CN111040960A - 植物乳杆菌lp33及其在制备用于促进铅排泄的产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了保藏编号为CCTCC NO：M 2019594的植物乳杆菌LP33(Lactobacillus plantarum LP33)以及该植物乳杆菌在制备促进铅排泄的保健品、食品和药品中的应用，本发明对开发功能保健制品、丰富发酵产品种类、建立乳酸菌菌种资源库具有重要的现实意义，同时也给铅中毒的预防带来了新的希望。
Description
技术领域
本发明涉及一株能促进铅排泄的植物乳杆菌及其在食品、保健品和药品中的 应用。
背景技术
铅(Pb)是一种自然界中广泛存在的人体所非必须的有毒重金属元素，能够 导致许多急性和慢性疾病。铅广泛应用于铅蓄电池的制造、电线外皮、铅管、化 学反应容器、颜料和杀虫剂等。全世界每年大约要消耗有几百万吨的铅，而这其 中只有不到25％会被回收利用，剩下的75％可通过废水，废气，废渣等进入环 境，产生污染，危害动植物及人体健康。大部分铅及其化合物通过呼吸道和消化 道感染，小部分通过皮肤感染，大约40％的铅是通过呼吸道吸收的。铅进入人体 内经吸收、转运和重新分布后，在不同的器官蓄积，致使铅负荷増加，最终 90％-95％的铅主要沉积在骨骼中，在骨骼中的半衰期可达25年，持续引发铅的 毒性，累及神经、造血、也血管、免疫、肝、肾、骨骼等多个系统，处于生长发 育期的儿童对铅暴露尤为敏感，且铅暴露造成的损伤无法完全修复。
铅在人体排出的途径主要有三条：其一是经肾脏随小便排出，约占排出总量 的60％。其二有30％的铅是通过胆汁分泌排入人肠腔,然后随大便排出。其三约 8％左右(存在于头发、指甲及牙齿中)的铅是通过头发、指甲及牙齿脱落而排出体 外的。MARCEL E.等人在1978通过放射性元素定位追踪法证明铅排泄主要通过 粪便和尿液，值得注意的是，他们还发现胆汁是肠道铅排泄的主要途径。肠肝循 环控制体内331种内源性物质(如BA和类固醇)和异生素(如重金属和药物) 的储存和重吸收。累积在肝脏中的Pb被释放到胆汁中并重新分泌到肠道中，在 肠道中大部分有毒金属被重新吸收并重新参与肠道循环，这将进一步加重铅暴露 造成的机体损伤。近年来，许多有趣的研究和综述讨论了益生菌在胆汁酸(BA) 代谢中的潜在作用。
乳酸菌中被认为是非致病性的、安全级的微生物，参与众多体内的代谢活动， 具有重要的益生特性。作为典型的革兰氏阳性菌，乳酸菌的细胞壁成分主要由肽 聚糖、磷壁酸、多糖和蛋白质组成。这些细胞壁的组分在与重金属结合过程中起 到关键性作用。肽聚糖和磷壁酸组成的致密的网状结构有利于吸附重金属离子。 乳酸菌细胞表面的蛋白质和多糖含有-COOH、-NH2、-SH和-OH等官能团， 能与重金属阳离子发生表面络合作用从而有效结合。乳酸菌作为食品安全级别的 益生菌，其吸附重金属的特性越来越受到关注。若在含重金属的食品中添加乳酸 菌作为重金属吸附剂将其移除，或作为膳食补充摄入体内，在肠道吸收重金属之 前抢先与之结合，通过粪便将重金属排出体外，可以抑制重金属对机体的毒性损 伤。此外，乳酸菌若是能阻断重金属的肝肠循环，减少重金属在组织的积累，促 进肠道铅的排泄，这将进一步减少重金属在体内的毒性损伤。因此，乳酸菌作为 重金属吸附剂具有重大潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够有效促进铅排泄的新的植物乳杆菌及其在制 备药品、食品、保健品等方面的应用。
本发明的再一目的是提供含有上述植物乳杆菌的铅离子吸附剂、药物组合 物、食品、保健品以及食品添加剂。
为实现以上目的，本发明提供如下技术方案：
本发明公开了一种植物乳杆菌LP33(Lactobacillus plantarum LP33)，保藏 编号为CCTCC NO：M 2019594。
