CN102105599A

CN102105599A - 作为用于分子识别酵母和真菌种类的目标基因的Ace2

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Publication number: CN102105599A
Application number: CN200980129337XA
Authority: CN
Inventors: T·G·巴里; T·J·史密斯; M·马赫; M·简克威兹; L·奥’考纳尔; N·图伊特; S·拉黑夫
Original assignee: National University of Ireland
Current assignee: National University of Ireland
Priority date: 2008-06-13
Filing date: 2009-06-15
Publication date: 2011-06-22
Anticipated expiration: 2029-06-15
Also published as: IES20090467A2; AU2009256587A1; ZA201009016B; EP2294221A1; JP2011522555A; WO2009150243A1; AU2009256587B2; EP2294221B1; CN102105599B; US20120094283A1

Abstract

本发明涉及用于识别一种或更多种酵母种类的核酸引物和探针。更具体而言，本发明涉及Ace2基因、相应的RNA、特异性探针、引物和与其有关的寡核苷酸，以及它们在检测和/或区分酵母种类的诊断分析中的应用。

Description

作为用于分子识别酵母和真菌种类的目标基因的Ace2

发明领域

本发明涉及用于识别一种或更多种酵母种类(species)的核酸引物和探针。更具体而言，本发明涉及Ace2基因、相应的RNA、特异性探针、引物和与其有关的寡核苷酸，以及它们在检测和/或区分酵母种类的诊断检测中的应用。

发明背景

酵母和真菌感染代表了免疫妥协患者发病率和死亡率的主要原因。处于酵母和真菌感染风险中的免疫妥协患者每年持续增加，这如同引起疾病的真菌和酵母因子的范围每年持续增加一样。由真菌感染、尤其是侵袭性真菌感染引起的死亡率在某些风险群体中是30％或更高。可用的抗真菌剂的阵容在增长；然而，对固有的和新出现的抗真菌药物抗性的识别也在增长。这些因素促成了在实验室检测中进行经费控制的增加需求，并已经导致检测程序中的实验室合并(laboratoryconsolidation)。

侵袭性真菌感染正在增加。在2003年，估计有900万的风险患者，其中120万发生感染。念珠菌属菌种(假丝酵母属菌种，Candida spp.)现被列为感染免疫抑制患者的最主要病原体。尤其地，在泌尿道、呼吸系统和血流中，在插入支架、导管和整形外科接头的部位处，感染是常见的。约10％的已知念珠菌属菌种已经牵涉到人类感染。当念珠菌进入血流时发生侵袭性念珠菌病，并且，估计其在美国以8/100,000人口的频率发生，死亡率为40％。白色念珠菌(Candida albicans)是血流感染的第四种最常见的原因。新出现的真菌病因子包括：镰刀菌属(Fusarium)、丝孢菌属(Scedosporium)、接合菌(Zygomycetes)和毛孢子菌菌种(Trichosporonspp.)(“Stakeholder Insight：Invasive fungal infections(侵袭性真菌感染)”，Datamonitor，Jan 2004)

免疫妥协患者，包括移植患者和手术患者、新生儿、癌症患者、糖尿病患者和那些患有HIV/AIDs的患者处于发生侵袭性真菌感染的高风险中(Datamonitorreport：Stakeholder opinion-Invasive fungal infections，options outweighreplacements(侵袭性真菌感染，选择重于取代)2004)。每年有大量严重的脓毒症病例被报道。尽管其医学管理有所改进，但脓毒症仍是重症特别护理医学中最大的挑战之一。引起脓毒症的微生物(细菌、真菌和酵母)传统地借助差灵敏性(25-82％)的微生物学培养方法在医院化验室中检测，其非常耗费时间，通常要花费2到5天来完成，并且花费多达8天来诊断真菌感染。

由酵母或真菌引起的感染的确诊通常是基于从临床样本中回收并识别特定因子，或者显微镜证明具有独特形态学特征的真菌或酵母。然而，存在这些方法不能提供关于感染因子的结论性证据的众多情况。在这些情况中，可以应用特异性宿主抗体反应的检测，尽管这可再次被患者的免疫状态所影响。在检测并识别通常由细菌、酵母或真菌引起的血流感染中，时间是关键性的。有效处理取决于迅速有效地找到感染源并就抗生素或抗真菌剂做出正确的决定。

基于真菌和酵母核酸的诊断主要集中于核糖体RNA(rRNA)基因、RNA转录物及其相关的DNA/RNA区域。rRNA基因在所有真菌种类中高度保守，并且它们也含有分歧的和独特的基因间转录间隔区。核糖体rRNA包含3个基因：大亚单位基因(28S)、小亚单位基因(18S)和5.8S基因。28S和18S rRNA基因被5.8S rRNA和两个内转录间隔区(ITS1和ITS2)分开。由于ITS区域含有多数的序列多态性，许多研究者已经将他们的努力集中于此作为目标(Atkins and Clark，2004)。rRNA基因也是多拷贝基因，在真菌基因组中大于10个拷贝。

许多团队从事于开发真菌和酵母感染的新分析。US2004044193涉及白色念珠菌的转录因子CaTEC1；其抑制剂，以及诊断和治疗与念珠菌属感染相关的疾病的方法；也涉及含有核酸序列、蛋白质、宿主细胞和/或抗体的诊断和药物组合物，和许多其它方面。WO0183824涉及杂交分析探针和附属寡核苷酸(accessoryoligonucleotides)，用于检测来自白色念珠菌和/或都柏林念珠菌(Candidadubliniensis)的核糖体核酸。US6017699和US5426026涉及一组DNA引物，其可以用于扩增并形成(speciate)5个医学上重要的念珠菌属种类的DNA。US 6747137公开了有助于诊断念珠菌属感染的序列。EP 0422872和US 5658726公开了基于18S rRNA基因的探针，而US 5958693公开了基于28S rRNA的探针，用于诊断一系列酵母和真菌种类。US 6017366描述了基于几丁质合酶基因的序列，用于一系列念珠菌属种类的基于核酸的诊断学。

但是清楚的是，需要开发更快、更精确的诊断方法，尤其是鉴于由现代抗微生物剂治疗引起的选择压力，所述抗微生物剂治疗产生具有突变基因组序列的抗性有毒菌株的增加群体。能早期诊断感染的微生物病因的方法使得能够选择特定狭窄范围的抗生素或抗真菌剂来治疗该感染(Datamonitor report：Stakeholderopinion-Invasive fungal infections，options outweigh replacements(侵袭性真菌感染，选择重于取代)，2004；Datamonitor report：Stakeholder Opinion-Sepsis，under reactionto an overreaction(脓毒症，反应不足到过度反应)，2006)。

只有在病原体被正确识别后，才能开始使用特异性抗生素或抗真菌剂的靶向治疗。许多医师希望看到用于酵母和真菌早期诊断的更好的体外扩增和直接检测诊断技术的发展(“Stakeholder Insight：Invasive fungal infections(侵袭性真菌感染)”，Datamonitor，Jan 2004)。本发明提供了应用于核酸诊断(NAD)检测的新的真菌和酵母核酸目标。这些是临床有意义的细菌和真菌病原体的快速、精确的诊断检测，用于临床部门中的生物分析应用。

Ace2是一种DNA结合的、细胞周期调控的转录因子。Ace2类似于转录因子SW15起作用，然而它们激活不同的基因。被翻译的Ace2蛋白存在于细胞周期早G1期中的细胞核中，并因而特异地激活G1期中基因的表达。尤其地，它激活CTS1基因。CTS1是几丁质酶编码基因，该基因在胞质分裂中被需要以降解母细胞和子细胞之间的细胞壁。在NCBI GenBank数据库中可公开获得7条Ace2序列，包括5个念珠菌属菌种序列。曲霉属菌种(Aspergillus spp.)没有可公开获得的Ace2序列。本发明人已经设计了PCR引物以在念珠菌属菌种中扩增与白色念珠菌中碱基对位置1736到2197相当的Ace2区域。Ace2基因的所述区域对于分子识别和/或区分酵母种类有用途。

定义

“合成寡核苷酸”指不直接来自基因组DNA或活的生物的2个或更多个核苷酸碱基的核酸聚合物分子。术语合成寡核苷酸拟包含已经用化学方法制造的或在体外酶合成的DNA、RNA和DNA/RNA杂交分子。

“寡核苷酸”是具有两个或更多个共价结合在一起的核苷酸亚单元的核苷酸聚合物。寡核苷酸通常为约10到约100个核苷酸。核苷酸亚单元的糖基团可以是核糖、脱氧核糖，或其改性的衍生物如OMe。核苷酸亚单元可以由如磷酸二酯键、修饰的键的键连接，或由不阻止寡核苷酸杂交到其互补的目标核苷酸序列上的非核苷酸部分连接。修饰的键包括这些键，其中标准的磷酸二酯键被不同的键取代，所述不同的键如硫代磷酸酯键、甲基磷酸酯键或中性肽键。根据本发明，含氮碱基类似物也可以是寡核苷酸的组分。

“目标核酸”是包含目标核酸序列的核酸。“目标核酸序列”、“目标核苷酸序列”或“目标序列”是可以与互补寡核苷酸杂交的特定脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列。

“寡核苷酸探针”是具有这样的核苷酸序列的寡核苷酸，所述核苷酸序列足以与其目标核酸序列互补，以能够在高度严格杂交条件下形成可检测的杂交探针：目标双链体。寡核苷酸探针是一种分离的化学物质，并可以包括目标区域外面的另外的核苷酸，只要这些核苷酸不阻止高度严格杂交条件下的杂交。非互补序列，如启动子序列、限制性内切核酸酶识别位点、或者赋予期望的二级或三级结构如催化活性部位的序列可以被使用，以促进使用发明探针的检测。寡核苷酸探针任选地可以标记有可检测部分，如放射性同位素、荧光部分、化学发光剂、纳米颗粒部分、酶或配体，它们可以被使用以检测或确定探针杂交到其目标序列。寡核苷酸探针优选地在约10到约100个核苷酸长的大小范围，尽管探针有可能长达约500个核苷酸及多于约500个核苷酸，或者长度小于10个核苷酸。

“杂交物”或“双链体”是通过互补碱基之间的Watson-Crick碱基配对或非规范碱基配对在两条单链核酸序列之间形成的复合体。“杂交”是这样的过程，通过该过程，两个互补的核酸链联合形成双链结构(“杂交物”或“双链体”)。“真菌”或“酵母”意指真菌界的任何生物，并且优选地，关注于子囊菌(Ascomycota)门的任何生物。

“互补”是由单链DNA或RNA的碱基序列赋予的一种特性，通过各自链上的Watson-Crick碱基对之间的氢键，所述单链DNA或RNA可以形成杂交物或双链DNA:DNA、RNA:RNA或DNA:RNA。腺嘌呤(A)通常与胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)互补，而鸟嘌呤(G)通常与胞嘧啶(C)互补。

术语“严格(stringency)”用于描述在杂交以及随后的处理步骤过程中存在的温度、离子强度和溶剂组成。本领域的技术人员会认识到“严格”条件可通过单独或共同改变那些参数而变化。在高度严格条件下，只有高度互补核酸杂交物才会形成；没有足够程度互补性的杂交物不会形成。因此，试验条件的严格性决定了形成杂交物的两个核酸链之间需要的互补性的量。严格条件被选择以最大化由目标和非目标核酸形成的杂交物之间的稳定性差异。

在“高度严格”条件下，核酸碱基配对只会发生在具有高频率互补碱基序列的核酸片段之间(例如，在“高度严格”条件下的杂交可发生在具有约85-100％同一性、优选约70-100％同一性的同系物之间)。在中等严格条件下，核酸碱基配对会发生在具有中间频率互补碱基序列的核酸之间(例如，在“中等严格”条件下的杂交可在具有约50-70％同一性的同系物之间发生)。因此，“弱”或“低”严格条件常常是来自遗传上不同的生物的核酸所要求的，因为互补序列的频率通常较低。

