CN111041052B - mir-206在抑制猪脂肪细胞内的甘油三酯生成以及瘦肉猪育种中的应用 - Google Patents

mir-206在抑制猪脂肪细胞内的甘油三酯生成以及瘦肉猪育种中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了mir‑206在抑制猪脂肪细胞内的甘油三酯生成以及瘦肉猪育种中的应用。本发明保护mir‑206在抑制猪脂肪细胞生成甘油三酯中的应用，在降低猪脂肪细胞的甘油三酯含量中的应用，在抑制猪前体脂肪细胞向猪脂肪细胞分化中的应用，在猪的育种中的应用。所述育种的目标为获得瘦肉型猪。本发明为了解我国家猪品种脂肪代谢网络提供了理论依据，有助于实现“分别调控肌内与皮下脂肪沉积”的育种策略，在不减少肌内脂肪含量的前提下，降低皮下脂肪积累。本发明对于改良我国脂肪型地方猪种意义重大。

Description

mir-206在抑制猪脂肪细胞内的甘油三酯生成以及瘦肉猪育 种中的应用
技术领域
本发明涉及mir-206在抑制猪脂肪细胞内的甘油三酯生成以及瘦肉猪育种中的应用。
背景技术
中国是世界上最大的猪肉生产和消费国。近二十年来，我国猪肉生产能力不断提高，但随着生活水平的提高，人们对高品质猪肉的需求日益增长，所以提升猪肉品质是我国养猪业面临的重要课题。不同部位脂肪的分布与沉积是影响肉品质的重要因素，其中，肌内脂肪(IM)是指嵌入猪骨骼肌组织内的脂肪细胞，其决定了肉的风味、嫩度和多汁性，被认为是衡量猪肉品质的重要指标。相比之下，皮下脂肪(SC)主要积聚在猪的背部和腹部，影响猪胴体性状，与瘦肉率呈负相关，皮下脂肪越多，瘦肉率越低，经济效益越差。然而肌内脂肪的含量与皮下脂肪的含量具有高度的协同性，即高肌内脂肪含量的猪肉一般皮下脂肪含量也高，并且其机制尚不清楚。因此，解析猪肌内与皮下脂肪细胞的代谢差异是培育优质瘦肉猪的一个重要前提。
MicroRNAs(miRNAs)是一种小的非编码RNA，在RNA干扰(RNAi)中起着核心作用，RNA干扰是一种存在于许多真核生物中的转录后基因沉默机制。约18-23个核苷酸的成熟miRNA通过与mRNA的3′非翻译区(UTR)部分或完全结合，使mRNA失稳或翻译受到抑制，从而降低编码的蛋白质的丰度。识别脂肪生成的关键miRNA调控因子对于理解脂肪细胞的代谢调控网络具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供mir-206在抑制猪脂肪细胞内的甘油三酯生成以及瘦肉猪育种中的应用。
本发明保护mir-206或mir-206-mimics在抑制猪脂肪细胞生成甘油三酯中的应用。
本发明还保护mir-206或mir-206-mimics在降低猪脂肪细胞的甘油三酯含量中的应用。
本发明还保护mir-206或mir-206-mimics在抑制猪前体脂肪细胞向猪脂肪细胞分化中的应用。
本发明还保护mir-206或mir-206-mimics在抑制猪前体脂肪细胞增殖中的应用。
本发明还保护mir-206或mir-206-mimics在猪的育种中的应用。所述育种的目标为获得瘦肉型猪。所述育种的目标为获得特定比值高的猪。所述特定比值为肌内脂肪含量/皮下脂肪含量。
本发明还保护一种抑制猪脂肪细胞生成甘油三酯的方法，包括如下步骤：在猪前体脂肪细胞中过表达mir-206。
本发明还保护一种降低猪脂肪细胞的甘油三酯含量的方法，包括如下步骤：在猪前体脂肪细胞中过表达mir-206。
本发明还保护一种抑制猪前体脂肪细胞向猪脂肪细胞分化的方法，包括如下步骤：在猪前体脂肪细胞中过表达mir-206。
本发明还保护一种抑制猪前体脂肪细胞增殖的方法，包括如下步骤：在猪前体脂肪细胞中过表达mir-206。
本发明还保护一种猪的育种方法，包括如下步骤：在猪中过表达mir-206。所述育种的目标为获得瘦肉型猪。所述育种的目标为获得特定比值高的猪。所述特定比值为肌内脂肪含量/皮下脂肪含量。在猪中过表达mir-206的实现方法具体可为：以猪或猪细胞为对象，转染mir-206-mimics。
以上任一所述在猪前体脂肪细胞中过表达mir-206具体是通过如下方法实现的：在猪前体脂肪细胞中转染mir-206-mimics。
以上任一所述mir-206为miRNA，如序列表的序列1所示；
以上任一所述mir-206-mimics为双链RNA，一条链如序列表的序列5所示，另一条链如序列表的序列6所示。
以上任一所述脂肪细胞为肌内脂肪细胞或皮下脂肪细胞。
以上任一所述猪为嘉兴黑猪。
本发明采用RNA-Seq深度测序技术对嘉兴黑猪原代培养的肌内和皮下脂肪细胞miRNA转录组进行了分析，比较了两种脂肪细胞的miRNA表达谱，鉴定了差异表达的miRNAs及其靶点。本发明的发明人发现mir-206能够抑制猪脂肪细胞内的甘油三酯的生成，并且明确了其抑制甘油三酯生成的作用机理，mir-206可用于瘦肉猪育种。本发明为了解我国家猪品种脂肪代谢网络提供了理论依据，有助于实现“分别调控肌内与皮下脂肪沉积”的育种策略，在不减少肌内脂肪含量的前提下，降低皮下脂肪积累。本发明对于改良我国脂肪型地方猪种意义重大。
附图说明
图1为嘉兴黑猪脂肪细胞中miRNA的表达特征。