本发明还公开了所述的植物乳杆菌LP33在制备用于促进铅排泄的药物中 的应用。
本发明还公开了所述的植物乳杆菌LP33在制备用于促进铅排泄的食品中 的应用。
本发明还公开了所述的植物乳杆菌LP33在制备用于促进铅排泄的保健品 中的应用。
本发明进一步公开了一种用于促进铅排泄的药物组合物，所述药物组合物 中含有保藏编号为CCTCC NO：M 2019594的药学有效剂量的植物乳杆菌LP33。
本发明进一步公开了一种用于促进铅排泄的食品，所述食品中含有保藏编 号为CCTCC NO：M 2019594的植物乳杆菌LP33。
本发明进一步公开了一种用于促进铅排泄的食品添加剂，所述食品添加剂 中含有保藏编号为CCTCC NO：M 2019594的植物乳杆菌LP33；
本发明进一步公开了一种用于促进铅排泄的保健品，所述保健品中含有保 藏编号为CCTCC NO：M 2019594的植物乳杆菌LP33。
本发明进一步公开了一种铅离子吸附剂，所述吸附剂中含有保藏编号为 CCTCCNO：M 2019594的植物乳杆菌LP33。
本发明根据卫生部2010年印发的《可用于食品的菌种名单》，从实验室菌种 库中选择37株菌株进行体外筛选。经过铅吸附实验、模人工胃液和胆盐耐受性 试验以及菌株抗氧化实验，经综合比较，植物乳杆菌LP33是最具有缓解铅毒性 损伤潜力的目的菌株，其在50mg/L铅离子溶液的铅离子清除率达55.63％，pH3.0 人工胃液中存活率为104.08％，在0.30％胆盐中生长率为20.86％，且该菌抗氧化 效果良好。经过扫描电镜发现该菌菌体表面能吸附铅离子；经透射电镜观察发现， 除了菌体表面能吸附铅离子外，还有部分铅离子进入菌体内。
本发明还考察了植物乳杆菌LP33对慢性铅暴露大鼠的铅排泄效果。结果发 现，经植物乳杆菌LP33处理可以使铅暴露大鼠的血铅显著降低，粪便铅含量显 著升高，肝组织和粪便中的总胆汁酸含量较模型组显著升高，可以上调回肠组织 中Fxr、Fgf15、Asbt、Ostα的mRNA表达,还可以上调肝组织中Cyp7a1、Cyp8b1、 Mrp2、Bsep的mRNA表达，下调肝组织中Shp、Ntcp、Fxr、Fgfr4的mRNA表达。 这些结果表明，口服植物乳杆菌LP33可通过下调Fxr-Fgf15轴诱导肝脏BA合成 并增加粪便BA排泄。这种调节可以反过来切断铅肠肝循环，增强粪便中铅的排 泄。因此，植物乳杆菌LP33可用于制备促进铅排泄的保健食品和药品。
本发明的有益效果在于：本发明提供了植物乳杆菌LP33在促进铅排泄的保 健品、食品和药品中的应用，不仅扩大了植物乳杆菌LP33的应用范围，提高了 其利用价值，而且给铅中毒的预防带来了新的希望。
保藏信息
保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国武汉，武汉大学；保藏日 期：2019年8月1日；保藏编号：CCTCC NO：M 2019594；分类命名：植物乳 杆菌LP33(Lactobacillusplantarum LP33)。
附图说明
图1为分离菌株菌落形态及革兰氏染结果。
图2在50mg/L(A)和500mg/L(B)铅离子浓度条件下测试菌株对铅离 子的吸附能力。
图3植物乳杆菌LP33的API 50CH反应结果。
图4植物乳杆菌LP33铅吸附的扫描电镜及能谱色散X光谱扫描结果。
图5植物乳杆菌LP33铅吸附的透射电镜扫描结果。
图6植物乳杆菌LP33对慢性铅暴露大鼠血液铅含量的影响。
图7植物乳杆菌LP33对慢性铅暴露大鼠粪便铅含量的作用。
图8植物乳杆菌LP33对慢性铅暴露老鼠肝组织及粪便中TBA含量的影响。
图9植物乳杆菌LP33对回肠组织(A)Fxr、Fgf15、Asbt、Ostα和肝组织 (B)Cyp7a1、Cyp8b1、Mrp2、Bsep、Shp、Ntcp、Fxr、Fgfr4的mRNA表达的 影响。