‘高度严格’条件是那些相当于这样的条件，即于42℃下，在由5×SSPE(43.8g/l(克/升)NaCl、6.9g/l NaH₂PO₄H₂O和1.85g/l EDTA，用NaOH将pH调至7.4)、0.5％SDS、5×Denhardt’s试剂和100μg/ml(微克/毫升)变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，接下来，于42℃下，在含有0.1×SSPE、1.0％SDS的溶液中洗涤，其时使用约500个核苷酸长的探针。

“中等严格”条件是那些相当于这样的条件，即于42℃下，在由5×SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH₂PO₄H₂O和1.85g/l EDTA，用NaOH将pH调至7.4)、0.5％SDS、5×Denhardt’s试剂和100μg/ml变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，接下来，于42℃下，在含有1.0×SSPE、1.0％SDS的溶液中洗涤，其时使用约500个核苷酸长的探针。

‘低严格’条件是那些相当于这样的条件，即于42℃下，在由5×SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH₂PO₄H₂O和1.85g/l EDTA，用NaOH将pH调至7.4)、0.1％SDS、5×Denhardt’s试剂[每500ml的50×Denhardt’s含有：5g Ficoll(Type 400，Pharamcia)、5g BSA(Fraction V；Sigma)]和100μg/ml变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，接下来，于42℃下，在含有5×SSPE、0.1％SDS的溶液中洗涤，其时使用约500个核苷酸长的探针。

在基于核酸体外扩增的技术的上下文中，通过使用该体外扩增技术特定的温度条件和离子缓冲条件来实现“严格”。例如，在PCR和实时PCR的上下文中，通过使用特定的温度和离子缓冲强度来实现“严格”，以将寡核苷酸引物，而对于实时PCR来说是探针，杂交到目标核酸上，以体外扩增目标核酸。

本领域的技术人员会理解，本发明的实质上相应的探针可以与所提到的序列不同，并仍与相同的目标核酸序列杂交。核酸的这种变异可根据序列中一致碱基的百分比或探针与其目标序列之间完全互补碱基的百分比来陈述。如果这些百分比是从约100％到约80％，或者从约10个核苷酸目标序列中0碱基错配到约10个核苷酸目标序列中约2个碱基错配，那么本发明的探针实质上相应于核酸序列。在优选的实施方式中，该百分比是从约85％到约100％。在更优选的实施方式中，该百分比是从约90％到约100％；在其它优选的实施方式中，该百分比是从约95％到约100％，例如：95％、96％、97％、98％、99％或100％。

通过“充分互补(sufficiently complementary)”或“实质上互补(基本互补，substantially complementary)”意指核酸具有足够邻接互补核苷酸数量，以在高度严格杂交条件下形成稳定用于检测的杂交物。实质上互补也可以指与给定的参考序列具有至少90％同一性至例如95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

术语“同一的”或百分比“同一性”在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，指两个或更多个序列或子序列，如使用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法用以下描述的默认参数所测定的，或者通过手工比对和目视检查(参见例如ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/的NCBI网站或类似物)所测定的，它们是相同的或者具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即，当在比较窗口或指明区域(designated region)中针对最大相关性进行比较和比对时，在指定区域中约60％的同一性，优选为65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)。这样的序列随后被称为“实质上同一的”。该定义也指测试序列的评价(compliment)，或者可用于测试序列的评价。该定义也包括具有缺失和/或插入的序列，以及那些具有置换的序列。如下所述，优选的算法可以解释空位和类似物。优选地，同一性存在于至少约25个氨基酸或核苷酸长的区域中，或者更优选地，存在于50-100个氨基酸或核苷酸长的区域中。

对于序列比较，通常一条序列作为参考序列，测试序列与所述参考序列相比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入到计算机中，指定子序列坐标，如果需要则指定序列算法程序参数。优选地，可以使用默认程序参数，或者可以指定可选的参数。然后，基于程序参数，序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

如本文所使用的“比较窗口”包括参考选自从20到600、通常约50到约200、更通常约100到约150的连续位置数目中的任何一个的区段，其中，一个序列可以与该相同数目连续位置的参考序列相比较——在这两条序列最佳比对之后。比对序列用于比较的方法在本领域是众所周知的。用于比较的最佳序列比对可以例如由Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法(localhomology algorithm)、Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法(homology alignment algorithm)、Pearson & Lipman，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的搜索相似性方法(search for similarity method)、这些算法的计算机化执行(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Wisconsin Genetics SoftwarePackage中，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI)进行，或者通过手工比对和目视检查(参见例如，Current Protocols in Molecular Biology(当前的分子生物学方案)(Ausubel et al.，eds.1987-2005，Wiley Interscience))进行。

适于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的优选例子是BLAST和BLAST 2.0算法，其在Altschul et al.，Nuc.Acids Res.25：3389-3402(1977)和Altschulet al.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中各有描述。使用本文描述的参数，BLAST和BLAST 2.0被用于确定本发明核酸和蛋白质的序列同一性百分比。进行BLAST分析的软件可通过美国国立生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公开获得。该算法包括通过识别查询序列中长度W的短字串来首先识别高分序列对(HSPs)，其在与数据库序列中相同长度的字串比对时或者匹配、或者满足一些正赋值的阈值分值T。T是指邻近字串分值阈值(Altschul et al.，见上)。这些最初的邻近字串命中充当起始搜索的种子以找到包含它们的更长的HSPs。字串命中沿每条序列在两个方向上延伸，直到积累的比对分值可以增加。对于核苷酸序列，积累分值是使用参数M(对匹配残基对的赋分；通常＞0)和N(对错配残基的罚分；通常＜0)计算的。对于氨基酸序列，得分矩阵被用于计算累计分值。当积累的比对分值从其最大获得值下降数量X时；当由于一个或更多个负得分残基比对的积累，累积分值变为零或小于零时；或者当达到任一序列的末端时，每一方向中的字串命中延伸被停止。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用默认的字串长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用默认的字串长3和期望值(E)10，以及BLOSUM62得分矩阵(参考Henikoff & Henikoff，Proc.Nail.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和比较两条链。

“核酸”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，和其单链或双链形式的聚合物，以及其互补物。该术语包含含有已知的核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接的核酸，其是合成的、自然发生的以及非自然发生的，其具有与参考核酸相似的结合特性，并且其以与参考核苷酸相似的方式被代谢。这样的类似物的例子包括但不限于：硫代磷酸酯、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、甲基磷酸酯、手性甲基磷酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNAs)。

“核酸杂交”或“探针：目标双链体”意为双链、氢键结构的结构，优选为约10到约100个核苷酸长，更优选为14到50个核苷酸长，尽管这将在一定程度上取决于寡核苷酸探针的总长度。该结构足够稳定，以便通过如化学发光或荧光检测、放射自显影术、电化学分析或凝胶电泳的手段来检测。这样的杂交物包括RNA:RNA、RNA:DNA或DNA:DNA双链体分子。

“RNA和DNA等价物”指具有相同互补碱基对杂交特性的RNA和DNA分子。RNA和DNA等价物具有不同的糖基团(即，核糖对脱氧核糖)，并且可以通过尿嘧啶存在于RNA中和胸腺嘧啶存在于DNA中而不同。RNA和DNA等价物之间的差异不促成实质上相应的核酸序列中的差异，因为等价物对特定的序列具有相同程度的互补性。

“优先杂交”表示在高度严格杂交条件下，寡核苷酸探针可以与其目标核酸杂交以形成稳定的探针：目标杂交物(因而表明存在目标核酸)，而不形成稳定的探针：非目标杂交物(其将表明存在来自其它生物的非目标核酸)。因此，探针以比非目标核酸实质上更大的程度杂交到目标核酸上，以使本领域技术人员能正确地检测这些种类的存在(例如，念珠菌属)并将这些种类与其它生物区分开。优先杂交可以使用本领域已知的和本文描述的技术来测量。

“治疗诊断学”意为使用诊断检测技术诊断疾病，选择正确的治疗方案，并监控患者对治疗的反应。本发明的治疗诊断学可以基于本发明的NAD分析在样品、拭子或从患者收集的样本上的使用。

发明目的

本发明的一个目的是提供序列和/或诊断分析以检测并识别一个或更多个酵母种类。本发明人已经利用Ace2基因序列来设计对念珠菌属Ace2基因具有特异性的引物和探针。这样的引物不仅允许检测酵母和真菌种类，而且也允许在念珠菌属种类之间进行区分。本发明还提供了引物和探针，其允许在不同的念珠菌属种类之间进行辨别。

发明概述

本发明提供了用于检测并识别酵母种类的诊断试剂盒，其包含寡核苷酸探针，所述探针能够与至少部分Ace2基因或其相应mRNA结合。该寡核苷酸探针可以具有与部分Ace2基因或其相应mRNA实质上同源或实质上互补的序列。因此，它能够与互补DNA或RNA分子结合或杂交。Ace2基因可以是酵母Ace2基因。核酸分子可以是合成的。试剂盒可以含有多于一种这样的探针。具体地说，试剂盒可以包含多数这样的探针。此外，试剂盒可以包含用于其它生物，例如，如细菌种类或病毒的另外的探针。

被识别的序列不仅适于基于体外DNA/RNA扩增的检测系统，也适于基于信号扩增(信号放大)的检测系统。此外，被鉴定为合适目标的本发明序列提供了下列优势：在一些区域中具有显著的基因内序列异质性，这是有利的，并使本发明的方面能够关注于类群或种类特异性目标；而且在一些区域中也具有显著的序列同质性，这使本发明的方面能够关注于属特异性酵母和真菌引物以及探针，以用于直接核酸检测技术、信号扩增核酸检测技术以及核酸体外扩增技术而用于酵母和真菌诊断学。Ace2序列在诊断分析中允许多检测性能和自动操作。

本发明序列的优势之一是近缘酵母种类之间的基因内Ace2核苷酸序列多样性使用于诊断学分析以检测酵母的特异性引物和探针能够被设计。Ace2核苷酸序列——既有DNA也有RNA——均可与直接检测、信号扩增检测和体外扩增技术一起用于诊断学分析。Ace2序列在诊断分析中允许多检测性能和自动操作。

试剂盒还可以包括用于扩增至少部分Ace2基因的引物。适当地，试剂盒包括部分Ace2基因的正向和反向引物。

Ace2基因的所述部分可以与白色念珠菌中碱基对位置1736到碱基对位置2197的基因区域的一部分相当。尤其优选的是这样的试剂盒，其含有用于部分Ace2白色念珠菌基因的探针，和/或用于相当于白色念珠菌中碱基对位置1736到碱基对位置2197的基因区域的一部分的探针。与碱基对位置1736到碱基对位置2197相当的区域可以在其它生物中找到，但不一定在相同的位置。

探针可以与选自SEQ ID NOs：4-7和32-39的Ace2基因序列的一部分或其相应mRNA优先杂交。

试剂盒也可以包含另外的探针。所述探针可以具有选自SEQ ID Nos：3、30、31的序列，和也可以充当Ace2基因的探针的与这些序列实质上同源或实质上互补的序列。

理想地，探针具有如SEQ ID NO：30所定义的序列。

试剂盒可以包括至少一种正向体外扩增引物和至少一种反向体外扩增引物，正向扩增引物具有选自SEQ ID Nos：1、20-24的序列，和也可以充当正向扩增引物的与它们实质上同源或互补的序列，而反向扩增引物具有选自SEQ ID Nos：2、25-29的序列，和也可以充当反向扩增引物的与它们实质上同源或互补的序列。理想地，所述正向引物序列选自SEQ ID NOs：21、22和23，而所述反向引物序列选自SEQ ID NOs：27、28和29。诊断试剂盒可以基于直接核酸检测技术、信号扩增核酸检测技术，而核酸体外扩增技术选自下列一种或更多种：聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)、分支DNA技术(bDNA)以及滚环扩增技术(RCAT)，或其它体外酶扩增技术。

