CN114748497A - 一种调控子宫肌收缩的miRNA分子miR-206及其应用 - Google Patents

一种调控子宫肌收缩的miRNA分子miR-206及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了一种调控子宫肌收缩的miRNA分子miR‑206及其应用，具体公开了miR‑206、miR‑206的前体和/或miR‑206模拟物在制备预防和/或治疗早产药物中的应用。本发明首次公开了miR‑206作为早产的治疗靶点，此前未见报道miR‑206与早产相关，通过过表达miR‑206可以对子宫平滑肌细胞的收缩能力产生显著抑制，从而发挥预防和治疗早产的作用，降低早产的发病率以及早产儿的数量。

Description

一种调控子宫肌收缩的miRNA分子miR-206及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种调控子宫肌收缩的miRNA分子miR-206及其应用。
背景技术
早产是指妊娠28周不足37周分娩，是围产儿不良结局的主要原因。每年全球超过100万的新生儿因早产及相关并发症死亡。中国的早产率约为5％～15％，每年早产儿超过117万，早产相关的新生儿死亡及严重损伤是严峻的医疗及社会问题。自发性早产的核心环节包括各种因素引起的过早宫颈成熟、蜕膜激活及子宫的收缩等。目前临床治疗早产的药物主要为化学类宫缩抑制剂，如盐酸利托君、硝苯地平和阿托西班等，有各自的使用禁忌症且多数仅用于48小时延长孕周以完成促胎肺成熟，以上药物并不能达到早产防治效果。目前迫切需要寻找新的高特异性的生物分子靶点，以对早产的防治提供新的策略。
微小RNA(microRNA，miRNA)是一种内源性短链非编码RNA，大小为20～23bp，通过5'端与靶基因mRNA的3'端中非翻译区(3'-UTR)特异性结合而发挥转录后调节效应。miRNA能特异性地调控靶基因的表达，在疾病的预防和治疗中占据着重要席位，基于miRNA的基因治疗方法可以作为一种有效的早产治疗手段。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供miR-206在制备预防和/或治疗早产药物中的应用。
本发明第二方面的目的，在于提供表达miR-206或miR-206的前体的核酸分子在制备预防和/或治疗早产药物中的应用。
本发明第三方面的目的，在于提供含有miR-206核酸分子的表达盒、载体或细胞系在制备预防和/或治疗早产药物中的应用。
本发明第四方面的目的，在于提供靶向上调miR-206的试剂或组合物在制备预防和/或治疗早产药物中的应用。
本发明第五方面的目的，在于提供miR-206在制备GJA1抑制剂中的应用。
本发明第六方面的目的，在于提供一种用于治疗早产或抑制子宫肌收缩的药物。
本发明第七方面的目的，在于提供检测miR-206表达量的试剂在制备诊断早产的产品中的应用。
本发明第八方面的目的，在于提供miR-206作为靶标在筛选早产诊断药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供miR-206在制备预防和/或治疗早产药物中的应用。
miR-206的前体在制备预防和/或治疗早产药物中的应用。
miR-206模拟物在制备预防和/或治疗早产药物中的应用。
优选地，所述miR-206的核苷酸序列为5’-UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG-3’(SEQ IDNo.1)。
优选地，所述miR-206抑制子宫平滑肌的收缩功能。
本发明通过对过表达miR-206的人子宫肌细胞进行转录组测序分析和实验验证，发现miR-206在临产的子宫肌组织中低表达，在体外实验过表达miR-206能够明显抑制子宫平滑肌收缩关键蛋白GJA1的表达，从而降低子宫平滑肌细胞的收缩功能，在早产动物模型上过表达miR-206能有效降低早产的发生。
优选地，所述的miRNA-模拟物(miRNA mimics/agomir)是模拟生物体内源的miRNA，运用化学合成的方法合成，能增强内源性miRNA的功能。具体地，所述的miR-206模拟物为针对miR-206的成熟体设计并合成的小片段双链miRNA，作用与体内成熟的miR-206是一样，可以上调细胞内相应miR-206的含量，增强内源性miR-206的功能。
优选地，本发明的miR-206包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体，其显示完整miR-206核酸分子相同的功能，它们可能通过核苷酸残基的缺失、置换或者插入而突变。
