CN111044470A - 一种血红蛋白半定量检测试剂及便潜血标本采集和检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血红蛋白检测试剂及便潜血标本采集和检测的方法，所述检测试剂包括：试剂A、试剂B和试剂C，所述试剂A为CTAB‑高氯酸溶液，所述试剂B为咪唑缓冲液，所述试剂C为0.9％NaCI溶液，所述试剂A、试剂B和试剂C的体积比20:4:11。用本方法进行便潜血半定量检测时，结果可以避免一些人为因素等的干扰，灵敏度大于定性实验(检测限<100ug/ml)。本发明检测试剂主要用于检测便标本，也可以用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液等中血红蛋白含量。环保且质量可靠，与金标准法对比也很理想；同时，原料易得成本低，检测过程也较简单，也不存在免疫法的拖尾情况；用于便潜血测定的优势就更加明显。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术分析检测领域，尤其是一种血红蛋白半定量检测试剂及便潜血标本采集和检测的方法。
背景技术
血红蛋白是红细胞的主要成份。每个血红蛋白分子由4个血红素基团与珠蛋白构成，每个血红素又由4个吡咯环组成，在环中央有一个铁原子。血红蛋白中的铁在二价状态时，可与氧呈可逆性结合(氧合血红蛋白)，如果铁氧化为三价状态。血红蛋白则转变为高铁血红蛋白，就失去了载氧能力。测定血红蛋白含量使用的方法有四种：①比色法。这是临床上使用最广泛的方法，它可分为目视比色和光电比色两类，后者根据所用的稀释液不同，再分为氰化高铁血红蛋白法、碱化血红蛋白法、酸化血红蛋白及氧合血红蛋白法。良好的稀释液必须能使血中所有的血红蛋白都转变为一种稳定的血红蛋白衍生物，以便能测出血中血红蛋白总量。氰化高铁血红蛋白法基本上具备了这个优点，它能使除了硫化血红蛋白(正常人血中极少)以外的所有血红蛋白都变成稳定的氰化高铁血红蛋白。所以用这种方法测得的结果准确，重复性好。因此氰化高铁血红蛋白法已成为国际上测定血红蛋白的标准方法。血红蛋白目视比色法准确性差，国外已被淘汰。但该法简便，经济，目前仍在有些基层医疗单位使用。②化学检测法。③测氧法。此二方法复杂，不适于常规使用。④免疫法。该法准确性差。
血红蛋白检验主要用于血液检测了解贫血等疾病；大便及尿液隐血检测分别检测肠道和泌尿系统。现阶段，便潜血的检测主要方法包括：便潜血(fecal occult bloodtesting，FOBT)和免疫检测(fecal immunochemica occult blood testing，FIT)，前者其敏感度和特异性较低，化学法根据亚铁血红蛋白具有过氧化物酶的作用，可催化过氧化氢生成新生态氧，氧化联苯胺等底物生成有色化合物的原理设计，检测形式有化学法和干化学法，由于联苯胺对人体有致癌性，现在已很少使用，另外，外源性食物中动物血红蛋白、肌红蛋白、可引起假阴性；大量食蔬菜中含有活性的植物过氧化酶也可催化H2O2分解产生新生态氧导致假阳性；V-C、铁剂及其他还原物可中和氧化物不能产生新生态氧引起假阴性。检测中要排除这些干扰。后者免疫层析胶体金技术的缺点是双抗体夹心存在HOOK效应，主要集中在潜血试验项目中。HOOK效应是指在双位点夹心免疫试验中，其剂量反应曲线的高剂量区段，线性走向不是呈平台状无限后延，而是向下弯曲状，此现象称之为HOOK效应，即钩状效应。目前，对于潜血的免疫学检测一般需要多步稀释才能使其处于线性范围内，但这样造成的误差势必会加大。FOBT检测灵敏度高但线性范围较窄(200ng/ml-2000ng/ml)，而且FOBT易出现假阴性结果，原因如下：(1)若上消化道出血经过消化道酶降解或者消化已不具有原来的免疫抗原性。(2)过量的大出血而致使反应体系中抗原过剩出现后带现象(HOOK效应)。(3)病人的血红蛋白(haematoglobin，Hb)的抗原与单克隆抗体不匹配等。
粪便潜血试验(FOBT)是检测肠道损伤的一种常用方法，也是筛查结直肠癌的有效方法。目前实验室常用的FOBT方法中，常用化学法和免疫胶体金法，粪便潜血是指消化道少量出血，红细胞被消化破坏，粪便外观无异常改变，肉眼和显微镜均不能证实的出血。粪便潜血试验一般用化学试验来检测粪便中微量的、肉眼看不到的血液。但正常人24h的胃肠道生理性失血量约0.6ml，用高灵敏度的化学法潜血试验(可检出消化道出血1ml以上)一般也难以检出；用灵敏度更高、特异性强的免疫学方法有时可出现假阳性，故值得注意。
发明内容