本发明也提供了核酸分子，其选自SEQ ID NO.1到SEQ ID NO.40，以及与其实质上同源、或与其部分实质上互补并在基于Ace2基因的诊断学中具有功能的序列。

核酸分子可以含有这样的寡核苷酸，其具有与SEQ ID NO.1到SEQ ID NO.40的核酸分子的一部分实质上同源或实质上互补的序列。本发明也提供了检测检测样品中的目标生物的方法，其包括以下步骤：

(i)在适当的条件下，将检测样品与至少一种如上所定义的寡核苷酸探针混合；和

(ii)在高度严格条件下，将可能存在于检测样品中的任何核酸与寡核苷酸杂交，形成探针：目标双链体；和

(iii)确定探针：目标双链体是否存在；双链体的存在明确(positively)识别出检测样品中目标生物的存在。

本发明的核酸分子和试剂盒可以用于诊断分析，以检测一种或更多种酵母和/或真菌种类的存在、测量患者中的酵母和/或真菌滴度，或者用于评估被设计以减少患者中的酵母和/或真菌滴度的治疗方案的功效的方法中，或者用于测量环境中的酵母和/或真菌污染物。环境可以是医院，或者其可以是食物样品，环境样品例如水，工业样品，如需要生物负载或质量评估的加工中样品或终产品。

本发明的试剂盒和核酸分子可以用于识别和/或表征一种或更多种破坏剂(disruptive agent)，所述破坏剂可以用于破坏Ace2基因功能。破坏剂可以选自反义RNA、PNA和siRNA。

在本发明的一些实施方式中，含有种类特异性探针的核酸分子可以用于在相同属的种之间进行区分。

本发明的寡核苷酸可以在用于检测酵母和真菌目标生物的核酸的组合物中被提供。适应于组合物的意图用途，这样的组合物也可以包含缓冲液、酶、去污剂、盐等。也考虑的是，本发明的组合物、试剂盒和方法尽管在本文中被描述为含有至少一种合成寡核苷酸，其也可以含有具有与该合成核苷酸片段实质上相同的序列的天然寡核苷酸，所述天然寡核苷酸替代合成寡核苷酸或在合成寡核苷酸旁边。

本发明也提供目标酵母和/或真菌生物的体外扩增诊断试剂盒，其包含至少一种正向体外扩增引物和至少一种反向体外扩增引物，正向扩增引物选自也可以充当正向扩增引物的与其实质上同源或互补的一条或更多条序列，而反向扩增引物选自也可以充当反向扩增引物的与其实质上同源或互补的一条或更多条序列。

本发明也提供用于检测候选酵母和/或真菌种类的存在的诊断试剂盒，其包含一条或更多条DNA探针，所述探针含有与候选酵母和/或真菌种类的Ace2基因序列实质上互补或实质上同源的序列。本发明也提供一条或更多条合成寡核苷酸，其具有与下列集合中的一个或更多个实质上同源或实质上互补的核苷酸序列：Ace2基因或其mRNA转录物；酵母Ace2基因或其mRNA转录物；酵母Ace2基因或其mRNA转录物；SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 40中的一个或更多个。

核苷酸可以包括DNA。核苷酸可以包括RNA。核苷酸可以包括DNA、RNA和PNA的混合物。核苷酸可以包括合成核苷酸。本发明的序列(以及与本发明的方法、试剂盒、组合物和分析有关的序列)可以被选择，以便与Ace2基因编码区的一部分实质上同源。基因可以是来自目标酵母或真菌生物的基因。本发明的序列优选为足够的，以便能够对该序列部分形成探针：目标双链体。

本发明也提供目标酵母或真菌生物的诊断试剂盒，其含有寡核苷酸探针，所述探针与本发明的寡核苷酸(其可以是合成的)实质上同源或实质上互补。应该理解，适合用作体外扩增引物的序列也可以适合用作寡核苷酸探针，尽管优选扩增引物可以具有约15个核苷酸到约30个核苷酸(更优选为约15到约23、最优选为约20到约23)之间的互补部分，本发明的寡核苷酸探针可以是任何适合的长度。技术人员应该理解，取决于选择的寡核苷酸探针的长度、性质和结构(例如，用于LightCycler的杂交探针对、Taqman 5’外切核酸酶探针、发夹环结构等)以及序列，将要求不同的杂交和/或退火条件。

本发明的试剂盒和分析也可以被这样提供，其中，寡核苷酸探针被固定于表面上。这样的表面可以是珠子、膜、柱、浸染棒(dipstick)、纳米颗粒、反应室的内表面，如诊断平板的孔或反应管的内部、毛细管或管(vessel)或类似物。

目标酵母或真菌生物可以选自：白色念珠菌、热带念珠菌(C.tropicalis)、光滑念珠菌(C.glabrata)、克柔念珠菌(C.krusei)、近平滑念珠菌(C.parapsilosis)、热带念珠菌、都柏林念珠菌、吉利蒙念珠菌(C.guilliermondii)、挪威念珠菌(C.norvegiensis)、无名念珠菌(C.famata)、C.haemuloni、乳酒念珠菌(C.kefyr)、产朊念珠菌(C.utilis)、维斯念珠菌(C.viswanathii)和曲霉属种类。

目标酵母生物可以是针对已经被试验证明了的给定引物组的念珠菌属种类，并且更优选地，选自：白色念珠菌、热带念珠菌、都柏林念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、吉利蒙念珠菌、挪威念珠菌、无名念珠菌、C.haemuloni、乳酒念珠菌、产朊念珠菌、维斯念珠菌。

在这些情况下，本发明的扩增引物和寡核苷酸探针可以针对基因特异性或属特异性区域来设计，以便能够鉴定目标酵母生物群体中的一个或更多个、或大部分、或几乎全部的期望生物。

检测样品可以包括目标酵母和/或真菌生物的细胞。方法也可包括从可能存在于所述检测样品中的目标酵母或真菌生物的任何细胞中释放核酸的步骤。理想的是，检测样品是从患者中获得的样品(如拭子或血液、尿、唾液、支气管灌洗液、牙齿样本、皮肤样本、头皮样本、移植器官活组织检查、粪便、粘液或排出物样品)的溶解产物。检测样品可以是食物样品、水样品、环境样品、终产物、终产品或加工中的工业样品。

本发明也提供了SEQ ID NO.1到SEQ ID NO.40中任一种在一种或更多种酵母种类的存在情况的诊断分析中的应用。所述种类可以选自：白色念珠菌、热带念珠菌、都柏林念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、吉利蒙念珠菌、挪威念珠菌、无名念珠菌、C.haemuloni、乳酒念珠菌、产朊念珠菌、维斯念珠菌。

本发明也提供用于临床诊断学、治疗诊断学、食品安全诊断学、工业微生物诊断学、环境监测、兽医诊断学、生物恐怖主义诊断学的试剂盒，其含有一种或更多种本发明的合成寡核苷酸。该试剂盒也可以包含选自下列的一种或更多种物品：合适的样品收集仪器、试剂容器、缓冲液、标记部分、溶液、去污剂和补充溶液。本发明也提供本发明的序列、组合物、核苷酸片段、分析和试剂盒在治疗诊断学、食品安全诊断学、工业微生物诊断学、环境监测、兽医诊断学、生物恐怖主义诊断学中的应用。

核酸分子、组合物、试剂盒或方法可以用于基于诊断核酸的分析中，以便检测酵母种类。

核酸分子、组合物、试剂盒或方法可以用于诊断分析中，以检测患者中的酵母或真菌滴度。滴度可以在体外测量。

核酸分子、组合物、试剂盒或方法可以用于评估被设计以减少患者中酵母和/或真菌滴度的治疗方案的功效的方法中，其包括评估在治疗方案的一个或更多个关键时期患者中的酵母和/或真菌滴度(通过体内方法或体外方法)。适当的关键时期可以包括：治疗前、治疗过程中和治疗后。治疗方案可以包含抗真菌剂，如药物。

核酸分子、组合物、试剂盒或方法可以用于诊断分析中，以测量潜在的酵母和/或真菌污染物，例如，在医院中。

核酸分子、组合物、试剂盒或方法可以用于识别和/或表征一种或更多种破坏剂，所述破坏剂可以用于破坏Ace2基因功能。合适的破坏剂可以选自反义RNA、PNA、siRNA。

附图简述

图1：白色念珠菌(XM_707274.1)Ace2基因中的引物结合部位(灰色突出部分)。感兴趣的扩增区域加有下划线(位置：1736到2197)。产物大小＝462碱基对

图2：白色念珠菌探针P1-CanAce2结合部位(加有下划线和粗体部分)在扩增的Ace2基因片段中的位置。PCR引物CanAce2-F/CanAce2-R被突出显示。

图3：用TaqMan探针P1-CanAce2基于Ace2基因进行的白色念珠菌实时PCR分析。用来自四个其它念珠菌属种类和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的一组DNA检测分析的特异性。被测试的三个白色念珠菌菌株在实时PCR中被检测到，并且没有发现与其它种类的DNA的交叉反应。

图4：显示的白色念珠菌引物和探针的位置。图4(a)引物ACF1被标记为粗体，而引物ACR1被标记为粗体下划线；图4(b)引物ACF2被标记为粗体，而引物ACR2被标记为粗体下划线；图4(c)引物ACF3被标记为粗体，而引物ACR3被标记为粗体下划线；以及图4(d)探针被标记为粗体，ACALB1在负链上，ACALB2在正链中。

图5：白色念珠菌(XM_707274.1)Ace2中的引物(ACF2b/ACR3b)结合部位(灰色突出部分)和ACALB1探针(粗体部分)。扩增的感兴趣区域加有下划线。(感兴趣区域的位置：1879-2004)。

图6：白色念珠菌菌株的包容性组(Inclusivity panel)。用TaqMan探针ACALB1和引物组ACF2b/ACR3b基于Ace2基因进行的白色念珠菌实时PCR分析的扩增图。用来自20个白色念珠菌菌株和覆盖临床相关和有关的19个念珠菌菌种的84个菌株的一组DNA检测分析的特异性。(a)被测试的20个白色念珠菌菌株被检测到。(b)没有发现与来自覆盖19个其它念珠菌属种类的84个菌株的DNA的交叉反应。信号仅从(+)对照中获得。

图7：排他性阴道炎/阴道病图。用TaqMan探针ACALB1和引物组ACF2b/ACR3b基于Ace2基因的白色念珠菌实时PCR分析的扩增图。信号仅针对(+)对照(白色念珠菌)样品获得。没有针对排他性组(exclusively panel)中的生物的信号被获得。

图8：用TaqMan探针ACALB1基于Ace2基因的白色念珠菌实时PCR分析的扩增图。用来自白色念珠菌的模板DNA的各种供给(input)来检测分析的灵敏性。发现分析的LOD为约1细胞当量(cell equivalent)。

附图详述

实施例1

材料和方法

细胞培养

念珠菌属种类在沙氏肉汤(Sabouraud broth)(4％wt/vol(重量/体积)的葡萄糖、1％wt/vol的蛋白胨、1.5％的琼脂)中于37℃在振荡培养箱中培养48小时。

DNA提取

在DNA分离前，用溶细胞酶或消解酶预处理念珠菌属菌种的细胞。用MagNA纯化体系(MagNA Pure System)(Roche Molecular Systems)联合MagNA纯化酵母和细菌分离试剂盒III，根据厂商指示，或者Qiagen DNeasy Plant Mini kit(旋转柱形式的基于二氧化硅的DNA纯化)，从念珠菌属菌种分离DNA。

