CN111087445A - 一种用于ace2活性检测的质谱探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于ace2活性检测的质谱探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于ACE2活性检测的质谱探针及其制备方法和应用。该质谱探针包括氨基酸序列为Asp‑Ala‑Pro‑Lys的多肽及修饰在所述多肽的天冬氨酸的哌嗪类化合物。本发明提供的质谱探针由可被ACE2特异性识别的多肽Asp‑Ala‑Pro‑Lys与高质谱响应的小分子哌嗪类化合物连接而成，不仅能被ACE2特异性识别并酶切，同时具有极高的质谱响应，质谱检测准确度高，能够准确反应ACE2的活性，适用于血清等复杂体系中酶活性的检测。

Description

一种用于ACE2活性检测的质谱探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物筛选与评价方法领域，具体涉及一种用于ACE2活性检测的质谱探针及其制备方法和应用。
背景技术
血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)，是ACE相关的同系物，是一种羧肽酶。ACE2主要在血管内皮细胞和肾小管上皮细胞中表达。ACE2蛋白是由805个氨基酸组成的I型跨膜蛋白，包括胞浆内尾端、跨膜结构域及位于细胞外的催化域三个结构。ACE2可将血管紧张素II水解为血管紧张素-(1-7)，ACE2也可以将血管紧张素I转化为血管紧张素1-9，随后血管紧张素1-9被ACE切割，产生血管紧张素1-7。ACE2的膜结合胞外域可被金属蛋白酶切割，随后释放出可溶性的ACE2。虽然可溶性ACE2的生理功能尚不明确，但有研究表明慢性心力衰竭患者血浆中可溶性ACE2活性升高。
肾素血管紧张素系统(Renin-Angiotensin-System，RAS)是人体内一种重要的激素系统，其主要生理功能为调节人体水分、电解质和血压，维持人体内环境稳态。ACE2的发现，使得研究者意识到，除经典的RAS轴之外，还存在第二轴，即ACE2/ANG-(1-7)/MAS轴。研究表明，在许多情况下，该第二轴似乎能抵消或者缓解RAS经典轴所带来的影响。
ACE2在肾脏中分布广泛，但当肾脏出现病变时ACE2的分布会发生改变。此外，外周循环中ACE2活性的改变与肾功能损伤密不可分。对2型糖尿病和糖尿病肾病患者的研究显示，疾病发展早期ACE2下降，肾小球和肾小管中ACE表达上升，导致ACE/ACE2比率显着增加。此外，另外一项研究表明，患有2型糖尿病和肾小球硬化的患者肾组织中ACE2表达下降。
对尿液中的ACE2进行检测，发现相比于健康对照组，慢性肾病患者尿液中ACE2蛋白显着增加，糖尿病肾病患者尿液中ACE2蛋白进一步升高。对外周血中的ACE2进行检测，研究结果表明，相比于健康对照组，慢性肾病患者外周循环中ACE2活性发生显著改变，以上种种研究表明，ACE2有望成为慢性肾病乃至糖尿病肾病的临床标志物。
目前用于ACE2活性检测的方法主要集中在ELISA法和荧光探针法。ELISA法虽然是目前酶活性测定的常用方法，但是其操作繁琐，耗时长，成本较高。荧光探针法采用荧光检测法测定酶与荧光探针反应前后的荧光值，虽然专属性较高，但容易受本底干扰，灵敏度较低。