本领域人员熟知，为了保证miRNA的稳定性，可以在miRNA的一端或者两端增加保护性碱基，如TT；也可对miRNA碱基进行修饰，但是不影响miRNA的功能。因此，本领域技术人员熟知，在不影响miR-206功能的条件下，对miR-206进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之，即所述miR-206可以是SEQ ID No.1所示序列中任意一个或多个核糖核苷酸被修饰。
优选地，所述miR-206为成熟的miRNA、前体miRNA或初级转录物。
优选地，所述miR-206的核酸分子可以以单链或双链的形式存在，成熟的miR-206主要呈单链形式，而miR-206的前体是部分自互补的，以形成双链结构。miR-206的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。
优选地，所述药物通过抑制GJA1的表达而达到预防和/或治疗早产的目的。
优选地，所述药物通过提高子宫平滑肌细胞中miR-206或其模拟物的含量/表达量从而抑制细胞GJA1的表达。
优选地，所述提高子宫平滑肌细胞中miR-206的含量的方法为：用细胞转染试剂包裹miR-206或其模拟物的核苷酸片段，转染子宫平滑肌细胞。
优选地，所述药物还包含药物学上可以接受的载体，所述载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。
优选地，所述药物可根据需要制备成各种剂型，包括但不限于溶液剂、片剂、颗粒剂、贴剂、胶囊剂、脂质体包裹RNA、细菌携带质粒表达RNA法或病毒包装表达RNA法、纳米材料组装、膏剂、栓剂。
优选地，所述药物的施用途径不受限制，包括但不限于腹腔注射、口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、鼻腔喷雾、直肠或阴道灌注、口腔喷雾、子宫注射、皮肤局部或全身经皮用药。
本发明的第二个方面，提供表达miR-206或miR-206的前体的核酸分子在制备预防和/或治疗早产药物中的应用。
优选地，所述药物通过抑制GJA1的表达而达到预防和/或治疗早产的目的。
优选地，所述药物通过提高子宫平滑肌细胞中miR-206或其模拟物的含量/表达量从而抑制细胞GJA1的表达。
优选地，所述提高子宫平滑肌细胞中miR-206的含量的方法为：用细胞转染试剂包裹miR-206或其模拟物的核苷酸片段，转染子宫平滑肌细胞。
优选地，所述药物还包含药物学上可以接受的载体，所述载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。
优选地，所述药物可根据需要制备成各种剂型，包括但不限于溶液剂、片剂、颗粒剂、贴剂、胶囊剂、脂质体包裹RNA、细菌携带质粒表达RNA法或病毒包装表达RNA法、纳米材料组装、膏剂、栓剂。
优选地，所述药物的施用途径不受限制，包括但不限于腹腔注射、口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、鼻腔喷雾、直肠或阴道灌注、口腔喷雾、子宫注射、皮肤局部或全身经皮用药。
本发明的第三个方面，提供含有miR-206核酸分子的表达盒、载体或细胞系在制备预防和/或治疗早产药物中的应用。
优选地，所述载体包括质粒载体、病毒载体或真核表达载体。
优选地，所述质粒载体可以是任选的质粒，所述真核表达载体不包括繁殖材料。
优选地，病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。
优选地，所述真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEF Bos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pBin438、pCAMBIA1301等。
优选地，所述药物通过抑制GJA1的表达而达到预防和/或治疗早产的目的。
优选地，所述药物还包含药物学上可以接受的载体，所述载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。
优选地，所述药物可根据需要制备成各种剂型，包括但不限于溶液剂、片剂、颗粒剂、贴剂、胶囊剂、脂质体包裹RNA、细菌携带质粒表达RNA法或病毒包装表达RNA法、纳米材料组装、膏剂、栓剂。
优选地，所述药物的施用途径不受限制，包括但不限于腹腔注射、口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、鼻腔喷雾、直肠或阴道灌注、口腔喷雾、子宫注射、皮肤局部或全身经皮用药。