念珠菌属种类中Ace2基因区域的DNA测序

念珠菌属种类Ace2基因的可公开得到的序列从NCBI数据库获得，并用Clustal W比对。PCR引物组，即CanAce2-F/CanAce2-R(图1，表1)被设计，并用于用引物组CanAce2-F/CanAce2-R扩增念珠菌属菌种中的Ace2基因区域，所述区域相当于白色念珠菌中的碱基对位置1736到碱基对位置2197。在白色念珠菌、热带念珠菌和都柏林念珠菌中，通过常规PCR，使用表2所列出的试剂和表3所描述的热循环条件，在iCycler BioRad PCR仪或PTC200Peltier热循环仪(MJ Research)上扩增Ace2基因区域。

用罗氏高纯度PCR产物纯化试剂盒(Roche High Pure PCR Product Purificationkit)或ExoSAP-IT试剂盒(ExoSAP-IT kit)(USB)，根据厂商指示，纯化PCR反应产物，并随后送交Sequiserve，Germany用正向扩增引物CanAce2-F测序。对于3个念珠菌属种类(白色念珠菌，热带念珠菌和都柏林念珠菌)产生了DNA序列信息。

表1：设计用于扩增念珠菌属菌种中Ace2基因区域的PCR引物。

引物名称	引物序列
		CanAce2-F	TATCACCTTTGAAAAAACAATTACC
CanAce2-R	CACCAACACAAATATTTCGATC

表2：用于扩增念珠菌属菌种中Ace2基因区域的常规PCR试剂。

表3：用于扩增念珠菌属菌种中Ace2基因区域的常规PCR反应条件。

表4：基于Ace2基因区域的用于白色念珠菌的TaqMan探针。

P1-CanAce2

CTGTCACCATTGAATGGAGTCCAG

表5：实时PCR试剂。

表6：实时PCR热循环条件

结果

引物和探针设计

将可得到的念珠菌属菌种Ace2基因的序列信息与新产生的念珠菌属菌种Ace2基因的序列信息进行比对，并用生物信息学工具进行分析。根据汇集的白色念珠菌Ace2序列信息设计种类特异性探针(表4)。图2显示了用于扩增并检测白色念珠菌的PCR引物和TaqMan DNA探针的相对位置。使用表5中列出的热循环条件和试剂，在LightCycler上在实时PCR分析中，证明用于鉴定白色念珠菌的TaqMan探针的特异性。对于基于Ace2基因的白色念珠菌分析，PCR引物CanAce2-F/CanAce2-R与TaqMan探针P1-CanAce2联合。通过将来自一系列近缘念珠菌属种类和烟曲霉种类的DNA包含于白色念珠菌实时PCR分析中，确定用于检测白色念珠菌的分析的特异性。该分析检测到白色念珠菌，但是没有检测到来自任何其它测试的念珠菌属种类的DNA或烟曲霉DNA、或与其交叉反应。图3显示了白色念珠菌实时PCR分析以及白色念珠菌分析的特异性。

实施例2

根据产生的序列的in silico分析(电脑分析)来设计用于特异性检测和识别的引物和探针。如下，产生了3个正向和3个反向引物，并设计了2个探针。图4(a)到4(d)公开了Ace2子序列中这些序列的位置。

ACF1：SEQ ID NO：20：ATCAAAGAATCATCACCA

ACF2：SEQ ID NO：21：AGACTTCATTGTTACCAC

ACF3：SEQ ID NO：24：CACCAGGTGAATTGG

ACR1：SEQ ID NO：25：CATTGTATCGACGAGTG

ACR2：SEQ ID NO：26：TGTATCGACGAGTGAAT

ACR3：SEQ ID NO：27：TTCGCACATTGTATCG

ACALB1：SEQ ID NO：30：6FAM-ATATCTTATCCTCATCCGGTCCT--BHQ1

ACALB2：SEQ ID NO：31：6FAM-AGGACCGGATGAGGATAAGATAT--BHQ1

用以下分析条件来评估引物组：UNG处理：50℃2分钟，接下来95℃1分钟；扩增包括50个循环：95℃10秒、60℃30秒，接下来于40℃冷却2分钟。

根据初始分析性能(例如，荧光性和功效)，引物组ACF3/ACR3被选择，以用ACALB1探针进一步评估。进行初始包容性和排他性试验，以评估使用选择的分析寡核苷酸的分析的潜力。用来自14个白色念珠菌菌株和代表19个其它念珠菌属种类的23个菌株的一组DNA来检测分析的特异性。所有测试的14个白色念珠菌菌株都被检测到。没有发现与来自19个其它念珠菌属种类的DNA的交叉反应，即，信号仅从阳性白色念珠菌对照中获得。

显示Ace2分析对白色念珠菌是特异性的，并且，在测试的条件下，初始性能是良好的。

接下来，8个不同的引物组合被检测以减少循环时间。以下条件被检测：于50℃UNG处理2分钟，95℃1分钟；接下来，扩增50个循环：95℃5秒，60℃10秒；其后是40℃2分钟的冷却步骤。

引物组组合ACF2/ACR3和ACALB1探针在这些条件下表现最佳。分析的LOD为约1-10细胞当量。该引物组合在较低的模板供给下展示出较高的荧光，并且，用较早的Cp值检测到了3个1细胞当量中的3个。对引物序列做了轻微的修饰，以进一步缩短循环时间，同时保持灵敏性和特异性(表7)。

表7：对引物序列的修饰。

引物名称	SEQ ID NO	温度
			ACF2	21	53℃
ACF2b	22	57.1℃
			ACF2c	23	59.5℃
ACR3	27	52.7℃
			ACR3b	28	56.8℃
ACR3c	29	60.2℃

被进一步减少的循环条件被检测，即，95℃1秒和60℃10秒的扩增步骤。白色念珠菌DNA的10倍稀释物被制备，并且1×10⁵到0.1细胞当量的供给被用作模板。由于与其它引物组相比，在较低的模板供给下荧光性较高，并且用较早的Cp值检测到了3个1细胞当量中的3个，如表8所示，ACF2b和ACR3b引物的组合被选择用于包容性和排他性检测。

表8：针对不同的Tm引物组获得的CP值。

20个白色念珠菌菌株被选择，以用该引物组证明检测的包容性(见表9，图5和图6)。白色念珠菌的实时PCR分析被完成，如用TaqMan探针ACALB1和引物组ACF2b/ACR3b所描述的那样。所有测试的20个白色念珠菌菌株都被检测到，并且从(-)对照中没有获得信号(见图6(a))。

表9：用于包容性试验的白色念珠菌菌株。

为了证明分析的排他性，对覆盖19个临床相关和有关的念珠菌菌种的84个菌株检测Ace2分析的性能(见下面的表10)。为了保证所有测试的DNA都是PCR可扩增的，用通用真菌引物U1和U2扩增念珠菌属DNA样品。显示所有测试的DNA是PCR可扩增的。使用了10⁵CE/rxn的模板供给，其高于通常测试的模板供给。较高的供给被检测，这是因为测试的生物是有关的念珠菌属，并且在测试前，17个种类的Ace2序列信息没有被确认。每个供给被重复三次检测。没有观察到交叉反应，证明Ace2分析对白色念珠菌检测的特异性(见图6(b))。

表10：念珠菌属特异性组——临床相关和有关的念珠菌属菌种

使用更短的循环条件，用具有45个临床相关生物种类的阴道炎/阴道病组重复三次进一步证明排他性(见下面的表11)。使用了约10⁴CE/rxn的模板供给。没有观察到交叉反应，进一步证明了Ace2分析的特异性(见图7)。

表11：针对Ace2分析测试的阴道病/阴道炎特异性组生物。

用更短的循环时间，使用ACF2b/ACR3b/ACALB1进行概率单位分析，以从统计上确定Ace2分析的LOD(检测的限度)。通过检测8个模板供给和12次重复，来确定Ace2分析的LOD。白色念珠菌菌株CBS 562被选择用于LOD确定。结果显示在以下的表12和图8中。通过概率单位分析，发现了0.839的LOD，其具有大于或等于95％的概率。

表12：供给水平(细胞当量)和概率单位分析的结果。

检测的重复数	供给水平	测试的重复数
			12	10	12
12	5	12
			12	4	12

12	3	12
			12	2	12
11	1	12
			11	0.5	12
1	0.1	12

讨论

免疫妥协患者中酵母和真菌感染的数目正在逐渐增加。促成这种增加的是许多酵母和真菌种类对抗真菌药物不断增加的抗性。因此，需要开发一种快速、精确的诊断方法，以能够早期诊断酵母和真菌种类。早期诊断将使得能够选择特定狭窄范围的抗生素或抗真菌剂以治疗感染。本发明提供了序列和/或诊断检测以检测并识别一种或更多种酵母和真菌种类。本发明人已经开发了念珠菌属种类中eIF2γ基因的序列，来设计对该基因区域具有特异性的引物和探针。Ace2序列是用于设计引物和探针的理想候选物，所述引物和探针分别关注于酵母和真菌种类特异性目标的检测和用于属特异性诊断目标的检测。本发明允许检测酵母和真菌种类，但也允许在念珠菌属种类之间进行区别。

总结

使用新产生的和可公开获得的序列，本发明人已经设计了新的引物和探针，所述探针和引物在此处确定的短循环时间下，对念珠菌属Ace2多核苷酸序列令人惊奇地具有特异性。这样的引物和探针不仅允许检测酵母和真菌种类，而且，令人惊奇地，即使是在短循环时间下，也允许在念珠菌属种类之间进行有效区分以及进行白色念珠菌的特异检测。本发明还提供了引物和探针，所述引物和探针允许在不同的念珠菌属种类之间进行极好的区分。

当参考本发明在本文使用时，用语“包含/含有”和单词“具有/包括”用于指定所陈述的特征、整体/整数、步骤或组分的存在，但不排除一种或更多种其它特征、整体/整数、步骤、组分或其集合的存在或加入。

应该理解，为了清楚而在分开的实施方式上下文中描述的本发明的某些特征也可以结合在单一的实施方式中而提供。反过来，为了简洁而在单一实施方式上下文中描述的本发明的各种特征也可以被单独地提供或以任何适当的亚组合提供。

就本文公开的任何序列与PatentIn3.3软件所附序列表中其对应物不同而言，本正文中的序列将被认为是正确的版本。

SEQ IDs

N或x＝任何核苷酸；w＝a/t、m＝a/c、r＝a/g、k＝g/t、s＝c/g、y＝c/t、h＝a/t/c、v＝a/g/c、d＝a/g/t、b＝g/t/c。在一些情况下，特定的简并选项显示在括号中：例如，(a/g)为A或G。

