JP2022191536A - サイトメガロウイルス関連疾患の予防又は治療用の剤 - Google Patents

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Abstract

【課題】ＨＣＭＶ感染症の従来薬とは作用機序が異なる、サイトメガロウイルス関連疾患の予防又は治療に用い得る新規な剤を提供する。【解決手段】４３の遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現又は機能を抑制する成分を含む、サイトメガロウイルス関連疾患の予防又は治療用の剤。【選択図】なし

Description

本発明は、サイトメガロウイルス関連疾患の予防又は治療用の剤に関する。
サイトメガロウイルスは、ヘルペスウイルス科サイトメガロウイルス属に属するウイルスの総称であり、ヒトに感染するヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）等が知られている。
ＨＣＭＶの感染は、頻繁に起こっているが、健常者では、症状が顕在化しないケースがほとんどである。一方、胎児や、免疫機能が低下した者等では、ＨＣＭＶの感染は、重篤な症状をしばしば引き起こす。
例えば、ＨＣＭＶは、妊婦の胎盤を介して胎児に感染する（いわゆる、先天性感染）。その結果として、胎児の子宮内発達の遅延を引き起こし得る。さらに、胎児期以降（すなわち、胎児、及び出生後）における、小頭症；精神発達遅滞；及び、感音性難聴などの神経・感覚器障害；など、さまざまな臓器障害を呈する、先天性ＨＣＭＶ感染症を引き起こす。またＨＣＭＶは、移植医療にともなう医原性免疫不全患者、及びエイズ患者などにおいて、肺炎、腸炎、及び、網膜炎などの日和見感染症を引き起こす。
重篤な症状を引き起こすＨＣＭＶの感染に対する治療法としては、ＨＣＭＶの増殖を抑制するために、ＨＣＭＶのＤＮＡ複製に必要な遺伝子のＤＮＡあるいはそのｍＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡを用いる方法があり（例えば、特許文献１）、臨床では、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、及び、ホスカルネット等の抗ウイルス薬の投与が行われている。また、初の核酸医薬として上市されたホミビルセンの投与も、エイズ患者のＨＣＭＶ性網膜炎に対する治療法の一つの選択肢となっている。一方で、ＨＣＭＶに有効なワクチンは、未だ報告がなされていない。
特表平１０－５００８５１号公報
しかしながら、上記の抗ウイルス薬は、ＨＣＭＶがコードするＤＮＡポリメラーゼなどを標的としているため、薬剤耐性ＨＣＭＶ株が出現する。また、上記の抗ウイルス薬は、重篤な副作用を引き起こす場合があるため、適応疾患が限定的である。とりわけ、胎児に対して、非常に重篤な副作用を引き起こし得るので、母体への投与自体が禁忌となっている抗ウイルス薬も存在する。
また、ホミビルセンは、ＨＣＭＶがコードするＩＥ２に対するアンチセンスＲＮＡであり、薬剤耐性ＨＣＭＶ株が出現する危険性が指摘されている。
本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＨＣＭＶ感染症の従来薬とは作用機序が異なる、サイトメガロウイルス関連疾患の予防又は治療に用い得る新規な剤を提供することにある。
発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＨＣＭＶの感染対象となるヒトにおける特定の遺伝子の発現又は機能を抑制することで、サイトメガロウイルス関連疾患を予防又は治療することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明の一態様は、以下の１．～４３．の遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現又は機能を抑制する成分を含む、サイトメガロウイルス関連疾患の予防又は治療用の剤である。
１． AHNAK2 (AHNAK nucleoprotein 2)
２． AIDA (axin interactor, dorsalization associated)
３． AKAP5 (A kinase (PRKA) anchor protein 5)
４． AP1S2 (adaptor-related protein complex 1, sigma 2 subunit)
５． APC (adenomatous polyposis coli)
６． C3orf74 (chromosome 3 open reading frame 74)
７． C9orf9 (chromosome 9 open reading frame 9)
８． C11orf67 (chromosome 11 open reading frame 67)
９． C19orf33 (chromosome 19 open reading frame 33)
１０． CHTF18 (CTF18, chromosome transmission fidelity factor 18 homolog (S. cerevisiae))
１１． CREB1 (cAMP responsive element binding protein 1)
１２． CYTH1 (cytohesin 1)
１３． EML1 (echinoderm microtubule associated protein like 1)
１４． EMP2 (epithelial membrane protein 2)
１５． EPHB6 (EPH receptor B6)
１６． FAM160A1 (family with sequence similarity 160, member A1)
１７． FAM176A (family with sequence similarity 176, member A)
１８． FXR2 (fragile X mental retardation, autosomal homolog 2)
１９． GPR126 (G protein-coupled receptor 126)