为解决的现有技术额问题，本发明所要提供一种血红蛋白检测试剂及便潜血标本采集和检测的方法。对于血红蛋白的检测用了环保无污染的方式，尤其是便潜血检测时，对于标本的不均匀性、大便稀稠不一及临床门诊取便的方式考虑，本发明方法采用了9点取便法，每次2-3g左右(黄豆粒大小)，混匀后进行如下原理技术的半定量检测，因取样误差较大，可视为是一种半定量的检测方法。测定技术为半定量检测便潜血的试剂。
一种便潜血(血红蛋白)的半定量检测试剂原理：主要用十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)和Hb作用，用微量高氯酸做沉淀蛋白质等，生产棕红色化合物。用530nm波长进行检测，同时建立标准曲线，用检测结果计算血红蛋白浓度。本法操作简单，呈色稳定，准确性和精确性符合要求，且无公害，结果准确、重复性好的优点。
本发明的技术方案是：一种血红蛋白检测试剂，包括：试剂A、试剂B和试剂C，所述试剂A为CTAB-高氯酸溶液，所述试剂B为咪唑缓冲液，所述试剂C为0.9％NaCI溶液，所述试剂A、试剂B和试剂C的体积比20:4:11。
根据上述的技术方案，优选的，所述CTAB-高氯酸溶液的配制方法为：将1-7g CTAB溶解于100ml乙醇中，再加入0.1-1g高氯酸、8-12.1g TRIS，溶解于800ml水中，之后用水定容到1L。
根据上述的技术方案，优选的，所述乙醇为浓度30-50％的乙醇。
根据上述的技术方案，优选的，所述高氯酸为浓度25-35％的高氯酸。
根据上述的技术方案，优选的，所述咪唑缓冲液为pH 7.0咪唑缓冲液。
根据上述的技术方案，优选的，所述pH 7.0咪唑缓冲液的配制方法为：先配制500-700mmol/L的NaCI溶液，再用NaCI溶液配制成0.25-0.5mol/L的咪唑溶液，之后用酸调pH至6.5-7.5。
根据上述的技术方案，优选的，所述的酸为盐酸。
本发明还保护一种用于检测便标本、细胞、组织的裂解液或匀浆液中血红蛋白含量。
一种便潜血标本采集方法，所述采集方法为9点取便法，具体包括如下步骤：
(1)先用采样棒从四周方向刮取一个圆圈，在圆圈上沿4条等分线方向的刮取。
(2)然后用小竹片进行圆圈上八等分点和圆心处共9个点的取样，每个点取黄豆粒大小(约2-3g)。
(3)将上述所有取的便标本放入采样用试管中，内有0.9％生理盐水2.5ml，混匀待用。
一种便潜血检测方法，使用血红蛋白(便潜血)检测试剂，为比色法，具体为：向粪便标本(便潜血标本)中加入生理盐水(0.9％NaCI溶液)、活性炭混匀，先通过40-60目的铜筛过滤，滤过液再通过260目锦纶筛兜过滤(约54微米)，再用玻璃漏斗过滤(20～30um滤除粗沉淀及胶状)，在3000转/分下离心10分钟，所得上清液中加入上述血红蛋白检测试剂，用分光光度计在530nm下进行检测，读取吸光度(OD)值，并根据比尔—朗伯定律计算结果；
所述粪便标本、生理盐水与活性炭的比例关系为50-250mg：2.5ml：250mg；
所述上清液与血红蛋白检测试剂的体积比为30-60:1。
根据上述的技术方案，优选的，所述粪便标本(便潜血标本)的采集方法为上述的9点取便法。
本发明的有益效果是：
(1)用本发明方法进行便潜血半定量检测时，结果可以避免一些人为因素等的干扰，灵敏度大于定性实验(检测限<100ug/ml)。
(2)本发明检测试剂主要用于检测便标本，也可以用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液等中血红蛋白含量。
(3)环保且质量可靠，与金标准法对比也很理想；同时，原料易得成本低，检测过程也较简单，也不存在免疫法的拖尾情况；用于便潜血测定的优势就更加明显。
附图说明
图1为刮取粪便平面图法。
图2为实施例1中本发明的方法得到的血红蛋白标准曲线。
具体实施方式
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
如图1所示，本发明所述一种便潜血标本采集方法，采用外周一圈和9点取便法，即所述刮取粪便平面图的方法，包括如下步骤：
(1)先用采样棒从四周一个圈的刮取一次，再沿等分4条线方向的刮取。
(2)然后用小竹片进行如图9个点的取样，每个点取黄豆粒大小(约2-3g)。
(3)上述所有取的便放入采样用试管中，内有0.9％生理盐水2.5ml，混匀待用。
下述实施例中涉及的试剂和仪器如下：
试剂A为CTAB-高氯酸溶液，记作A液，配制方法为：称取CTAB 6g,加40％乙醇100ml，取35％高氯酸0.3g,TRIS 8g，溶解蒸馏水800ml，蒸馏水定容到1L。
试剂B为pH7.0咪唑缓冲液，记作B液，配制方法为：首先配制620mmol/L NaCI溶液，用此液再配制成0.3mol/L的咪唑溶液用10％HCI调pH为7.0。
试剂C为0.9％NaCI溶液，记作C液。
