CN111053891A - 治疗糖尿病的多肽纳米粒、多肽纳米粒微针及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物制剂及其制备方法技术领域，具体涉及一种治疗糖尿病的多肽纳米粒、多肽纳米粒微针及其制备方法。该方法如下：1)制备包载有艾塞那肽的壳聚糖纳米粒；2)通过物理交联法制备硬度强、溶解性高、生物相容性好的聚合物复合微针；3)将纳米粒冻干成粉末装载入聚合物微针中制成干粉载药微针。本发明利用聚合物微针制备过程中自然形成的空穴装载艾塞那肽纳米粒冻干粉末，制备成可用于二型糖尿病治疗的艾塞那肽干粉微针，本发明的艾塞那肽壳聚糖纳米粒微针透皮贴片，可有效降低由该药物引发强烈炎症和免疫系统反应的风险，实现无痛、无针、透皮、缓释降糖的目的。

Description

治疗糖尿病的多肽纳米粒、多肽纳米粒微针及其制备方法

技术领域

本发明属于药物制剂及其制备方法技术领域，具体涉及一种治疗糖尿病的多肽纳米粒、多肽纳米粒微针及其制备方法。

背景技术

截止2017年，国际糖尿病联盟(IDF)统计全球糖尿病患者高达4.51亿名，仅2017年一年，因糖尿病导致的死亡人数就达到了500万。由于糖尿病极易产生神经病变、终末期肾病、视网膜病变、心血管疾病等合并症，每年用在糖尿病相关治疗上的费用达到8500亿美元以上。糖尿病的高患病率和高治疗费用给世界各国金融和卫生系统带来了极大的负担。

II型糖尿病又称成人发病型糖尿病，多在35岁以后发病，在所有糖尿病患者中占总人数的90％。II型糖尿病主要表现为胰岛素敏感性降低以及β细胞功能障碍导致胰岛素分泌受损。

醋酸艾塞那肽是一种胰高血糖素样肽类似物，含有39个氨基酸，能增加葡萄糖依赖性胰岛素的分泌，缓解胃排空。自2005年被FDA批准上市以皮下注射的方式每日两次餐前给药。注射作为患者依从性极低的给药方式通常伴随有疼痛、针头恐惧症和注射部位感染等问题。因此纳米材料和微针结合能有效解决给药频率高和一系列注射带来的问题，提高患者依从性。

微针是一种小型侵入性设备，根据形态和性质的不同可大致分为实心微针、包衣微针、空心微针和可溶性微针四种。微针长度一般为25-2000μm，尖端直径为1-25μm，这使其能在不损伤神经和毛细血管的基础上深入皮肤表皮或真皮层进行给药。金属、硅、玻璃、镍、钛以及聚合物常被用作制备微针的材料。相较于其他材料，聚合物制备成的微针对皮肤的刺激性更小，创口感染的风险更低，故逐渐成为微针制备的主要材料。单一聚合物材料制备的微针存在机械强度低、成型性差、脆度高等缺点。

羧甲基纤维素钠(CMC-Na)是一种从纤维素中分离出来的阴离子多糖，具有高生物相容性、低毒性、可降解、高亲水性和高延展性等优点；透明质酸(HA)是一种酸性粘多糖材料，具有调节血管壁通透性、促进创伤愈合、高保水、高生物相容性、低刺激性、易降解等优点。这两类材料被广泛应用于药物缓释领域。

目前，载药量低、药物稳定性不高是限制微针大规模生产及应用的主要因素。

发明内容

本发明的目的之一在于解决现有技术的不足，提供一种治疗糖尿病的多肽纳米粒，该多肽纳米粒药物稳定性好，用于加工而成的多肽纳米粒微针，与常规可溶性微针有效载药量(针尖及近针头端可被渗透吸收的药量)只有7.12μg相比，有效载药量能达到200μg，极大程度增加了微针的有效载药量。

本发明的目的之二在于提供一种治疗糖尿病的多肽纳米粒微针，该微针载药量高，药物满足患者单次最高给药量要求，并可以减少给药次数。另外，所载药物的稳定性好，可常温储存，方便运输。使用操作简单，费用低廉，适用于大规模推广。

