CN111088356A - 一种检测hsa_circ_0065793的引物对及其应用和试剂盒 - Google Patents

一种检测hsa_circ_0065793的引物对及其应用和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测hsa_circ_0065793的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，上游引物序列如SEQ ID NO:1所示；下游引物序列如SEQ ID NO:2所示。本发明所提供的引物对可用于制备定性或定量检测hsa_circ_0065793试剂盒。本发明所提供的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物对能特异性扩增hsa_circ_0065793目的基因，且重复性良好。检测速度快，特异性强，灵敏度高，稳定可靠。

Description

一种检测hsa_circ_0065793的引物对及其应用和试剂盒
技术领域
本发明属于生物分子学技术领域，涉及一种检测hsa_circ_0065793的引物对及其应用和试剂盒。
背景技术
非编码RNA(Non-coding RNA)是一种不编码蛋白质的RNA，大量研究数据表明，高等生物多达一半以上的DNA转录为RNA，其中绝大多数为ncRNA。ncRNA在生物发育的过程中，可能有着不亚于蛋白质的重要作用。但是，今天对整个ncRNA的世界却了解甚少，主要任务是发现更多的ncRNA及其生物功能。因此，要彻底弄清ncRNA的调控网络，将是揭示生命奥秘的最终突破。
环状RNA(circRNA)是一类特殊的非编码RNA分子，并且不易降解的RNA分子。环状RNA与已知的线状RNA不同，形成一个共价闭合的连续循环。虽然第一个circRNA早在40多年前就被发现的，但是人们对它的大规模研究却是近十几年的事情。在环状RNA中，RNA分子的3'和5'末端通常是连接在一起的。这种特性赋予了环状RNA许多特性，其中许多特性是最近才被识别出来的。许多环状RNA来源于蛋白质编码基因，但是细胞中产生的环状RNA还没有被证明可以编码蛋白质。因此它们被归类为非编码RNA。最近，一些环状RNA显示出了作为基因调节器的潜力。像许多其他非编码亚型一样，大多数环状RNA的生物学功能尚不清楚。由于环状RNA没有5'或3'端，它们对核外酶介导的降解具有抵抗性，并且可能比细胞中的大多数线性RNA更稳定。
hsa_circ_0065793广泛存在于小脑、枕叶、顶叶等组织中，，hsa_circ_0065793可能存在竞争性內源RNA(ceRNA)作用。通过生物信息学分析，筛选出了miRNAs和mRNAs，把mRNAs进行通路富集找到了与乳腺癌相关的circRNA-miRNA-PI3K-AKT信号通路，因此，hsa_circ_0065793在研究乳腺癌中的意义重大。
对于非编码RNA的鉴定，目前往往通过构建非编码RNA的cDNA文库，运用比较传统的克隆测序鉴定非编码RNA，但这种方法工作量很大，且对低丰度的非编码RNA检测效率较差。随着测序技术的发展，得到非编码RNA的cDNA文库以后，不用克隆就可以直接测序，检测到大量低丰度的非编码RNA，但是对仪器要求较高，成本也很高。所以为了能够快速且廉价的检测人体中的hsa_circ_0065793的表达水平，需要找到一种能特异性好的识别hsa_circ_0065793的引物，实现快速，简单，廉价的检测方法或检测试剂盒。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性好的检测hsa_circ_0065793的引物，并提供所述引物对在制备定性或定量检测hsa_circ_0065793试剂盒的应用，以及提供一种检测hsa_circ_0065793的试剂盒。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1.一种检测hsa_circ_0065793的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，上游引物序列如SEQ ID NO:1所示；下游引物序列如SEQ ID NO:2所示。
2.包含SEQ ID NO:1所示上游引物序列，和SEQ ID NO:2所示下游引物序列的引物对在制备检测hsa_circ_0065793试剂盒中的应用。
进一步所述的应用，所述检测为定性检测或定量检测。
3.一种检测hsa_circ_0065793的试剂盒，所述试剂盒包括SEQ ID NO:1所示上游引物序列，和SEQ ID NO:2所示下游引物序列的引物对。
进一步，所述试剂盒包括SEQ ID NO:1所示上游引物序列、SEQ ID NO:2所示下游引物序列、50×ROX Reference Dye和2×TB Green Premix Ex Taq II。
进一步，所述上游引物序列浓度为0.1μmol/ml，所述下游引物序列浓度为0.1μmol/ml。
进一步，所述试剂盒中按照每20μl PCR反应体系计，包括上游引物序列0.8μl，下游引物序列0.8μl，50×ROX Reference Dye 0.4μl，2×TB Green Premix Ex Taq II 10μl。
进一步，试剂盒的20μl PCR反应体系中，加入待检测DNA模板2μl和灭菌水。
进一步，所述试剂盒的PCR反应条件为预变性95℃30sec，再变性95℃5sec，60℃退火34sec，40循环，最后72℃延伸5min。
本发明的有益效果在于：本发明提供的检测hsa_circ_0065793的引物对，可用于制备定性或定量检测hsa_circ_0065793试剂盒。所提供的引物对能特异性扩增hsa_circ_0065793目的基因，且重复性良好。利用本发明所提供引物对制备的检测试剂盒检测速度快，特异性强，灵敏度高，稳定可靠。本发明提供的检测试剂盒可利用简单的PCR仪就可以定量的测定人体中hsa_circ_0065793的表达量，以便分析病例和对照之间的是否存在差异表达，为进一步实验提供依据。所设计的引物可适用于大多数PCR试剂盒和PCR仪，应用广泛，操作简单，拥有方便、廉价、快速检测的优势。最后，本发明所提供的SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示的引物合成方法简单，并采用PAGE纯化方法，特异性好，合成时间短。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为PCR的扩增曲线；
图2为PCR的溶解曲线；
图3为RNase R消化酶使用后，RNA核酸凝胶电泳图；
图4为RNase R消化酶使用后，qRT-PCR检测候选circRNAs表达水平结果图；
图5为qRT-PCR产物测序图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
根据hsa_circ_0065793特有的序列，通过跨反向剪切位点设计引物确保引物的特异性，其核苷酸序列如下：
上游引物序列：5’-ACGAGAGGGAGAGCAAGACC-3’，SEQ ID NO:1；
下游引物序列：5’-TCTTCGGATCGGTCACTGTT-3’，SEQ ID NO:2。