２０． HDHD1A (haloacid dehalogenase-like hydrolase domain containing 1A)
２１． HNRNPH3 (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H3 (2H9))
２２． TESPA1 (Thymocyte Expressed, Positive Selection Associated 1)
２３． PALD1 (Phosphatase Domain Containing Paladin 1)
２４． KRTAP12-1 (keratin associated protein 12-1)
２５． MBD1 (methyl-CpG binding domain protein 1)
２６． MESDC2 (mesoderm development candidate 2)
２７． MUC5AC (mucin 5AC, oligomeric mucus/gel-forming)
２８． NOL12 (nucleolar protein 12)
２９． NRP1 (neuropilin 1)
３０． NUP153 (nucleoporin 153kDa)
３１． PATL2 (protein associated with topoisomerase II homolog 2 (yeast))
３２. PCBD1 (pterin-4 alpha-carbinolamine dehydratase/dimerization cofactor of hepatocyte nuclear factor 1 alpha)
３３． PPKRIR (protein-kinase, interferon-inducible double stranded RNA dependent inhibitor, repressor of (P58 repressor))
３４． RBM26 (RNA binding motif protein 26)
３５． RSBN1 (round spermatid basic protein 1)
３６． SCXA (scleraxis homolog A (mouse))
３７． SPINT3 (serine peptidase inhibitor, Kunitz type, 3)
３８． TATDN3 (TatD DNase domain containing 3)
３９． TBC1D3G (TBC1 domain family, member 3G)
４０． TSC22D1 (TSC22 domain family, member 1)
４１． UNC119B (unc-119 homolog B (C. elegans))
４２． WBP4 (WW domain binding protein 4 (formin binding protein 21))
４３． ZNF354A (zinc finger protein 354A)
また、本発明の他の態様は、上述の１．～４３．の遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現又は機能を抑制するかを一つの指標とする、サイトメガロウイルス関連疾患の予防又は治療用の候補物質のスクリーニング方法である。
本発明によれば、新規な作用機序に基づく、サイトメガロウイルス関連疾患の予防又は治療用の剤を提供することができる。
本発明の実施例の結果を示す図である。 本発明の実施例の結果を示す図である。
以下に、本発明の一実施形態について詳述するが、本発明はこれに限定されるものではない。
〔１．サイトメガロウイルス関連疾患の予防又は治療用の剤〕
（サイトメガロウイルス関連疾患）
本明細書において、「サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）」とは、分類学上、ヘルペスウイルス科サイトメガロウイルス属に属するウイルスの総称である。サイトメガロウイルスの中では、特に好ましくはヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）を指す。
本明細書において、「サイトメガロウイルス関連疾患」とは、サイトメガロウイルスがヒトに感染することによって引き起こされる疾患の総称である。「サイトメガロウイルス関連疾患」は、「サイトメガロウイルス感染症」とも称される。「サイトメガロウイルス関連疾患」の範疇には、例えば、ＣＭＶの感染を原因とする、１）胎児の子宮内発達の遅延、流産、死産等、２）小頭症、３）精神発達遅滞、４）感音性難聴などの神経・感覚器障害、５）肝脾腫、６）肺炎、腸炎、食道炎、網膜炎、並びに、７）腫瘍細胞の変性（オンコモジュレーション）、なども含まれる。
本明細書において、「ＣＭＶに感染している」は、一時的にか持続的にかを問わず、個体の細胞へＣＭＶが感染している状態を意味する。「ＣＭＶに持続感染している」は、個体の細胞におけるＣＭＶの感染が持続している状態を意味する。ここで、持続感染している個体は、ＣＭＶ感染にともなう症状を呈しているか、又は呈していない（後者の個体をキャリアとも称する）。
（サイトメガロウイルス関連疾患の予防又は治療）
本明細書において、「サイトメガロウイルス関連疾患の予防」とは、本発明の一実施形態にかかる剤を投与しない場合と比較して、ヒトにおけるＣＭＶの感染リスクが低減することを意図する。特に好ましくは、本発明の一実施形態にかかる剤を投与しない場合と比較して、ヒトにおけるＣＭＶの感染を、実質的に完全に防止することを意味する。本発明の一実施形態にかかる剤は、ヒトにおける、ＣＭＶの感染を抑制する剤と捉えることもできる。
サイトメガロウイルス関連疾患の予防の対象となるヒトは、特に限定されないが、一例では、母体内にいる胎児であってもよい。すなわち、本発明の一態様では、妊婦の胎盤を介した胎児への感染（いわゆる、先天性感染）を、予防の対象とする。この場合、本発明の一実施形態にかかる剤が投与される母体は、ＣＭＶに感染していてもいなくてもよいが、典型的な一例では、母体は、ＣＭＶのキャリアである。
他の一例では、サイトメガロウイルス関連疾患の予防の対象となるヒトは、免疫機能が低下したヒトであってもよい。免疫機能が低下したヒトとは、例えば、移植医療にともなう医原性免疫不全患者、及びエイズ患者などである。