图2为155个显著性差异表达的miRNA。
图3为皮下脂肪细胞和肌内脂肪细胞的miRNA丰度比较。
图4为miRNA的靶基因预测和基因功能注释。
图5为实施例2中miRNA qRT-PCR验证结果。
图6为实施例3的结果。
图7为实施例4的试验一的结果。
图8为实施例4的试验二的步骤7的结果。
图9为实施例4的试验二的步骤8和步骤9的结果。
图10为实施例5的试验一的结果。
图11为实施例5的试验二的结果。
图12为实施例5的试验三的结果。
图13为实施例5的试验四的步骤2的结果。
图14为实施例5的试验四的步骤3的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，每次重复试验设置五个重复样本，结果取平均值。
诱导成脂分化的方法(整个培养时间为10天)：将细胞置于含0.5mM IBMX、1μM DEX和5μg/ml insulin的DMEM/F12完全培养基中培养2天，然后转移至含5μg/ml insulin的DMEM/F12完全培养基中培养8天。
肌内前体脂肪细胞进行诱导成脂分化后得到的细胞为肌内脂肪细胞，肌内脂肪细胞用IM表示。皮下前体脂肪细胞进行诱导成脂分化后得到的细胞为皮下脂肪细胞，皮下脂肪细胞用SC表示。
mir-206(序列表的序列1)：5’-UGGAAUGUAAGGAAGUGUG-3’。
mir-206-mimics为双链结构，两条链分别如下：
一条链(序列表的序列5)：5’-UGGAAUGUAAGGAAGUGUG-3’；
另一条链(序列表的序列6)：3’-ACCUUACAUUCCUUCACAC-5’。
NC-mimics为双链结构，两条链分别如下：
一条链：5’-UUUGUACUACACAAAAGUACUG-3’；
另一条链：3’-AAACAUGAUGUGUUUUCAUGAC-5’。
实施例1、猪前体脂肪细胞的制备
洗涤液(pH7.2-7.4)：NaCl 2g、KCl 0.05g、Na2HPO4·12H2O 0.725g、KH2PO4 0.05g，定容至250mL，高压灭菌后加入青霉素和链霉素，使青霉素浓度为100IU/mL、链霉素浓度为100μg/mL，4℃备用。
消化液：0.1g I型胶原酶(Gibco)、2g牛血清白蛋白，溶解于100mL超纯水，用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，10mL/支进行分装，-20℃保存备用。
无菌状态下采集3日龄嘉兴黑猪仔猪的背最长肌，用洗涤液洗涤，然后剪成约1mm3的组织块；取组织块，浸没于消化液中，37℃振荡消化90-120min，然后用200目钢筛过滤并收集滤液；取滤液，常温、1500rpm离心10min，收集细胞沉淀，用DMEM完全培养基重悬，得到细胞悬液；将细胞悬液接种于35mm培养皿中(接种密度为：5×104个细胞/cm2)，加入适量的DMEM完全培养基，置37℃、5％CO2培养箱培养1h；采用差速贴壁法，收集贴壁的细胞，即为肌内前体脂肪细胞。
无菌状态下采集3日龄嘉兴黑猪仔猪的皮下脂肪组织，用洗涤液洗涤，然后剪成约1mm3的组织块；取组织块，浸没于消化液中，37℃振荡消化45-60min，然后用200目钢筛过滤并收集滤液；取滤液，常温、1500rpm离心10min，收集细胞沉淀，即为皮下前体脂肪细胞。
实施例2、发现mir-206可能是嘉兴黑猪肌内脂肪沉积的重要因素
一、嘉兴黑猪脂肪细胞中miRNA的表达特征
取实施例1制备的肌内前体脂肪细胞和皮下前体脂肪细胞，分别进行诱导成脂分化，然后收集细胞，用PBS缓冲液充分洗涤，然后利用BGISEQ-500测序技术进行RNA-seq深度测序。最终测得161,724,934个高质量的干净reads与Sus scrofa miRNAs完全匹配，其中肌内脂肪细胞和皮下脂肪细胞中分别占95.53±0.14％和94.8±0.07％。这些干净reads的长度主要在18-30nt，峰值为22-23nt(图1)。与已知的小RNA数据库(包括miRBase和Rfam)比对发现，在所有测序样本中，miRNA是最大的一类小RNA，超过了83％。miRNA是最重要的小RNA，在肌内脂肪细胞中已知的miRNA是307±2.65个、新的miRNA是160.7±7.31个，在皮下脂肪细胞中已知的miRNA是306±1.16个、新的miRNA是161.3±5.78个。
二、肌内脂肪细胞和皮下脂肪细胞中差异表达的miRNA
为了解miRNA在猪脂肪细胞中扮演的角色，检测miRNA在不同脂肪细胞中的表达谱，利用TPM来标准化小RNA的的表达水平，并用DEGseq软件来分析测得的miRNA。在两种脂肪细胞中，RNA Hybrid和miRanda software均测得的显著性差异表达的miRNA共155个，包括98个新的miRNA。其中，肌内脂肪细胞特有的是29个，皮下脂肪细胞特有的是24个，二者共有的是102个(见图2)。前50个已知和新的miRNA列在图3中。与皮下脂肪细胞相比，在肌内脂肪细胞中有20个已知的(图3A)和25个新的(图3C)差异表达miRNAs显著上调，而有30个已知的(图3B)和25个未知的(图3D)差异表达miRNAs显著下调。ssc-miR-206(log2Ratio(SKSF)/SKIM)＝-5.2)、ssc-miR-196b-3p(log2Ratio(SKSF/SKIM)＝-5.0)、novel_mir191(log2Ratio(SKSF/SKIM)＝10.3)、novel_mir148(log 2Ratio(SKSF/SKIM)＝-7.3)的表达倍数最高。