与常规线性RNA引物设计不同的是，circRNA的引物设计需要跨过剪接位点，这是由于保证获取的circRNA序列是环状列从剪接位点打开后的线性序列，因此，为了复原序列成环时的位置关系，发明人采用反向跨剪接位点的方式设计引物，保证引物的特异性。具体实施方案为：截取3’端50-100bp长度序列置于5’端头部，形成一个新的序列。利用NCBI数据库设计引物，采用“Primer-Blast”工具进行引物特异性比对分析。本发明所提供引物对从多种引物对中挑选验证而得，特异性强，灵敏度高，稳定可靠，其他设计的引物对在PCR时出现双峰。
实施例2
一.血样TRizol预处理
1.征求广西中医药大学第一附属医院24名志愿者同意，抽取静脉血5ml；将5ml血样离心8min，弃上清，加入3倍体积的红细胞裂解液，振荡，静置10min，分装4个2ml离心管。
2.再在13000rpm，4℃离心3min，弃上清，继续加入1.5ml红细胞裂解液，振荡至沉淀消失，再静置2min，然后再13000rpm，4℃离心3min，随后弃上清。
3.每个离心管中加入500ul TRizol，振荡至沉淀完全溶解；将4个2ml离心管中的0.5mlTRizol溶液合为两个2ml的离心管(每管1ml TRizol溶液)；
二.RNA提取
1.采用TRizol法从人血样本中提取RNA，取1ml TRizol样本，加入0.2ml氯仿，振荡，静置10min。
2.4℃离心，14000r×20min，取上清约0.5ml，移至1.5ml离心管。
3.加入0.5ml异丙醇，静置10min，4℃离心，12000r×10min，弃上清。
4.加入1ml 75％乙醇，吹打洗涤沉淀至沉淀打散。
5.4℃离心，7500r×5min，弃上清；加入20ul DEPC H2O，在金属浴65℃促溶10-15min，得到RNA溶解液。
6.1％琼脂糖电泳检测RNA浓度及质量。
三.RNA反转录为cDNA
本实施例所用反转录试剂盒为Takara，型号：RR047A。
1.去除基因组DNA反应：
步骤1：10ul反应体系如表1所示；反应条件：42℃，2min。
表1 10ul反应体系
试剂 用量
5×gDNA Eraser Buffer 2.0μl
gDNA Eraser 1.0μl
Total RNA 1000/RNA浓度
RNase Free dH<sub>2</sub>O 补充至总体积10μl
步骤2：20ul反应体系如表2所示，反应条件：37℃15min，85℃5sec，4℃退火。
Figure BDA0002351521820000041
四.PCR扩增方法的建立
本实施例所用反转录试剂盒为Takara，型号：RR820。
1.20ul PCR反应体系制备：
样品DNA 2ul，
hsa_circ_0065793上下游引物序列各0.8ul，
ROX Reference Dye 0.4ul，
TB Green Premix Ex Taq II 10ul，
DNase/RNase-Free Deionized Water 6ul，
cDNA和引物的浓度：0.1μmol/ml。
2.PCR反应条件：预变性95℃30sec，再变性95℃5sec，60℃退火34sec，40循环，最后72℃延伸5min。
经PCR反应结束后确认PCR的扩增曲线和溶解曲线，图1为PCR的扩增曲线，图2为PCR的溶解曲线，所有样本均做了2个复孔。图2的溶解曲线是单峰，说明扩增产物特异性好，结果较好。表1为24个样本的CT值。由图1和图2可知，从24个人血样本中所提取的cDNA，均能用本发明所设计的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物对能特异性扩增hsa_circ_0065793目的基因，且每个样本的经过两次PCR反应，重复性良好。
表1 24个样本的CT值
编号 CT值 编号 CT值
D129 33.567997 D281 29.39679
D139 34.452808 D273 29.62703
D144 32.526096 D173 31.639574
D150 34.264782 D198 34.030659
D183 33.724331 D272 34.95298
D282 35.377171 D275 34.39809
D285 34.006941 D277 33.19823
D154 34.23357 D278 35.70888
D160 28.40114 D279 35.31525
D172 31.22376 D280 34.30735
D193 29.33602 D271 32.87224
D284 30.06952 D274 33.44683
实施例3
将实施例2经qRT-PCR扩增后的circRNA使用RNA消化酶(RNase R)进行验证。
由于circRNA具有抗线性RNA消化酶(RNase R)消化的能力，故采用RNase R消化酶实验来验证候选circRNAs的环状结构。
RNase R消化酶使用后，RNA核酸凝胶电泳图如图3所示。图3实验结果显示，在使用RNase R消化酶消化总RNA之后，RNase R(-)组的RNA完整(28S和18S条带清晰)，而RNase R(+)组RNA已被降解；图4为RNase R消化酶使用后，qRT-PCR检测候选circRNAs表达水平结果图，如图4所示，通过qRT-PCR检测两组中目的因子的表达水平发现，与RNase R(-)组相比，RNase R(+)组中阳性对照GAPDH的表达显著下降，而hsa_circ_0065793的表达水平未出现降低。以上结果表明，hsa_circ_0065793为环状的circRNA分子，且本发明所提供的SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示的引物能够对其进行有效的特异性扩增。
再通过对PCR产物进行测序，进一步验证它的环状结构，红色箭头为其反向剪切位点，详细测序如图5所示。
本发明设计的hsa_circ_0065793的PCR鉴定用引物对，相对于以往通过测序鉴定基因更加快捷方便，廉价。本发明所设计的PCR鉴定用引物特异性良好，合成简单，只需要简单的PCR试剂盒和PCR仪就能从人体血液、组织等样本中有效特异性识别hsa_circ_0065793。
通过本发明所设计并筛选出的引物对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，并用简单的PCR仪就可以定量的测定人体中hsa_circ_0065793的表达量，以便分析病例和对照之间的是否存在差异表达，为进一步实验提供依据。所设计的引物可适用于大多数PCR试剂盒和PCR仪，应用广泛，操作简单，拥有方便、廉价、快速检测的优势。最后，本发明所提供的SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物合成方法简单，并采用PAGE纯化方法，特异性好，合成时间短。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 广西医科大学
<120> 一种检测hsa_circ_0065793的引物对及其应用和试剂盒
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgagaggga gagcaagacc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcttcggatc ggtcactgtt 20

