CN111057722A - 一种利用红茶发酵剂发酵玉米秸秆的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用红茶发酵剂发酵玉米秸秆的方法，属于微生物发酵技术领域。为了提高玉米秸秆的可消化性以及营养价值，本发明将红茶与水混合，85‑95℃浸泡8‑15min后向茶液中加入蔗糖制成茶糖液，再向茶糖液中接入Kombucha菌，28℃摇床培养3天，得到发酵液；将发酵液离心后弃上清，收集菌体得到菌泥，将菌泥与保护剂以(1～1.5):(2.5～4)的质量比混合后，保持35‑45min，然后冷冻干燥制得红茶发酵剂；最后将制备的红茶发酵剂接种到玉米秸秆粉与茶糖液混合溶液中，进行发酵。本发明解决了单一菌株降解秸秆木质纤维素效率低的问题，且由于含有自然形成的益生菌群系，比例均衡，又增加了饲料的营养功能。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种利用红茶发酵剂发酵玉米秸秆的方法。
背景技术
国内外一直在寻找降解植物秸秆木质纤维素的最佳途径，由于秸秆的粗纤维的结构，纤维素、半纤维素与木质素紧密结合相互缠绕构成粗纤维，这些天然有机高分子化合物结构很牢固，只能吸水润胀，不能为单胃动物的消化液和酶所分解，纤维素是由β-1,4键的葡萄糖单元所组成的长链状大分子，木质素是由苯基丙烷聚合而成的一种非多糖物质，木质素为苯基丙烷的非结晶体聚合物，不能为哺乳动物消化道内厌氧微生物产生的酶分解，降低了它们的可消化性。
发明内容
为了提高玉米秸秆的可消化性以及营养价值，本发明提供了一种利用红茶发酵剂发酵玉米秸秆的方法，所述红茶发酵剂通过如下方法制备获得：
1)将红茶与水混合，85-95℃浸泡8-15min，滤去茶渣后，向茶液中加入蔗糖制成茶糖液，冷却至室温，所述红茶与水的料液比为1g:(80-150)mL，以茶液体积计，蔗糖添加量为6％～12％
(质量)；
2)向茶糖液中接入Kombucha菌，28℃摇床培养3天，得到发酵液；
3)将发酵液离心后弃上清，收集菌体得到菌泥，将菌泥与保护剂以(1～1.5):(2.5～4)的质量比混合后，保持35-45min，然后在真空度为2～10Pa条件下，-45～-55℃，23-25h冷冻干燥制得红茶发酵剂；
所述玉米秸秆的发酵方法如下：将玉米秸秆粉与按照步骤1)的方法制备得到的茶糖液混合后，接入步骤3)制备得到的红茶发酵剂进行发酵。
进一步地限定，步骤1)所述红茶发酵剂中菌种丰度大于0.1％的菌种如下：细菌包括Komagataeibacter xylinus、Komagataeibacter europaeus、Komagataeibacterintermedius、Komagataeibacter kakiaceti、Komagataeibacter hansenii、Komagataeibacter oboediens、Komagataeibactermedellinensis、Gluconacetobactersp.SXCC-1、Gluconacetobacter diazotrophicus、Gluconobacteroxydans、Gluconobacterjaponicus、Gluconobacter albidus、Acetobacter malorum、Acetobacterpasteurianus、Acetobacter tropicalis、Acetobacter senegalensis、Acetobacter aceti、Acetobacter cerevisiae、Acetobacter nitrogenifigens、Acetobacterpapayae、Acetobacter syzygii、Acetobacter indonesiensis、Acetobacterorientalis、Acetobacterghanensis、Sorangium cellulosum、Kozakia baliensis、Komagataella phaffii、Acetobacter syzygii、Acetobacter indonesiensis、Pediococcus pentosaceus、Gluconobacter cerinus、Gluconobacter frateurii、Tanticharoenia sakaeratensis、Acetobacter orientalis、Clostridioides difficile、Nannocystissp.MB1016、Gluconobacter morbifer、Acetobacter ghanensis和Acidiphilium cryptum；真菌包括Pichia kudriavzevii、Brettanomyces bruxellensis、Ogataeaparapolymorpha、Ogataea angusta、Kuraishia capsulata、Rhizophagusirregularis和Tremella mesenterica。
进一步地限定，步骤1)所述浸泡，温度为90℃，浸泡10min。
进一步地限定，步骤1)所述红茶与水的料液比为1g:100mL；以茶液体积计，蔗糖的添加量为10％(质量)。
进一步地限定，步骤2)中以茶糖液体积计，菌液浓度为5.4×105CFU/mL的Kombucha菌液按照5％(v/v)的比例接种到茶糖液中。
进一步地限定，步骤3)所述保护剂为海藻糖与甘油按照1:1质量比组成的混合物。