三、miRNA的靶基因预测和基因功能注释
为了确定这些差异表达的miRNAs所属的功能簇，在超几何分布检验的基础上，对其预测的靶基因进行GO分析，共预测到19715个靶基因，且这些靶基因涉及到15种细胞组分的形成，45种分子功能，参与了65种生物学过程。这些功能主要包括含磷化合物的代谢过程、多细胞组织过程调控和细胞发育(图4A)。为了进一步了解这些靶基因的生物学功能，利用KEGG公共数据库进行了信号通路富集分析，共鉴定出326条通路。其中30个最丰富的通路可能与脂代谢有关(图4B)，包括ECM受体相互作用、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、RAS信号通路、脂肪酸生物合成、PPAR信号通路和mTOR信号通路。
四、miRNA qRT-PCR验证
1、取实施例1制备的肌内前体脂肪细胞和皮下前体脂肪细胞，分别进行诱导成脂分化。
2、完成步骤1后，收集细胞，用PBS缓冲液充分洗涤，然后提取总RNA，通过qRT-PCR检测目标miRNA(mir-206、mir-503、mir-196b-3p、mir-185)基因的表达水平。采用U6基因作为内参基因。结果见图5A。
3、完成步骤1后，收集细胞，然后提取总RNA，通过RNA-seq检测目标miRNA(mir-206、mir-503、mir-196b-3p、mir-185)的表达水平。结果见图5B。
结果显示，这些miRNAs的表达模式在qRT-PCR与RNA-seq检测中一致，表明从RNA-seq中鉴定的显著差异表达的miRNAs是可靠的。更重要的是，发现四者中mir-206在肌内脂肪细胞和皮下脂肪细胞间的差异倍数最高，这意味着mir-206可能是嘉兴黑猪肌内脂肪沉积的重要因素。
实施例3、mir-206在猪肌内脂肪中表达丰富并且在脂肪细胞分化过程中表达下调
一、mir-206在猪肌内脂肪中表达丰富
分别取3日龄嘉兴黑猪猪仔的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、大脑、下丘脑、皮下脂肪细胞和肌内脂肪细胞，提取总RNA并通过qRT-PCR检测mir-206的丰度(采用U6基因作为内参基因)。
结果见图6A。图6A中，1至9依次代表心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、大脑、下丘脑、皮下脂肪细胞和肌内脂肪细胞。结果表明，大多数组织中都能检测到mir-206，并且其在肌内脂肪细胞中丰度远远高于皮下脂肪细胞和其他组织。
二、mir-206在脂肪细胞分化过程中表达下调
取实施例1制备的肌内前体脂肪细胞和皮下前体脂肪细胞，分别进行诱导成脂分化。
分别于诱导成脂分化过程中的各个时刻(培养0时刻、培养2天后、培养4天后、培养6天后、培养8天后和培养10天后)，取样细胞，用PBS缓冲液充分洗涤，然后提取总RNA并通过qRT-PCR检测mir-206的丰度(采用U6基因作为内参基因)。
结果见图6B。结果表明，在肌内脂肪细胞和皮下脂肪细胞成脂分化过程中，mir-206的丰度持续下降。
以上结果表明，mir-206可能是猪脂肪生成的关键调控因子。
实施例4、过表达mir-206抑制猪脂肪细胞增殖和分化
供试mimics分别为：mir-206-mimics、NC-mimics。
一、试验一
供试细胞分别为：实施例1制备的肌内前体脂肪细胞和皮下前体脂肪细胞。
1、将供试细胞接种至12孔细胞培养板(约3×105个细胞/孔)，采用DMEM/F12完全培养基培养1天。
2、完成步骤1后，观察细胞状态，更换新鲜的DMEM/F12完全培养基(1ml/孔)。
3、取60μl 1×riboFECTTMCP Buffer和5μl 20μM供试mimics溶液，轻轻混匀，然后加入6μl riboFECTTMCP Reagent，轻轻吹打混匀，室温孵育15min，得到转染复合物。
4、完成步骤2后，每孔加入71μl步骤3制备的转染复合物，培养48h。
5、完成步骤4后，取样细胞,检测mir-206的丰度以及相关基因的表达水平
取步骤5得到的细胞，用PBS缓冲液充分洗涤细胞，然后提取总RNA并通过qRT-PCR检测mir-206的丰度(采用U6基因作为内参基因)。
取步骤5得到的细胞，用PBS缓冲液充分洗涤细胞，然后提取总RNA并通过qRT-PCR检测细胞周期素b基因(cyclinB基因)的表达水平、细胞周期素e基因(cyclinE基因)的表达水平、CDKN2B基因的表达水平。采用GAPDH基因作为内参基因。
用于检测CyclinB基因的引物对如下：
上游引物：5’-AATCCCTTCTTGTGGTTA-3’；
下游引物：5’-CTTAGATGTGGCATACTTG-3’。
用于检测CyclinE基因的引物对如下：