SEQ ID NO 1：CanAce2-F

TATCACCTTTGAAAAAACAATTACC

SEQ ID NO 2：CanAce2-R

CACCAACACAAATATTTCGATC

SEQ ID NO 3：P1-CanAce2

CTGTCACCATTGAATGGAGTCCAG

SEQ ID NO 4：

＞CA3165-Ace2/ACE2F白色念珠菌

AAACACACCAACGAAGCAACCCCCTGTCACCATTGAATGGAGTCCAGTTATA

TCACCAAACTCAAAACAACCATTACACAAACAAATCAAAGAATCATCACCAC

GACGCCGAATCAAAAAGACTTCATTGTTACCACCAGGTCAATTGGACAATTA

CTGGACAGGACCGGATGAGGATAAGATATATACTTGTACTTACAAAAACTGTG

GGAAAAAATTCACTCGTCGATACAATGTGCGAAGTCATATTCAGACACATTTA

AGTGATCGTCCATTTGGTTGTCAATTCTGTCCGAAPAGATTTGTCAGACAACA

TGATTTGAATCGTCACGTGAAAGGGCACATTGAAGCTAGATATAGCAAATGTC

CTTGTGGTAAAGAGTTTGCTAGATTAGATGCATTAAGAAAACATCAGGATCGA

AATATTTGTGTTGGTG

SEQ ID NO 5：

＞CA765-Ace2/ACE2F白色念珠菌

AAACACTCCCACAAAGCAACCCCCTGTCACCATTGAATGGAGTCCAGTTAT

ATCACCAAACTCAAAGCAACCATTACACAAACAAATCAAAGAATCATCAC

CACGACGCCGAATCAAAAAGACTTCATTGTTACCACCAGGTGAATTGGAC

AATTACTGGACAGGACCGGATGAGGATAAGATATATACTTGTACTTACAA

AAACTGTGGGAAAAAATTCACTCGTCGATACAATGTGCGAAGTCATATTC

AGACACATTTAAGTGATCGTCCATTTGGTTGTCAATTCTGTCCGAAAAGAT

TTGTCAGACAACATGATTTGAATCGTCACGTGAAAGGGCACATTGAAGCT

AGATATAGCAAATGTCCTTGTGGTAAAGAGTTTGCTAGATTAGATGCATTA

AGAAAACATCAGGATCGAAATATTTGTGTTGGTG

SEQ ID NO 6：

＞CA562-Ace2/ACE2F白色念珠菌

AAACACT000ACAAAGCAACCCCCTGTCACCATTGAATGGAGTCCAGTTATA

TCACCAAACTCAAAGCAACCATTACACAAACAJATCAAAGAATCATCACCA

CGACGCCGAATCAAAAAGACTTCATTGTTACCACCAGGTGAATTGGACAAT

TACTGGACAGGACCGGATGAGGATAAGATATATACTTGTACTTACAAAAAC

TGTGGCAAAAAATTCACTCGTCGATACAATGTGCGAAGTCATATTCAGACA

CATTTAAGTGATCGTCCATTTGGTTGTCAATTCTGTCCGAAPAGATTTGTCAG

ACAACATGATTTGAATCGTCACGTGAAAGGGCACATTGAAGCTAGATATAG

CAAATGTCCTTGTGGTAAAGAGTTTGCTAGATTAGATGCTTTGAGAAAGCAC

CAGGATCGAAATATTTGTGTTGGTG

SEQ ID NO 7：

＞CA2700-Ace2/ACE2F白色念珠菌

AAACACTCCCACAAAGCAACCCCCTGTCACCATTGAATGGAGTCCAGTTAT

ATCACCAAACTCAAAGCAACCATTACACAAACAAATCAAAGAATCATCACC

ACGACGCCGAATCAAAAAGACTTCATTGTTACCACCAGGTGAATTCGACAA

TTACTGGACAGGACCGGATGAGGATAAGATATATACTTGTACTTACAAAAA

CTGTGGGAAAAAATTCACTCGTCGATACAATGTGCGAAGTCATATTCAGAC

ACATTTAAGTGATCGTCCATTTGGTTGTCAATTCTGTCCGAAPAGATTTGTCA

GACAACATGATTTGAATCGTCACGTGAAAGGGCACATTGAAGCTAGATATA

GCAAATGTCCTTGTGGTAAAGAGTTTGCTAGATTAGATGCATTAAGAAAAC

ATCAGGATCGAAATATTTGTGTTGGTG

SEQ ID NO 8：

＞CD3494/ACE2F都柏林念珠菌

AAACACTCCCACAAAGCAACCCCCTGTCACCATTGAATGGAGTCCAGTTATA

TCACCAAACTCAAAGCAACCATTACACAAACAAATCAAAGAATCGTCACCAC

GACGCCGAATCAAAAAGACCTCATTGTTGCCACCAGGTGAATTGGATAATTA

CTGGACAGGACCGGATGAGGATAAGATATATACTTGTACTTACAAAAACTGTG

GGAAAAAATTCACTCGTCGATATAATGTGCGAAGTCATATTCAAACACATTTA

AGTGATCGTCCATTTGGTTGTCAGTTCTGTCCCAAAAGATTTGTTAGACAACA

TGATTTGAATCGTCACGTGAAAGGACACATTGAAGCCAGATATAGTAAATGTC

CTTGTGGTAAAGAGTTTGCTAGATTAGATGCTTTGAGAAAGCACCAGGATCG

AAATATTTGTGTTGGTG

SEQ ID NO 9：

＞CD7987/ACE2F都柏林念珠菌

AAACACACCAACGAAGCAACCCCCTGTCACCATTGAATGGAGTCCAGTTATA

TCACCAAACTCAAAACAACCATTACACAAACAAATCAAAGAATCGTCACCAC

GACGCCGAATCAAAAAGACCTCATTGTTGCCACCAGCTGAATTGGATAACTA

TTGGACAGGACCAGATAAAGACAAAATATATACCTGTACCTACAAAAACTGT

GGGAAAAAATTCACTCGTCGATATAATGTGCGAAGTCATATTCAAACACATTT

AAGTGATCGTCCATTTGGTTGTCAGTTCTGTCCCAAAAGATTTGTTAGACAAC

ATGATTTGAATCGTCACGTGAAAGGACACATTGAAGCCAGATATAGTAAATGT

CCTTGTGGTAAAGAGTTTGCTAGATTAGATGCTTTGAGAAAGCACCAGGATC

GAAATATTTGTGTTGGTG

SEQ ID NO 10：

＞CD8501S23/ACE2F都柏林念珠菌

AACACACCAACGAAGCAACCCCCTGTCACCATTGAATGGAGTCCAGTTATAT

CACCAAACTCAAAACAACCATTACACAAACAAATCAAAGAATCGTCACCAC

GACGCCGAATCAAAAAGACCTCATTGTTGCCACCAGGTGAATTGGATAATTA

CTGGACAGGACCGGATGAGGATAAGATATATACTTGTACTTACAAAAACTGTG

GGAAAAAATTCACTCGTCGATATAATGTGCGAAGTCATATTCAAACACATTTA

AGTGATCGTCCATTTGGTTGTCAGTTCTGTCCCAAAAGATTTGTTAGACAACA

TGATTTGAATCGTCACGTGAAAGGACACATTGAAGCCAGATATAGTAAATGTC

CTTGTGGTAAAGAGTTTGCTAGATTAGATGCTTTGAGAAAGCACCAGGATCG

AAATATTTGTGTTGGTG

SEQ ID NO 11：

＞94-Ace2/ACE2F热带念珠菌

TATCACCTTTGAAAPCCAATTACCAAGTACACCAACTAAACAACAAAATTCCC

AAGTTACTATTGAATGGAGCCCTGTTATTTCACCAAATTCCAAAGCATCATTAT

CTAAACAACTCAAAGAATCATCATTACAAACGTCGCCACGTAGAAGAATTAA

AAAGACTTCATTATTGCCACCTGGAGAACTTGATAATTATTGGATTGGACCCG

ATGAAAATAAAATTTATACATGTACTTATAAAAACTGTTTTAAAAAATTTACAA

GAAGATATAATGTTAGAAGTCATATTCAAACTCATTTTGTCCTAAAAGATTTGT

TCGACAACATGATTTAAATCGTCATGTTAAAGGACATATTGAAGCAAGATATA

GTAAATGGACATATTGAAGCAAGATATAGTAAATGTCCATGTGGTAAAGAATT

TGCAAGATTAGATGCTTTAAGAAAACATCAAGATCGAAATATTTGTATTGGTG

SEQ ID NO 12：

＞CT8157-Ace2/ACE2F热带念珠菌

TACACCAACTAAACAACAAAATTCCCAAGTTACTATTGAATGGAGCCCTGTTA

TTTCACCAAATTCCAAAGCATCATTATCTAAACAACTCAAAGAATCATCATTA

CAAACGTCGCCACGTAGAAGAATTAAAAAGACTTCATTATTGCCACCTGGAG

AACTTGATAATTATTGGATTGGACCCGATGAAAATAAAATTTATACATGTACTT

ATAAAAACTGTTTTAAAAAATTTACAAGAAGATATAATGTTAGAAGTCATATTC

AAACTCATTTAPGTGATAGACCATTTGGATGTCAATTTTGTCCTAAAAGATTTG

TTCGACAACATGATTTAAATCGTCATGTTAAAGGACATATTGAAGCAAGATAT

AGTAAATGTCCATGTGGTAAAGAATTTGCAAGATTAGATGCTTTAAGAAAACA

TCAAGATCGAAATATTTGTGTTGGTG

SEQ ID NO 13：

＞CT2311-Ace2/ACE2F热带念珠菌

TACACCAACTAAACAACAAAATTCCCAAGTTACTATTGAATGGAGCCCTGTTA

TTTCACCAAATTCCAAAGCATCATTATCTAAACAACTCAAAGAATCATCATTA

CAAACGTCGCCACGTAGAAGAATTAAAAAGACTTCATTATTGCCACCTGGAG

AACTTGATAATTATTGGATTGGACCCGATGAAAATAAAATTTATACATGTACTT

ATAAAAACTGTTTTAAAAAATTTACAAGAAGATATAATGTTAGAAGTCATATTC

AAACTCATTTAAGTGATAGACCATTTGGATGTCAATTTTGTCCTAAAAGATTT

GTTCGACAACATGATTTAAATCGTCATGTTAAAGGACATATTGAAGCAAGATA

TAGTAAATGTCCATGTGGTAAAGAATTTGCAAGATTAGATGCTTTAAGAAAAC

ATCAAGATCGAAATATTTGTGTTGGTG

SEQ ID NO 14：

＞CT2424-Ace2/ACE2F热带念珠菌

TACACCAACTAAACAACAAAATTCCCAAGTTACTATTGAATGGAGCCCTG

TTATTTCACCAAATTCCAAGCATCATTATCTAAACAACTCAAAGAATCATC

ATTACAAACGTCGCCACGTAGAAGAATTAAAAAGACTTCATTATTGCCAC

CTGGAGAACTTGATAATTATTGGATTGGACCCGATGAAAATAAAATTTAT

ACATGTACTTATAAAAACTGTTTTAA

AAAATTTACAAGAAGATATAATGTTAGAAGTCATATTCAAACTCATTTAA

GTGATAGACCATTTGGATGTCAATTTTGTCCTAAAAGATTTGTTCGACAAC

ATGATTTAAATCGTCATGTTAAAGGACATATTGAAGCAAGATATAGTAAA

TGTCCATGTGGTAAAGAATTTGCAAGATTAGATGCTTTAAGAAAACATCA

AGATCGAAATATTTGTGTTGGTG

SEQ ID NO 15：

＞gi1684874911refIXM_707274.1I白色念珠菌SC5314推定的(putative)转录因子(Ca019.13543)，mRNA GENE ID：3645995 ace21推定的锌指蛋白，与CUP1[白色念珠菌SC5314]的酿酒酵母ACE2(YLR131C)细胞周期特异转录调节子相似