本发明的目的之三在于提供一种治疗糖尿病的多肽纳米微针的制备方法。

为了实现上述发明目的，本发明拟采用以下技术方案：

一种治疗糖尿病的多肽纳米粒料，由以下方法制备：

S1：壳聚糖(CS)溶液配制：选取低分子量(120K)壳聚糖投入0.2％(v/v)醋酸溶液中配制成1.4-1.6mg/ml的壳聚糖溶液，搅拌溶胀12h，取溶胀后的壳聚糖溶液用0.1mol/l的NaOH溶液调整pH至5.8-6.2后用孔径为0.45μm的水性滤膜进行过滤；

S2：三聚磷酸钠(TPP)溶液配制：取三聚磷酸钠投入去离子水中配制成0.7-0.9mg/ml的三聚磷酸钠溶液并用0.2％(v/v)醋酸溶液调整pH为6，用孔径为0.45μm的水性滤膜进行过滤；

S3：FITC-EX4溶液配制：称取100μg FITC-EX4投入10ml去离子水中配制成10μg/mlFITC-EX4溶液并用0.2％(v/v)醋酸溶液调整pH为5.8-6.2，用孔径为0.45μm的水性滤膜进行过滤；

S4：载有治疗糖尿病的多肽类药物的纳米粒制备：将FITC-EX4溶液与TPP溶液1∶1(v/v)混合后以1.8-2.2s/滴的速度缓慢滴加到壳聚糖溶液中直至出现明显蓝色乳光；

S5：载有多肽类药物的纳米粒冻干制剂制备：将制得的FITC-EX4壳聚糖纳米粒于-80℃条件下冻干成多肽纳米粒粉末。

作为优选，壳聚糖溶液浓度为1.5mg/ml；

作为优选，三聚磷酸钠溶液浓度为0.8mg/ml；

作为优选，纳米粒制备过程中pH为6；

作为优选，制备速度为2s/滴；

作为优选，纳米粒制备过程中搅拌速度为600rad/min；

本发明还提供了前述多肽纳米粒加工而成的纳米粒微针，其以复合聚合物加工而成的带空穴的微针内装载多肽纳米粒而成。

本发明的多肽纳米粒微针的制备方法，步骤如下：

S1：可溶性微针模具制备：选取力学性能好的200-800μm金属微针作为可溶性微针的阳模，平缓插入聚二甲基硅氧烷(PDMS)中，抽真空去除气泡，70℃干燥2h，冷却至室温后取出阳模，形成阴模；

S2：配置羧甲基纤维素钠/透明质酸(CMC-Na/HA)凝胶：确定羧甲基纤维素钠/透明质酸的质量比为1∶5；配置8-12％(w/v)低浓度羧甲基纤维素钠/透明质酸凝胶，用于制备微针贴片；确定羧甲基纤维素钠/透明质酸的质量比为1∶5；配置12-17％(w/v)高浓度羧甲基纤维素钠/透明质酸凝胶，用于制备微针针头；

S3：取上述高浓度羧甲基纤维素钠/透明质酸凝胶置于微针模具中，在4℃下，置于6孔板中3000rad/min水平离心5min后转置继续离心，重复3次，利用离心力使羧甲基纤维素钠/透明质酸凝胶进入微针模具中；

S4：去除多余的羧甲基纤维素钠/透明质酸凝胶，置于真空环境中干燥12h形成带空穴的针头；

S5：加入冻干的多肽纳米粒粉末，轻敲使其自然下落，分布均匀，置于6孔板中1000rad/min水平离心10min后转置离心10min；

S6：取出，加入低浓度羧甲基纤维素钠/透明质酸凝胶，在4℃下，置于6孔板中2000rad/min水平离心5min后转置继续离心5min；调整离心速度至1500rad/min水平离心5min后转置继续离心5min；调整离心速度至1000rad/min水平离心5min后转置继续离心5min形成基底贴片；

S7：置于室温下干燥24h后用胶布黏附基底贴片背面，然后脱模。

作为优选，微针的高度为500μm；

作为优选，贴片羧甲基纤维素钠/透明质酸凝胶浓度为10％，此浓度黏度和流动性适中，吸湿性低且不皱缩，易于制备；

作为优选，针头羧甲基纤维素钠/透明质酸凝胶浓度为15％，此浓度形成的针头含水量低，硬度高，脆性适中针形完整。

与现有技术相比，本发明的优点如下：

1.本发明以复合聚合物加工而成的带空穴的微针装载治疗糖尿病的多肽纳米粒，相较于现有的微针直接载药而言，可实现长时间、高稳定性给药；

2.本发明制备的复合聚合物微针贴片具有更好的机械性能，能轻易刺入皮肤且刺激较小，不易引起皮肤过敏反应；

3.本发明制备的复合聚合物微针以微针天然形成的空穴装载多肽纳米粒粉末，有效提高载药量；

4.本发明制备的复合聚合物微针贴片吸湿性低，不会受空气湿度影响导致机械性能的降低，易于保存及运输。

附图说明

图1为多肽纳米粒微针制备方法示意图：A定制的金属微针阳模；B利用阳膜制备的PDMS阴模；C加入15％羧甲基纤维素钠/透明质酸凝胶制备的微针针头；D加入10％羧甲基纤维素钠/透明质酸凝胶制备的微针贴片；E脱模完成的微针；