本发明的第四个方面，提供靶向上调miR-206的试剂或组合物在制备预防和/或治疗早产药物中的应用。
增强miR-206活性的试剂或组合物在制备预防和/或治疗早产药物中的应用。
优选地，所述药物通过抑制GJA1的表达而达到预防和/或治疗早产的目的。
优选地，所述药物通过提高子宫平滑肌细胞中miR-206或其模拟物的含量/表达量从而抑制细胞GJA1的表达。
优选地，所述提高子宫平滑肌细胞中miR-206的含量的方法为：用细胞转染试剂包裹miR-206或其模拟物的核苷酸片段，转染子宫平滑肌细胞。
优选地，所述上调miR-206或增强miR-206活性的试剂可以是蛋白、寡核苷酸、小分子化合物。
优选地，所述的试剂可以是miR-206的模拟物、miR-206的激动剂、前体miR-206、携带miR-206的载体。
根据miR-206序列设计出它的模拟物或激动剂，miR-206的激动剂是经过特殊标记和化学修饰的双链小RNA，将miR-206模拟物或者激动剂转移到人体内后，它们能够明显上调miR-206的表达。
优选地，所述药物还包含药物学上可以接受的载体，所述载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。
优选地，所述药物可根据需要制备成各种剂型，包括但不限于溶液剂、片剂、颗粒剂、贴剂、胶囊剂、脂质体包裹RNA、细菌携带质粒表达RNA法或病毒包装表达RNA法、纳米材料组装、膏剂、栓剂。
优选地，所述药物的施用途径不受限制，包括但不限于腹腔注射、口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、鼻腔喷雾、直肠或阴道灌注、口腔喷雾、子宫注射、皮肤局部或全身经皮用药。
本发明的第五个方面，提供miR-206在制备GJA1抑制剂中的应用。
miR-206的前体在制备GJA1抑制剂中的应用。
miR-206模拟物在制备GJA1抑制剂中的应用。
靶向上调miR-206的试剂在制备GJA1抑制剂中的应用。
靶向增强miR-206活性的试剂在制备GJA1抑制剂中的应用。
本发明的第七个方面，提供一种用于治疗早产或抑制子宫肌收缩的药物，所述药物中含有靶向上调miR-206或增强miR-206活性的试剂或组合物。
优选地，所述上调miR-206或增强miR-206活性的试剂可以是蛋白、寡核苷酸、小分子化合物。
优选地，所述的试剂可以是miR-206的模拟物、miR-206的激动剂、前体miR-206、携带miR-206的载体。
优选地，所述药物还包含药物学上可以接受的载体，所述载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。
优选地，所述药物可根据需要制备成各种剂型，包括但不限于溶液剂、片剂、颗粒剂、贴剂、胶囊剂、脂质体包裹RNA、细菌携带质粒表达RNA法或病毒包装表达RNA法、纳米材料组装、膏剂、栓剂。
优选地，所述药物的施用途径不受限制，包括但不限于腹腔注射、口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、鼻腔喷雾、直肠或阴道灌注、口腔喷雾、子宫注射、皮肤局部或全身经皮用药。
本发明的第七个方面，提供检测miR-206表达量的试剂在制备诊断早产的产品中的应用。
优选地，所述产品包括芯片或试剂盒。
优选地，所述芯片包括固相载体以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针。
进一步优选地，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应miR-206的部分或全部序列。
优选地，所述试剂盒包括用于检测miR-206表达水平的试剂。
优选地，试剂盒还包含扩增miR-206的引物组。
进一步优选地，所述miR-206的引物组如下：
上游引物：5’-GGCGGTGGAATGTAAGGAAG-3’(SEQ ID No.4)。
下游引物：5’-GGCTGTCGTGGACTGCG-3’(SEQ ID No.5)。
优选地，所述的寡核苷酸探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于诊断早产的miRNA的寡核苷酸探针。将多种miRNA的检测探针放置在同一芯片上通过检测多种miRNA指标联合诊断早产的情况也包含在本发明的保护范围之内。