本明細書において、「サイトメガロウイルス関連疾患の治療」とは、本発明の一実施形態にかかる剤を投与しない場合と比較して、サイトメガロウイルス関連疾患の症状の進行が少なくとも遅延すること、好ましくは、少なくとも１つの症状が改善することを意図する。サイトメガロウイルス関連疾患の治療の対象となるヒトは、ＣＭＶが感染しているヒトであれば特に限定されない。
なお、本発明の剤による効果は、例えば、ＣＭＶゲノムのリアルタイムＰＣＲなどの既存の方法によって評価され得る。
（剤の有効成分）
本発明の一実施形態に係るサイトメガロウイルス関連疾患の予防又は治療用の剤（以下、「本実施形態に係る剤」）は、（課題を解決するための手段）の欄に記載した１．～４３．の遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現又は機能を抑制する成分（以下、「有効成分」）を含んでいる。これらの遺伝子は何れもヒト細胞に存在するターゲットである。そのため、本実施形態に係る剤は、従来の抗ウイルス薬等と比較して、薬剤耐性ＣＭＶが出現しにくいと期待される。また、本実施形態に係る剤は、従来の抗ウイルス薬等とは異なる、細胞因子を介した作用機序で抗ＣＭＶ効果を示す。そのため、本実施形態に係る剤は、薬剤耐性ＣＭＶに対しても補完的な治療効果を発揮する代替医薬品になることも期待される。
本実施形態に係る剤は、有効成分として、上述の１．～４３．の遺伝子の中でも、以下１０個の遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現又は機能を抑制する成分を含むことが好ましい場合がある。
５． APC (adenomatous polyposis coli)
６． C3orf74 (chromosome 3 open reading frame 74)
１１． CREB1 (cAMP responsive element binding protein 1)
１６． FAM160A1 (family with sequence similarity 160, member A1)
１９． GPR126 (G protein-coupled receptor 126)
２７． MUC5AC (mucin 5AC, oligomeric mucus/gel-forming)
２９． NRP1 (neuropilin 1)
３６． SCXA (scleraxis homolog A (mouse))
３７． SPINT3 (serine peptidase inhibitor, Kunitz type, 3)
４２． WBP4 (WW domain binding protein 4 (formin binding protein 21))。
なお、一例では、本実施形態に係る剤は、１．～４３．の遺伝子からなる群より選択される１０個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、又は、１個の遺伝子の発現又は機能を抑制する有効成分（１種であっても、遺伝子の数に応じて複数種であってもよい）を含んでいる。典型的には、１つの有効成分は、対応する１個の遺伝子の発現又は機能を抑制するが、１つの有効成分が複数の遺伝子の発現又は機能を抑制してもよい。
ここで、「遺伝子の発現又は機能を抑制する」とは、１）遺伝子からのタンパク質の合成（転写及び翻訳のプロセス）、２）転写された遺伝子（ｍＲＮＡ）の作用、及び、３）遺伝子から合成されたタンパク質の作用、の何れかを、直接的あるいは間接的に抑制することを指す。典型的な一例では、上記の有効成分は、ターゲットとなる遺伝子特異的に、その発現又は機能を抑制する。
このような有効成分としては、例えば、低分子化合物、オリゴヌクレオチドなどの核酸重合体、高分子化合物、及び、これらの組合せ等が挙げられるが、これらに限定されない。低分子化合物としては、例えば、上記の遺伝子がコードするタンパク質の阻害剤が挙げられる。オリゴヌクレオチドなどの核酸重合体としては、１）対象となる遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチド、２）ＲＮＡｉ用の核酸重合体（オリゴヌクレオチド）、３）ヘテロ二本鎖核酸（ＤＮＡ/ＲＮＡ）、４）ｍｉＲＮＡ標的核酸、及び、５）上記の遺伝子がコードするタンパク質に対する核酸アプタマーなどが挙げられる。なお、ＣＭＶの感染を原因とする中枢神経系障害に対する予防又は治療に関しては、血液脳関門を通過可能な大きさの分子、並びに、物質送達手段が求められる場合もある。
以下、上記２）のＲＮＡｉ用の核酸重合体について説明する。ＲＮＡｉ用の核酸重合体は、典型的には、相補的な二本鎖部分を有するＲＮＡ分子である。相補的な二本鎖部分は、例えば１６ｐｂ以上であり、１７ｂｐ以上であることが好ましい場合があり、２０ｂｐ以上がより好ましい場合がある。この相補的な二本鎖部分は、例えば３０ｐｂ以下であり、２７又は２６ｂｐ以下であることが好ましい場合があり、２５ｂｐ以下がより好ましい場合がある。
ＲＮＡｉ用の核酸重合体は、ターゲットたるｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉を引き起こすものであれば、その構造等は特に限定されない。ＲＮＡｉ用の核酸重合体は、例えば、ｓｈＲＮＡ、ダンベル型、ｓｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ等であり得、一例ではｓｈＲＮＡである。ｓｈＲＮＡにおけるループ部分の塩基配列は特に限定されず、適宜設計することが可能である。例えば、ループ部分は「ＣＴＣＧＡＧ」とすることができる（５´末端から３´末端。鋳型となるＤＮＡの配列で示す。）。
本実施形態における有効成分は、上述の核酸重合体を発現するベクターであってもよい。このようなベクターは、市販のキットを用いて作製することができる。ｓｈＲＮＡを発現するベクターは、転写によってｓｈＲＮＡを生成するＤＮＡを、市販のベクター（例えば、アデノウイルスベクター）に挿入することによって作製することができる。挿入するＤＮＡに含めるプロモーター及びターミネーターの塩基配列は特に限定されず、適宜設計することが可能である。例えば、プロモーター部分を「ＣＣＧＧ」、ターミネーター部分を「ＴＴＴＴＴＧ」とすることができる（いずれも５´末端から３´末端）。