在蛋白质分析中，为了提高检测的灵敏度和专属性，同时扩宽检测范围，常会对蛋白质样品进行预处理。肽段化学衍生就是蛋白质分析中常用的一种样品预处理方法，通过对肽段的氨基、巯基或羧基进行衍生化处理，引入易电离的小分子标签，从而达到提高检测灵敏度的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高质谱响应的质谱探针，作为酶底物，被ACE2特异性识别，通过质谱测定酶切反应前后的探针或酶切产物的量来检测ACE2的活性。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于ACE2活性检测的质谱探针，包括氨基酸序列为Asp-Ala-Pro-Lys的多肽及修饰在所述多肽的天冬氨酸上的哌嗪类化合物。
本发明的质谱探针由可被ACE2特异性识别的多肽与高质谱响应的小分子连接而成。所述多肽的氨基酸序列为：天冬氨酸-丙氨酸-脯氨酸-赖氨酸(SEQ IDNO.1)，所述的高质谱响应的小分子为哌嗪类化合物，哌嗪类化合物的-NH与多肽链上的天冬氨酸的羧基缩合。
ACE2酶切位点为脯氨酸与赖氨酸之间的酰胺键，因此，本发明质谱探针的酶切产物为哌嗪类化合物-天冬氨酸-丙氨酸-脯氨酸和赖氨酸。由于哌嗪类化合物具有很强的质谱响应，因此通过测定反应前后该探针或酶切产物哌嗪类化合物-天冬氨酸-丙氨酸-脯氨酸的量，即可检测ACE2的活性。
作为优选，所述哌嗪类化合物为1-(2-嘧啶基)哌嗪、1-(4-吡啶基)哌嗪或1-(1-甲基-4-吡啶基)哌嗪。
更为优选，所述哌嗪类化合物为1-(2-嘧啶基)哌嗪，所述质谱探针的结构如下式(Ⅰ)所示，
Figure BDA0002366738420000021
本发明还提供了上述用于ACE2活性检测的质谱探针的制备方法，包括：采用固相法合成氨基酸序列为Asp-Ala-Pro-Lys的多肽，再将多肽与哌嗪类化合物进行固相合成多肽反应，纯化后即得所述的质谱探针。
所述多肽由以下方法制得：先用二氯甲烷溶涨树脂，再加入3倍摩尔过量的保护氨基酸原料，再加入5倍摩尔过量的N,N-二异丙基乙胺进行反应，反应结束后加20％哌啶-二甲基甲酰胺溶液进行脱保护；重复上述步骤依次连接氨基酸Lys、Pro、Ala、Asp后制得。
第二方面，本发明提供了所述的质谱探针在ACE2活性检测试剂中的应用。本发明还提供了所述的质谱探针在制备检测血清中ACE2活性试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的质谱探针由可被ACE2特异性识别的多肽Asp-Ala-Pro-Lys与高质谱响应的小分子哌嗪类化合物连接而成，不仅能被ACE2特异性识别并酶切，同时具有极高的质谱响应，质谱检测准确度高，能够准确反应血ACE2的活性，也非常适用于血清等复杂体系中ACE2活性的检测。
附图说明
图1为ACE2质谱探针用于酶活性检测的流程图。
图2为ACE2质谱探针纯度分析的HPLC色谱图。
图3为ACE2质谱探针结构确证的HPLC-QqQ-MS提取离子流色谱图，其中右上角附图为质谱结果图。
图4为ACE2质谱探针的1H核磁共振谱图。
图5为ACE2质谱探针对ACE2的检测灵敏度考察结果图。
图6为ACE2质谱探针及其他蛋白对ACE2的检测特异性考察结果图。
图7为血清中ACE2酶活性测定结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
实施例1：ACE2质谱探针的合成
本实施例ACE2质谱探针的合成方法，主要包括以下步骤：
一、树脂溶涨
称取0.6g取代度为0.4mmol/g的2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂，将树脂放入反应管中，加二氯甲烷(DCM)(15ml/g)，振荡30min.