优选地，所述试剂还包括针对现有技术中已经报道的诊断早产miRNA的引物和/或探针。将多种miRNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种miRNA指标联合诊断早产的情况也包含在本发明的保护范围之内。
优选地，所述固相载体包括所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
本发明的第八个方面，提供miR-206作为靶标在筛选早产诊断药物中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明首次公开了miR-206作为早产的治疗靶点，此前未见报道miR-206与早产相关，通过过表达miR-206可以对子宫平滑肌细胞的收缩能力产生显著抑制，从而发挥预防和治疗早产的作用，降低早产的发病率以及早产儿的数量。
通过检测受试者miR-206的表达水平，可以判断受试者是否存在早产的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
附图说明
图1为未临产和临产子宫肌组织中miRNA表达的火山图，标记miRNA为差异表达的miRNA。
图2为足月未临产孕妇和足月临产孕妇的ROC曲线。
图3为临产子宫平滑肌组织中miR-206表达量和GJA1表达量相关性统计图。
图4为荧光素酶报告载体GJA1序列示意图(上图)和双荧光素酶活性检测结果统计图(下图)。
图5为不同处理组的子宫平滑肌细胞中miR-206和GJA1的表达量，**代表p＜0.01。
图6为CD1小鼠不同处理组的处理方式示意图。
图7为不同处理组CD1小鼠的妊娠时长结果统计图。
图8为不同处理组CD1小鼠的胎儿照片(上图)、胎儿体重统计图(左下图)和身长(右下图)统计图。
图9为不同处理组CD1小鼠的GJA1蛋白检测图。
图10为miR-206对子宫肌收缩的影响结果图，其中，左上图为收缩波曲线下积分统计图，右上图为收缩振幅统计图，下图为子宫肌收缩波形图。
具体实施方式
现结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不限制本发明的范围。
本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。
本发明中，所述的“互补”可以是完全互补，也可以是部分互补。所述完全互补是指序列完全匹配且不形成粘性末端。所述部分互补是指序列完全匹配，但形成粘性末端。
本发明中的RNA为微小RNA(microRNA，或miRNA)，其是指单链的寡核糖核苷酸。核糖核苷酸是由核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。核糖核苷酸分子由一分子碱基、一分子核糖和磷酸构成。
本发明中，所述“修饰”，是指本发明提供的RNA分子链或其互补链中的核糖和/或碱基连接任何一种或多种基团或其组合。
实施例1miRNA-206在临产子宫肌中的表达
1.收集样本
发明人于广州市妇女儿童医疗中心收集纳入剖宫产手术的足月未临产孕妇和足月临产孕妇的人子宫肌组织，该人子宫肌组织取自于剖宫产手术的子宫肌切口边缘部分，上述样本为排除妊娠糖尿病、子痫等妊娠并发症的样本，其中，足月未临产孕妇(10例)的人子宫肌组织作为对照组，足月临产孕妇(10例)的人子宫肌组织作为观察组，对照组和观察组的孕妇的BMI值和年龄无显著差异。事前已通过各孕妇的知情同意，取得的所有样本均达到组织伦理委员会的同意。
2.组织RNA的提取和测序
将收集得到的人子宫肌组织经过清洗后，剪碎，利用Trizol试剂(Invitrogen，货号为15596018)提取人子宫肌组织的总RNA，并利用PAGE纯化得到人子宫肌的miRNA。将得到的miRNA进行高通量测序及建库，测序出的reads通过Bowtie2进行比对，使用featureCounts软件进行定量，并使用DESeq2软件进行基因差异分析，阈值为(p<0.01,|fold change|>2)。
结果如图1所示，与未临产组相比，临产组子宫肌miR-206、miR-196a-5p和miRNA-615-3p显著下调，且miR-206为表达差异最显著的miRNA，表明在足月临产孕妇的人子宫肌组织中miR-206低表达。将受试者的基因序列进行工作特征曲线(Receiver OperatingCharacteristic Curve，ROC)分析，结果显示(图2)，miR-206鉴别临产具有较高的灵敏度和特异性(AUC＝0.8333，p＝0.0055)。
miRNA-206的核苷酸序列为：5’-UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG-3’(SEQ ID No.1)。