後述するが、本実施形態に係る剤は、上述の有効成分の他に、その他の成分を含んでいてもよい。
１．～４３．の遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現又は機能を抑制するｓｈＲＮＡの具体的な配列としては、例えば、実施例に記載の表１に示した＃１～＃４３のＤＮＡ配列の発現産物（ＲＮＡ）が挙げられる。＃１～＃４３のＤＮＡ配列は何れも、５’側から順に（表中で左側から順に）、（１）プロモーター部分「ＣＣＧＧ」、（２）相補的な二本鎖部分を成す第一鎖（センス側）、（３）ループ部分「ＣＴＣＧＡＧ」、（４）相補的な二本鎖部分を成す第二鎖（アンチセンス側）、及び、（５）ターミネーター部分「ＴＴＴＴＴＧ」、を含んで構成されている。発現産物（ＲＮＡ）においては、上記（２）の第一鎖に対応する（第一鎖を鋳型とする）ＲＮＡと、上記（４）の第二鎖に対応するＲＮＡとが相補的な二本鎖部分を形成する。
表１に示した＃１～＃４３のＤＮＡ配列の発現産物（ＲＮＡ）は、上述の１．～４３．の遺伝子のうち対応する番号の遺伝子の発現又は機能をそれぞれ抑制することができる。
なお、表１に示したＤＮＡ配列の発現産物（ＲＮＡ）と同等の、相補的な二本鎖部分を有するＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉ用のオリゴヌクレオチドとして機能する。配列表の配列番号１～４３は、表１に示した＃１～＃４３のＤＮＡ配列の、上記（２）の相補的な二本鎖部分を成す第一鎖（センス側）を示す。
ＲＮＡｉ用の核酸重合体として機能する上記ＲＮＡ分子の一例は、ａ）配列番号１～４３で示す塩基配列の何れかにおける連続する１６以上の塩基を含むＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ、及び、ｂ）当該ＤＮＡに相補的なＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ、の少なくとも一方を含んでなる。上記ＲＮＡ分子は、好ましくは、上記のａ）及びｂ）のＲＮＡｓが二本鎖構造を形成してなる核酸重合体である。このＲＮＡ分子は、ＤＮＡ（ベクター等）の形態で投与されうる。
上述の連続する塩基の数は、１７以上であることが好ましく、１８以上又は１９以上であることがより好ましく、２０以上であることがさらに好ましい場合がある。
（有効成分としての核酸重合体の修飾）
有効成分としての核酸重合体は、天然の核酸重合体であってもよく非天然の核酸重合体であってもよい。核酸重合体は修飾されたものであってもよく、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（locked nucleic acids、ＬＮＡ）、ホスホロチオアートオリゴヌクレオチド、２’Ｏ－Ｍｅ修飾オリゴヌクレオチド、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋型核酸種（ＥＮＡ）等が挙げられるがこれらに限定されない。このような修飾により生体内での核酸重合体の安定性を高めることができる。
（その他の成分）
本実施形態に係る剤を構成する有効成分以外の成分は特に限定されず、例えば、薬学的に許容される担体、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧調整用の塩類、緩衝剤、着色剤、香味料、甘味料、抗酸化剤、粘度調整剤などと混合することができる。
上記薬学的に許容される担体は、特に限定されないが、担体であって、上記有効成分と同時投与された場合に有効成分の効能を阻害せず、かつ、投与対象となるヒトに対して実質的な悪影響を及ぼさないという性質を備えることが好ましい。このような担体としては、この分野で従来公知のものを広く使用でき、具体的には、例えば、水、各種塩溶液、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、パラフィン、脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸ジグリセリド、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、特にこれらに限定されない。担体の種類は、本実施形態に係る剤の剤型、投与方法などに応じて、適宜選択すればよい。
（既存の抗サイトメガロウイルス剤との併用）
本実施形態に係る剤は、既存の抗サイトメガロウイルス剤と併用することも出来る。併用の一形態は、本実施形態に係る剤が、既存の抗サイトメガロウイルス剤を含んで製剤化されている、いわゆる配合剤の形態である。併用の他の形態は、本実施形態に係る剤と、抗サイトメガロウイルス剤とが別々に製剤化されていて、これらの剤を組合せて使用する（別々の剤を同時投与又は逐次投与する）形態である。
既存の抗サイトメガロウイルス剤としては、例えば、ガンシクロビル及びその塩、ホスカルネット及びその塩（ホスカルネットナトリウム水和物など）、ホスフェニトインナトリウム及びその塩（水和物など）、バルガンシクロビル及びその塩（バルガンシクロビル塩酸塩など）、レテルモビル、シドフォビル及びその塩、ならびに、ホミビルセンからなる群を挙げることができる。
〔２．剤の投与〕
本実施形態に係る剤は、サイトメガロウイルス関連疾患の予防又は治療を目的として、ヒトの個体に投与することができる。
ヒトの個体を投与対象とする場合、ヒトに対して、サイトメガロウイルス関連疾患の予防又は治療に有効な量の有効成分を投与する。ここで、有効成分は、単独で投与してもよく、又は、投与の目的に適した剤の一構成成分として投与してもよい。
本実施形態に係る剤に含まれる有効成分の投与量は特に限定されず、投与対象の疾患状態、体重、治療に対する反応、剤の投与形態、疾患の経過の段階、又は投与の間隔に依存して適宜調整され得る。なお、投与は、１回～数回に分けておこなわれ得、例えば、１日あたり１～数回投与され得る。