图10植物乳杆菌LP33促进铅排泄的机制图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明 的优选实施例进行详细的描述。
一、吸附铅离子的乳酸菌筛选及其吸附机制研究
1实验材料
根据卫生部颁发的《可用于食品的菌种名单》，本研究从西南大学食品科学 学院索化夷实验室菌种库中选择37株菌株进行后续实验。该菌种库的菌株是从 红原、青海、新疆等高原地区的传统发酵奶制品以及川渝地区传统的发酵蔬菜中 分离得到。
2实验方法
2.1乳酸菌的活化与培养
将实验室安瓿管保藏的菌株接种于MRS液体培养基中，并在37℃的恒 温培养箱中孵育18h后，以2％(v/v)的比例接种于MRS液体培养基中活化， 通过革兰氏染色进行形态学观察。菌株活化两代后再用于后续实验。
2.2 PCR扩增16S rDNA序列
采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的DNA。采用25μL反应体系进行 PCR扩增，反应结束后利用琼脂糖凝胶电泳进行检测。合格样品送华大基因科技 有限公司测序，测序结果通过NCBI中的BLAST程序进行同源性比对分析。
2.3菌株铅吸附能力测定
所有活化完成后的菌株在37℃条件下扩大培养18h后，通过8000×g 离心10min得到菌体，使用灭菌后的超纯水对离心得到的菌体清洗两次，再重 复上述离心过程进而得到乳酸菌菌体。称取一定量的乙酸铅，溶于超纯水中使溶 液铅离子的终浓度为50mg/L，并用0.22um滤头过滤除菌。将离心所得的菌体 重悬于上述铅溶液中使其中的乳酸菌浓度达到1g/L湿菌体重量。将上述得到 的菌悬液的pH值调整到6.0，在37℃条件下振荡孵育1h，之后通过8000 ×g离心10min，取得上清液使用原子吸收分光光度计测定其铅浓度。乳酸菌 对铅离子的吸附能力可以下述公式计算：
式中：
C0——初始溶液中的铅离子浓度
C1——菌株吸附后溶液中的铅离子浓度
依据50mg/L铅离子条件下菌株吸附能力的结果显示，从37株乳酸菌菌 株中挑选出铅离子吸附能力>50％的乳酸菌，将8株初筛菌株再次重悬于500 mg/L铅离子浓度条件下进行复筛，进一步评估其吸附能力。
2.4菌株对模拟胃肠液耐受能力测定
2.4.1测定菌株在pH 3.0人工胃液中存活率
分离菌株在37℃培养18h，于3000r/min、15min的条件下离心收集菌体， 用无菌生理盐水洗涤菌体后重悬为菌悬液。将所得菌悬液与人工胃液(0.2％NaCl、 0.35％胃蛋白酶1︰10000，用1mol/L的HCl调节pH至3.00)按体积比1︰9 混合，37℃培养3h后，采用平板涂布法分别测定0h、3h的活菌数，按式(1) 计算菌株在pH 3.00人工胃液中的存活率。
式中：
c——存活率，％；
m1——3h活菌数，CFU/mL；
m2——0h活菌数，CFU/mL。
2.4.2测定菌株在0.3％胆盐中生长效率
分离菌株在37℃培养18h，以2％的接种量分别接种于含0.00％、0.30％牛 胆盐的MRS-THIO培养基中，37℃培养24h后测定其生长率，以未接种菌液的 液体培养基作为空白对照，按照式(2)计算菌株在胆盐中的生长率。
式中：
c——生长率，％；
A0——空白对照OD600nm值；
A1——含0.00％胆盐培养基OD600nm值；
A2——含0.30％胆盐培养基OD600nm值。
2.5乳酸菌抗氧化能力的测定
选择铅离子率≥45％且在0.30％胆盐中生长率＞10％的具有良好性能的 菌株进行下一步的抗氧化能力测定。
2.5.1乳酸菌样品的制备
培养好的乳酸菌菌液8000×g离心20min，获得菌体，用PBS(pH＝7.2) 清洗两遍后重悬于PBS中，调整菌液浓度至OD600值为1.0，分别取两份5 mL菌悬液备用。其中一组作为完整细胞，另一组置于冰浴中超声破碎细胞(变 幅杆Φ6；超声开4s；超声关4s；功率46％)10min后，8000r/min、4℃离 心10min，取上清液于无菌离心管中，即为无细胞提取物。