图2为多肽纳米粒在达尔文粒径仪下的分布图，平均粒径为149.9nm，分散系数PDI为0.16，说明形成完整、均一且粒径较小的纳米颗粒；

图3为本发明治疗糖尿病的多肽纳米粒的体外释放行为曲线图，与控制组(药物直接释放组，12小时基本释放完毕)相比有缓慢释放效果，60小时后释放完全；

图4为制备完整的微针贴片：A空白微针；B载药微针；

图5为所制备的微针贴片在扫描电子显微镜(SEM)下的形态：A放大60倍的微针显微图；B放大200倍的微针显微图；制备的500μm空白(不载药)微针贴片，微针长度和底座直径分别为500和130μm，针尖顶端直径为12μm，针之间的中心间距700μm，针体均匀尖锐，贴片平整在扫描电镜(SEM)呈圆锥体阵列，针尖锋利不弯曲，针体表面光滑无裂痕，形态良好；

图6为所制备的微针力学性能考察结果，由图可知，500μm的微针(单根针)能承受的极限压力为0.21N，一般认为，微针刺入皮肤大约需要0.15N/针的力，这也从理论上证明了本发明制备的微针达到了透皮要求；

图7为微针贴片透皮性能考察结果，A为将制得的500μm微针刺入小鼠离体皮肤，皮肤上出现肉眼明显可见的针孔阵列；B移除微针后用0.4％台盼蓝溶液对该皮肤进行染色，针孔呈现蓝色，说明微针的刺入造成皮肤细胞死亡，进一步证实了微针能穿透皮肤角质层在真皮层形成微通道；

图8为微针内药物稳定性考察结果，A为100μg/ml的EX4-FITC的液相图，B为载药微针在置于相对湿度60％，温度60℃的环境下静置72h后的液相图，比较两图可发现微针所载的EX4-FITC未发生变质；

图9为微针机械性能稳定性测试，A为湿度0％时的微针显微图片，B为湿度75％时的微针显微图片，可见微针在湿度为75％的环境下储存至与环境等湿度(微针质量不变)后机械性能无改变，仍保持完整；C为不同相对湿度下微针的含水量，含水量图显示相对湿度75％后微针开始大量吸水。

具体实施方式

以下以具体实施例来说明本发明的方案，但本发明的保护范围不限于此：

实施例1

包载多肽类药物的多肽纳米粒制备方法如下：

1.用0.2％醋酸溶液分别配制浓度为2mg/ml；2.5mg/ml；1mg/ml；0.5mg/ml的低分子量壳聚糖溶液，搅拌溶胀12h；

2.用去离子水配制浓度为1.2mg/ml；0.8mg/ml；0.4mg/ml；0.2mg/ml的三聚磷酸钠溶液；

3.用去离子水配制浓度为10μg/ml的醋酸艾塞那肽溶液；

4.在速度为200、400、600、800、1000、1200rad/min条件搅拌下向壳聚糖溶液中滴加三聚磷酸钠和醋酸艾塞那肽混合液(体积比为1∶1混合)使之形成纳米粒；冷冻干燥后获得多肽纳米粒粉末。

实施例2

离心法配合荧光酶标仪测定药物的包封率和载药量，取制备好的多肽纳米粒溶液适量，15000rad/min离心30min，取上清液过220nm滤膜后通过荧光酶标仪测定并计算药物的包封率和载药量。