进一步地限定，步骤3)所述冷冻干燥温度为-50℃，干燥24h。
进一步地限定，所述玉米秸秆粉颗粒为40目。
进一步地限定，所述红茶发酵剂的接种量，以玉米秸秆粉质量计，为5％-7％(g/g)。
进一步地限定，所述接入步骤3)制备得到的红茶发酵剂进行发酵所采用的温度为25～35℃、湿度为84％～88％，发酵时间为10-15天。
有益效果
本发明采用高通量测序技术，揭示了发酵3d的茶糖发酵液的微生物菌群构成，获得96.18％的序列归属到细菌(63.46％)、真菌(32.72％)，细菌中主要优势菌种是Komagataeibacter xylinus(8.91％)、Komagataeibacter europaeus(8.42％)、Komagataeibacter intermedius(5.29％)、Gluconacetobacter sp.SXCC-1(5.08％)，真菌中主要优势菌种是Pichia kudriavzevii(12.37％)、Brettanomyces bruxellensis(9.42％)、Ogataeaparapolymorpha(5.06％)；将该时间的活菌茶糖液作为秸秆饲料的发酵剂，不仅解决了单一菌株降解秸秆木质纤维素效率低的问题，且由于含有自然形成的益生菌群系，比例均衡，又增加了饲料的营养功能。
附图说明
图1发酵3d茶糖发酵液微生物在“种”水平的菌群结构(丰度大于0.1％)；
图2未发酵玉米秸秆中氨基酸的检测结果，横坐标为出峰时间(min)，纵坐标为吸收强度，单位mV；
图3红茶发酵剂发酵玉米秸秆中氨基酸的检测结果，横坐标为出峰时间(min)，纵坐标为信号强度，单位mV；
图4茶糖水秸秆中有机酸的检测结果，横坐标为出峰时间(min)，纵坐标为吸收强度AU；
图5红茶发酵剂发酵后秸秆有机酸的检测结果，横坐标为出峰时间(min)，纵坐标为吸收强度AU。
具体实施方式
本发明所用的试剂、仪器、设备等如无特殊说明均可通过商业化途径购买获得，其中Kombucha菌为市面通用的一种红茶菌，也可通过购买获得。
实施例1.红茶发酵剂的制备。
1)称取1g红茶加入100mL 90℃水中浸泡10min，用4层纱布去除茶渣，得到茶液，然后加入茶液10％(质量分数)蔗糖溶解制得茶糖液。
2)将茶糖液装入250mL的无菌三角瓶中，装液量为100mL，冷却至室温。接入活菌总数为5.4×105CFU/mL的Kombucha菌液5％(v/v)，纱布封口，于28℃恒温摇床培养3d，得到发酵液。结果：真菌总数3.5×107CFU/mL，细菌总数2.4×108CFU/mL，发酵液总糖度3.5Brix，pH3.54。
3)将发酵液以12000r/min离心5min，弃上清，收集全部菌体，获得菌泥。将海藻糖与甘油按照1:1的质量比混合后制成保护剂，将保护剂与菌泥按照3:1的质量比混合进行平衡，保持时间40min，然后在真空度5Pa条件下，冷阱温度-50℃，真空干燥时间24h，冷冻干燥制备成红茶发酵剂，其中菌粉的存活率为78.24％。
实施例2.红茶发酵剂的制备。
1)称取1g红茶加入80mL 85℃水中浸泡15min，用4层纱布去除茶渣，得到茶液，然后加入茶液6％(质量分数)蔗糖溶解制得茶糖液。
2)将茶糖液装入250mL的无菌三角瓶中，装液量为100mL，冷却至室温。接入活菌总数为5.4×105CFU/mL的Kombucha菌液5％(v/v)，纱布封口，于28℃恒温摇床培养3d，得到发酵液。结果：真菌总数(1.5)×107CFU/mL，细菌总数(1.4)×108CFU/mL，发酵液总糖度3.2Brix，pH 3.67。
3)将发酵液以12000r/min离心5min，弃上清，收集全部菌体，获得菌泥。将海藻糖与甘油按照1:1的质量比混合后制成保护剂，将保护剂与菌泥按照2.5:1的质量比混合进行平衡，保持时间35min，真空度2Pa条件下，冷阱温度-45℃，真空干燥时间23h，冷冻干燥制备成红茶发酵剂，其中菌粉的存活率为75.5％。
实施例3.红茶发酵剂的制备。
4)称取1g红茶加入150mL 95℃水中浸泡8min，用4层纱布去除茶渣，得到茶液，然后加入茶液12％(质量分数)蔗糖溶解制得茶糖液。
5)将茶糖液装入250mL的无菌三角瓶中，装液量为100mL，冷却至室温。接入活菌总数为5.4×105CFU/mL的Kombucha菌液5％(v/v)，纱布封口，于28℃恒温摇床培养3d，得到发酵液。结果：真菌总数4.3×107CFU/mL，细菌总数3.8×108CFU/mL，发酵液总糖度3.64Brix，pH 3.41。
6)将发酵液以12000r/min离心5min，弃上清，收集全部菌体，获得菌泥。将海藻糖与甘油按照1:1的质量比混合后制成保护剂，将保护剂与菌泥按照4:1的质量比混合进行平衡，保持时间45min，在真空度10Pa条件下，冷阱温度-55℃，真空干燥时间25h，冷冻干燥制备成红茶发酵剂，其中菌粉的存活率为79.4％。
宏基因组对发酵3d的茶糖发酵液菌群组成分析。
以实施例1为例，将发酵3d茶糖液进行宏基因组测序，其中共有96.18％的细菌(63.46％)和真菌(32.72％)序列。在“种”水平上菌群组成中菌种丰度大于0.1％的具体菌种如图1所示。