Claims (9)

1.一种检测hsa_circ_0065793的引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物和下游引物，上游引物序列如SEQ ID NO:1所示；下游引物序列如SEQ ID NO:2所示。
2.权利要求1所述引物对在制备检测hsa_circ_0065793试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测为定性检测或定量检测。
4.根据权利要求1制备的检测hsa_circ_0065793试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求所述的引物对。
5.根据权利要求4所述的检测hsa_circ_0065793试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括SEQ ID NO:1所示上游引物序列、SEQ ID NO:2所示下游引物序列、50×ROX Reference Dye和2×TB Green Premix Ex Taq II。
6.根据权利要求4所述的检测hsa_circ_0065793试剂盒，其特征在于，所述上游引物序列浓度为0.1μmol/ml，所述下游引物序列浓度为0.1μmol/ml。
7.根据权利要求4所述的检测hsa_circ_0065793试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中按照每20μl PCR反应体系计，包括上游引物序列0.8μl，下游引物序列0.8μl，50×ROXReference Dye 0.4μl，2×TB Green Premix Ex Taq II 10μl。
8.根据权利要求4所述的检测hsa_circ_0065793试剂盒，其特征在于，试剂盒的20μlPCR反应体系中，加入待检测DNA模板2μl和灭菌水。
9.根据权利要求4-8任一项所述的检测hsa_circ_0065793试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的PCR反应条件为预变性95℃30sec，再变性95℃5sec，60℃退火34sec，40循环，最后72℃延伸5min。
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