二、接第一个氨基酸
通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-L-Lys(Boc)-OH氨基酸，再加入5倍摩尔过量的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，最后加入少量二甲基甲酰胺(DMF)溶解，振荡1h，最后用DMF和DCM交替清洗6遍。
三、脱保护
加15ml 20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，反应5min，去掉溶剂，再加15ml20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，反应15min。
四、检测
抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮、氰化钾(KCN)、苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应。
五、洗
依次用DMF(10ml/g)清洗两次、甲醇(10ml/g)清洗两次、DMF(10ml/g)清洗两次。
六、缩合
保护氨基酸Fmoc-L-Pro-OH三倍摩尔过量，HBTU三倍摩尔过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA五倍摩尔过量，反应60min，反应后用DMF(10ml/g)清洗一次、甲醇(10ml/g)清洗两次、DMF(10ml/g)清洗两次。重复上述缩合操作，依次连接氨基酸Ala和Asp。
七、接Boc
接完FmocL-Asp(Oall)-OH后，加入3倍摩尔当量的Boc酸酐和3倍摩尔当量的DIEA脱保护接Boc。
八、脱Oall
加入3倍摩尔当量的四三苯基膦钯和3倍摩尔当量DIEA，加DMF充氮气震荡12h脱Oall。
九、接1-(2-嘧啶基)哌嗪
以相同方法接1-(2-嘧啶基)哌嗪，接完后，甲醇洗4次，抽干10min。
十、切割
配制切割液(TFA 94.5％；水2.5％；EDT 2.5％；TIS 1％)，从树脂上全保护切割多肽，即得粗品粗品肽序。
十一、HPLC纯化多肽
用HPLC纯化粗品探针，将纯化后的溶液冻干，密封包装，-20度保存得到ACE2质谱探针。
实施例2：ACE2质谱探针的化学表征
采用实施例1所述的方法合成ACE2质谱探针，用HPLC对探针的纯度进行分析。分析条件为：安捷伦1260HPLC色谱系统，配备可变波长检测器(VWD)，检测波长214nm；色谱柱，Agilent Zorbax SB-C18(4.6mm×100mm，1.8μm)；流动相为0.05％甲酸-水(A)和0.05％甲酸-乙腈(B)；流速0.4mL/min；梯度洗脱，0-5min，1％B；5-40min，1-30％B；40-45min，30-100％B；40-45min，100％B；进样量10μL；柱温30℃。
将ACE2质谱探针用纯水溶解后，10000rpm离心10分钟后取上清进样分析，得到的HPLC色谱图如图2所示。
由图2可见，实施例1合成的ACE2质谱探针纯度很高，可以用于后续的实验和研究。
此外，我们进一步用HPLC-QqQ-MS对探针的结构进行了确证。分析条件为：安捷伦1200HPLC色谱系统，串联AB Api 4000三重四极杆质谱(HPLC-QqQ-MS)；ESI离子源；正离子模式；质荷比(m/z)，100-1000；源电压，4kV；源温度600℃；色谱柱，Zorbax SB C18(4.6mm×100mm，1.8μm)；流动相为0.05％甲酸-水(A)和0.05％甲酸-乙腈(B)；流速0.4mL/min；洗脱梯度为0-1min，1％B；1-7min，1-70％B；7-7.5min，70-99％B；7.5-11min，99％B；11-11.5min，99-1％B；11.5-15min，1％B；进样量5μL；柱温30℃。
ACE2质谱探针的HPLC-QqQ-MS色谱图如图3所示，其1H核磁共振谱图如图4所示。从质谱图上可以看到准分子离子峰[M+H]+(m/z 576.7)以及双电荷离子[M+2H]2+(m/z288.9)。这些离子与探针的结构相吻合，也进一步确证了探针的结构。
实施例3：ACE2质谱探针对ACE2的检测灵敏度考察
取5μL质谱探针PP-DAPK(终浓度约50μM)，不同浓度ACE2(终浓度分别为400、300、200、150、100、50、25、5、1、0.5、0.25、0.05、0.01μg/L)，以50mM Tris-HCl pH 7.5补齐至100μL，37℃孵育30min后加200μL甲醇终止反应，溶液涡旋、离心，取上清用于进样分析。分析条件为：安捷伦1200HPLC色谱系统，串联Api 4000三重四极杆质(HPLC-QqQ-MS)；ESI离子源；正离子模式；MRM模式；源电压，4500V；源温度530℃；色谱柱，Zorbax SB C18(4.6mm×100mm，1.8μm)；流动相为0.05％甲酸-水(A)和0.05％甲酸-乙腈(B)；流速0.4mL/min；洗脱梯度为0-1min，1％B；1-7min，1-70％B；7-7.5min，70-99％B；7.5-11min，99％B；11-11.5min，99-1％B；11.5-15min，1％B；进样量5μL；柱温30℃。检测结果见图5。