细菌中丰度较高菌种为Komagataeibacter xylinus(8.91％)、Komagataeibactereuropaeus(8.42％)、Komagataeibacter intermedius(5.29％)、Komagataeibacterkakiaceti(4.35％)、Komagataeibacter hansenii(0.75％)、Komagataeibacteroboediens(1.26％)、Komagataeibacter medellinensis(2.75％)均属于Komagataeibacter菌属；Gluconacetobactersp.SXCC-1(4.09％)、Gluconacetobacterdiazotrophicus(1.64％)属于Gluconacetobactersp菌属；Gluconobacter oxydans(0.62％)、Gluconobacter japonicus(0.36％)、Gluconobacter albidus(0.32％)属于Gluconobacter菌属；Acetobacter malorum(1.19％)、Acetobacterpasteurianus(0.96％)、Acetobacter tropicalis(0.61％)、Acetobacter senegalensis(0.53％)、Acetobacter aceti(0.51％)Acetobacter cerevisiae(0.36％)、Acetobacternitrogenifigens(0.27％)、Acetobacter papayae(0.25％)、Acetobacter syzygii(0.14％)、Acetobacter indonesiensis(0.13％)、Acetobacter orientalis(0.11％)、Acetobacter ghanensis(0.11％)属于Acetobacter菌属；Sorangium cellulosum(0.26％)属于Sorangium菌属；Kozakia baliensis(0.25％)属于Kozakia菌属，都为变形菌门(Proteobacteria)。真菌中丰度较高菌种为Pichia kudriavzevii(12.37％)属于Pichia菌属；Brettanomyces bruxellensis(9.42％)属于Brettanomyces菌属；Ogataeaparapolymorpha(5.06％)、Ogataea angusta(0.17％)属于Ogataea菌属；Kuraishiacapsulata(0.63％)属于Pichia菌属，都为子囊菌门(Ascomycota)。
在检测到的菌种中Komagataeibacter xylinus、Komagataeibacter rhaeticus及Komagataeibacter europaeus用于细菌纤维素的生产；在果汁中也发现Komagataeibacterintermedius菌种；Gluconacetobacter diazotrophicus，该菌种具有产酸、产酯量高等特点；在芒果中也发现Acetobacter senegalensis；Acetobacter ghanensis对发酵可可豆有一定促进作用；值得关注的是Sorangium cellulosum的次级代谢产物埃博霉素具有抗肿瘤的活性，已成为国内外研究热点；真菌菌种中Brettanomyces bruxellensis是用来发酵葡萄酒或饮料的菌种；Ogataea parapolymorpha是一种新型甲醇同化酵母；Pichiakudriavzevii是一种可以增强发酵食品中叶酸含量的益生菌。与已有对红茶菌菌群组成分析的结果相比较，本次研究检测到Gluconacetobacter sp.SXCC-1是优势菌种。
实施例4.利用红茶发酵剂对玉米秸秆进行发酵的方法。
将自然风干的玉米秸秆组织粉碎机粉碎，过40目筛，备用。称取5g玉米秸秆粉加入1：1的茶糖水搅拌均匀，置于250mL烧瓶中，高压蒸气121℃灭菌20-30min。再加入实施例1制备的红茶发酵剂0.25g，放入温度30℃、湿度86％的恒温恒湿培养箱中培养，测定15d秸秆中纤维素、半纤维素、木质素降解率分别为32.04％，48.09％，50.50％。
氨基酸是组成蛋白质的基本物质，不同种氨基酸有其独特的生理作用和保健功能。用氨基酸自动分析仪对标准品进行检测，结果如图2、图3及表1所示。
表1玉米秸秆中氨基酸的检测结果(％)
注：*标记的是必需氨基酸
在利用本发明制备的红茶发酵剂发酵玉米秸秆的过程中，天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸含上升，甘氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、酪氨酸和脯氨酸含量有所下降，使游离氨基酸的含量上升，提高秸秆的营养价值。群菌发酵剂对玉米秸秆有机酸含量变化如图4、图5所示。
表2玉米秸秆发酵后有机酸含量分析结果(g/L)
菌群代谢途径中的糖酵解、三羧酸循环、磷酸戊糖循环和糖异生等都可能参与产细菌纤维素膜的过程，这些途径的中间代谢产物多为有机酸。从表2可知，玉米秸秆发酵后总有机酸含量大幅度增加，乙酸和葡萄糖酸含量较高。茶糖菌液发酵玉米秸秆代谢生成7种有机酸，除琥珀酸、乙酸、葡萄糖酸及柠檬酸含量上升，其余3种有机酸含量下降。发酵过程中葡萄糖酸的含量升高，菌群中出现大量醋酸菌，将葡萄糖转化为葡萄糖酸。柠檬酸含量增加，乙酸的含量上升，由于茶糖发酵液发酵过程中菌种之间的共生互生关系，代谢产物相互转化，丰富了玉米秸秆的营养成分。
Claims (10)