2.5.2乳酸菌清除二苯基三硝基肼自由基能力的测定
参考文献的方法，分别取菌液上清和无细胞提取物1mL，加入0.2mmol/L DPPH-无水乙醇溶液1mL，充分混匀避光反应30min，6000r/min、4℃离心 10min,吸取上清液，置于517nm波长处测定吸光值。以PBS溶液代替待检样 品溶液作为对照组，计算公式计算如下：
式中：
D—待测样品吸光度值；
D0—空白对照吸光度值。
2.5.3乳酸菌清除羟基自由基能力的测定
根据文献，将菌液上清和无细胞培养物分别于2.5mmol/L 1，10-菲啰啉溶 液、无菌PBS溶液(pH＝7.4)各1mL均匀混合，再加入2.5mmol/L Fe2SO4溶 液1mL，充分混匀后加入1mL 20mmol/L H2O2溶液，放入37℃水浴中作用1 h。水浴完毕，8000r/min离心10min，吸取上清，置于536nm波长处测定吸 光值。以PBS溶液替代待测样品溶液作为空白对照，以PBS溶液替代H2O2溶液作为阴性对照，计算公式如下：
式中：
H—待测样品吸光度值；
H0代表空白对照吸光度值；
H1代表阴性对照吸光度值。
2.5.4乳酸菌还原能力的测定
取0.5mL待测样品，加入0.5mL PBS缓冲溶液(0.2mol/L、pH＝6.6)， 0.5mL铁氰化钾(质量分数1％)，混匀后置于50℃恒温水浴锅中水浴20min， 置于冰水中冷却。再加入0.5mL三氯乙酸(质量分数10％)，4000rpm离心 10min，取1mL上清液，加入1mL蒸馏水，1mL三氯化铁(质量分数0.1％)， 混匀，反应10min后，测定700nm波长下其吸光值；用PBS代替待测样品 作为空白对照。
式中：
AS—待测样品吸光度值；
A0—空白对照吸光度值。
根据上述结果，筛选出具有优良的吸附铅能力、模拟胃肠液耐受能力、体外 抗氧化能力的乳酸菌，进行后续试验。
2.6 API试剂盒鉴定
分离菌株在37℃培养18h，于3000r/min、15min的条件下离心收集菌体， 用无菌生理盐水洗涤菌体后重悬为菌悬液。参考API试剂盒说明书进行操作。
2.7植物乳杆菌LP33对铅离子吸附前后的扫描电镜观察和能谱扫描
按照2.3中方法进行LP33吸附铅离子的实验，将离心所得的菌体于2.5％ 的戊二醛溶液4℃固定过夜，固定完成后，用0.1M，pH 7.0的磷酸缓冲液漂 洗样品三次，每次15min；用1％的锇酸溶液固定样品1-2h；小心取出锇酸废 液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；用梯度浓度(包 括30％，50％，70％，80％，90％和95％五种浓度)的乙醇溶液对样品进行脱水 处理，每种浓度处理15min，再用100％的乙醇处理两次，每次20min。用乙醇 与醋酸异戊酯的混合液(V/V＝1/1)处理样品30min，再用纯醋酸异戊酯处理样 品1h或放置过夜。临界点干燥。镀膜，观察。处理好的样品在型扫描电镜中观 察。
除不需要进行铅离子吸附实验外，空白对照的样品制备亦按照上述方法进行。 使用扫描电子显微镜(SEM)观察样品中菌体细胞形态的变化，并用与之相连的 能谱色散光谱仪(EDX)分析元素的组成。
2.8植物乳杆菌LP33对铅离子吸附前后的透射电镜样品观察
按照2.3中方法进行LP33吸附铅离子的实验，将离心所得的菌体于2.5％ 的戊二醛溶液4℃固定过夜，固定完成后，倒掉固定液，用0.1M，pH 7.0的 磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；用1％的锇酸溶液固定样品1-2h；小 心取出锇酸废液，用0.1M，pH 7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min； 用梯度浓度(包括30％，50％，70％，80％，90％和95％五种浓度)的乙醇溶液 对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100％的乙醇处理20min； 最后过度到纯丙酮处理20min。