上游引物：5’-TGACGGTCATCTCCTGGCTA-3’；
下游引物：5’-GCTTCACTGGGCTGGTACTT-3’。
用于检测CDKN2B基因的引物对如下：
上游引物：5’-AGTGGCGGCGGTGGAGAT-3’；
下游引物：5’-GGGTGAGGGTGGCAGGGT-3’。
用于检测GAPDH基因的引物对如下：
上游引物：5’-AGGTCGGAGTGAACGGATTTG-3’；
下游引物：5’-ACCATGTAGTGGAGGTCAATGAAG-3’。
结果显示，转染48h后mir-206的表达水平显著升高(图7A)，细胞周期素b(图7C)和细胞周期素e(图7B)的mRNA水平显著降低，但CDKN2B的mRNA水平显著升高(图7D)。
6、完成步骤4后，取样细胞，分别进行Edu染色和CCK-8检测。
Edu染色结果表明，过表达mir-206减少了Edu标记细胞的数量(图7E和7F)。CCK-8检测结果表明，过表达mir-206减少了增殖期细胞数量(图7G)。以上这些数据均表明，过表达mir-206抑制了肌内前体脂肪细胞和皮下前体脂肪细胞的增殖，并且对皮下前体脂肪细胞增殖的抑制效果优于对肌内前体脂肪细胞增殖的抑制效果。
二、试验二
1、将实施例1制备的肌内前体脂肪细胞(或皮下前体脂肪细胞)接种至12孔细胞培养板(约3×105个细胞/孔)，采用DMEM/F12完全培养基培养1天。
2、完成步骤1后，观察细胞状态，更换新鲜的DMEM/F12完全培养基(1ml/孔)。
3、取60μl 1×riboFECTTMCP Buffer和5μl 20μM供试mimics溶液，轻轻混匀，然后加入6μl riboFECTTMCP Reagent，轻轻吹打混匀，室温孵育15min，得到转染复合物。
4、完成步骤2后，每孔加入71μl步骤3制备的转染复合物，培养48h。
5、完成步骤4后，观察细胞状态，待细胞完全长满时，取细胞，进行诱导成脂分化。
6、完成步骤5后，收集细胞，用PBS缓冲液充分洗涤，然后提取总RNA并通过qRT-PCR检测mir-206的丰度(采用U6基因作为内参基因)。
mir-206mimics组的脂肪细胞的mir-206丰度显著高于NC-mimics组(图8A)。
7、完成步骤5后，收集细胞，用PBS缓冲液充分洗涤，然后进行油红染色(图8B)，然后用异丙醇溶解油红O并测量OD值(图8C)。完成步骤5后，收集细胞，用PBS缓冲液充分洗涤，然后检测甘油三酯含量(图8D)。检测甘油三酯含量采用甘油三酯(TG)测试盒(南京建成生物工程研究所，货号A110-2)，结果数据的单位为mmol/g，即参比每g总蛋白的甘油三酯数量。
mir206 mimics组皮下脂肪细胞中的甘油三脂平均含量为0.63mmol/g，NC-mimics组皮下脂肪细胞中的甘油三脂平均含量为2.14mmol/g，与NC-mimics组相比mir206mimics组下降了约70％。mir206 mimics组肌内脂肪细胞中的甘油三脂平均含量为0.49mmol/g，NC-mimics组肌内脂肪细胞中的甘油三脂平均含量为1.01mmol/g，与NC-mimics组相比mir206 mimics组下降了约50％。结果显示，在两种脂肪细胞中mir-206mimics组的甘油三酯的含量均显著低于NC组，并且mir-206mimics对皮下脂肪细胞甘油三酯含量的降低效果优于对肌内脂肪细胞甘油三酯含量的降低效果。
8、完成步骤5后，收集细胞，用PBS缓冲液充分洗涤，然后提取总RNA并通过qRT-PCR检测脂肪酸标记基因以及脂解标记基因的表达水平。脂肪酸标记基因为：脂肪酸合成酶基因(FAS基因)、脂肪酸结合蛋白4基因(aP2基因)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因(PPARγ基因)、CCAAT/增强子结合蛋白-α基因(C/EBPα基因)、CCAAT/增强子结合蛋白-β基因(C/EBPβ基因)。脂解标记基因为：激素敏感脂肪酶基因(HSL基因)、脂肪甘油三酯脂肪酶基因(ATGL基因)、脂蛋白脂肪酶(LPL基因)。采用GAPDH基因作为内参基因。
用于检测FAS基因的引物对如下：
上游引物：5’-AGCCTAACTCCTCGCTCAAT-3’；
下游引物：5’-TCCTTGGAACCGTCTGTGTTC-3’。
用于检测aP2基因的引物对如下：
上游引物：5’-GAGCACCATAACCTTGAGTGGA-3’；
下游引物：5’-AAATTCTGGTAGCCGTGACA-3’。
用于检测PPARγ基因的引物对如下：
上游引物：5’-AGGACTACCAAAGTGCCATCAAA-3’；
下游引物：5’-GAGGCTTTATCCCCACAGACAC-3’。
用于检测C/EBPα基因的引物对如下：
上游引物：5’-CGTGGAGACTCAACAGAAGG-3’；
下游引物：5’-GCAGCGTGTCCAGTTCGCGG-3’。
用于检测C/EBPβ基因的引物对如下：
上游引物：5’-GCACAGCGACGAGTACAAGA-3’；
下游引物：5’-TATGCTGCGTCTCCAGGTTG-3’。