ATGCATTGGAAATTTCTGAACTTTCGAAAGTACCATCTTTCTTTCCATTTA

AATTTATTTGATCTTTCTCTCTTTTTTATTTCCTTTTACTGCTTTCCCATCCT

ATATATTTGTTTCTTTAATCAAGTCCATTCATTCAGAAGCACACAACCAAG

TCTTATAATGAATAAATTTGACTTGTTTGATGATTACTCGACCAAAGGGTC

AACCATCCCTCTTCCTAATGAAAATTTTGACCAATTATTTTTAAGTTCCGA

AGCCAATGATATGGAATTTCTCTTTTTTATTTCCTTTTACTGCTTTCCCATC

CTATATATTTGTTTCTTTAATCAAGTCCATTCATTCACCATTAATAACGATT

TCCAACACACACCAAATAAGTCAAAATCTCACAGTAGACAATACAGTGGA

ACAGCAATTTTTGGTTTTGCTGACCATAATAAAGATTTGTCCATTAACGGT

GTCAACAATGACTTGTGCAAACAATCCAATAAAGCCATCAATACACAATC

GGTTTCACCTGGTGAGTTGTTGAAACGTTCAAGAGGTTCTCAAACACCAA

CACCAACATCAGCACTACCAGACACTGCCCAAGATATTTTAGATTTTAATT

TTGAGGAAAAACCAATATTGTTGCTTGAGGAGGATGAGCTTGAGGAAGA

AAAACATAAACAACAACAAAGAATGATGACACAGCTGTCACCTTTGAAG

AGAGTAACCACTCCTAGTCAATCACCATTTGTTCAACAGCCACAAACCAT

GAAACAAAGAAAGCCACACAAGAAGACAAACGAGTACATTGTTGCCAAT

GAAAATCCCAATTCGTACAAATTTCCACCATCTCCATCTCCGACTGCCAAA

CGCCAGCAGTATCCACCATCATCTCCAATACCATACAATCCAAAATCAGA

TTCAGTTGGTGGCAATTCTTACTCTGCAAAATACTTGCAGTCTTTAAACAA

AACCCAGCAAATTGAATATGTGGATGATATTGAGCCACTTTTACAGGAAG

ATAATAACAATATGAAATATATTCCAATTCCCGTACAAGAGCCAATGCTG

TATCAAAAACAGAAACCAGTGACACCTCCATTACAGTCACAAAATGATTC

TCAACAATTAGAACCATTGAAGACACCACAACCACAACCAAAACAACAA

CAACAGCAACAGCAACCAAATAATGAACAGGATAAAGAATTTACTGCTA

ATATCAATTTCAACACCTTCTTACCTCCACCTACTCCGCCTAATTTGATTA

ATGGATCTCCCGATTGGAATTCATCGCCAGAACCACATTCTCCTTCCCCAG

GAAGATTGCAACCACCGCAACAGATATCCCCAATTCACCAGAATTTAGGT

GCCATGGGTAATAATATCAACTTTTATACACCCATGTATTACGAGCTTCCA

GTACAAGCTGAACAACCGCAACCACAACCACAACCACATCAACAGCAAC

ATCAACAGCAACAGCATCAACCTGAATTACAAAACACTTACCAACAAATT

AAACACATTCAACAGCAACAGCAAATGCTACAACATCAGTTTCACAACCA

AAACAATCAACTCCGCCAACAACACCCAAATCAATTCCAGAACCAGAACC

AGAACCAGAACCAAAATCAAACTAAGACTCCTTACTCACAACAAAATTTT

AATTTGTCTCCTGCAAAACAACTTAATTCAAATGTAGGTTCCATGCATTTA

TCACCTTTGAAAATCCATGCATTTATCACCTTTGAAAAAACAATTACCAAP

CACTCCCACAAAGCAACCCCCTGTCACCATTCAACAGCATCAACCTGAAT

TACAAAACACTTACCAACAAATTAAACACATTCAACAGCAACAGCAAATG

CCGACGCCGAATCAAAAAGACTTCATTGTTACCACCAGGTGAATTGGACA

ATTACTGGACAGGACCGGATGAGGATAAGATATATACTTGTACTTACAAA

AACTGTGGGAAAAAATTCACTCGTCGATACAATGTGCGAAGTCATATTCA

GACACATTTAAGTGATCGTCCATTTGGTTGTCAATTCTGTCCGAAAAGATT

TGTCAGACAACATGATTTGAATCGTCACGTGAAAGGGCACATTGAAGCTA

GATATAGCAAATGTCCTTGTGGTAAAGAGTTTGCTAGATTAGATGCATTA

AGAAAACATCAGGATCGAAATATTTGTGTTGGTGGGAATAAAAATGTTAT

TAGTAAACCCACAAAGAAAAAGGGAACTAATAACACTCAACAACAATTG

CTTAAAACAGATACAGTGGTTGAGAGGATAGAAAAACAGTTGCTACA

GGAAGATAAGAGTGTTACTGAGGAGTTTTTAATGTTGCAATAG

SEQ ID NO 16：

＞gi|168487564|Iref|IXM_707238.|I白色念珠菌SC5314假定转录因子(Ca019.6124)部分mRNA

ATGCATTGGAAATTTCTGAACTTTCGAAAGTACCATCTTTCTTTCCATTTAAA

TTTATTTGATCTTTCTCTCTTTTTTATTTCCTTTTACTGCTTTCCCATCCTATAT

ATTTGTTTCTTTAATCAAGTCCATTCATTCAGAAGCACACAACCAAGTCTTA

TAATGAATAAATTTGACTTGTTTGATGATTACTCGACCAAAGGGTCAACCAT

CCCTCTTCCTAATGAAAATTTTGACCAATTATTTTTAAGTTCCGAAGCCAAT

GATATGGAATTTTTGTTTAATGAAACATTGATGGGATTACAAGATTTAGATG

TTCCTTCTGGTTATGGAATTCCCCAAAATACCATTAATAACGATTTCCAACA

CACACCAAATAAGTCAAAATCTCACAGTAGACAATACAGTGGAACAGCAAT

TTTTGGTTTTGCTGACCATAATAAAGATTTGTCCATTAACGGTGTCAACAAT

GACTTGTGCAAACAATCCAATAAAGCCATCAATACACAATCGGTTTCACCT

GGTGAGTTGTTGAAACGTTCAAGAGGTTCTCAAACACCAACACCAACATCA

GCACTACCAGACACTGCCCAAGATATTTTAGATTTTAATTTTGAGGAAAAAC

CAATATTGTTGCTTGAGGAGGATGAGCTTGAGGAAGAAAAACATAAACAAC

AACAAAGAATGATGACACAGCTGTCACCTTTGAAGAGAGTAACCACTCCTA

GTCAATCACCATTTGTTCAACAGCCACAAACCATGAAACAAAGAAAGCCAC

ACAAGAAGACAAACGAGTACATTGTTGCCAATGAAAATCCCAATTCGTACA

AATTTCCACCATCTCCATCTCCGACTGCCAAACGCCAGCAGTATCCACCATC

ATCTCCAATACCATACAATCCAAAATCAGATTCAGTTGGTGGCAATTCTTAC

TCTGCAAAATACTTGCAGTCTTTAAACAAAACCCAGCAAATTGAATATGTG

GATGATATTGAGCCACTTTTACAGGAAGATAATAACAATATGAAATATATT

CCAATTCCCGTACAAGAGCCAATGCTGTATCAAAAACAGAAACCAGTGACA

CCTCCATTACAGTCACAAAATGATTCTCAACAATTAGAACCATTGAAGACA

CCACAACCACAACCAAAACAACAACAACAGCAACAGCAACCAAATAATGA

ACAGGATAAAGAATTTACTGCTAATATCAATTTCAACACCTTCTTACCTCCA

CCTACTCCGCCTAATTTGATTAATGGATCTCCCGATTGGAATTCATCGCCAG

AACCACATTCTCCTTCCCCAGGAAGATTGCAACCACCGCAACAGATATCCCC

AATTCACCAGAATTTAGGTGCCATGGGTAATAATATCAACTTTTATACACCC

ATGTATTACGAGCTTCCAGTACAAGCTGAACAACCGCAACCACAACCACAA

CCACATCAACAGCAACATCAACAGCAACAGCATCAACCTGAATTACAAAAC

ACTTACCAACAAATTAAACACATTCAACAGCAACAGCAAATGCTACAACAT

CAGTTTCACAACCAAAACAATCAACTCCGCCAACAACACCCAAATCAATTC

CAGAACCAGAACCAGAACCAGAACCAAAATCAAACTAAGACTCCTTACTCA

CAACAAAGTCAATTCTCACCTACACATTCCAATTTTAATTTGTCTCCTGCAA

AACAACTTAATTCAAATGTAGGTTCCATGCATTTATCACCTTTGAAAAAACA

ATTACCAAACACTCCCACAAAGCAACCCCCTGTCACCATTGAATGGAGTCC

AGTTATATCACCAAACTCAAAGCAACCATTACACAAACAAATCAAAGAATC

ATCACCACGACGCCGAATCAAAAAGACTTCATTGTTACCACCAGGTGAATT

GGACAATTACTGGACAGGACCGGATGAGGATAAGATATATACTTGTACTTA

CAAAAACTGTGGGAAAAAATTCACTCGTCGATACAATGTGCGAAGTCATAT

TCAGACACATTTAAGTGATCG

TCCATTTGGTTGTCAATTCTGTCCGAAAAGATTTGTCAGACAACATGATTTG

AATCGTCACGTGAAAGGGCACATTGAAGCTAGATATAGCAAATGTCCTTGT

GGTAAAGAGTTTGCTAGATTAGATGCATTAAGAAAACATCAGGATCGAAAT

ATTTGTGTTGGTGGGAATAAAAATGTTATTAGTAAACCCACAAAGAAAAAG

GGAACTAATAACACTCAACAACAATTGCTTAAAACAGATACAGTGGTTGAG

AGGATAGAAAAACAGTTGCTACAGGAAGATAAGAGTGTTACTGAGGAGTTT

TTAATGTTGCAATAG

SEQ ID NO 17：

＞热带念珠菌Ace2，来自全基因组DNA序列。手工装配(17146-19101)