用包埋剂与丙酮的混合液(V/V＝1/1)处理样品 1h；用包埋剂与丙酮的混合液(V/V＝3/1)处理样品3h；纯包埋剂处理样品过 夜；将经过渗透处理的样品包埋起来，70℃加热过夜，即得到包埋好的样品。样 品在超薄切片机中切片，获得70-90nm的切片，切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双 氧铀50％乙醇饱和溶液各染色5-10min，即可在透射电镜中观察
除不需要进行铅离子吸附实验外，空白对照的样品制备亦按照上述方法进行。 使用透射电子显微镜(SEM)观察样品中菌体细胞形态的变化
2.9统计分析
每个试验做3次平行试验，试验数据以“平均值±标准方差”表示，用SPSS20 进行方差分析，以P＜0.05表示有统计学意义。
3结果与分析
3.1菌株的菌落形态和细胞形态
37株菌株活化后在MRS培养基中形成单菌落，菌落形态几乎一致，大多数呈 圆形，白色，表面光滑湿润。革兰氏染色后在显微镜下观察到紫色细胞形态，判 定为革兰氏阳性菌(G+)。其中，编号为33的菌株的菌落形态和革兰氏染色结果 见图1。
3.2菌株16S rDNA序列PCR扩增结果
编号为33的菌株的PCR扩增序列经NCBI中Blast比对鉴定其为植物乳杆 菌。
3.3乳酸菌对铅离子的吸附能力
当筛选能够缓解铅毒性的乳酸菌时，首先应该考虑该乳酸菌应该具有很强的 铅离子吸附能力，这样该乳酸菌就可以在铅离子进入宿主肠道被吸收之前，将铅 离子抢先吸附后随粪便排出体外，从而降低肠道对铅离子的吸收，进而降低铅离 子在宿主各个器官的蓄积。37株实验乳酸菌对铅离子的吸附能力以对铅离子吸 附率(％)表示。如图2A所示，当铅离子浓度为50mg/L时，不同菌株的吸附 铅离子的能力存在较大的差异(从16.93％到55.63％)。在此条件下，选取吸附 率大于50％的菌株进行复筛实验，它们分别是：发酵乳杆菌1，5，6，12以及植 物乳杆菌7，26，30，33。结果表明，当铅离子初始浓度提高到500mg/L时，这8株乳酸菌的铝离子吸附能力普遍降低(图2B)，但植物乳杆菌LP33仍然 表现出最强的铅离子吸附能力(26.83％)。
3.4乳酸菌对模拟胃肠液的耐受能力
人体胃肠液的主要功能之一是承担人体食物的消解及营养物质的吸收，其次， 其含有的大量酶和胆汁盐可破坏细胞膜结构，是阻止微生物进入胃肠道的第一道 屏障。因此，理想的功能菌株应该具有良好的耐酸耐胆盐特性，可以保证其顺利 通过胃酸环境到达肠道并在肠道中继续保持活性。本研究根据正常人体生理环境 下胃液和肠液的pH值和胆汁盐浓度，以及食物在胃和肠道内的停留时间，选 择pH3.0的人工胃液和0.3％的胆盐浓度来测试乳酸菌的耐受能力，从而筛选 出具有较好耐受性的菌株。研究结果表明，菌33表现出良好的胆盐胃酸抗性， 其在人工胃液的存活率达到104.08％，在0.30％胆盐生长率达到20.86％，菌2在 人工胃液的存活率有78.69％，而在0.30％胆盐生长率仅有5.56％。
3.5乳酸菌的抗氧化能力
3.5.1乳酸菌清除DPPH自由基的能力
DPPH是一种稳定的以氮为中心的人工合成自由基，自由基淬灭剂或抗氧化 剂与其反应时，溶液会由深紫色向浅黄色或无色转变，因此可以通过测定517nm 吸光度值的变化来定量检测样品中自由基清除情况，进而评价待测样品的清除自 由基能力。菌33完整细胞悬液对DPPH的清除率高达23.20％要高于无细胞提 取液。对于无细胞提取液，菌33表现出最高的DPPH清除率(13.63％)。
3.5.2乳酸菌清除羟基自由基的能力
