CN111065451A - 用于微生物裂解的半干珠磨方法及进行该方法的装置 - Google Patents
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Abstract
公开了用于裂解细胞以释放提取物基因组(gDNA)的方法和装置。该方法使用微玻璃珠和细胞(例如孢子)的混合物，该混合物在珠磨裂解过程中形成紧贴于较大的金属球和管侧面的半干饼，大大提高了珠磨过程的效率。装置产生混沌运动，确保产生足够的力来打开细胞，并且金属球冲击遍及分布于容器的内表面，使得所有的细胞混合物均经受充分的冲击，以破坏细胞。结果是，孢子和其他难以裂解的微生物可以在数秒内打开。该方法通过快速打开难以裂解的细胞，减少了步骤的数目和操作时间，同时还保持了DNA的完整性。
Description
技术领域
公开了裂解细胞以从细胞内部释放或提取基因组DNA(gDNA)的方法和装置。公开的方法使用微玻璃珠和细胞(例如孢子)的混合物，该混合物在珠磨裂解(bead beatinglysis)过程中形成紧贴于较大的金属球和管侧面的半干饼，大大提高了珠磨过程的效率。由于细胞在玻璃珠和金属球上成饼，每一次球撞击容器侧面时，细胞都受到冲击。该装置设计成产生混沌运动(chaotic motion)是出于双重目的，第一是确保产生足够的力以打开细胞，第二是使金属球冲击遍及分布于容器的内表面，使得所有的细胞混合物均经受充分的冲击，以破坏细胞。结果是，通常需要煮沸或打磨多达30分钟才能实现充分裂解的孢子和其他微生物，使用本发明公开的半干珠磨方法可以在数秒内打开。该方法通过快速打开难以裂解的细胞，减少了步骤的数目和操作时间，同时还保持了DNA的完整性。
背景技术
许多基于细胞的或基于DNA的分析方法都要求从细胞内部释放包括DNA在内的细胞内含物，以便于分析。打开细胞以释放内含物被称作“裂解”。例如，使用DNA测序技术研究微生物组的方法首先要求裂解微生物以便可以提取DNA。大多数微生物组是细菌、古生菌和真菌的群体，它们对裂解技术的敏感性方面差异巨大。差异敏感性为微生物种群研究者提出了重大问题，研究者希望确保最难裂解的细菌(通常呈革兰氏阳性)和最容易裂解的细菌(通常呈革兰氏阴性)与其原始样品中的种群成比例。令人遗憾的是，大多数微生物裂解方案对于一些微生物效果良好，但对其他则效果很差。(微生物组裂解技术的比较-SanqingYuan,Dora B.Cohen,Jacques Ravel,Zaid Abdo,Larry J.Forney.Evaluation ofMethods for the Extraction and Purification of DNA from the HumanMicrobiome.PLoS ONE 7(3):e33865.doi:10.1371/journal.pone.0033865；另外，用于回收质粒DNA的快速简单的碱裂解技术还会除去微生物基因组DNA，而该基因组DNA是微生物组筛选的靶标(碱裂解打开细胞但除去gDNA-Birnboim,H.C.and Doly,J.,A rapidalkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA,NucleicAcids Res.7(6),1979,1513-1524；相反，KOH裂解可以用于回收细菌基因组DNARaghunathan,Arumugham et al.“Genomic DNA Amplification from a SingleBacterium.”Applied and Environmental Microbiology 71.6(2005):3342–3347.PMC.Web.29Sept.2016)。现有技术中已知有多种裂解技术可基于不同的生化方法破坏细胞完整性，这些方法包括溶菌酶(酶促破坏肽聚糖细胞壁)、强碱(化学破坏)、去垢剂(溶解细胞膜)、珠磨或振荡(机械破坏)和热DNA提取方法，不同的方法会影响微生物组分析结果：Wagner Mackenzie B,Waite DW,Taylor MW.Evaluating variation in human gutmicrobiota profiles due to DNA extraction method and inter-subjectdifferences.Frontiers in Microbiology.2015；6:130.doi:10.3389/fmicb.2015.00130)。