CN111057149A

CN111057149A - 抗人源d-二聚体单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN111057149A
Application number: CN201911290727.7A
Authority: CN
Inventors: 徐娅佳; 汪渊; 陈旭华; 谌敦华
Original assignee: Shanghai Cymbal Poetry Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Cymbal Poetry Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-16
Filing date: 2019-12-16
Publication date: 2020-04-24
Anticipated expiration: 2039-12-16
Also published as: CN111057149B

Abstract

本发明属于单克隆抗体技术领域，具体为一种抗人源D‑二聚体单克隆抗体及其应用。本发明的二聚体单抗包括由保藏编号为CGMCC No 18843的杂交瘤细胞株DD‑3A8和保藏编号为CGMCC No 18842的杂交瘤细胞株DD‑2E7分泌产生的单克隆抗体。本发明的抗人源D‑二聚体单克隆抗体配对使用，用于双抗夹心ELISA法检测人D二聚体，灵敏度高，线性范围宽。

Description

抗人源D-二聚体单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及抗人源D-二聚体单克隆抗体及其应用，属于生物医药工程技术领域。

背景技术

血液凝固的反向过程被称为纤维蛋白溶解，即在纤维酶的作用下将纤维凝块裂解成可溶性片段的过程。这一过程中，纤溶酶将纤维切割成许多不同分子量的碎片，形成了所谓的纤维降解产物(FDPs)^[1]。D-二聚体是最小的纤维降解产物(MW：180kDa)，它相对稳定并被认为是纤维蛋白溶解的最终产物，血液中增加的D-二聚体是激发凝血过程的标志物，临床上的应用十分广泛^[2,3]。

目前在临床实践使用的D-二聚体检测方法多种多样，包括免疫比浊法试、胶乳凝集法、ELISA、胶体金检测和荧光免疫层析法等，它们检测的灵敏度和线性宽度往往是由使用的抗体或抗体对决定的，因而抗体的特异性、灵敏度和检测线性宽度就尤为重要。

参考文献：

[1].Reber G,de Moerloose P,Coquoz C,Bounameaux H.Comparison of tworapid D-dimer assays for the exclusion of venous thromboembolism.Blood CoagulFibrin.1998；9:387–8.

[2].Mullier F,Vanpee D,Jamart J,Dubuc E,Bailly N,Douxfils J etal.Comparison of five D-dimer reagents and application of an age-adjustedcut-off for the diagnosis of venous thromboembolism in emergencydepartment.Blood Coagul Fibrin.2014；25:309–15.

[3].Kogan AE,Mukharyamova KS,Bereznikova AV,Filatov VL,Koshkina EV,Bloshchitsyna MN et al.Monoclonal antibodies with equal specificity to D-dimer and high-molecular-weight fibrin degradation products.Blood CoagulFibrin.2016；27(5):542–50.

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种抗人源D-二聚体单克隆抗体及其应用。本发明的抗人源D-二聚体单克隆抗体由2株能够稳定传代，且稳定分泌抗人源D二聚体单抗的杂交瘤细胞分泌产生。本发明的抗人源D-二聚体单克隆抗体配对使用，用于双抗夹心ELISA法检测人D二聚体，灵敏度高，线性范围宽。

7.本发明的技术方案具体介绍如下。

一种抗人源D-二聚体单克隆抗体，其轻链可变区VL和重链可变区VH分别包括四个框架区域FR1、FR2、FR3、FR4，以及三个高变区域CDR1、CDR2、CDR3，其氨基酸序列按N至C方向结构域如下：N-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-C；其中轻链可变区VL的框架区域FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID No:1～4所示；高变区域CDR1的氨基酸序列如SEQID NO:5所示，高变区域CDR2的氨基酸序列为YTS，高变区域CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示；重链可变区VH的FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别SEQ ID No:8～11所示；高变区域CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:12～14所示；其由保藏编号为CGMCC No 18843，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneral Microbiological Culture Collection Center for,简称CCTCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号、保藏日为2019年10月31日的杂交瘤细胞株DD-3A8分泌产生。