羟基自由基(·OH)是一种具有强氧化性的ROS，可破坏生物细胞膜的通 透性，并导致DNA的氧化损伤，破坏细胞的正常功能。因此羟自由基清除能力 是评价乳酸菌抗氧化活性的重要指标。菌33完整细胞悬液表现出最强的羟自由 基清除率(30.81％)，对于无细胞提取液，菌33的清除率高于25％，显著高于 其他菌株(P﹤0.05)。
3.5.3乳酸菌的还原能力
还原能力主要指一些氧化还原反应的酶类物质和一些具有抗氧化能力的非 酶类化合物不仅具有抑制ROS的产生，而且可以控制Fe2+等过渡金属离子的 反应，从而有效防止氧化反应的产生，这种能力被称为还原能力。因此还原能力 也常常被选择作为评价菌株抗氧化能力的指标。菌33的还原能力最强，不论是 完整细胞悬液还是无细胞提取液的还原能力均在90％以上，都显著优于其他菌株 (P﹤0.05)。
3.6最佳抗性菌株的生化特性鉴定结果
综合比较铅吸附能力、人工胃液和胆盐耐受性、菌株抗氧化评价结果，编号 为33的菌株为最佳抗性菌株。乳酸杆菌种水平的表型鉴定主要依据碳水化合物 发酵试验。API50CH试剂盒是通过菌株对49种不同碳水化合物的利用情况来进 行鉴定。
图3示出了编号为33的菌株的API 50CH反应结果。表1示出了编号为33 的菌株对49种碳水化合物发酵试验结果。由图3和表1可知，在供试的49种碳 源中，编号为33的菌株可以利用其中25种碳水化合物。经API lab plus系统最 终鉴定，编号为33的菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，其ID值为 95.00％，T值为0.36。其ID值未达到99.0％以上，提示该菌株是植物乳杆菌新 变种。
表1菌33对49种碳水化合物发酵试验结果
3.7 LP33铅吸附的电镜观察和能谱扫描
扫描电镜结果如图2所示，相较于正常的空白对照菌体(图4A)，铅离子 吸附试验后菌体表面出现了一些新的不规则颗粒，部分颗粒出现了聚集现象。同 时，我们也发现有菌体破裂的情况发生。采用能量色散X射线光谱(EDX)对 铅离子吸附前后部分区域进行光谱扫描，结果显示，铅离子暴露组的菌体扫描光 谱比空白对照组的铅元素峰(图4C和D)明显升高。如表2所示，在元素原 子百分比上，铅离子暴露组的铅元素占比达到0.18％，而空白对照组的铅元素占 比仅为0.03％。此结果进一步验证了植物乳杆菌LP33菌体对铅离子的吸附作用。
表2 EDX扫描铅吸附前后菌体的元素原子百分比
透射电镜结果如图3所示，吸附完成后，菌体外围出现了明显的沉积物，并 在原生质体内部发现了部分沉积物(图5B)；而在空白对照组的菌体周围却并 未出现相似的沉积物(图5A)。此结果与扫描电镜结果一致。
二、植物乳杆菌能促进铅中毒大鼠铅排泄
1实验材料
菌株：Lactobacillus plantarum LP33(LP33)保藏于中国典型培养物保藏中 心(保藏编号：M 2018592)和西南大学食品科学学院学院(保藏编号：33)。 Lactobacillusfermentum 2(LF2)保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(保 藏编号：16637)西南大学食品科学学院学院(保藏编号：2)。
实验动物：4-6周龄雄性SD大鼠40只，购买自重庆医科大学实验动物中 心，许可证号为：SCXK(渝)2018-0003。
2实验方法
2.1实验动物分组及处理
表3动物实验设计方案
注：普通水：无铅的普通饮用水，供大鼠自由饮用；铅水：将三水乙酸铅溶于饮用水中 使其浓度达500mg/l，供小鼠自由饮用；LP33、LF2：菌悬液浓度为1×109CFU/ml，灌 胃剂量根据每100g体重灌胃0.1ml确定；生理盐水：灌胃剂量根据每100g体重灌胃1 ml确定。实验持续8周。
如表3所示，将40只SD大鼠随机分成正常组(control)、模型组(Pb only)、 菌33组(Pb+LP33)、菌2组(Pb+LF2)4组，每组10只，适应性喂养一周 后开始实验，实验周期为8周。每周定时单独收集每只大鼠的粪便。