大多数公开或市售的DNA制备方法使用这些方法中的一种或多种来裂解细胞，通常以连续的步骤进行，会花费大量的时间，特别是在同时处理许多样品时。尽管单独的裂解方法对于那些不完全或部分裂解就能产生足够的DNA用于所进行方案的应用来说通常是足够的，但它们通常无法与原始群落成比例地由微生物组样品产生DNA，并且可能不能完全裂解某些微生物。例如，基于去垢剂的裂解可以破坏具有弱细胞壁和强细胞膜的细胞亚集，但不能打开具有强细胞壁的去垢剂抗性微生物，导致来自去垢剂抗性细胞的DNA在产生的DNA制剂中比例较低或不存在。在另一实例中，足以裂解具有强细胞膜的细胞的微生物珠磨可能剪切或破坏在该过程早期从容易裂解的细胞中释放的DNA。另外，各种裂解方法往往彼此不相容，如果组合使用的话需要依序进行。例如，溶菌酶在去垢剂或强碱的存在下将会无法起效。某些去垢剂在强碱的存在下会沉淀。珠磨很难与加热处理组合使用。尽管通过连续进行单独的裂解方案可以克服单个方案的缺点，但这增加了复杂性、所涉时间和成本。重要的是，裂解之后必须除去去垢剂例如十二烷基硫酸钠(SDS)，因为SDS干扰下游的DNA操作。另外，某些微生物可能耐受依序进行的裂解方法，其取决于方案的顺序。例如，某些具有坚固肽聚糖细胞壁的微生物可能具有保护其不被强碱或溶菌酶初始处理破坏的脂质双层外包膜。同时组合使用多种方法可能是有效的，或者连续进行许多个步骤，以便从样品中的全部微生物中产生DNA，但是使用单一方法打开所有细胞将会是显著的改进。
进行珠磨的装置和振荡器是现有技术中已知。例如，参见表1。能够处理大量样品的珠磨器和振荡器往往是又大又重，具有大功率电机和快速移动部件，对用户可能具有危险性。本文公开的装置是小型、高效和安全的。现有技术中已知的较小型的装置通常一次处理少量样品。本文公开的装置可以一次处理1-48个样品。现有技术中已知的装置使用规则或简单的运动处理样品，而所公开的装置使用随机运动，其导致更有力的冲击，并使用宽范围的运动，其以更慢(危险性更低)的速度在更短的时间内导致更均匀的裂解。
本文公开的方法和装置利用珠磨法，其迅速起效以裂解细胞，甚至包括最难的微生物孢子(本文中描述了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)孢子作为实例)，但保留足够大小的DNA，以产生那些需要或必须按比例裂解的应用和技术所需的大扩增子，所述的应用和技术例如高分辨微生物组表征。结果是简单、迅速的方案，其均匀地打开样品中的所有细胞，在含有不同细胞成分的样品例如微生物组中产生更具有代表性的DNA图谱。
发明内容
公开了用于裂解细胞，例如微生物组中存在的细菌的方法和装置，其可以在短时间内完成，例如在小于1分钟的时间内完成，并且重要的是，可以从难以裂解的样品，例如细菌孢子中产生质量和数量均提高的基因组DNA(gDNA)。
附图说明
图1显示含有单个4.5毫米钢球和0.05克100微米玻璃珠的2毫升微量离心管。
图2显示钢球外部形成的半干饼。
图3是显示珠磨之后吡啶二甲酸(DPA)释放的图。DPA是存在于许多细菌孢子的核内部的化合物，其仅在孢子裂解之后释放，当与TbCl3结合时可以通过荧光检测。样品经受珠磨的时间增加。每个样品由4ul的枯草芽孢杆菌孢子在TE中的1OD/ml溶液组成。将孢子加入到图1所示的2ml离心管中的5mg玻璃珠(Sigma,G4649)中。将含有孢子混合物的管在仪器上进行指定时间的珠磨。珠磨完成时，向玻璃珠加入150ul TE，从中回收100微升裂解液。在DPA检验中使用来自每个时间点的75微升裂解液。将裂解液加入到含有50ul溶液的黑色平底96孔板中，所述溶液含有0.2uM TbCl3和0.1M K-HEPES。96孔板在270nM激发和545nM发射条件下在荧光分析仪中读取。对于每个样品，记录与吡啶二甲酸荧光对应的相对荧光单位，并作图。对照裂解液含有4ul煮沸30分钟的孢子。