用于检测HSL基因的引物对如下：
上游引物：5’-CACTGACTGCTGACCCCAAG-3’；
下游引物：5’-TCCTCACTGTCCTGTCCTTCAC-3’。
用于检测ATGL基因的引物对如下：
上游引物：5’-TCACCAACACCAGCATCCA-3’；
下游引物：5’-GCACATCTCGAAGCACCA-3’。
用于检测LPL基因的引物对如下：
上游引物：5’-GGAGAGAGGAAGGGAAAACAGAG-3’；
下游引物：5’-AGACCGACCAATAAACTGCAAAG-3’。
结果见图9。与NC-mimics组相比，mir-206-mimics组的脂肪酸合成酶基因、脂肪酸结合蛋白4基因、过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因)、CCAAT/增强子结合蛋白-α基因、CCAAT/增强子结合蛋白-β基因的mRNA丰度均降低。与NC-mimics组相比，mir-206-mimics组的激素敏感脂肪酶基因、脂肪甘油三酯脂肪酶基因和脂蛋白脂肪酶基因的mRNA丰度均显著升高。
9、完成步骤5后，收集细胞，用PBS缓冲液充分洗涤，然后提取总蛋白进行WesternBlot试验。
FAS抗体：Anti-Fatty Acid Synthase antibody，abcam公司，货号ab22759。aP2抗体：Anti-FABP4 antibody，abcam公司，货号ab23693。HSL抗体：Anti-Hormone sensitivelipase antibody，abcam公司，货号ab45422。LPL抗体：Anti-Lipoprotein lipaseantibody，abcam公司，货号ab137821。β-tubulin抗体：β-tubulin Mouse MonoclonalAntibody，天津三箭生物技术股份有限公司，货号KM9003。
结果见图9。
以上结果表明，mir-206在体外能抑制肌内脂肪细胞和皮下脂肪细胞的分化。
实施例5、mir-206在猪脂肪细胞中靶向stard7和klf4
为了揭示mir-206在猪脂肪细胞增殖和分化中的潜在机制，利用生物信息学预测软件预测靶基因，确定了两个候选靶基因：最终确定stard7和klf4(见图10A)。
供试mimics分别为：mir-206-mimics、NC-mimics。
一、试验一
将含有预测靶点的stard7 3’UTR序列的DNA分子(如序列表的序列2所示)插入psichecktm-2质粒的Not I和Xho I酶切位点之间，得到荧光素酶报告质粒psicheck-stard7-3’UTR。
将含有预测靶点的klf4 3’UTR序列的DNA分子(如序列表的序列3所示)插入psichecktm-2质粒的Not I和Xho I酶切位点之间，得到荧光素酶报告质粒psicheck-klf4-3’UTR。
将荧光素酶报告质粒与供试mimics共转染293T细胞，具体步骤为：取24孔板，每孔加入500μl DMEM完全培养液，然后接种50-70％融合率的细胞，培养至细胞密度达到80％左右；然后借助Vigofect转染试剂转染荧光素酶报告质粒与供试mimics，每孔转染1.25μg荧光素酶报告质粒和2μl 100nM供试mimics溶液，然后培养48小时；然后收集细胞，用于荧光素酶报告分析。
结果见图10B和图10C。与对照组相比，mir-206-mimics组48小时内荧光素酶活性显著降低(p<0.05)，进一步验证了预测的两个靶点。
二、试验二
供试细胞分别为：实施例1制备的肌内前体脂肪细胞和皮下前体脂肪细胞。
1、将供试细胞接种至12孔细胞培养板(约3×105个细胞/孔)，采用DMEM/F12完全培养基培养1天。
2、完成步骤1后，观察细胞状态，更换新鲜的DMEM/F12完全培养基(1ml/孔)。
3、取60μl 1×riboFECTTMCP Buffer和5μl 20μM供试mimics溶液，轻轻混匀，然后加入6μl riboFECTTMCP Reagent，轻轻吹打混匀，室温孵育15min，得到转染复合物。
4、完成步骤2后，每孔加入71μl步骤3制备的转染复合物，培养48h。
5、完成步骤4后，取样细胞，用PBS缓冲液充分洗涤细胞，然后提取总RNA，通过qRT-PCR检测stard7基因和klf4基因的表达水平。采用GAPDH基因作为内参基因。
用于检测stard7基因表达的引物对如下：
上游引物：5’-ATTACAGGCACCCACCTTTACCAG-3’；
下游引物：5’-CCTCAGAACCACTAACCACATCCC-3’。
用于检测klf4基因表达的引物对如下：
上游引物：5’-GAGGAGCCAAAGCCAAAGAGG-3’；
下游引物：5’-CATCCCAGTCACAGTGGTAAGGT-3’。
6、完成步骤4后，取样细胞，用PBS缓冲液充分洗涤细胞，然后提取总蛋白进行Western blot，检测stard7蛋白和klf4蛋白丰度。