一种抗人源D-二聚体单克隆抗体，其轻链可变区VL和重链可变区分别包括四个框架区域FR1、FR2、FR3、FR4，以及三个高变区域CDR1、CDR2、CDR3；其氨基酸序列按N至C方向结构域如下：N-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-C；其中轻链可变区VL的框架区域FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID No:15～18所示；高变区域CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，高变区域CDR2的氨基酸序列为SAS，高变区域CDR3的氨基酸序列如SEQID NO:21所示；重链可变区VH的FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别SEQ ID No:22～25所示；高变区域CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:26～28所示；其由保藏编号为CGMCC No 18842，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneral Microbiological Culture Collection Center for,简称CCTCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号、保藏日为2019年10月31日的杂交瘤细胞株DD-2E7分泌产生。

本发明还提供一种上述的抗人源D-二聚体单克隆抗体在制备用于检测人D-二聚体的试剂盒方面的应用。

本发明进一步提供一种上述的抗人源D-二聚体单克隆抗体在制备检测人D-二聚体的制剂中的应用。

和现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明提供了一种不受纤维蛋白原(Fibrinogen，FIB)干扰的D二聚体单克隆抗体，即DD-3A8杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，并提供了能够与其配对使用的与FIB有弱反应但亲和力高的DD-2E7杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

2、本发明中公开的一对D二聚体单克隆抗体，以DD-3A8杂交瘤细胞株产生分泌的单克隆抗体为捕获抗体，DD-2E7杂交瘤细胞株产生分泌的单克隆抗体为标记抗体，配对应用于双抗夹心ELISA法检测D-二聚体时，与FIB不发生交叉反应，具有良好的特异性，且表现出良好的灵敏度和线性。

3、本发明公开了两单克隆抗体配对用于双抗夹心ELISA法检测人D二聚体时的捕获抗体的浓度、标记抗体浓度、抗原包被时间、抗体孵育时间和缓冲体系。在本发明的反应条件下，两单克隆抗体配对使用，灵敏度可达0.25μg/ml，线性宽度达0.25～8μg/ml。

附图说明

图1是抗体对灵敏度和线性测定(捕获抗体：100ng/孔检测板)。

图2是抗体对灵敏度和线性测定(捕获抗体：50ng/孔检测板)。

图3是IgG蛋白的结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施对本发明的技术方案进行详细阐述。

实施例1

1.抗原获得

使用抗原为BBI公司购入的人源D二聚体，货号为P202-3，初始浓度0.496mg/ml。

2.动物免疫

选取4周龄Balb/c小鼠进行免疫。第一次免疫使用与等体积的弗氏完全佐剂乳化后的抗原，注射颈前、颈后、颈浅部和左右腋下淋巴结五点，每点注射0.05ml；后足足垫两处，每处注射0.025ml。每只小鼠共注射抗原50μg，0.3ml。第一次免疫后第21天进行第二次免疫，使用与等体积的弗氏完全佐剂乳化后的抗原，腹腔注射0.05ml，并选择左右腋下和左右腹股沟淋巴结四处，每次注射约0.05ml，每次每只小鼠共注射抗原40μg，0.25ml。第二次免疫后第14天进行第三次免疫，使用1×PBS稀释抗原，腹腔注射0.05ml，并选取左右腋下和左右腹股沟淋巴结四处，每处注射约0.05ml，每次每只小鼠共注射抗原40μg，0.25ml。一周后眼眶采血测其效价，血清效价达到1：81000(表1)，即进行最后一次冲击免疫。冲击免疫使用1×PBS稀释后抗原进行静脉注射与腹腔注射联合免疫，每次共注射抗原60μg，300μl。

表1小鼠免疫后血清效价

注：细胞融合前一日采集眼眶血，检测小鼠免疫后效价。

3.饲养层细胞(小鼠腹腔巨噬细胞)的制备

选取状态良好的雌性Balb/c提前三天腹腔注射石蜡油，500μl/只。制备饲养层当日，取小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养层细胞，并于37℃，5％CO₂培养箱中培养一日，确认饲养层细胞无污染后方可使用。

4.细胞融合

骨髓瘤细胞SP2/0使用含10％FBS的RPMI-1640培养液培养，且需在融合前一天换液，保证细胞活力。于生物安全柜中取出免疫后小鼠的脾细胞后，脾细胞和SP2/0细胞分别计数。调整细胞数量为脾细胞：SP2/0细胞＝3：1。然后将脾细胞和SP2/0细胞混合，离心，吸尽培养液后，使用PEG促融合。