图4是显示珠磨之后从细菌孢子释放的DNA的质量和相对定量的评价的图。使用Shoreline Biome 16S V1-V9DNA提纯和PCR扩增试剂盒(Shoreline Biome cat#SBV19-16)，通过细菌16S rRNA基因的1500碱基V1-V9区的PCR，对DNA质量进行评价。通过比较每个珠磨时间点的Cq，对相对定量进行评价。将5微升与图3所述相同的裂解液与0.1ul 1:20EvaGreen(Biotum,cat#31000)混合，并加入到PCR反应中，使用设定成检测Sybr染料的BioRad CFX 96Touch热循环仪，根据制造商说明书进行扩增。记录每个时间点的Cq值并作图。
图5是显示通过本文所示的方法裂解之后从孢子中的DPA释放和相应的DNA释放的图。使用如图3中的铽荧光检验测量孢子裂解。通过如图4中的qPCR定量来测量DNA的量。如X-轴上的细节所显示，孢子经受珠磨达10分钟。
图6是显示孢子煮沸裂解过程中的孢子裂解和DNA定量的图。使用如图3中的铽荧光检验测量孢子裂解。通过如图4中的qPCR定量来测量DNA的量。将孢子悬浮在TE中，并在100℃温度下(煮沸)经受X-轴上所示的时间。
图7是显示当摇动的时间和强度变化时，每次试验测量的DPA释放作为孢子裂解的指标的图。
图8a是珠磨器原型的图。上文“发明内容”部分讨论的原型的元件被加以标记。
图8b是上文“发明内容”部分讨论的“自由元件”的撞杆(striker bar)和槽区域(slot region)的图。
具体实施方式
说明书结尾处的权利要求中具体指出并明确要求保护被视为是本发明的主题。通过以下详述结合附图，本发明的前述和其他目的、特征和有点将变得显而易见。
作为基于DNA的分析方法，例如，Mark Driscoll和Thomas Jarvie的题为“用于多路高通量靶向筛选的DNA制备方法(Methods for DNA Preparation for Multiplex HighThroughput Targeted Screening)”的美国专利申请No.15/372,588(通过引用的方式将其全文并入本文)中所述的方法，通过裂解目标微生物组中的细胞产生DNA，然后将所得的DNA在靶向所有细菌和古生菌中均存在的16S、23S或其他rRNA(核糖体RNA)基因序列的PCR扩增中用作模板。微生物可以通过它们的rRNA基因序列来鉴别，该序列在大多数(即使不是全部)细菌和古生菌中只是略有不同。rRNA基因序列的不同意味着细菌和古生菌的单个物种在rRNA基因中具有特征性的DNA变异，可以作为该物种的标识或指纹。使用rRNA基因序列，试剂盒、方案和软件能够对样品中的微生物进行全面的指纹分析，并允许以高分辨率一次同时进行许多样品的rRNA指纹分析。已知微生物可以在测序之后通过将rRNA基因DNA序列定位到微生物基因组数据库中来鉴定。未知微生物会含有与数据库中的任何微生物不同的rRNA序列，但可以使用他们独特的rRNA序列进行追踪。此外，从样品中每种微生物获得的reads的数量可以揭示每种微生物在样品中的相对丰度。相对丰度可以是每个微生物组的状态的重要指标。改变微生物相对丰度或者完全遗漏某些微生物的裂解技术可能导致测序结果不正确地表征被研究的微生物组的状态。所述的发明是一种改进的裂解方法，用于从样品中获得正确的微生物相对丰度。
如本文所用，“非周期运动”是指不具有规则的重复周期或轨道运动并且以非规则的时间间隔重复自身的任何运动。
如本文所用，“随机运动”和“混沌运动”可互换使用，是指任何速度和三维方向持续变化的运动。
如本文所用，“半干饼”是指每重量水分具有1％至30％重量样品(例如孢子或微生物)的生物细胞样品。
如本文所用，“微米(micron)”和“微米(micrometer)”可互换使用，是指等于百万分之一米的长度单位。