由图5可见，质谱探针PP-DAPK对ACE2的检测限为0.05μg/L，线性范围5μg/L-250μg/L(R2>0.97)。
实施例4：ACE2质谱探针对ACE2的检测特异性考察
在5μL质谱探针PP-DAPK(终浓度约50μM)中，加入终浓度约为150ng/mL的ACE2、DPP4、牛血清白蛋白、脂肪酶、α-葡萄糖苷酶、α-胰凝乳蛋白酶、蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)、血管紧张素转换酶(ACE)、凝血酶和胰蛋白酶，以缓冲液50mM Tris-HCl pH 7.5补齐至100μL，37℃孵育30min后加200μL甲醇终止反应，溶液涡旋、离心，取上清，按照实施例3所述的分析方法进行分析，检测结果见图6。
由图6可见，除ACE2组的峰面积较高外，其他对照组的峰面积均较低，表明该质谱探针仅能被ACE2特异性识别，该质谱探针对ACE2具有较强的检测特异性。
实施例5：ACE2质谱探针在血清中ACE2活性检测的应用
取10μL ACE2探针溶液，加入10μL健康人及糖尿病患者血清，37℃孵育30分钟，加120μL甲醇终止反应，8000rpm离心10min后取上清液用于进样分析。空白血清组以纯水代替探针，空白探针组以纯水代替血清。
样品组1：加入5μL PP-DAPK(终浓度约50μM)、5μLACE2蛋白(终浓度125μg/L)；
样品组2：加入5μL PP-DAPK(终浓度约50μM)、10μL健康人血清2号；
样品组3：加入5μL PP-DAPK(终浓度约50μM)、10μL健康人血清7号；
样品组4：加入5μL PP-DAPK(终浓度约50μM)、10μL健康人血清13号；
样品组5：加入5μL PP-DAPK(终浓度约50μM)、10μL糖尿病患者血清30号；
样品组6：加入5μL PP-DAPK(终浓度约50μM)、10μL糖尿病患者血清35号；
样品组7：加入5μL PP-DAPK(终浓度约50μM)、10μL糖尿病患者血清40号；
质谱分析条件为安捷伦1200HPLC色谱系统，串联Api 4000三重四极杆质(HPLC-QqQ-MS)；ESI离子源；正离子模式；MRM模式；CAD：4；CUR：30；GS1：40；GS2：45；IS：4500；TEM：500。色谱柱，Zorbax SB C18(4.6mm×100mm，1.8μm)；流动相为0.05％甲酸-水(A)和0.05％甲酸-乙腈(B)；流速0.4mL/min；洗脱梯度为0-1min，1％B；1-7min，1-70％B；7-7.5min，70-99％B；7.5-11min，99-99％B；11-11.5min，99-1％B；11.5-15min，1-1％B；进样量，5μL。柱温30℃。检测结果见图7。
由图7可见，ACE2探针可用于检测血清中ACE2酶活性，健康人血清中ACE2酶活性相对较低，糖尿病患者血清中ACE2活性较高，表明该探针可以用于临床血清样本中ACE2活性分析。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种用于ACE2活性检测的质谱探针及其制备方法和应用
<150> 2019109740470
<151> 2019-10-14
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ala Pro Lys
1

Claims (8)

1.一种用于ACE2活性检测的质谱探针，其特征在于，包括氨基酸序列为Asp-Ala-Pro-Lys的多肽及修饰在所述多肽的天冬氨酸上的哌嗪类化合物。
2.如权利要求1所述的质谱探针，其特征在于，所述哌嗪类化合物为1-(2-嘧啶基)哌嗪、1-(4-吡啶基)哌嗪或1-(1-甲基-4-吡啶基)哌嗪。
3.如权利要求1所述的质谱探针，其特征在于，所述哌嗪类化合物为1-(2-嘧啶基)哌嗪。
4.如权利要求1所述的质谱探针，其特征在于，其结构式如下式(Ⅰ)所示：
Figure FDA0002366738410000011
5.如权利要求1-4任一项所述的质谱探针的制备方法，其特征在于，包括：采用固相法合成氨基酸序列为Asp-Ala-Pro-Lys的多肽，再将多肽与哌嗪类化合物进行固相合成多肽反应，纯化后即得所述的质谱探针。
6.如权利要求5所述的质谱探针的制备方法，其特征在于，所述多肽由以下方法制得：先用二氯甲烷溶涨树脂，再加入3倍摩尔过量的保护氨基酸原料，再加入5倍摩尔过量的N,N-二异丙基乙胺进行反应，反应结束后加20％哌啶-二甲基甲酰胺溶液进行脱保护；重复上述步骤依次连接氨基酸Lys、Pro、Ala、Asp后制得。
7.如权利要求1-4任一项所述的质谱探针在ACE2活性检测中的应用。
8.如权利要求1-4任一项所述的质谱探针在制备检测血清中ACE2活性试剂中的应用。
CN202010038071.6A 2019-10-14 2020-01-14 一种用于ace2活性检测的质谱探针及其制备方法和应用 Active CN111087445B (zh)

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