klf4抗体：KLF4 Antibody，Cell Signaling公司，货号#4038。stard7抗体：STARD7Rabbit Polyclonal antibody，proteintech公司，货号15689-1-AP。β-tubulin抗体：β-tubulin Mouse Monoclonal Antibody，天津三箭生物技术股份有限公司，货号KM9003。
结果见图11。在前体脂肪细胞增殖阶段，mir-206-mimic显著降低了stard7的表达，而klf4的表达水平没有变化。
三、试验三
供试细胞分别为：实施例1制备的肌内前体脂肪细胞和皮下前体脂肪细胞。
1、将供试细胞接种至12孔细胞培养板(约3×105个细胞/孔)，采用DMEM/F12完全培养基培养1天。
2、完成步骤1后，观察细胞状态，更换新鲜的DMEM/F12完全培养基(1ml/孔)。
3、取60μl 1×riboFECTTMCP Buffer和5μl 20μM供试mimics溶液，轻轻混匀，然后加入6μl riboFECTTMCP Reagent，轻轻吹打混匀，室温孵育15min，得到转染复合物。
4、完成步骤2后，每孔加入71μl步骤3制备的转染复合物，培养48h。
5、完成步骤4后，观察细胞状态，待细胞完全长满时，取细胞，进行诱导成脂分化。
6、完成步骤5后，收集细胞，用PBS缓冲液充分洗涤，然后提取总RNA并通过qRT-PCR检测stard7基因和klf4基因的表达水平。同步骤二的5。
7、完成步骤5后，收集细胞，用PBS缓冲液充分洗涤，然后提取总蛋白进行Westernblot检测stard7蛋白和klf4蛋白的丰度。同步骤二的6。
结果见图12。前体脂肪细胞分化为脂肪细胞时，mir-206mimics显著降低了klf4的表达，而对stard7没有显著影响。
四、试验四
为了进一步证明mir-206和klf4在脂肪细胞分化过程中的关系。
1、分别进行如下几组转染：
第一组：转染NC-mimics和pcDNA3.1质粒；
第二组：转染mir-206-mimics和pcDNA3.1质粒；
第三组：转染mir-206-mimics和pcDNA3.1_-klf4-pcDNA质粒(将序列表的序列4所示DNA分子插入pcDNA3.1质粒的BamH I和NheI酶切位点得到的重组质粒；KLF4序列如序列表的序列4所示)。
转染对象为3T3-L1细胞，转染方法参见步骤二。
转染48h后，观察细胞状态，待细胞完全长满时，取细胞，进行诱导成脂分化。
2、完成步骤1的诱导成脂分化后，收集细胞。取细胞，用PBS缓冲液充分洗涤，然后进行油红染色，然后用异丙醇溶解油红O并测量OD值。取细胞用PBS缓冲液充分洗涤，然后检测甘油三酯含量。方法见实施例4的步骤二。
结果见图13。过表达klf4使得脂肪细胞的脂质积累恢复及甘油三酯浓度升高，而mir-206可抑制脂肪细胞的脂质积累，并使甘油三脂浓度降低。
3、完成步骤1的诱导成脂分化后，收集细胞。
取细胞，用PBS缓冲液充分洗涤，然后提取总RNA并通过qRT-PCR检测脂肪酸标记基因以及脂解标记基因的表达水平。脂肪酸标记基因为：脂肪酸合成酶基因(FAS基因)、脂肪酸结合蛋白4基因(aP2基因)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因(PPARγ基因)。脂解标记基因为：脂肪甘油三酯脂肪酶基因(ATGL基因)、脂蛋白脂肪酶(LPL基因)。采用GAPDH基因作为内参基因。
用于检测mus-GAPDH的引物如下：
上游引物：5’-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTCT-3’；
下游引物：5’-ATGCATTGCTGACAATCTTGAG-3’。
用于检测mus-FAS的引物如下：
上游引物：5’-AGTTGCCCGAGTCAGAGAA-3’；
下游引物：5’-CGTCGAACTTGGAGAGATCC-3’。
用于检测mus-PPARγ的引物如下：
上游引物：5’-CCAAGAATACCAAAGTGCGATCA-3’；
下游引物：5’-CCCACAGACTCGGCACTCAAT-3’。
用于检测mus-ATGL的引物如下：
上游引物：5’-TTCGCAATCTCTACCGCCTC-3’；
下游引物：5’-AAAGGGTTGGGTTGGTTCAG-3’。
用于检测mus-LPL的引物如下：
上游引物：5’-CCAATGGAGGCACTTTCCA-3’；
下游引物：5’-TGGTCCACGTCTCCGAGTC-3’。
用于检测mus-aP2的引物如下：
上游引物：5’-AAGAAGTGGGAGTGGGCTTTG-3’；
下游引物：5’-CTCTTCACCTTCCTGTCGTCTG-3’。
取细胞，用PBS缓冲液充分洗涤，然后提取总蛋白进行Western Blot试验。ATGL抗体：Anti-Adipose Triglyceride Lipase antibody，abcam公司，货号ab99532。FAS抗体：Anti-Fatty Acid Synthase antibody，abcam公司，货号ab22759。aP2抗体：Anti-FABP4antibody，abcam公司，货号ab23693。β-tubulin抗体：β-tubulin Mouse MonoclonalAntibody，天津三箭生物技术股份有限公司，货号KM9003。