本実施形態に係る剤の投与経路は特に限定されず、例えば、経口投与、静脈内又は動脈内への血管内投与、腸内投与といった手法により全身投与されてもよく、注入（注射器又は注入ポンプなどを利用）、経皮投与、舌下投与、臓器表面投与といった手法により局所投与されてもよい。投与量及び投与方法は、治療目的、患者の体重、年齢、及び症状などに応じて、当業者が適宜選択すればよい。本実施形態に係る剤の剤型は特に限定されず、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、貼り薬、塗り薬、及び注射剤などが挙げられる。
本実施形態における有効成分が核酸重合体である場合、本実施形態に係る剤は、遺伝子治療剤であり得る。当該遺伝子治療剤は、有効成分を、注射によりヒトに直接投与する形態のものであってもよく、あるいは、上記核酸重合体が組み込まれたベクターを、注射によりヒトに直接投与する形態のものであってもよい。また、上記ベクターは、特に限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクターなど、遺伝子治療に適用可能なベクターが挙げられる。なお、上記遺伝子治療剤はリポソーム製剤であってもよい。
上記遺伝子治療剤を構成する上記ベクターには、標的部位において特異的に上記有効成分を発現させる発現調節配列が組み込まれていることが好ましい。ここで、発現調節配列とは、例えば、プロモーター又はエンハンサーである。
〔３．本発明に係るスクリーニング方法〕
本実施の形態のスクリーニング方法は、サイトメガロウイルス関連疾患の予防又は治療用の候補物質のスクリーニング方法であって、１．～４３．の遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現又は機能を抑制するかを一つの指標とするスクリーニング方法である。本発明の一態様のスクリーニング方法は、細胞試料と被験物質とを接触させる工程（接触工程）、該細胞試料における１．～４３．の遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現又は機能を評価する工程（評価工程）、対照と比較して上記１．～４３．の遺伝子の発現又は機能が抑制された場合に、該被検物質を、候補物質として選択する工程（選択工程）を包含する。
上記接触工程に用いられる細胞試料は、例えばＣＭＶの感染対象となる細胞を含む試料である。細胞試料としては、非ヒト生物、各種の細胞株の培養細胞、生物から分離された生物学的試料等が挙げられる。培養細胞は、例えばヒト及び非ヒト生物の生体細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等であり、より具体的にはヒト神経系細胞株（U373MG細胞株）、ヒト線維芽細胞株等が挙げられる。
被検物質としては、低分子化合物、オリゴヌクレオチドなどの核酸重合体、ペプチド、タンパク質、高分子化合物、及び、これらの組合せ等が挙げられるが、これらに限定されない。被験物質は天然に存在するものでもよく、化学合成されたものでもよい。候補物質は、好ましくは、生体内で無害な物質であり得る。被験物質の一例はｓｈＲＮＡである。
細胞試料と被験物質とを接触させる具体的な方法は特に限定されない。例えば、細胞試料が培養細胞である場合、細胞を培養している培養液へ、候補物質を直接投与することが可能である。特に限定されないが、被験物質がオリゴヌクレオチドである場合には、リポフェクション法又はエレクトロポレーション法などを用いることによって、より確実に被験物質を細胞内へ導入することができる。また、被験物質がポリペプチド又は高分子化合物である場合には、インジェクション法又はリポソーム法などを用いることによって、より確実に被験物質を細胞内へ導入することができる。被検物質の添加濃度は、その種類に応じて、細胞の生育に悪影響を及ぼさない範囲で適宜選択され得る。接触期間、および、接触期間中の温度なども適宜選択され得る。
評価工程における遺伝子の発現又は機能の評価は、例えば、遺伝子発現量をリアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ等の定量ＰＣＲ、又はマイクロアレイ解析などの解析により評価することができる。あるいは、該遺伝子から転写されるタンパクを標的にしてＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロッディング法、サザンブロッディング法及び免疫蛍光染色などを用いて評価してもよいし、細胞死が見られるかどうかで評価してもよい。これらの操作は、常法に従って行うことができる。
指標とする遺伝子は、１．～４３．の遺伝子からなる群より選択される、少なくとも１つの遺伝子であり、好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上、さらにより好ましくは４つ以上、特に好ましくは５つ以上、最も好ましくは１０個以上であることが好ましい。
上記選択工程において、遺伝子の発現又は機能活性の程度を、対照（例えば被検物質を投与しなかった細胞試料における遺伝子の発現又は機能活性の程度）と比較する。比較は、好ましくは有意差の有無を考慮して行われる。その結果、対照と比較して、遺伝子の発現又は機能が抑制されたときに、該被検物質を、ＣＭＶ関連疾患の予防又は治療用の候補物質として選択する。
以上のようなスクリーニング方法は、ＣＭＶ関連疾患の予防又は治療用の候補物質を効率よく得る方法として非常に有用である。
以上に示したように、本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施の形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施の形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
〔実施例〕
１．shRNAスクリーニング及び標的遺伝子の推定
以下の手順でshRNAの塩基配列を決定して標的遺伝子を推定した。
標的細胞として、ヒト神経系細胞（U373MG細胞株）を用いた。U373MG細胞は、培地として１０％ウシ胎児血清（BioWest社）及び抗生物質‐抗真菌剤混合溶液（ペニシリン１００ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ及びアムホテリシンＢ２５０ｎｇ／ｍＬ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ナカライテスク）を用い、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養した。