本文公开了同时以非周期运动和混沌运动方式摇动样品的装置，具有大约1cm至大约2.5cm的行程长度，大约0.2cm至大约1cm的行程高度，和大约5Hz至大约55Hz的速度。在一些实施方式中，该装置被设置成将样品容纳在微量离心管或微量滴定板或者其他适合于高通量分析的容器中。在一些实施方式中，能够被同时处理的管的数量在1-96之间。在一些实施方式中，微量滴定板选自由8、16、24、46、96或384孔板组成的组。在一些实施方式中，管或微量滴定板的孔的容积在200微升至2ml之间。
本文公开了用于裂解样品中的生物细胞以从细胞中释放DNA的方法，包括以下连续步骤：(a)将含有一种或更多种生物细胞的第一水溶液或半固体样品与(i)4.5mm钢(或其他生物相容材料)球和(ii)～100微米的珠(玻璃或其他莫氏硬度等级为4或更高的材料)混合，以形成半干饼；和(b)将(a)的混合物以非周期和随机运动的方式摇动一段时间，所述时间能有效地从细胞中释放DNA；(c)将半干饼重悬在第二水溶液中，并允许珠沉降；(d)从混合物中沉降的固体组分回收第二水溶液，其中从生物细胞释放的DNA存在于回收的第二水溶液中。
在一些实施方式中，第一水溶液是水。在一些实施方式中，第一水溶液含有Tris或其他缓冲剂、盐或去垢剂，以控制pH或限制生物活性。在一些实施方式中，第一溶液是当加入到珠时足以形成半干饼的非水液体。在一些实施方式中，第一水溶液含有一种或更多种生物细胞。
在一些实施方案中，钢球具有大约2毫米至大约10毫米的直径。在一些实施例中，钢球具有大约4.5毫米的直径。在一些实施方案中，玻璃珠具有大约10微米至大约300微米的直径。在一些实施方案中，玻璃珠具有大约100微米的直径。在一些实施方案中，玻璃珠以按重量计约83％玻璃珠的浓度(例如，将10ul(10mg)样品加入到50mg珠)加入到第一水溶液中。
在一些实施方式中，玻璃珠以按重量计40％至99％的浓度加入到水溶液中。
在一些实施方式中，摇动进行大约5秒至大约10分钟的一段时间。
在一些实施方式中，摇动进行2分钟。
在一些实施方式中，细胞裂解通过与DNA共同位于孢子内部的吡啶二甲酸的铽荧光测量。
在一些实施方式中，裂解过程中的DNA释放通过UV光谱(OD260)追踪。
在一些实施方式中，裂解过程中的DNA释放通过DNA荧光检验测定。
在一些实施方式中，钢和玻璃珠与第二水溶液的分离通过选自由离心、过滤和重力沉降组成的组的方法进行。
在一些实施方式中，生物细胞来源于选自由以下各项组成的组的样品：粪便、细胞裂解物、组织、血液、肿瘤、舌、齿、口腔拭子、痰液、粘液、伤口拭子、皮肤拭子、阴道拭子或任何其他生物材料或生物液体，其最初得自人、动物、植物或环境样品，包括原始样品、复杂样品、混合物和微生物组样品。
在一些实施方式中，生物细胞来源于选自由孢子、生物膜、多细胞生物体、单细胞生物体、原核生物、真核生物、微生物、细菌、古生菌、原生动物、藻类和真菌组成的组的生物体。
在一些实施方式中，摇动装置具有刚性的扁平管或板支撑元件(自由元件)，其中可以装载有多个板或管(图8a和8b)。在一些实施方式中，可以将多达48个样品容器管装载到自由元件中。在优选的实施方式中，自由元件通过刚性连杆(rigid linkages)与固定元件(基座(base))连接，该刚性连杆通常将自由元件的运动限制在两个自由度上，并具有垂直于每个自由度布置的槽(slot)。旋转电机元件安装在基座元件上，并通过撞杆周期性地与自由元件中的槽接触，从而将能量传递至自由元件。该撞杆一端安装在电机轴上，另一端端保持自由。在优选的实施方式中，自由元件中的槽的宽度远大于(substantially largerthan)撞杆的自由端，同时以非周期运动和随机运动的方式摇动样品。自由元件和转动的撞杆之间的运动的不连续的和非线性的混沌关系导致了撞杆和自由元件槽之间通常弹性的碰撞，其在两个自由度上为自由元件提供了周期性的迅速加速，增加了撞击力，并使细胞饼和钢球的冲击均随机地遍及分布在样品容器的内部。整个随机动作能够在数秒内完成细胞裂解。
实施例
以下是本文公开的细胞裂解方法的示例性实施方式：
步骤1:将2微升枯草芽孢杆菌(1OD/ml)悬浮在8ul水中，形成10μl混合物。
步骤2:制备2ml微量离心管(Dot Scientific#RN2000-GMT)，其含有单个4.5mm钢球和0.05g玻璃珠(经酸洗,100um,Sigma G4649)(参见图1).