ATCATGGATAAGTTTGATTTATTTAGTGACTTTTCAAGTAGACCTTCAACTA

TACCTTTACCTAGTGATAATTTCGATCAATTTTTATTAACTTCAGAACCAAA

TGATATTGATTTCTTATTTAACGAAACTTTAAATGGTTTACAAGATTTAGAT

GTTCCTTCTGGTTACGGGTTTAACCAACAACAAGCACCATCACAACAACAA

CAGCCATATCATTCACCTCATAGATCTAAAACACATAGTCGACAATATAGT

GGTACTGCAATTTTTGGTTTCACAGAACATACAAGAGACTTATCTATAAAC

GGAATTAATAATGACTTGTATAAACAATATGTGAATAAAGGACCTGAAAA

TAATTCTATTTCACCAAACGATTTATTAAGAGAAACCAATAATCATCAACA

AAATCCAATACCAACACAAGATATTTTAAATTTCAATTTTGATGAAAAACC

AATACTTTTATTAGAACAAGATGAGTTGGAAGATGAGAAACATTATTCGG

CTAAATATTTACAATCCTTACAAAAATCACAACCACAGGAATATGTTGATG

ATATTGGTCCATTATTACAAGGAGATGAATTGTCTGATATTAAGTATATCC

CCATTCCCGTTCAGGAACCAGTTGTGTTTGATAAACAAGAAAAAAGGAAT

TCAGCCCCATTGGATCAATCAGAAGAATCAAAACAACCATCAAGAAAAGA

ACAATCTGACCAACAACAGGTACCACAACCAGTACCACAACCAGCAGCAG

CACCACCACAACAGAAACAACAAACATTTCCAGGAAATTTCAATTTCAAT

ACATATTTACCACCTCCTTCTTCACCACCACCTAATTTGAGTAATGGGTCTC

CTGACTGGAATAGCTCTCCAGAACCACAATCTCCTTCGCCAAGTAGATTAC

AACCAAATCAACAAATTTCGCCAGTTCATCAAAATTTACGTGCCATGGGTA

GCAATGTGAATTTTTATAATCCTGTGTATTATGAACAACATCCTCAACAAC

CTCCACCTTCACTACCACCTCATTCTCAACCTTCTCAGCAACTGCAACTGCC

TGGAATGCGTCAGACTTACGAACAAATCAAACAAATTCAACAACAACAAC

AAATGTTGCAACAACAATTTCACACTCAACAACAAACTCAACAACAACTT

CAATCATCACCAATTTATTCCACTTTGAATTCATCACCAATTAAACAATTTA

ATCCTGATACAGTGAATAACTTACAAATATTTCACCTTTGAAAAACCAATT

ACCAAGTACACCAACTAAACAACAAAATTCCCAAGTTACTATTGAATGGA

GCCCTGTTATTTCACCAAATTCCAAAGCATCATTATCTAAACAACTCAAAG

AATCATCATTACAAACGTCGCCACGTAGAAGAATTAAAAAGACTTCATTAT

TGCCACCTGGAGAACTTGATAATTATTGGATTGGACCCGATGAAAATAAA

ATTTATACATGTACTTATAAAAACTGTTTTAAAAAATTTACAAGAAGATAT

AATGTTAGAAGTCATATTCAAACTCATTTAAGTGATAGACCATTTGGATGT

CAATTTTGTCCTAAAAGATTTGTTCGACAACATGATTTAAATCGTCATGTT

AAAGGACATATTGAAGCAAGATATAGTAAATGTCCATGTGGTAAAGAA

TTTGCAAGATTAGATGCTTTAAGAAAACATCAAGATCGAAATATTTG

TATTGGTGGTAACAAA

SEQ ID NO 18：

＞gi1460199391emb1AJ630371.11光滑念珠菌Ace2基因，针对转录因子

ATGAATACTTTCCAGGCGGATTGGGGAGAGATTCCTCAAATGCCAAAGGA

CCAAGTGTTCACGCCCCAGGACCAACTAACGAATTACAACGATAACATGA

TGGACAACTTGCTTGACTTCAATTATAACGATGTTGATGCTCTCCTGTCGG

AGGAGTTGAAGGACTTAGATATACCATTGGCGCCTTCGCCTAGAGACTTGA

ATATGAATGCCGAACAAAGTCTCAATTGGATGCAGGATATACAGGGACAC

AGGTCCAATAAACCTTCGATGTCGCATAAGAGAGGAATGAGTGGTACCGC

AATATTTGGCTTCAAAAATCATAACAAAACCCTCAGCATTGCTAGTTTTAG

CAAGAATACAGACATTATCAATGAAGCTGAGAACGAGAATGTAAAAGGA

AACACAGATAACCAGAATGGCTTTGTATTAAGCCAAGTTCTTCTGAAACAG

CAGGAAGAGCTTCGATTAGCTTTAGAAAAACAGAAAGAAGTAAATAGAAA

CTTAGAGCGGCAACTGCGAGAAAATAGATTACAACAAGAACATATACAGC

GTGTGCTTCACGATCAGGAAGCTGTAACAAGTCAATTAACAGCTCAAAAC

GTAACTGAATCGCCATCAAAACAAAGAAGTCCAACCAAATATCAAGGAGA

TGACGCCATCATAGTTACAAAAAACTCATCTTCTGGCGGCTATGTTTTCCC

ACCTCCACCTCGAGTTACATTAAATAACGAAGCTGTTACTCCACCGCTATC

ATTCTCAAGGTTTAGCAATATTGATCAAATGGAATCTTCAGATCCACTCAA

TTACCTGCAACCAAATGCTGATTTCACAGAGGCTTATGCATCACACAAGAC

ACCCGAATCATCATTTGGAAAGGAACATGCTTCAGTGCTTTCAACATCGGA

ATTTTTGAGACCTACCAATGCTGCTAGAGAATCATCATCAAAGGCAATGTA

TAGCTCACCAAACAGTATGATTTCACCTCATAGGAAAAAAGATTCTGTTCT

CTCAACAGTTTCTACTATTTTACAACCCCAAGATGACTATCAGAACACTGC

AAGTCCGCCTTCGCAAATGTTGAACTTAGAAGAAGCCAATTTAGAGAATG

AACAAAAGAACAATGGGAAAATGCTACGTGCACCAGTAGAAATTATGCCA

ACTATACCGGGATCAAAAAATAATACTCCCATGACTGCTAATAAGTCTGG

ATTCATGCCTCAGAAACATACTTTCCAGCAT

ACTCCTGTGAAAGCGAAAAATAATGTGGACATGAACGAGAGATCATTGGT

ACGGCCGGAGCTATCAGGAACACCACTCAATAAGAGCGTACAAAATGGAA

TGCATTTTAGAGAAGAGGACGACAGTAATATATTGCACCATATATCAGAA

ATACCGCAAGGATCAACATCACATAATAATACCACCGCTGGCGATGATTC

AAATGTGGACAATAGGTTACAATTTTCTAATACCGAAAGTAGTCCAAGCC

GGCAAAGGAAAAAACCTACTACATTACCACCAGGTTATATTGATCGATTTG

TTAAAGAACTACCTGACAAGAATTTTGAATGTTTATTTCCTAACTGTGGTA

AATTTTTTAGGAGAAGGTATAATATAAAGTCCCATATTCAAACACATCTAG

AAGATAAACCATATAAGTGTGACTTTGAGGGATGCACTAAAGCGTTTGTG

AGGAATCATGACCTTGCTAGACACAAGAAGACTCATGATAAGCATTTTTCT

TGTCCCTGCGGGAAAAAATTCAGCTCAGAACAATCAATGATGAAGCACAA

GAATAGGCATAACTGCACTGGCCCTGCCAGAGTTCCTGATTCCAAAATGGT

ATCCAAGTCTCCTAGAAAACAATCTTCTCCCACTAAACTTTCTTCAGCGAT

AATGAATAGCCCCATAAAGGAAAATTATCTGAAAGAAAATACCAACCTAC

ATATCGATCAATTAAGAATGGATCCTAAAATGAGAAATGCACTAGAGGAT

GGGGGGCTATTGAAGCCAGTTGAGAGAACTGAAGCAATGGCTTTTCCATC

TCCACTATCGGGATATAGTGATTTGGGTTCCCCTTTTAGAGATTTAGGGAC

GATTGAGGAGTAG

SEQ ID NO 19：

＞gi|50294246|ref|XM 449535.1|光滑念珠菌CBS138假定蛋白(CAGL0M0323g)部分mRNA

ATGAATACTTTCCAGGCGGATTGGGGAGAGATTCCTCAAATGCCAAAGGAC

CAAGTGTTCACACCCCAGGACCAACTAACGAATTACAACGATAACATGATG

GACAACTTGCTTGACTTCAATTATAACGATGTTGATGCTCTCCTGTCGGAGG

AGTTGAAGGACTTAGATATACCATTGGCGCCTTCGCCTAGAGATCTGAATAT

GAATGCCGAACAAAGTCTCAATTGGATGCAGGATATACAGGGACACAGGTC

AAATAAACCTTCGATGTCGCATAAGAGAGGAATGAGTGGTACCGCAATATT

TGGCTTCAAAAATCATAACAAAACCCTCAGCATTGCTAGTTTTAGCAAGAAT

ACAGACATTATCAATGAAGCTGAGAACGAGAATGTAAAAGGAAACACAGA

TAACCAGAATGGCTTTGTATTAAGCCAAGTTCTTCTGAAACAGCAGGAAGA

GCTTCGATTAGCTTTAGAAAAACAGAAAGAAGTAAATAGAAACTTAGAGCG

GCAACTGCGAGAAAATAGATTACAACAAGAACATATACAGCGTGTGCTTCA

CGATCAGGAAGCTGTAACAAGTCAATTAACAGCTCAAAACGTAACTGAATC

GCCATCAAAACAAAGAAGTCCAACCAAATATCAAGGAGATGACGCCATCAT

AGTTACAAAAAACTCATCTTCTGGCGGCTATGTTTTCCCACCTCCACCTCGA

GTTACATTAAATAACGAAGCTGTTACTCCACCGCTATCATTCTCAAGGTTTA

GCAATATTGATCAAATGGAATCTTCAGATCCACTCAATTACCTGCAACCAAA

TGCTGATTTCACAGAGGCTTATGCATCACACAAGACACCCGAATCATCATTT

GGAAAGGAGCATGCTTCAGTGCTTTCAACATCGGAATTTTTGAGACCTACCA

ATGCTGCTAGAGAATCATCATCAAAGGCAATGTATAGCTCACCAAACAGTA

TGATTTCACCTCATAGGAAAAAAGATTCTGTTCTCTCAACAGTTTCTACTAT

TTTACAACCCCAAGATGACTATCAGAACACTGCAAGTCCGCCTTCGCAAAT

GTTGAACTTAGAAGAAGCCAATTTAGAGAATGAACAAGAACAATGGGAAA

ATGCTACGTGCACCAGTAGAAATTATGCCAACTATACCGGGATCAAAAAAT

AATACTCCCATGACTGCTAATAAGTCTGGATTCATGCCTCAGAAACATACTT

TCCAGCATACTCCTGTGAAAGCGAAAAATAATGTGGACATGAACGAGAGAT

CATTGGTACGGCCGGAGCTATCAGGAACACCACTCAATAAGAGCGTACAAA

ATGGAATGCATTTTAGAGAAGAGGACGACAGTAATATATTGCACCATATAT

CAGAAATACCGCAAGGATCAACATCACATAATAATACCACCGCTGGCGATG

ATTCAAATGTGAGCAATAGGTTACAATTTTCTAATACCGAAAGTAGTCCAA

GCCGGCAAAGGAAAAAGCCTACTACATTACCACCAGGTTATATTGATCGAT

ATGTTAAAGAACTACCTGACAAGAATTTTGAATGTTTATTTCCTAACTGTGG

TAAATTTTTTAGGAGAAGGTATAATATAAAGTCCCATATTCAAACACATCTA

GAAGATAAACCATATAAGTGTGACTTTGAGGGATGCACTAAAGCGTTTGTG

AGGAATCATGACCTTGCTAGACACAAGAAGACTCATGATAAGCATTTTTCTT

GTCCCTGCGGGAAAAAATTCAGCTCAGAACAATCAATGATGAAGCACAAGA

ATAGGCATAACTGCACTGGCCCTGCCAGAGTTCCTGATTCCAAAATGGTATC

CAAGTCTCCTAGAAAACAATCTTCTCCCACTACTTTCTTCAGCGATAATGAA

TAGCCCCATAAAGGAAAATTATCTGAAAGAAAATACCAACCTACATATCGA

TCAATTAAGAATGGATCCTAAAATGAGAAATGCACTAGAGGATGGGGGGCT

ATTGAAGCCAGTTGAGAGAACTGAAGCAATGGCTTTTCCATCTCCACTAT

CGGGATATAGTGATTTGGGTTCCCCTTTTAGAGATTTAGGGACGATTG

AGGAGTAG

SEQ ID NO 20：＞ACF1引物

ATCAAAGAATCATCACCA

SEQ ID NO 21：＞ACF2引物