市販のキットに含まれる、レンチウイルスに組み込まれたshRNAのライブラリーを、U373MG細胞に導入した。shRNAが導入されたU373MG細胞を、１０μｇ／ｍＬ Puromycin（Invivogen）培地を用いて３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで１４日間培養し、Puromycin耐性を示す細胞集団を選択した。これにより、U373MG細胞の生存及び増殖を妨げないshRNAが導入されたU373MG細胞集団（以下、shRNA導入U373MG細胞集団）を獲得した。
shRNA導入U373MG細胞集団にヒトサイトメガロウイルスTowne株（ATCC、製品番号VR-977）を感染させ、培養を続けて細胞死への抵抗性を観察した。また、対照としてshRNAライブラリーを導入していないU373MG細胞に対しても同様にヒトサイトメガロウイルスTowne株を感染させた。結果を図１に示す。図１中で、細胞集団Ａは強度耐性クローンを、細胞集団Ｂは中等度耐性クローンを示す。
ヒトサイトメガロウイルスTowne株に感染しているshRNA導入U373MG細胞集団のうち、約３週間経過後に生存している細胞集団を、ヒトサイトメガロウイルスTowne株に耐性を示す細胞集団（以下、ヒトCMV耐性細胞集団）とした。なお、対照実験に用いたU373MG細胞は、感染後約３週間でほとんどの細胞が死滅した。
９６ウェルプレートを用いた限界希釈法を用いて、ヒトCMV耐性細胞集団に対してシングルセルクローニングを行った。続いて、単一細胞クローンそれぞれから常法に従ってゲノムDNAを抽出した。抽出したゲノムDNAのshRNA領域をPolymerase Chain Reaction（PCR）法で増幅した。続いて、PCR産物をプラスミドへそれぞれ導入し、shRNAの塩基配列をジデオキシ法により決定した。さらに、キットの販売者が提供するshRNAライブラリーの情報に基づいて、決定したshRNAの塩基配列から各shRNAが標的とする細胞遺伝子を特定した。shRNAの塩基配列、及び各shRNAが標的とする細胞遺伝子を以下の表１及び表２に示す。
Figure 2022191536000001
Figure 2022191536000002
２．効果の検証
（HCMV遺伝子の発現抑制）
上述のヒトCMV耐性細胞集団からシングルセルクローニングを行って得た単一細胞クローンのうちの６クローン（サンプルＡ～Ｆとする）と、陰性対照shRNAを導入したU373MG細胞（対照）とを用い、各細胞におけるHCMV遺伝子の発現を比較した。より具体的には、HCMV遺伝子の発現量は、HCMV遺伝子から転写されるIE2タンパク質の発現量を指標にして比較した。IE2タンパク質の検出にはウエスタンブロッディング法及び免疫蛍光染色を用いた。ウエスタンブロッディング法では６クローンのうちの３クローンを用い、ローディングコントロールとしてβ‐アクチンを用いた。免疫蛍光染色では残りの3クローンを用いた。また、細胞核はDAPI染色を行った。その結果、特定のshRNAが導入された、ヒトサイトメガロウイルスに耐性を有するU373MG細胞では、IE2タンパク質の発現抑制がみられることから、HCMV遺伝子の発現の抑制が示唆された（結果は図示せず）。
（標的細胞の遺伝子の発現抑制）
上述のヒトCMV耐性細胞集団のうちの＃５のshRNAが導入されていた単一細胞クローンにおいてReverse Transcription-PCR (RT-PCR)法を用い、それぞれのshRNAが標的とする細胞遺伝子の発現を調べた。RT-PCR法のプライマーはshRNAの塩基配列に基づいて設計した。逆転写反応試薬はPrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit（タカラバイオ）を、RT-PCR用試薬は、Tks GflexTM DNA Polymerase（タカラバイオ）を用い、解析装置としてVeritiサーマルサイクラ― (Applied Biosystems)を使用した。得られたPCR産物を電気泳動によって確認した。ローディングコントロールにはTBPを用いた。図２に示すように、導入したshRNAは、標的とする細胞遺伝子の発現を抑制していた。
（shRNAの単独導入）
新たにU373MG細胞を用意し、上述の条件（１０％ウシ胎児血清及び抗生物質‐抗真菌剤混合溶液を含むダルベッコ変法イーグル培地、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター）で培養した。新たに＃５のshRNAを導入したU373MG細胞と、陰性対照shRNAを導入したU373MG細胞（対照）とを１０μｇ／ｍＬ Puromycin培地を用いて３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで１４日間培養した後、Puromycin耐性を示す細胞集団を選択した。選択した細胞集団にヒトサイトメガロウイルスTowne株を感染させ、細胞死への抵抗性を比較した。図２に示すように、特定のshRNAを導入したU373MG細胞が、CMV感染にともなう細胞死に対して抵抗性を示すことを確認した。

Claims (8)

  1. 以下の１．～４３．の遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現又は機能を抑制する成分を含む、サイトメガロウイルス関連疾患の予防又は治療用の剤。
    １． AHNAK2 (AHNAK nucleoprotein 2)
    ２． AIDA (axin interactor, dorsalization associated)
    ３． AKAP5 (A kinase (PRKA) anchor protein 5)
    ４． AP1S2 (adaptor-related protein complex 1, sigma 2 subunit)
    ５． APC (adenomatous polyposis coli)
    ６． C3orf74 (chromosome 3 open reading frame 74)