miRNA mimics是模拟生物体内源的miRNA，运用化学合成的方法合成，能增强内源性miRNA的功能。具体地，miRNA-206mimics即miR-206的模拟物为针对miR-206的成熟体设计并合成的小片段双链miRNA，作用与体内成熟的miR-206是一样，可以上调细胞内相应miR-206的含量，增强内源性miR-206的功能。miR-206的模拟物含有SEQ ID No.1所示的序列和/或其互补序列。
miRNA-206mimics：正链5’-UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG-3’(SEQ ID No.2)，反链5’-CCACACACUUCCUUACAUUCCA-3’(SEQ ID No.3)。
实施例2miR-206的模拟物对子宫平滑肌细胞中GJA1表达的影响
1.子宫平滑肌细胞原代培养
收集来源于剖腹产手术的人子宫平滑肌组织，用Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除黏附的结缔组织等非培养所需组织；再次清洗后，用手术刀将组织切成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入PBS，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm3大小。静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次；使用胰酶(胰酶与组织块体积比为1:0.25)将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，收集细胞悬液，用计数板进行细胞计数；分装于含有10v/v％FBS的DMEM培养基的培养瓶中(细胞汇合度约30％)，置CO2培养箱内，5％CO2，37℃静置培养；细胞汇合度达80％～90％时用0.25％胰酶对细胞进行消化传代，传代得到人子宫平滑肌细胞，备用。
2.miRNA-206与下游GJA1结合的预测和验证
使用miRNA靶基因预测工具miRanda预测miR-206与GJA1的结合位点，分析临产子宫肌转录组发现，miRNA-206的表达和GJA1呈负相关(图3)。进一步选取结合位点上下游约150个bp碱基的片段克隆到荧光素酶报告基因下游，构建荧光素酶报告载体Luc-GJA1-野生型；采用改变碱基排列的原则，构建突变型荧光素酶报告载体Luc-GJA1-突变型；将野生型、突变型的载体分别和miRNA-206mimics共转染至HEK293细胞，转染36h后利用双荧光素酶报告基因检测系统检测Firefly和Renilla荧光素酶的活性。
如图4所示，miR-206表达上调能显著降低荧光素酶活性((mean±SEM)(n＝3)，**p＜0.005)，而将识别位点突变后，miR-206对荧光素酶活性的抑制丧失。
3.通过慢病毒转染miRNA-206的模拟物
将miRNA-206和阴性对照NC mimics(5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’(SEQ IDNo.10))的序列分别与GV309载体构建慢病毒表达载体，并通过慢病毒感染技术将miRNA-206和阴性对照NC mimics的慢病毒表达载体分别感染人原代子宫平滑肌细胞，MOI(multiplicity of infection)值为50；以未感染慢病毒表达载体的人子宫平滑肌细胞作为空白对照组。慢病毒感染细胞后3天，使用试剂盒RNeasy Plus Mini Kit(ESscience，货号为RN001)分别提取人子宫平滑肌细胞的总RNA，分别使用反转录试剂盒Fast miRNAReverse Transcription Kit(ESscience，货号为miR002)、PrimeScript RT Master Mix(TAKARA，货号为RR036A)对miRNA和mRNA进行反转录，并通过TB Green Premix Ex Taq II(TAKARA，货号为RR820A)进行实时定量PCR进行检测并计算miR-206和GJA1表达情况。其中，miR-206和GJA1实时定量PCR所用的引物分别为：miR-206-F：5’-GGCGGTGGAATGTAAGGAAG-3’(SEQ ID No.4)，miR-206-R：5’-GGCTGTCGTGGACTGCG-3’(SEQ ID No.5)，GJA1-F：5’-GGTGGACTGTTTCCTCTCTCG-3’(SEQ ID No.6)，GJA1-R：5’-GGAGCAGCCATTGAAATAAGC-3’(SEQID No.7)。
