(4℃，12000rpm，2min)；
(9)按照每上样孔上样50μg总蛋白的上样量，计算各组需要上样的体积并用1×Loading Buffer蛋白上样缓冲液补齐体积，每上样孔最大上样体积不得超过40μl；
(10)使用20μl量程的移液器以及上样吸头进行上样。在每板SDS-Page聚丙烯酰胺凝胶的第一个上样孔中加入4μl预染蛋白Marker，然后根据实验设计依次加入对应蛋白样品，上样结束后在其旁边上样孔内加入等量1×Loading Buffer蛋白上样缓冲液防止相邻蛋白样品扩散；
(11)将电泳装置接通电源并将电源设置为80V，开始电泳。当观察到预染蛋白Marker分离出清晰的蛋白条带后，将电压设置为110V继续电泳，直至所观察的目的蛋白附近预染蛋白Marker分离完全并与相邻分子量的预染蛋白Marker分离出足够距离，说明目的蛋白已经与其他分子量的蛋白相互分开，此时关闭电源，结束电泳。
(12)将电泳装置从电泳槽中取出，取下玻璃板，用切胶板将玻璃板与凝胶分离，根据目蛋白的分子量与上样的样品数量进行切胶，切胶宽度为1.5cm，切胶长度为(样品数+预染蛋白Marker数)1.5cm。
5.转膜(湿转法)
(1)转膜前进行聚偏氟乙烯膜(PVDF)膜的裁剪，使之与所切的凝胶形状大小一致。将裁剪好的PVDF膜放入甲醇中浸泡15min左右，之后再放入二级水中进行平衡缓冲，时间约10-15min。
(2)将湿转夹放置于浅盘中，加入湿转液使之完全浸透，在负极板(黑色)上依次放入海绵垫、凝胶、PVDF膜，用玻璃棒轻轻赶出凝胶与膜之间的气泡，确保对位正确，最后再放入海绵垫，合上湿转夹，闭锁卡扣，确保湿转夹对齐并夹紧。将湿转夹妥善放入湿转装置，确保极性正确，向湿转槽内加满湿转液，并盖上电极盖。
(3)接通电源，电流设置为300mA，时间依据目的蛋白分子量大小而定，湿转时间(min)＝目的蛋白分子量(KD)。转膜结束后，拆除湿转装置，小心取出PVDF膜并放入抗体孵育盒内。
6.免疫反应
(1)漂洗：用干净的镊子将PVDF膜从湿转夹中取出放置于抗体孵育盒内，向其中加入TBS-T缓冲液，并将抗体孵育盒放置在水平摇床上缓慢摇动漂洗，每次10min，时间到后将TBS-T倒出，重新加入新的TBS-T缓冲液。以上步骤重复3次。
(2)封闭：使用TBS-T缓冲液提前配制5％封闭用牛奶。当膜漂洗结束后，将TBST倒出后，向抗体孵育盒中每格加入3ml封闭用牛奶进行封闭，封闭时将抗体孵育盒放置于水平摇床缓慢摇动，封闭时间1.5h。封闭结束后，倒出封闭用牛奶，用TBST简单冲洗后再次加入TBS-T，进行漂洗步骤，方法同前。
(3)一抗孵育：封闭结束后将封闭用牛奶倒出，向抗体孵育盒每格中倒入3ml封闭用牛奶，根据各一抗使用说明书，按照工作浓度加入对应一抗，然后将抗体孵育盒置于水平摇床轻轻摇动，室温下孵育2h，最后将抗体孵育盒转移至4℃冰箱内过夜孵育；
(4)一抗漂洗：次日将抗体孵育盒从冰箱中取出，置于水平摇床上轻轻摇动复温30min，其后吸出一抗，-20℃保存备用，向抗体孵育盒加入TBST轻轻漂洗，将TBST倒出后再加入新的TBST重复3次漂洗步骤，方法同前；
(5)二抗孵育：将抗体孵育盒中的TBST缓冲液倒出，向每格中加入3ml封闭用牛奶，根据二抗使用说明书按照工作浓度加入与一抗种属相对应的二抗，将抗体孵育盒置于水平摇床轻轻摇动，室温下孵育2h；
(6)二抗漂洗：二抗孵育完成后，将二抗吸出保存于-20℃冰箱中备用，重复3次漂洗步骤，方法同前；
7.化学发光与拍照
使用Milipore增强化学发光液进行化学发光，将发光液试剂A与试剂B1:1(v/v)混合配置成化学发光工作液备用。用镊子将PVDF膜从抗体孵育盒中夹出置于增强化学发光仪的托盘中央，向PVDF膜滴加适量配制好的化学发光工作液，使发光液完全覆盖并浸润PVDF膜，然后将托盘放入仪器中进行化学发光成像并拍照。
8.统计学分析
本研究使用SPSS 23.0软件进行统计学分析，统计数据计量资料使用x±s表示，使用单因素方差分析进行组间数据统计分析，检验水准a＝0.05，当P＜0.05时认为差异具有统计学意义。
结果：
通过Western blot检测TMZ与VPA联合应用对AtT-20、GT1-1细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响，结果显示：TMZ、VPA分别作用于AtT-20、GT1-1细胞72h后，TMZ组、VPA组细胞中所表达的Bax、AIF以及p53等凋亡相关蛋白表达水平升高，caspase-3、caspase-9、PARP等凋亡相关蛋白的活化水平升高，而抗凋亡相关蛋白Bcl-2表达水平降低，与对照组相比差异具有统计学意义(p＜0.05)；当TMZ与VPA联合应用时，TMZ+VPA组细胞与TMZ组、VPA组相比，对上述凋亡相关蛋白的表达水平影响更大，差异具有统计学意义(p＜0.05)(见图6)。
结论：1.TMZ与VPA在体外环境下都能够表现出对小鼠垂体腺瘤细胞的增殖抑制作用，且这两种药物对肿瘤细胞的增殖抑制作用都具有时间依赖性以及剂量依赖性.
2.通过LDH法、TUNEL染色、Hoechst 33258染色以及流式细胞计数等检测发现TMZ与VPA在体外环境下都能够抑制垂体腺瘤细胞的活性并促进其凋亡，当TMZ与VPA联合应用时，二者能够发挥协同作用，进一步加强这一作用效果。
3.当VPA作用于小鼠垂体瘤细胞后，可以激活凋亡相关信号通路，使Bax、AIF凋亡相关蛋白表达水平升高，Caspase-3、Caspase-9、PARP等凋亡相关蛋白活化水平升高，并且抑制抗凋亡相关蛋白Bcl-2的表达，从而促进了垂体瘤细胞的体外凋亡。我们还发现TMZ和VPA在体外治疗垂体瘤细胞时显著升高p53蛋白的表达水平，从而促进肿瘤细胞凋亡的发生，达到抑制肿瘤的目的；此外，TMZ和VPA的联合应用能够显著增强这一作用效果。