结果见图14。过表达klf4能够减弱mir-206mimics的功能，因为它挽救了FAS、aP2和ATGL的表达。这些数据进一步证明klf4是mir-206在脂肪细胞中的直接功能靶点。
SEQUENCE LISTING
<110> 嘉兴学院
<120> mir-206在抑制猪脂肪细胞内的甘油三酯生成以及瘦肉猪育种中的应用
<130> GNCYX192634
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> Sus scrofa
<400> 1
uggaauguaa ggaagugug 19
<210> 2
<211> 495
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
atcaaagcag gaggaggagg aggcatctgg ggggacattg tcatgttctc aggccaagca 60
ttttgatttg cttgtttcac tgagcaaatc tggaaccagc cgctcacctc aggccagagg 120
ggacaacctc ttttgcttcc ctgagcggtg tcctctgccc acattccatt ctcagcctca 180
gttctgcagc actttgggtt tccttcagtt ctggaggacc aactggacgg tcgagtccca 240
gcgggggtca tgggagcgct cttggtcgga gtcctgatct tgagcgggtg tgaactgttg 300
cttggcagtg caagtgcctt gtcctcacct cgctcccatc tctagggaca tagagtttgt 360
accaagaact gtctctcttt gcctcccatt cacactgcgt tgactcaccc acccaaagca 420
gtttcctttc aattggccag ttcttctgta ttcatgtgct ctattaattc aggtttatgc 480
ctccttctgt agccc 495
<210> 3
<211> 287
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
atgacccaca ctgccaagag agaattcagt attttttttt ttttaacctt tcacactgtc 60
tccctggtga ggggaggaac ccagctggaa agcactacaa tcatggtcaa gttcccaaca 120
agtcaacttg tgaatggata atcaggaaac atgaggaaac caaaagacaa attaaagaac 180
agatggggtc tgtaactgga tcttctatca ttccaattct aaatccaact tgaacatata 240
ttcctggact tatatgaaaa catcaacggg gttactggaa gttgtgg 287
<210> 4
<211> 1460
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
atgaggcagc cacctggcga gtctgacatg gctgtcagcg acgcactgct cccgtccttc 60
tccacgttcg cgtccggccc ggcgggaagg gagaagacac tgcgtccagc aggtgccccg 120
aataaccgct ggcgggagga gctctcccac atgaagcaaa gacttccccc ggtgcttccc 180
ggccgcccct acgacctggc ggcggcgacc gtggccaccg acctggagag tggcggagtc 240
ggcgcggctt gcggcagtag caacccggct cttctacccc ggagggagac ggaggagttc 300
aatgatctcc tggacctgga ctttatcctc tccaactcac tgtctcatca ggagtcagtg 360
gccgccaccg tgtcctcgtc ggcttcagcc tcatcctctt cctccccatc gagcagcggt 420
cccgccagtg cgccctccac ctgcagcttc agctatccga tccgggctgg gggcgacccg 480
ggcgtggcac cgggcagcac tggaggcagc ctcctctatg gccgggagtc tgcacctccc 540
ccgacagctc ccttcaacct ggcagacatc aacgatgtga gcccctcggg cggcttcgtg 600
gccgaactcc tgcggcctga attggaccca gtgtacattc cgccgcagca gtcgcagccg 660