    ７． C9orf9 (chromosome 9 open reading frame 9)
    ８． C11orf67 (chromosome 11 open reading frame 67)
    ９． C19orf33 (chromosome 19 open reading frame 33)
    １０． CHTF18 (CTF18, chromosome transmission fidelity factor 18 homolog (S. cerevisiae))
    １１． CREB1 (cAMP responsive element binding protein 1)
    １２． CYTH1 (cytohesin 1)
    １３． EML1 (echinoderm microtubule associated protein like 1)
    １４． EMP2 (epithelial membrane protein 2)
    １５． EPHB6 (EPH receptor B6)
    １６． FAM160A1 (family with sequence similarity 160, member A1)
    １７． FAM176A (family with sequence similarity 176, member A)
    １８． FXR2 (fragile X mental retardation, autosomal homolog 2)
    １９． GPR126 (G protein-coupled receptor 126)
    ２０． HDHD1A (haloacid dehalogenase-like hydrolase domain containing 1A)
    ２１． HNRNPH3 (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H3 (2H9))
    ２２． TESPA1 (Thymocyte Expressed, Positive Selection Associated 1)
    ２３． PALD1 (Phosphatase Domain Containing Paladin 1)
    ２４． KRTAP12-1 (keratin associated protein 12-1)
    ２５． MBD1 (methyl-CpG binding domain protein 1)
    ２６． MESDC2 (mesoderm development candidate 2)
    ２７． MUC5AC (mucin 5AC, oligomeric mucus/gel-forming)
    ２８． NOL12 (nucleolar protein 12)
    ２９． NRP1 (neuropilin 1)
    ３０． NUP153 (nucleoporin 153kDa)
    ３１． PATL2 (protein associated with topoisomerase II homolog 2 (yeast))
    ３２. PCBD1 (pterin-4 alpha-carbinolamine dehydratase/dimerization cofactor of hepatocyte nuclear factor 1 alpha)
    ３３． PPKRIR (protein-kinase, interferon-inducible double stranded RNA dependent inhibitor, repressor of (P58 repressor))
    ３４． RBM26 (RNA binding motif protein 26)
    ３５． RSBN1 (round spermatid basic protein 1)
    ３６． SCXA (scleraxis homolog A (mouse))
    ３７． SPINT3 (serine peptidase inhibitor, Kunitz type, 3)
    ３８． TATDN3 (TatD DNase domain containing 3)
    ３９． TBC1D3G (TBC1 domain family, member 3G)
    ４０． TSC22D1 (TSC22 domain family, member 1)
    ４１． UNC119B (unc-119 homolog B (C. elegans))
    ４２． WBP4 (WW domain binding protein 4 (formin binding protein 21))
    ４３． ZNF354A (zinc finger protein 354A)
  2. 上記成分は、核酸重合体である、請求項１に記載の剤。
  3. 上記核酸重合体は、
    １）配列番号１～４３で示す塩基配列の何れかにおける連続する１６以上の塩基を含むＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ、及び、当該ＤＮＡに相補的なＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ、の少なくとも一方を含むか、
    ２）上記１）のＲＮＡを含む核酸重合体を転写により生成するＤＮＡを含んでいる、
    請求項２に記載の剤。
  4. 上記核酸重合体は、ｓｉＲＮＡである、請求項２又は３に記載の剤。
  5. 上記５．、６．、１１．、１６．、１９．、２７．、２９．、３６．、３７．及び４２．の遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を抑制する成分を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の剤。
  6. 抗サイトメガロウイルス剤を含むか、抗サイトメガロウイルス剤と組合せられている、請求項１～５のいずれか１項に記載の剤。