Claims (4)

1.一种促进小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1凋亡的药物组合物，其特征是，该药物组合物由丙戊酸钠和替莫唑胺组成。
2.根据权利要求1所述的一种促进小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1凋亡的药物组合物，其特征是，丙戊酸钠：替莫唑胺＝(1～2)mM:(10～20)mM。
3.根据权利要求1所述的一种促进小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1凋亡的药物组合物，其特征是，丙戊酸钠：替莫唑胺＝1.6mM:16mM。
4.根据权利要求1～3所述的促进小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1凋亡的药物组合物在制备治疗垂体腺瘤的药物中的应用。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20130130562A (ko) * 2012-05-22 2013-12-02 가톨릭대학교 산학협력단 테모졸로미드 및 발프로산을 함께 이용하는 항암적 용도

Patent Citations (1)

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KR20130130562A (ko) * 2012-05-22 2013-12-02 가톨릭대학교 산학협력단 테모졸로미드 및 발프로산을 함께 이용하는 항암적 용도

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
林益光等: "替莫唑胺在垂体腺瘤治疗中的应用及进展", 《中国现代神经疾病杂志》 *
蔺勇等: "替莫唑胺联合丙戊酸钠对人脑胶质瘤细胞生物学行为的影响", 《中国实验诊断学》 *

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