AGACTTCATTGTTACCAC

SEQ ID NO 22：＞ACF2b引物

AAGACTTCATTGTTACCACC

SEQ ID NO 23：＞ACF2c引物

AGACTTCATTGTTACCACCAG

SEQ ID NO 24：＞ACF3引物

CACCAGGTGAATTGG

SEQ ID NO 25：＞ACR1引物

CATTGTATCGACGAGTG

SEQ ID NO 26：＞ACR2引物

TGTATCGACGAGTGAAT

SEQ ID NO 27：＞ACR3引物

TTCGCACATTGTATCG

SEQ ID NO 28：＞ACR3b引物

ACTTCGCACATTGTATCG

SEQ ID NO 29：＞ACR3c引物

TGACTTCGCACATTGTATCG

SEQ ID NO 30：＞ACALB1探针

ATATCTTATCCTCATCCGGTCCT

SEQ ID NO 31：＞ACALB2探针

AGGACCGGATGAGGATAAGATAT

SEQ ID NO 32：

＞CA3345/ACE2-Ace2序列，针对白色念珠菌产生

AAACACTCCCACAAAGCAACCCCCTGTCACCATTGAATGGAGTCCAGTTATA

TCACCAAACTCAAAGCAACCATTACACAAACAAATCAAAGAATCATCACCAC

GACGCCGAATCAAAAAGACTTCATTGTTACCACCAGGTGAATTGGACAATTA

CTGGACAGGACCGGATGAGGATAAGATATATACTTGTACTTACAAAAACTGTG

GGAAAAAATTCACTCGTCGATACAATGTGCGAAGTCATATTCAGACACATTTA

AGTGATCGTCCATTTGGTTGTCAATTCTGTCCGAAAAGATTTGTCAGACAACA

TGATTTGAATCGTCACGTGAAAGGGCACATTGAAGCTAGATATAGCAAATGTC

CTTGTGGTAAAGAG

SEQ ID NO 33：

＞CA16733/ACE2-Ace2序列，针对白色念珠菌产生

AAACACTCCCACAAAGCAACCCCCTGTCACCATTGAATGGAGTCCAGTTATA

TCACCAAACTCAAAGCAACCATTACACAAACAAATCAAAGAATCATCACCAC

GACGCCGAATCAAAAAGACTTCATTGTTACCACCAGGTGAATTGGACAATTA

CTGGACAGGACCGGATGAGGATAAGATATATACTTGTACTTACAAAAACTGTG

GGAAAAAATTCACTCGTCGATACAATGTGCGAAGTCATATTCAGACACATTTA

AGTGATCGTCCATTTGGTTGTCAATTCTGTCCGAAAAGATTTGTCAGACAACA

TGATTTGAATCGTCACGTGAAAGGGCACATTGAAGCTAGATATAGCAAATGTC

CTTGTGGTAAAGA

SEQ ID NO 34：

＞CA1899/ACE2-Ace2序列，针对白色念珠菌产生

AAACACTCCCACAAAGCAACCCCCTGTCACCATTGAATGGAGTCCAGTTATA

TCACCAAACTCAAAGCAACCATTACACAAACAAATCAAAGAATCATCACCAC

GACGCCGAATCAAAAAGACTTCATTGTTACCACCAGGTGAATTGGACAATTA

CTGGACAGGACCGGATGAGGATAAGATATATACTTGTACTTACAAAAACTGTG

GGAAAAAATTCACTCGTCGATACAATGTGCGAAGTCATATTCAGACACATTTA

AGTGATCGTCCATTTGGTTGTCAATTCTGTCCGAAAAGATTTGTCAGACAACA

TGATTTGAATCGTCACGTGAAAGGGCACATTGAAGCTAGATATAGCAAATGTC

CTTGTGGTAAAGAGTT

SEQ ID NO 35：

＞CA1912/ACE2-Ace2序列，针对白色念珠菌产生

AAACACTCCCACAAAGCAACCCCCTGTCACCATTGAATGGAGTCCAGTTATA

TCACCAAACTCAAAGCAACCATTACACAAACAAATCAAAGAATCATCACCAC

GACGCCGAATCAAAAAGACTTCATTGTTACCACCAGGTGAATTGGACAATTA

CTGGACAGGACCGGATGAGGATAAGATATATACTTGTACTTACAAAAACTGTG

GGAAAAAATTCACTCGTCGATACAATGTGCGAAGTCATATTCAGACACATTTA

AGTGATCGTCCATTTGGTTGTCAATTCTGTCCGAAAAGATTTGTCAGACAACA

TGATTTGAATCGTCACGTGAAAGGGCACATTGAAGCTAGATATAGCAAATGTC

CTTGTGGTAAAGAG

SEQ ID NO 36：

＞CA2312/ACE2-Ace2序列，针对白色念珠菌产生

AAACACTCCCACAAAGCAACCCCCTGTCACCATTGAATGGAGTCCAGTTATA

TCACCAAACTCAAAGCAACCATTACACAAACAAATCAAAGAATCATCACCAC

GACGCCGAATCAAAAAGACTTCATTGTTACCACCAGGTGAATTGGACAATTA

CTGGACAGGACCGGATGAGGATAAGATATATACTTGTACTTACAAAAACTGTG

GGAAAAAATTCACTCGTCGATACAATGTGCGAAGTCATATTCAGACACATTTA

AGTGATCGTCCATTTGGTTGTCAATTCTGTCCGAAAAGATTTGTCAGACAACA

TGATTTGAATCGTCACGTGAAAGGGCACATTGAAGCTAGATATAGCAAATGTC

CTTGTGGTAAAGAGT

SEQ ID NO 37：

＞CA2688/ACE2-Ace2序列，针对白色念珠菌产生

AAACACTCCCACAAAGCAACCCCCTGTCACCATTGAATGGAGTCCAGTTATA

TCACCAAACTCAAAGCAACCATTACACAAACAAATCAAAGAATCATCACCAC

GACGCCGAATCAAAAAGACTTCATTGTTACCACCAGGTGAATTGGACAATTA

CTGGACAGGACCGGATGAGGATAAGATATATACTTGTACTTACAAAAACTGTG

GGAAAAAATTCACTCGTCGATACAATGTGCGAAGTCATATTCAGACACATTTA

AGTGATCGTCCATTTGGTTGTCAATTCTGTCCGAAAAGATTTGTCAGACAACA

TGATTTGAATCGTCACGTGAAAGGGCACATTGAAGCTAGATATAGCAAATGTC

CTTGTGGTAAAGAGTT

SEQ ID NO 38：

＞CA2701/ACE2-Ace2序列，针对白色念珠菌产生

AAACACTCCCACAAAGCAACCCCCTGTCACCATTGAATGGAGTCCAGTTATA

TCACCAAACTCAAAGCAACCATTACACAAACAAATCAAAGAATCATCACCAC

GACGCCGAATCAAAAAGACTTCATTGTTACCACCAGGTGAATTGGACAATTA

CTGGACAGGACCGGATGAGGATAAGATATATACTTGTACTTACAAAAACTGTG

GGAAAAAATTCACTCGTCGATACAATGTGCGAAGTCATATTCAGACACATTTA

AGTGATCGTCCATTTGGTTGTCAATTCTGTCCGAAAAGATTTGTCAGACAACA

TGATTTGAATCGTCACGTGAAAGGGCACATTGAAGCTAGATATAGCAAATGTC

CTTGTGGTAAAGA

SEQ ID NO 39：

＞CA15640/ACE2-Ace2序列，针对白色念珠菌产生

AAACACTCCCACAAAGCAACCCCCTGTCACCATTGAATGGAGTCCAGTTATA

TCACCAAACTCAAAGCAACCATTACACAAACAAATCAAAGAATCATCACCAC

GACGCCGAATCAAAAAGACTTCATTGTTACCACCAGGTGAATTGGACAATTA

CTGGACAGGACCGGATGAGGATAAGATATATACTTGTACTTACAAAAACTGTG

GGAAAAAATTCACTCGTCGATACAATGTGCGAAGTCATATTCAGACACATTTA

AGTGATCGTCCATTTGGTTGTCAATTCTGTCCGAAAAGATTTGTCAGACAACA

TGATTTGAATCGTCACGTGAAAGGGCACATTGAAGCTAGATATAGCAAATGTC

CTTGTGGTAAAG

SEQ ID NO 40：

＞T94/ACE2-Ace2序列，针对热带念珠菌产生

AAGATACACCAACTAAACAACAAAATTCCCAAGTTACTATTGAATGGAGCCC

TGTTATTTCACCAAATTCCAAAGCATCATTATCTAAACAACTCAAAGAATCAT

CATTACAAACGTCGCCACGTAGAAGAATTAAAAAGACTTCATTATTGCCACCT

GGAGAACTTGATAATTATTGGATTGGACCCGATGAAAATAAAATTTATACATGT

ACTTATAAAAACTGTTTTAAAAAATTTACAAGAAGATATAATGTTAGAAGTCA

TATTCAAACTCATTTAAGTGATAGACCATTTGGATGTCAATTTTGTCCTAAAAG

ATTTGTTCGACAACATGATTTAAATCGTCATGTTAAAGGACATATTGAAGCAA

GATATAGTAAA

Claims

1.酵母或真菌种类的诊断试剂盒，所述试剂盒含有能够与至少部分Ace2基因或其相应mRNA结合的寡核苷酸探针。

2.权利要求1所述的试剂盒，其中，所述Ace2基因的所述部分是白色念珠菌(C.albicans)Ace2基因从碱基对位置1736到碱基对位置2197的基因区域的一部分。

3.权利要求1或2所述的试剂盒，包含寡核苷酸探针，所述探针与选自SEQ IDNOs：4-7和32-39的所述Ace2基因序列的一部分或其相应mRNA优先杂交。

4.任一前述权利要求中所述的试剂盒，包含用于白色念珠菌Ace2基因从碱基对位置1736到碱基对位置2197的基因区域的一部分的探针。

5.任一前述权利要求中所述的试剂盒，其中所述探针选自SEQ ID NOs：3、30、31，或者也可以充当探针的与其实质上相似或互补的序列。

6.权利要求5所述的试剂盒，其中所述探针序列为SEQ ID NO：30。

7.任一前述权利要求中所述的试剂盒，还包含用于扩增至少部分所述Ace2基因的引物。

8.权利要求7所述的试剂盒，包含用于部分所述Ace2基因的正向和反向引物。

9.任一前述权利要求中所述的试剂盒，包含至少一种正向体外扩增引物和至少一种反向体外扩增引物，所述正向扩增引物选自SEQ ID NOs：1、20-24，和也可以充当正向扩增引物的与其实质上相似或互补的序列，以及所述反向扩增引物选自SEQ ID NOs：2、25-29，和也可以充当反向扩增引物的与其实质上相似或互补的序列。

10.权利要求9所述的试剂盒，其中所述正向引物序列选自SEQ ID NOs：21、22和23，以及所述反向引物序列选自SEQ ID NOs：27、28和29。

11.任一前述权利要求中所述的试剂盒，其基于直接核酸检测技术、信号扩增核酸检测技术，并且核酸体外扩增技术选自下列一种或更多种：聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)、分支DNA技术(bDNA)以及滚环扩增技术(RCAT)或其它基于酶体外扩增的技术。

12.核酸分子，其选自：从SEQ ID NO 1到SEQ ID NO 40，以及与其或其部分实质上同源或实质上互补且在基于所述Ace2基因的诊断学中具有功能的序列。

13.核酸分子，其含有寡核苷酸，所述寡核苷酸具与权利要求12所述的核酸分子的一部分实质上同源或实质上互补的序列。

14.检测检测样品中的目标生物的方法，包括以下步骤：

(i)在适当的条件下，将所述检测样品与能够与至少部分Ace2基因或其相应mRNA结合的至少一种寡核苷酸探针混合；

(ii)在高度严格条件下，将可能存在于所述检测样品中的任何核酸与所述寡核苷酸杂交，形成探针：目标双链体；和

(iii)确定探针：目标双链体是否存在，所述双链体的存在明确识别出所述检测样品中所述目标生物的存在。

15.权利要求14所述的方法，其中所述Ace2基因的所述部分是白色念珠菌Ace2基因从碱基对位置1736到碱基对位置2197的基因区域的一部分。

16.权利要求14或15所述的方法，包含寡核苷酸探针，所述探针与选自SEQ IDNOs：4-7和32-39的所述Ace2基因序列的一部分或其相应mRNA优先杂交。

17.权利要求14到16中任意一项所述的方法，其中所述探针选自SEQ ID Nos：3、30、31，和也能够充当所述Ace2基因的探针的与其实质上同源或实质上互补的序列。

18.权利要求12或13中任意一项所述的核酸分子在检测酵母和/或真菌种类中一种或更多种的存在情况的诊断分析中的应用。

19.权利要求1至11中任意一项所述的试剂盒或权利要求12或13中任意一项所述的核酸分子在测量患者中酵母滴度的诊断分析中的应用。

20.评估被设计以减少患者中酵母滴度的治疗方案的功效的方法，其包括在所述治疗方案的一个或更多个关键时期应用权利要求1至11中任意一项所述的试剂盒或权利要求12或13中任意一项所述的核酸分子。

21.权利要求1至11中任意一项所述的试剂盒或权利要求12或13中任意一项所述的核酸分子在测量环境中酵母污染物的诊断分析中的应用。

22.权利要求21所述的应用，其中，所述环境是：医院；食物样品；环境样品，例如水；工业样品，如需要生物负载或质量评估的加工中样品或终产品。

23.权利要求1至11中任意一项所述的试剂盒或权利要求12或13中任意一项所述的核酸分子在识别和/或表征一种或更多种破坏剂中的应用，所述破坏剂可以用于破坏所述Ace2基因功能。

24.权利要求23所述的应用，其中，所述破坏剂选自反义RNA、PNA、siRNA。