ccaggtggcg ggctgatggg caagtttgtg ttgaaggcat cgctgagtgc ccccggcagc 720
gagtacggca gcccatcggt catcagtgtt agcaaaggca gcccagatgg gagccacccg 780
gtggtggtgg cgccctacag cggtggcccg ccgcgcatgt gccccaagat caagcaggag 840
gctgtctcct cgtgcaccgt cggccggccc ttagaggccc acttgggcac tggaccccct 900
ctcagcaatg gccaccggcc gcctgcccac gactttcccc tggggcggca gctccccagc 960
aggactaccc caaccctggg tgcggaggaa ctgctaagca gcagggactg tcatcctgcc 1020
ctgccgctcc ccccgggctt ccatccccac catgggccaa actacccacc cttcctgccg 1080
gatcagctgc agccgcaggt cccaccgctc cattaccaag agctcatgcc acctggttcc 1140
tgcatgccag aggagccaaa gccaaagagg gggagaaggt cgtggccccg gaaaaggacg 1200
gccactcaca cttgtgatta cgcgggctgc ggcaaaacct acacgaagag ttctcatctc 1260
aaggcacacc tgcgaaccca cacaggtgag aaaccttacc actgtgactg ggatggctgt 1320
gggtggaaat ttgcccgctc agatgaactg accaggcact accgcaaaca tactgggcac 1380
cgccccttcc agtgccagaa gtgcgaccgg gcattttcaa ggtcggacca ccttgcctta 1440
cacatgaaga ggcattttta 1460
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
uggaauguaa ggaagugug 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
cacacuuccu uacauucca 19

Claims (10)

1.mir-206或mir-206-mimics在抑制猪脂肪细胞生成甘油三酯中的应用；
所述mir-206为miRNA，如序列表的序列1所示；
mir-206-mimics为双链RNA，一条链如序列表的序列5所示，另一条链如序列表的序列6所示。
2.mir-206或mir-206-mimics在降低猪脂肪细胞的甘油三酯含量中的应用；
所述mir-206为miRNA，如序列表的序列1所示；
mir-206-mimics为双链RNA，一条链如序列表的序列5所示，另一条链如序列表的序列6所示。
3.mir-206或mir-206-mimics在抑制猪前体脂肪细胞向猪脂肪细胞分化中的应用；
所述mir-206为miRNA，如序列表的序列1所示；
mir-206-mimics为双链RNA，一条链如序列表的序列5所示，另一条链如序列表的序列6所示。
4.mir-206或mir-206-mimics在抑制猪前体脂肪细胞增殖中的应用；
所述mir-206为miRNA，如序列表的序列1所示；
mir-206-mimics为双链RNA，一条链如序列表的序列5所示，另一条链如序列表的序列6所示。
5.mir-206或mir-206-mimics在猪的育种中的应用；
所述mir-206为miRNA，如序列表的序列1所示；
mir-206-mimics为双链RNA，一条链如序列表的序列5所示，另一条链如序列表的序列6所示；
所述育种的目标为获得特定比值高的猪；所述特定比值为肌内脂肪含量/皮下脂肪含量。
6.一种抑制猪脂肪细胞生成甘油三酯的方法，包括如下步骤：在猪前体脂肪细胞中过表达mir-206；所述mir-206为miRNA，如序列表的序列1所示。
7.一种降低猪脂肪细胞的甘油三酯含量的方法，包括如下步骤：在猪前体脂肪细胞中过表达mir-206；所述mir-206为miRNA，如序列表的序列1所示。
8.一种抑制猪前体脂肪细胞向猪脂肪细胞分化的方法，包括如下步骤：在猪前体脂肪细胞中过表达mir-206；所述mir-206为miRNA，如序列表的序列1所示。
9.一种抑制猪前体脂肪细胞增殖的方法，包括如下步骤：在猪前体脂肪细胞中过表达mir-206；所述mir-206为miRNA，如序列表的序列1所示。
10.一种猪的育种方法，包括如下步骤：在猪中过表达mir-206；所述mir-206为miRNA，如序列表的序列1所示；
所述育种的目标为获得特定比值高的猪；所述特定比值为肌内脂肪含量/皮下脂肪含量。
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