1.一种利用红茶发酵剂发酵玉米秸秆的方法，其特征在于，所述红茶发酵剂通过如下方法制备获得：
1)将红茶与水混合，85-95℃浸泡8-15min，滤去茶渣后，向茶液中加入蔗糖制成茶糖液，冷却至室温，所述红茶与水的料液比为1g:(80-150)mL，以茶液体积计，蔗糖添加量为6％～12％(质量)；
2)向茶糖液中接入Kombucha菌，28℃摇床培养3天，得到发酵液；
3)将发酵液离心后弃上清，收集菌体得到菌泥，将菌泥与保护剂以(1～1.5):(2.5～4)的质量比混合后，保持35-45min，然后在真空度为2～10Pa条件下，-45～-55℃，23-25h冷冻干燥制得红茶发酵剂；
所述玉米秸秆的发酵方法如下：将玉米秸秆粉与按照步骤1)的方法制备得到的茶糖液混合后，接入步骤3)制备得到的红茶发酵剂进行发酵。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述红茶发酵剂中菌种丰度大于0.1％的菌种如下：细菌包括Komagataeibacter xylinus、Komagataeibacter europaeus、Komagataeibacter intermedius、Komagataeibacter kakiaceti、Komagataeibacterhansenii、Komagataeibacter oboediens、Komagataeibacter medellinensis、Gluconacetobactersp.SXCC-1、Gluconacetobacter diazotrophicus、Gluconobacteroxydans、Gluconobacter japonicus、Gluconobacter albidus、Acetobactermalorum、Acetobacterpasteurianus、Acetobacter tropicalis、Acetobactersenegalensis、Acetobacter aceti、Acetobacter cerevisiae、Acetobacter nitrogenifigens、Acetobacterpapayae、Acetobacter syzygii、Acetobacter indonesiensis、Acetobacterorientalis、Acetobacter ghanensis、Sorangium cellulosum、Kozakia baliensis、Komagataella phaffii、Acetobactersyzygii、Acetobacter indonesiensis、Pediococcuspentosaceus、Gluconobacter cerinus、Gluconobacterfrateurii、Tanticharoenia sakaeratensis、Acetobacter orientalis、Clostridioides difficile、Nannocystissp.MB1016、Gluconobacter morbifer、Acetobacterghanensis和Acidiphilium cryptum；真菌包括Pichia kudriavzevii、Brettanomyces bruxellensis、Ogataeaparapolymorpha、Ogataea angusta、Kuraishia capsulata、Rhizophagusirregularis和Tremella mesenterica。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述浸泡，温度为90℃，浸泡10min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述红茶与水的料液比1g:100mL；以茶液体积计，蔗糖的添加量为10％(质量)。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中以茶糖液体积计，菌液浓度为5.4×105CFU/mL的Kombucha菌液按照5％(v/v)的比例接种到茶糖液中。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述保护剂为海藻糖与甘油按照1:1质量比组成的混合物。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述冷冻干燥温度为-50℃，干燥24h。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述玉米秸秆粉颗粒为40目。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述红茶发酵剂的接种量，以玉米秸秆粉质量计，为5％-7％(g/g)。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接入步骤3)制备得到的红茶发酵剂进行发酵所采用的温度为25～35℃、湿度为84％～88％，发酵时间为10-15天。
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| PB01 | Publication | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20200424 |