  7. 上記抗サイトメガロウイルス剤は、ガンシクロビル及びその塩、ホスカルネット及びその塩（ホスカルネットナトリウム水和物など）、ホスフェニトインナトリウム及びその塩（水和物など）、バルガンシクロビル及びその塩（バルガンシクロビル塩酸塩など）、レテルモビル、シドフォビル及びその塩、ならびに、ホミビルセンからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項６に記載の剤。
  8. 以下の１．～４３．の遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現又は機能を抑制するかを一つの指標とする、サイトメガロウイルス関連疾患の予防又は治療用の候補物質のスクリーニング方法。
    １． AHNAK2 (AHNAK nucleoprotein 2)
    ２． AIDA (axin interactor, dorsalization associated)
    ３． AKAP5 (A kinase (PRKA) anchor protein 5)
    ４． AP1S2 (adaptor-related protein complex 1, sigma 2 subunit)
    ５． APC (adenomatous polyposis coli)
    ６． C3orf74 (chromosome 3 open reading frame 74)
    ７． C9orf9 (chromosome 9 open reading frame 9)
    ８． C11orf67 (chromosome 11 open reading frame 67)
    ９． C19orf33 (chromosome 19 open reading frame 33)
    １０． CHTF18 (CTF18, chromosome transmission fidelity factor 18 homolog (S. cerevisiae))
    １１． CREB1 (cAMP responsive element binding protein 1)
    １２． CYTH1 (cytohesin 1)
    １３． EML1 (echinoderm microtubule associated protein like 1)
    １４． EMP2 (epithelial membrane protein 2)
    １５． EPHB6 (EPH receptor B6)
    １６． FAM160A1 (family with sequence similarity 160, member A1)
    １７． FAM176A (family with sequence similarity 176, member A)
    １８． FXR2 (fragile X mental retardation, autosomal homolog 2)
    １９． GPR126 (G protein-coupled receptor 126)
    ２０． HDHD1A (haloacid dehalogenase-like hydrolase domain containing 1A)
    ２１． HNRNPH3 (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H3 (2H9))
    ２２． TESPA1 (Thymocyte Expressed, Positive Selection Associated 1)
    ２３． PALD1 (Phosphatase Domain Containing Paladin 1)
    ２４． KRTAP12-1 (keratin associated protein 12-1)
    ２５． MBD1 (methyl-CpG binding domain protein 1)
    ２６． MESDC2 (mesoderm development candidate 2)
    ２７． MUC5AC (mucin 5AC, oligomeric mucus/gel-forming)
    ２８． NOL12 (nucleolar protein 12)
    ２９． NRP1 (neuropilin 1)
    ３０． NUP153 (nucleoporin 153kDa)
    ３１． PATL2 (protein associated with topoisomerase II homolog 2 (yeast))
    ３２. PCBD1 (pterin-4 alpha-carbinolamine dehydratase/dimerization cofactor of hepatocyte nuclear factor 1 alpha)
    ３３． PPKRIR (protein-kinase, interferon-inducible double stranded RNA dependent inhibitor, repressor of (P58 repressor))
    ３４． RBM26 (RNA binding motif protein 26)
    ３５． RSBN1 (round spermatid basic protein 1)
    ３６． SCXA (scleraxis homolog A (mouse))
    ３７． SPINT3 (serine peptidase inhibitor, Kunitz type, 3)
    ３８． TATDN3 (TatD DNase domain containing 3)
    ３９． TBC1D3G (TBC1 domain family, member 3G)
    ４０． TSC22D1 (TSC22 domain family, member 1)
    ４１． UNC119B (unc-119 homolog B (C. elegans))
    ４２． WBP4 (WW domain binding protein 4 (formin binding protein 21))
    ４３． ZNF354A (zinc finger protein 354A)
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