5.杂交瘤细胞的培养和筛选

使用HAT培养基，于37℃，5％CO₂条件下培养杂交瘤细胞，融合后第七日更换为含20％FBS的RPMI-1640培养液。换液后的第2天，ELISA检测细胞上清效价，选出反应呈阳性(OD 450nm≥1)的细胞，进行三或四次有限平板稀释，筛选出稳定的能够分泌单抗的细胞株：包括3A8、6E2、17H2、14F4、2E7、3G2、6E10、14F6、2A7和1D4。

6.单抗扩大生产——腹水法

每只小鼠腹腔注射约1×10⁶个杂交瘤细胞，接种细胞7天后可产生腹水，每只老鼠采集三次腹水后处死。

7.腹水效价测定

ELISA检测腹水效价，每孔包被抗原100ng，采用倍比稀释法，以三倍递增稀释腹水，以大于等于约2倍阴性对照孔(空白孔)的吸光度为最高稀释度来判定抗体的效价(表2)。使用已商业化的罗氏公司的D二聚体单抗M1(与FIB发生特异性反应)和M2(与FIB不发生特异性反应)作为参照抗体。

表2小鼠腹水效价

8.腹水的纯化

腹水纯化采用经典的辛酸硫酸铵沉淀法进行初步纯化，纯化后的抗体纯度达到95％以上。

9.抗体效价测定

纯化后的抗体调整蛋白浓度至1mg/ml，测定方式同腹水效价检测方式。使用已商业化的罗氏公司的D二聚体单抗M1(与FIB发生特异性反应)和M2(与FIB不发生特异性反应)作为参照抗体。

10.抗体特异性测定

采用ELISA法检测抗体与FIB、FDP、1×胆红素、10×胆红素、100×胆红素、15mg/ml甘油三酯、30mg/ml甘油三酯、15mg/ml胆固醇、20mg/ml胆固醇的反应。测得DD-3A8与FIB、FDP、1X胆红素、10×胆红素、100×胆红素、15mg/ml甘油三酯、30mg/ml甘油三酯、15mg/ml胆固醇、20mg/ml胆固醇均无反应，DD-2E7与1×胆红素、10×胆红素、100X胆红素、15mg/ml甘油三酯、30mg/ml甘油三酯、15mg/ml胆固醇、20mg/ml胆固醇无反应，与FIB、FDP有弱反应。

11.抗体亲和力测定

采用AMQ固化抗体法检测抗原亲和力，使用仪器为Octet生物分子相互作用系统(Pall-Fortebio，美国)。使用已商业化的罗氏公司的D二聚体单抗M1(与FIB发生特异性反应)和M2(与FIB不发生特异性反应)作为参照抗体。结果如表3所示，抗体DD-2E7的亲和力最强，DD-3A8亲和力略低于M1，但优于M2。

表3纯化后抗体效价亲和力和检测

12.抗体的亚型鉴定

用HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM二抗来鉴定所获得单克隆抗体的亚型。使用已商业化的罗氏公司的D二聚体单抗M1(与FIB发生特异性反应)和M2(与FIB不发生特异性反应)作为参照抗体。结果如表4所示，结果表明，单抗DD-3A8和DD-2E7的亚型为IgG1。

表4抗体亚型鉴定

图3是IgG蛋白的结构示意图。根据碱基序列与氨基酸编码序列的相应关系，分析PCR产物的阅读框架，确定抗体相应可变区的氨基酸序列；测序结果表明，DD-3A8杂交瘤细胞株产生分泌的单克隆抗体的轻链可变区VL和重链可变区VH分别包括四个框架区域FR1、FR2、FR3、FR4，以及三个高变区域CDR1、CDR2、CDR3，其氨基酸序列按N至C方向结构域如下：N-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-C；其中轻链可变区VL的框架区域FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID No:1～4所示；高变区域CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，高变区域CDR2的氨基酸序列为YTS，高变区域CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；重链可变区VH的FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别SEQ ID No:8～11所示；高变区域CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:12～14所示。

DD-2E7杂交瘤细胞株产生分泌的单克隆抗体的轻链可变区VL和重链可变区分别包括四个框架区域FR1、FR2、FR3、FR4，以及三个高变区域CDR1、CDR2、CDR3；其氨基酸序列按N至C方向结构域如下：：N-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-C；其中轻链可变区VL的框架区域FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID No:15～18所示；高变区域CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，高变区域CDR2的氨基酸序列为SAS，高变区域CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；重链可变区VH的FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别SEQ ID No:22～25所示；高变区域CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:26～28所示。