包封率＝(m_投药-m_{上清液含药})/m_投药×100％

载药量＝(m_投药-m_{上清液含药})/m_{载药纳米粒}×100％

经测定，FITC-EX4壳聚糖纳米粒的包封率及载药量分别为74.26％和25.61％。

实施例3

治疗糖尿病的多肽纳米粒体外释放方法如下：

取实例1制备的艾塞那肽壳聚糖纳米粒溶液3ml于14K透析袋中，设置含等量艾塞那肽水溶液作为对照组置于透析袋中，将透析袋放置于盛有70ml pH7.4PBS的100ml释放管内。放入全温震荡培养箱设置震荡速度100rad/min，温度37℃进行震荡。分别于1、2、3、6、9、12、24、36、60、72h取样1ml，同时补充同等体积的pH7.4PBS。

实施例4

复合聚合物空白微针制备方法如下：

1.称取一定量的羧甲基纤维素钠与透明质酸混合比例为1∶2、1∶5、2∶1、5∶1的羧甲基纤维素钠与透明质酸混合物，加纯化水利用四维旋转混合仪配成5％、8％、10％、15％、20％的水凝胶保存至4℃冰箱备用；选择浓度为15％，羧甲基纤维素钠∶透明质酸＝1∶5用于制备针头；选择浓度为10％，羧甲基纤维素钠∶透明质酸＝1∶5用于制备贴片；

2.取浓度为15％，羧甲基纤维素钠∶透明质酸＝1∶5的凝胶0.2g加入微针阴模中，所述的模具为1.5×1.5cm，微针高度为500μm的聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具；

3.用微量药匙刮去模具表面多余的羧甲基纤维素钠/透明质酸凝胶(收集备用)，将模具置于真空干燥箱中干燥12h，形成针头；

4.取出模具在表面加入0.12g低浓度羧甲基纤维素钠/透明质酸凝胶，在4℃条件下，以2000rad/min的速度水平离心5min后转置继续以相同条件离心5min，重复三次，形成基底贴片；

5.将模具常温常压干燥24h后用胶带小心脱模，即得制备好的空白微针贴片(图4A)。

实施例5

一种多肽纳米粒微针贴片的制备方法如下：

1.按照实施例4中步骤1-3所述方法制备复合聚合物微针针头；

2.将2mg多肽纳米粒干粉均匀倒入模具表面，抹平，轻敲使其自然下落，1000rad/min水平离心10分钟；

3.按照实施例4中步骤4-5方法制备微针贴片。

实施例6

微针的机械力学性能考察：

将微针贴片剪成3×3阵列(即含有9根微针)，用胶带固定在质构仪的铝制底座上，选择压缩模式，设置p/6探针的运动速度为0.1mm/s，触发力为0.04N，数据采集率为25，保持探针与微针轴向平行，缓慢下降，直到微针完全形变，位移中分析仪记录探针所受的压力如图6。

实施例7

微针皮肤穿刺性能测试：

离体皮肤实验：健康SD大鼠脱颈处死并脱毛，进行离体皮肤剥离，去除皮下脂肪，皮肤保存于4℃生理盐水备用。使用前用滤纸吸去表面残留水分，真皮侧朝下固定在泡沫上，取500μm微针贴片垂直刺入，30s后移除微针，皮肤形成明显针孔形态阵列(图7A)；用0.4％台盼蓝溶液染色后以脱脂棉蘸取乙醇擦去皮肤表面多余染料，如图7B可见清晰蓝色针孔，证明微针成功刺入皮内，造成了皮肤细胞的死亡。

实施例8

多肽纳米粒微针内药物储存稳定性测试：

多肽纳米粒微针内药物稳定性实验：取制备好的载药微针，置于相对湿度60％，温度60℃的环境下静置72h后取出微针溶解于去离子水中稀释备用；取-4℃储存的EX4-FITC溶于去离子水，配制成100μg/ml的EX4-FITC溶液；将EX4-FITC溶液与载药微针在相同条件下进行高效液相色谱检测，如图8中A为100μg/ml的EX4-FITC的液相图，B为载药微针的液相图，比较两图可发现微针所载的EX4-FITC未发生变质。

实施实例9

微针机械性能稳定性测试：

微针吸湿性实验：取新制备微针于湿度0-100％的环境中储存，记录不同湿度环境下微针的含水量并拍照观察不同湿度坏境下微针的外观变化，如图9中，A为湿度0％时的微针显微图片，B为湿度75％时的微针显微图片，可见微针在湿度为75％的环境下储存至与环境等湿度(微针质量不变)后机械性能无改变，仍保持完整；C为不同相对湿度下微针的含水量，相对湿度75％后开始大量吸水。

Claims (9)