血红蛋白检测试剂记作检测试剂D，所述检测试剂D溶液的配制方法为：取A液200ml，B液40ml，C液110ml，按此比例配制进行配制反应试剂D，混匀密封避光保存。
Hb标准品厂家：Sigma公司。
胶体金纸条厂家：由艾博生物医药(杭州)有限公司生产。
分光光度计721：上海元析仪器有限公司。
实施例1本试验与对比实验
标准曲线的制取：
1.配制标准品工作液：取出Hb标准品恢复至室温，浓度分别配制为50g/L，100g/L，150g/L，200g/L的标准液。
2.用721分光光度计540nm检测，OD值分别为0，0.126，0.25，0.4，0.54。
3.方法比对验证及绘制标准曲线：
(1)采用静脉新鲜血样3个，分别各取20微升2份，其中一份加到5ml血红蛋白转化液(文齐氏法)中，另一份加到本方法所新配制的5ml检测试剂D中，分别进行混匀，静止5分钟。分别吸取1ml于比色杯中，用分光光度计分别在540nm和530nm波长下，按标准测量方式，测定二者的吸光度(OD值)。然后根据比尔—朗伯定律(Beer–Lambertlaw)计算结果。结果见下表和图2，检测结果成线性关系：
(2)分别取Hb标准品(配制浓度为150g/L)20微升6份，其中3份加到5ml血红蛋白转化液中，另3份加到5ml本方法所新配制检测试剂D中，分别进行混匀，静止5分钟。用分光光度计分别在540nm和530nm波长下，按标准测量方式，测定二者的吸光度。结果见下表：
从上述结果看，重复性、灵敏度良好，CV(精密度)值均符合要求。
实施例2用于便潜血检测的应用例
标本：痔疮病患大便标本20例，正常人标本50例。
检测步骤：
1.标本采样及处理：采样棒和竹片(方法见附图1)，采用刮取粪便平面图的方法进行。
本发明方法：取粪便标本50mg(5倍火柴头大小)放入处理试管中，加入生理盐水2.5ml，活性炭250mg混匀，先通过40目或60目的铜筛过滤。滤过液再通过260目锦纶筛兜过滤(约54微米)，再用G1玻璃漏斗(20～30um滤除粗沉淀及胶状)过滤，然后放入离心机，在3000转/分下离心10分钟，取出吸上清液0.6ml加到一洁净试管中，再加入0.015ml检测试剂D，混匀后加到比色杯中，用分光光度计530nm下进行检测，读取OD值，并根据比尔—朗伯定律计算结果。
胶体金法：用胶体金纸条对粪便标本按说明书进行检测，读取检测结果。
2.检测结果如下表：
说明：上述50例正常人特异性两种方法都是100％；对于敏感度的差异主要原因可能是取标本位置和方式所致。
由上述方法可以看到，本方法灵敏度和特异度均好，可以减少漏诊率，提高阳性率，有一定的临床价值和意义。
Claims (10)
1.一种血红蛋白检测试剂，其特征在于，包括：试剂A、试剂B和试剂C，所述试剂A为CTAB-高氯酸溶液，所述试剂B为咪唑缓冲液，所述试剂C为0.9％NaCI溶液，所述试剂A、试剂B和试剂C的体积比20:4:11。
2.根据权利要求1所述的血红蛋白检测试剂，其特征在于，所述CTAB-高氯酸溶液的配制方法为：将1-7g CTAB溶解于100ml乙醇中，再加入0.1-1g高氯酸、8-12.1g TRIS，溶解于800ml水中，之后用水定容到1L。
3.根据权利要求1所述的血红蛋白检测试剂，其特征在于，所述咪唑缓冲液为pH 6.5-7.5咪唑缓冲液。
4.根据权利要求2所述的血红蛋白检测试剂，其特征在于，所述乙醇为浓度30-50％的乙醇。
5.根据权利要求2所述的血红蛋白检测试剂，其特征在于，所述高氯酸为浓度25-35％的高氯酸。
6.根据权利要求3所述的血红蛋白检测试剂，其特征在于，所述pH 6.5-7.5咪唑缓冲液的配制方法为：先配制500-700mmol/L的NaCI溶液，再用NaCI溶液配制成0.25-0.5mol/L的咪唑溶液，之后用酸调pH至6.5-7.5。
7.权利要求1-6中任意一项所述试剂用于检测便标本、细胞、组织的裂解液或匀浆液中血红蛋白含量。
8.一种便潜血检测方法，其特征在于，具体为：
向便潜血标本中加入生理盐水、活性炭混匀，先通过40-60目的铜筛过滤，滤过液再通过260目锦纶筛兜过滤，再用玻璃漏斗过滤，在3000转/分下离心10分钟，所得上清液中加入权利要求1所述的血红蛋白检测试剂，用分光光度计在530nm下进行检测，读取吸光度；
其中，所述粪便标本、生理盐水与活性炭的比例关系为50-250mg：2.5ml：250mg；
所述上清液与血红蛋白检测试剂的体积比30-60:1。
9.根据权利要求9所述的便潜血检测方法，其特征在于，所述便潜血标本的采集方法为9点取便法。
10.一种便潜血标本采集方法，其特征在于，所述采集方法为9点取便法。
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