结果表明，感染阴性对照的慢病毒表达载体的人子宫平滑肌细胞与未感染慢病毒表达载体的空白对照组人子宫平滑肌细胞中miR-206表达和GJA1表达无明显差异；而当人子宫平滑肌细胞后感染miRNA-206mimics慢病毒表达载体后，人子宫平滑肌细胞中miR-206表达显著升高，GJA1表达显著下降(图5)。
实施例3miRNA-206模拟物在早产动物模型中的治疗作用
为获得miR-206的过表达，我们采用miR-206的agomir，agomir是经过特殊化学修饰的双链小RNA，通过模拟内源性miR-206来调节对应靶基因的生物学功能，正义链碱基进行Ome(甲氧基)修饰，反义链进行Chol(胆固醇)修饰，可以在小鼠体内稳定存在，并易被细胞摄取，相应的agomir NC作为阴性对照。其中agomiR-206序列为：正链5’-UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG-3’(SEQ ID No.8)，反链5’-chol-CCACACACUUCCUUACAUUCCA-3’(SEQ ID No.9)。
采用CD1小鼠(6～8周龄)，使用米非司酮RU486构建早产模型，在小鼠妊娠第15天皮下注射RU486(200μg/kg/d，用芝麻油配置为100μL)，小鼠在注射后20h内发生早产。具体步骤如下：将CD1小鼠分为7组，每组6只，分别为空白对照组(NP组，小鼠不做任何处理，正常妊娠)、芝麻油处理组(在CD1小鼠妊娠第15天皮下注射100μL芝麻油)、RU486处理组(在CD1小鼠妊娠第15天皮下注射RU486)、agomiR-NC+RU486共同处理组(在CD1小鼠妊娠第11、12、13天连续3天给小鼠尾部静脉注射agomiR-NC，80mg/kg/d，用生理盐水配置为100uL；在第15天皮下注射RU486)、miR-206和RU486共同处理Ⅰ组(即miR-206高剂量+RU486组，在CD1小鼠妊娠第11、12、13天连续3天给小鼠尾部静脉注射agomiR-206，80mg/kg/d，用生理盐水配置为100uL；在第15天皮下注射RU486)，miR-206和RU486共同处理Ⅱ组(即miR-206低剂量+RU486组，在CD1小鼠妊娠第11、12、13天连续3天给小鼠尾部静脉注射agomiR-206，40mg/kg/d，用生理盐水配置为100uL；在第15天皮下注射RU486)和miR-206处理组(在CD1小鼠妊娠第11、12、13天连续3天给小鼠尾部静脉注射agomiR-206，80mg/kg/d，用生理盐水配置为100uL)(图6)。按照上述分组对各小鼠进行处理后，观察并统计各CD1小鼠的妊娠时限和胎儿结局。
观察并统计各CD1小鼠的妊娠时限和胎儿结局，结果表明，miR-206处理组的小鼠的妊娠时长与空白对照组小鼠的妊娠时长无明显差异；在注射RU486前连续注射三天高剂量(80mg/kg/d)的agomiR-206，可显著延长早产模型小鼠的妊娠时长，甚至可以达到足天分娩，胎儿存活率增加；在注射RU486前连续注射三天低剂量(40mg/kg/d)的agomiR-206，对小鼠的妊娠时长无明显延长(图7)。通过对agomiR-NC+RU486组、miR-206低剂量+RU486组和miR-206高剂量+RU486组小鼠的胎儿进行称重和长度测定，结果表明miR-206低剂量+RU486组和agomiR-NC+RU486组小鼠的胎儿体重和身长无明显差异，miR-206高剂量+RU486组的胎儿体重和身长均显著增加(图8)。
收集agomiR-NC+RU486组、miR-206低剂量+RU486组和miR-206高剂量+RU486组的母鼠的子宫肌条，利用蛋白质印迹法(即Western Blot)检测各母鼠子宫肌条中GJA1的蛋白表达量，结果表明，agomiR-206可有效降低母鼠子宫肌GJA1的表达，且呈现剂量依赖性(图9)