步骤3:将10μl孢子悬液加入到钢珠/玻璃珠混合物中。
步骤4:将管置于振荡器中。摇动过程中在珠的外部形成半干饼(参见图2)，使得所述珠对管壁的每一次打击都在冲击含有孢子和细胞的玻璃珠饼。珠磨过程中还在管的侧壁上形成饼。
步骤5:孢子的裂解释放出吡啶二甲酸(DPA)，其可以经由铽荧光测量。图3显示DPA的释放，图4显示珠磨之后DNA的释放。对照裂解含有煮沸30分钟的孢子。对照裂解仅显示出DPA释放，因为煮沸30分钟将孢子打开，但也会选择性破坏DNA。
步骤6:DNA质量通过16S rRNA基因的PCR评价(参见图5)，其是1500碱基的扩增子，常用于鉴别微生物。选择该扩增子作为DNA质量的指标是因为它比许多典型的扩增子靶标要长，因此，如果它完整存在，则表明DNA对于大多数PCR或测序应用来说具有足够的质量。振荡器中的珠磨延长到超过裂解孢子所需时间，以测试DNA损伤的积累速率。使用DPA铽检验追踪孢子裂解，如图3所示，其在2分钟达到最大值。如图4中所述对样品进行实时PCR。对于2、3、4和10分钟的珠磨，实时PCR产生不可区分的17个循环的Cq值，与此相反，没有珠磨的Cq值为25。这8个循环的差异表明，与对照(无珠磨)反应所含的0.1ng总量相比，DNA浓度增加了250倍(250x increase)。而且，应当注意到，珠磨10分钟之后Cq没有变化，表明额外的8分钟珠磨不影响从孢子释放的可扩增模板DNA的质量。
作为比较，在孢子煮沸裂解的过程中追踪孢子的裂解和DNA的量，如图6所示。与半干珠磨中观察到的DNA量的快速增加相反，煮沸仅5分钟即可观察到DNA快速减少。另外，与30-45秒的半干珠磨相比，通过煮沸达到最大程度的孢子裂解需要12分钟，表明珠磨比煮沸裂解快20倍以上。与珠磨相比，在DPA荧光检验表明孢子被裂解之后，观察到DNA没有增加，表明破坏孢子所需的时间和温度同时破坏了DNA。
还使用本文公开的新的振荡器装置研究了珠磨参数。如图7所示，改变摇动的时间和速度，一式两份，每次试验测量DPA的释放作为孢子裂解的指标。以10和55次打击/秒(beat per second,BPS)摇动表现出显著的孢子裂解。以大约6BPS摇动的结果多变，两次试验中有一次显著裂解，表明优选6BPS以上的速度。孢子煮沸30分钟作为阳性对照。
以多达55次打击/秒对振荡器强度进行测试，结果与图7所示结果类似。将半干饼珠磨过程与随机摇动动作结合使用，可实现新的振荡器设计，其具有小的行程长度，减少了成本以及用于其他珠磨法的振荡器潜在的动能危险。这反过来减少了对于更高功率的电机、广泛的安全功能和更加复杂和昂贵的设计的需求，降低了振荡器设计的成本和复杂性，增加了便携性和可同时处理的样本的数量，同时减少了重量和占据的面积。
本文公开的方法和装置可以用于任何需要裂解细胞和孢子的应用，例如微生物组测序(例如16S rRNA或其他靶向基因图谱分析)、DNA应用(例如全基因组shotgun图谱分析)、非DNA应用(例如蛋白质、RNA、代谢物和细胞器)和难裂解病原体的诊断应用。
已对本发明一个或多个实施方式加以说明。但是，应当理解到，可以在不偏离本发明精神和范围的情况下进行各种变化。因此，其他实施方式也在所附权利要求的范围内。
Claims (22)