1.一种治疗糖尿病的多肽纳米粒料，由以下方法制备：

S1：壳聚糖溶液配制：选取120K的低分子量壳聚糖投入0.2％(v/v)醋酸溶液中配制成1.4-1.6mg/ml的壳聚糖溶液，搅拌溶胀12h，取溶胀后的壳聚糖溶液用0.1mol/1的NaOH溶液调整pH至5.8-6.2后用孔径为0.45μm的水性滤膜进行过滤；

S2：三聚磷酸钠溶液配制：取三聚磷酸钠投入去离子水中配制成0.7-0.9mg/ml的三聚磷酸钠溶液并用0.2％(v/v)醋酸溶液调整pH为6，用孔径为0.45μm的水性滤膜进行过滤；

S3：FITC-EX4溶液配制：称取100μg FITC-EX4投入10ml去离子水中配制成10μg/mlFITC-EX4溶液并用0.2％(v/v)醋酸溶液调整pH为5.8-6.2，用孔径为0.45μm的水性滤膜进行过滤；

S4：载有治疗糖尿病的多肽类药物的纳米粒制备：将FITC-EX4溶液与TPP溶液1∶1(v/v)混合后以1.8-2.2s/滴的速度缓慢滴加到壳聚糖溶液中直至出现明显蓝色乳光；

S5：载有多肽类药物的纳米粒冻干制剂制备：将步骤S4制得的FITC-EX4壳聚糖纳米粒溶液于-80℃条件下冻干成多肽纳米粒粉末。

2.根据权利要求1所述治疗糖尿病的多肽纳米粒，其特征在于，壳聚糖溶液浓度为1.5mg/ml，三聚磷酸钠溶液浓度为0.8mg/ml。

3.据权利要求1所述治疗糖尿病的多肽纳米粒，其特征在于，步骤S1、S2和S3中pH值为6.0。

4.据权利要求1所述治疗糖尿病的多肽纳米粒，其特征在于，步骤S4中滴加速度为2s/滴。

5.据权利要求1所述治疗糖尿病的多肽纳米粒，其特征在于，纳米粒制备过程中搅拌速度为600rad/min。

6.一种权利要求1-5任意一项治疗糖尿病的多肽纳米粒加工而成的多肽纳米粒微针。

7.根据权利要求6所述的多肽纳米粒微针，其特征在于，所述多肽纳米粒装载于以羧甲基纤维素钠/透明质酸复合聚合物加工而成的带空穴的微针内。

8.一种权利要求7所述多肽纳米粒微针的制备方法，其特征在于，步骤如下：

S1：可溶性微针模具制备：选取力学性能好的200-800μm金属微针作为可溶性微针的阳模，平缓插入聚二甲基硅氧烷中，抽真空去除气泡，70℃干燥2h，冷却至室温后取出阳模，形成阴模；

S2：配置羧甲基纤维素钠/透明质酸凝胶：确定羧甲基纤维素钠/透明质酸的质量比为1∶5；配置8-12％(w/v)低浓度羧甲基纤维素钠/透明质酸凝胶，用于制备微针贴片；确定羧甲基纤维素钠/透明质酸的质量比为1∶5；配置12-17％(w/v)高浓度羧甲基纤维素钠/透明质酸凝胶，用于制备微针针头；

S3：取上述高浓度羧甲基纤维素钠/透明质酸凝胶置于微针模具中，在4℃下，置于6孔板中3000rad/min水平离心5min后转置继续离心，重复3次，利用离心力使羧甲基纤维素钠/透明质酸凝胶进入微针模具中；

S4：去除多余的羧甲基纤维素钠/透明质酸凝胶，置于真空环境中干燥12h形成带空穴的针头；

S5：加入冻干的多肽纳米粒粉末，轻敲使其自然下落，分布均匀，置于6孔板中1000rad/min水平离心10min后转置离心10min；

S6：取出，加入低浓度羧甲基纤维素钠/透明质酸凝胶，在4℃下，置于6孔板中2000rad/min水平离心5min后转置继续离心5min；调整离心速度至1500rad/min水平离心5min后转置继续离心5min；调整离心速度至1000rad/min水平离心5min后转置继续离心5min形成基底贴片；

S7：置于室温下干燥24h后用胶布黏附基底贴片背面，然后脱模。

9.权利要求8所述多肽纳米粒微针的制备方法，其特征在于，金属微针选用500μm，低浓度羧甲基纤维素钠/透明质酸凝胶的浓度为10％，高浓度羧甲基纤维素钠/透明质酸凝胶的浓度为15％。

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