进一步用小鼠子宫肌组织进行肌张力实验，具体如下：取空白对照组和miR-206处理组小鼠子宫肌条，剔除肉眼可见血管组织及其它非子宫平滑肌组织，剪成1*0.5*0.5cm大小，将其悬挂于组织水浴槽中，槽中预先加入Krebs平衡液(119mM NaCl，25mM NaHCO3,1.2mM KH2PO4，4.7mM KCl，1.2mM MgSO4·H2O，0.026mM Na2·EDTA·2H2O，11.5mM葡萄糖，2.5mM CaCl2·H2O)，并预热至37℃，使子宫肌条完全浸泡在Krebs平衡液中，开启混合气(95％O2+5％CO2)模拟临产子宫缺复氧状态，通过Powerlab传感器观察并调节起始张力值1g，平衡收缩1h。向每个组织槽内加入缩宫素(终浓度为1nM)触发子宫肌条使其收缩，并将此时间段设为T0。模拟临产子宫缺复氧状态：关闭混合气，通入100％氮气使组织缺氧10～15min，再重新通入混合气30～45min，如此循环3次。将每一循环的复氧段分别设为T1、T2和T3。全程通过PowerLab PL3508接收信号，由Labchart Pro V8.0.7记录子宫肌条收缩参数。结果表明，与未经过agomiR-206处理的CD1小鼠相比，经过agomiR-206处理后的CD1小鼠的子宫肌条的收缩强度和收缩振幅均显著降低(p＜0.05)(图10)。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州市妇女儿童医疗中心
<120> 一种调控子宫肌收缩的miRNA分子miR-206及其应用
<130>
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
uggaauguaa ggaagugugu gg 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
uggaauguaa ggaagugugu gg 22
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccacacacuu ccuuacauuc ca 22
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggcggtggaa tgtaaggaag 19
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggctgtcgtg gactgcg 17
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggtggactgt ttcctctctc g 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggagcagcca ttgaaataag c 21
<210> 8
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 8
uggaauguaa ggaagugugu gg 22
<210> 9
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 9
ccacacacuu ccuuacauuc ca 22
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ttctccgaac gtgtcacgt 19

Claims (10)

1.(1)～(3)中至少一种在制备预防和/或治疗早产药物中的应用；
(1)miR-206；
(2)miR-206的前体；
(3)miR-206模拟物。
2.表达miR-206或miR-206的前体的核酸分子在制备预防和/或治疗早产药物中的应用。
3.含有miR-206核酸分子的表达盒、载体或细胞系在制备预防和/或治疗早产药物中的应用。
4.(4)或(5)在制备预防和/或治疗早产药物中的应用；
(4)靶向上调miR-206的试剂或组合物；
(5)增强miR-206活性的试剂或组合物。
5.根据权利要求1～4中任一所述的应用，其特征在于，所述药物通过抑制GJA1的表达而达到预防和/或治疗早产的目的。
6.(6)～(10)中至少一种在制备GJA1抑制剂中的应用；
(6)miR-206；
(7)miR-206的前体；
(8)miR-206模拟物；
(9)靶向上调miR-206的试剂；
(10)靶向增强miR-206活性的试剂。
7.一种用于治疗早产或抑制子宫肌收缩的药物，其特征在于，所述药物中含有靶向上调miR-206或增强miR-206活性的试剂或组合物。
8.检测miR-206表达量的试剂在制备诊断早产的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片或试剂盒，优选地，所述芯片包括固相载体以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针；所述试剂盒优选包括用于检测miR-206表达水平的试剂；更优选地，所述试剂盒还包含扩增miR-206的引物组。
10.miR-206作为靶标在筛选早产诊断药物中的应用。
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