1.同时以非周期运动和混沌运动方式摇动样品的装置，具有大约1cm至大约2.5cm的行程长度，大约0.2cm至大约1cm的行程高度，和大约5Hz至大约55Hz的速度。
2.权利要求1的装置，其中所述装置被设置成将样品容纳在一个或更多个微量滴定板、单独的微量离心管或者其他适合于低通量或高通量分析的容器中。
3.权利要求2的装置，其中所述微量滴定板选自由8、16、24、46、96、384或1536孔板组成的组。
4.权利要求2的装置，其中能够被同时处理的微量离心管的数量范围为从1到96。
5.用于裂解样品中的生物细胞以从所述细胞中释放DNA的方法，包括以下的连续步骤：
(a)将含有生物细胞的第一水溶液或非水溶液与(i)具有大约2毫米至大约10毫米直径的球和(ii)具有大约20微米至大约150微米直径的珠混合，以形成半干饼；
(b)将(a)的混合物以非周期和混沌运动的方式摇动一段时间，所述时间能有效地从所述细胞中释放DNA；
(c)将所述半干饼用第二水溶液洗涤，以溶解和/或悬浮包括DNA在内的细胞内含物；
(d)通过使所述珠沉降，并回收含有步骤(b)中释放的DNA和其他细胞成分的上清液，从而将所述第二水溶液与固体组分分离。
6.权利要求4的方法，其中所述第一溶液是(i)选自由水、生物缓冲液或另一种含水物质(another aqueous)组成的组的水溶液或(ii)足以形成半干饼的非水溶液。
7.权利要求5的方法，其中所述第一水溶液中所述生物细胞的容量是所述珠和所述第一水溶液的总重量的大约20％。
8.权利要求5的方法，其中所述球具有大约4.5毫米的直径。
9.权利要求5的方法，其中所述球由莫氏硬度等级为4或更高的材料制成。
10.权利要求9的方法，其中所述材料是钢。
11.权利要求5的方法，其中所述珠具有大约20微米至大约150微米的直径。
12.权利要求11的方法，其中所述珠具有大约100微米的直径。
13.权利要求5的方法，其中所述珠由莫氏硬度等级为4或更高的材料制成。
14.权利要求13的方法，其中所述材料是玻璃。
15.权利要求5的方法，其中将所述珠以所述生物细胞和所述第一水溶液的总重量的大约80％的浓度加入到所述第一水溶液中。
16.权利要求5的方法，其中步骤(b)中的所述摇动进行大约5秒至大约10分钟的一段时间。
17.权利要求16的方法，其中所述摇动进行2分钟。
18.权利要求5的方法，其中步骤(b)中从细胞释放的所述DNA通过选自由铽荧光、OD260测量、嵌入染料荧光、终点或实时PCR检验或其任意组合组成的组的方法测量。
19.权利要求5的方法，其中所述分离通过选自由离心、过滤和重力沉降组成的组的方法进行。
20.权利要求5的方法，其中所述生物细胞来源于选自由以下各项组成的组的样品：粪便、细胞裂解物、组织、血液、肿瘤、舌、齿、口腔拭子、痰液、粘液、伤口拭子、皮肤拭子、阴道拭子或任何其他生物材料或生物液体，其最初得自人、动物、植物或环境样品，包括原始样品、复杂样品、混合物和微生物组样品。
21.权利要求5的方法，其中所述生物细胞来源于选自由孢子、生物膜、多细胞生物体、单细胞生物体、原核生物、真核生物、微生物、细菌、古生菌、原生动物、藻类、真菌和病毒组成的组的生物体。
22.权利要求5的方法，其中所述摇动在权利要求1的装置中进行。
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