13.抗体配对初步检测

采用双抗夹心ELISA法检测抗体对配对效果，以DD-3A8为捕获抗体，筛选出配对后特异性好，OD值大于1的抗体对。使用已商业化的罗氏公司的D二聚体单抗M1(与FIB有交叉反应)和M2(与FIB不发生交叉反应)作为参照抗体。

14.抗体对灵敏度和线性测定

采用双抗夹心法，以DD-3A8为捕获抗体，且分别包被100ng/孔和50ng/孔两种检测板，以多个特异性较差D二聚体单克隆抗体为标记抗体，设置抗原浓度分别为0μg/ml、0.125μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml，每孔100ul，检测抗体对的灵敏度和线性，结果如表5、表6和图1、图2所示；并挑选出灵敏度与线性都十分优异的抗体对。使用已商业化的罗氏公司的D二聚体单抗M1(与FIB有交叉反应)和M2(与FIB不发生交叉反应)作为参照抗体。

最终确定的检测方法如下：

1).以DD-3A8作为捕获抗体，以1X PBST(配制10X PBS：NaCl 80g，KCl 2g，KH₂PO₄2.7g,Na₂HPO₄ 14.2g，加水定容至1L；使用前稀释10倍)为抗体稀释液，包被50ng/孔，每孔100μl，4℃过夜。

2)次日弃去包被液后，加入200μl/孔5％脱脂奶粉-PBS，37℃封闭2h后，弃净封闭液。

3)根据实验需求，配制不同浓度的抗原，100μl/孔，孵育1h后，洗板5次。

4)以DD-2E7作为标记抗体，1：2000倍稀释使用，使用5％脱脂奶粉-PBS作为抗体稀释液。

5)二抗孵育1h后，洗板5次。

6)显色。

表5抗体对灵敏度和线性测定(捕获抗体：100ng/孔检测板)

表6抗体对灵敏度和线性测定(捕获抗体：50ng/孔检测板)

如图1和图2所示，上述反应体系下，DD-3A8与DD-2E7配对使用，灵敏度可达0.25μg/ml，线性宽度达0.25～8μg/ml。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海钹乐诗生物技术有限公司

<120> 抗人源 D- 二聚体单克隆抗体及其应用

<130>

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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<223> 人工

<400> 1

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1 5 10 15

Gly Lys Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser

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<223> 人工

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1 5 10 15

Tyr

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<223> 人工

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<223> 人工

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<223> 人工

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<223> 人工

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Tyr

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<223> 人工

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<213> Artificial Sequence

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<223> 人工

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Ser Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Glu

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Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Arg Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp

20 25 30

Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

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<213> Artificial Sequence

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<223> 人工

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Claims

1.一种抗人源D-二聚体单克隆抗体，其特征在于，其轻链可变区VL和重链可变区VH分别包括四个框架区域FR1、FR2、FR3、FR4，以及三个高变区域CDR1、CDR2、CDR3，其氨基酸序列按N至C方向结构域如下：N-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-C；其中轻链可变区VL的框架区域FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID No:1～4所示；高变区域CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，高变区域CDR2的氨基酸序列为YTS，高变区域CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；重链可变区VH的FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别SEQ ID No:8～11所示；高变区域CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:12～14所示。

2.一种抗人源D-二聚体单克隆抗体，其特征在于，其轻链可变区VL和重链可变区分别包括四个框架区域FR1、FR2、FR3、FR4，以及三个高变区域CDR1、CDR2、CDR3；其氨基酸序列按N至C方向结构域如下：N-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-C；其中轻链可变区VL的框架区域FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID No:15～18所示；高变区域CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，高变区域CDR2的氨基酸序列为SAS，高变区域CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；重链可变区VH的FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别SEQ ID No:22～25所示；高变区域CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:26～28所示。

3.根据权利要求1所述的抗人源D-二聚体单克隆抗体，其特征在于，其由保藏编号为CGMCC No 18843的杂交瘤细胞株DD-3A8分泌产生。

4.根据权利要求2所述的抗人源D-二聚体单克隆抗体，其特征在于，其由保藏编号为CGMCC No 18842的杂交瘤细胞株DD-2E7分泌产生。

5.一种根据权利要求1或2所述的抗人源D-二聚体单克隆抗体在制备用于检测人D-二聚体的试剂盒方面的应用。

6.一种根据权利要求1或2所述的抗人源D-二聚体单克隆抗体在制备检测人D-二聚体的制剂中的应用。