2.2样本采集与保存
在8周实验结束后，大鼠禁食禁水18h后称取体重，乙醚迷晕后眼球取血。 其中取2ml全血用于检测血铅，将其装入肝素钠管，颠倒混匀，待测。剩余的 血液于4℃，3000r/min，10min的条件下离心收集血清，放置-80℃保存备用。 取血后脱颈椎处死大鼠，并迅速解剖取出大鼠肝以及回肠组织，做好标记于-80℃ 保存备用。
2.3粪便及血液中的铅含量测定
将粪便与血液样品转移至用20％硝酸浸泡过夜的锥形瓶中，加入10ml浓 硝酸，放置过夜后置于可调式电热板上消解，直至消化液呈无色透明或略带淡黄 色。冷却后用定容，使用火焰原子吸收分光光度计测定样品中铅的含量。
2.4粪便及肝组织的总胆汁酸(TBA)含量测定
按照TBA试剂盒说明书对粪便及肝组织的TBA进行测定。
2.5 qRT-PCR测定组织中相关基因的mRNA表达
按照Trizol说明书提取回肠和肝脏的总RNA；然后取1μL的RNA样品1μL， 加入1μL(oligo)primer dT和10μL无菌超纯水，混合物于65℃反应5min，反 应完成后，在反应体系中加入1μL Ribolock RNase Inhibitor、2μL 100mM dNTP mix、4μL 5×Reaction buffer和1μL Revert Aid M-mu/v RT，混合均匀后，在42℃、60min和70℃、5min条件下合成cDNA；用超微量分光光度计测定cDNA的纯 度和浓度，将每个样本的cDNA浓度调整到同一水平(1μg/μL)。接着以表7 所述引物序列对目标基因进行反转录和扩增，反应条件为：95℃预变性10min； 95℃、15s，60℃、1min，72℃、30s共40个循环；最后以GAPDH作为内参 基因，通过2-ΔΔCT计算目的基因的相对表达量。
表4引物序列
2.6数据分析
采用spss 17.0中的one-wayANOVA对数据进行显著性分析(p<0.05)，最 终结果表示为平均值±标准偏差(x±s)。文中所用图是由Graphpad软件制作 所得。
3实验结果与分析
3.1植物乳杆菌LP33对铅暴露老鼠血液及粪便中铅含量的影响
大鼠血液铅含量如图6所示。铅暴露组铅含量远远高于对照组，Pb+LP33 和Pb+LF2组的血液铅含量较模型组显著降低且Pb+LP33组的铅含量显著低于 Pb+LF2组(P<0.05)。研究结果表明植物乳杆菌LP33能显著降低慢性铅暴露老 鼠血液中的铅含量(P<0.05)。
大鼠粪便中铅含量在整个实验周期的变化如图7所示。正常组整个周期的的 粪便中几乎不含铅。而在其他三组老鼠中，当铅暴露时，粪便中铅离子含量显著 增加。与铅暴露组相比，植物乳杆菌LP33显著提高每个时间点的粪便铅含量， 且发酵乳杆菌2的铅排泄效果显著低于植物乳杆菌LP33。研究发现，植物乳杆 菌能显著降低慢性铅暴露老鼠每周粪便中的铅含量，且铅排泄效果明显好于发酵 乳杆菌2。
3.2植物乳杆菌LP33对铅暴露老鼠肝组织及粪便中TBA含量的影响
胆汁酸(BA)是胆汁的主要成分，它作为消化液能促进脂类的消化和吸收， 还能作为排泄液将体内的如胆固醇等的代谢产物通过肝脏的生物转化变成非营 养物质排入肠腔随粪便排出体外。一些研究已经证明了BA在刺激铅排泄中的潜 在作用机制，二羟基胆汁盐的小聚集体与二价重金属离子(例如Pb2+和Cd2+) 离子反应并形成微溶的络合物。
如图8所示，灌胃植物乳杆菌LP33后，慢性铅暴露老鼠的肝组织和粪便中 的BA含量较模型组均有显著性提高(P<0.05)。而发酵乳杆菌2组的肝组织和 粪便中的BA含量较模型组虽略有上升，但并没有显著性差异。这说明，植物乳 杆菌LP33能促进胆汁酸的合成和排泄，且效果优于菌2。
3.3植物乳杆菌LP33对铅暴露老鼠肝组织中mRNA表达的影响
BA的肠肝循环在宿主的脂质代谢，葡萄糖稳态，肝胆汁形成和肠功能中起 重要作用。它还调节重金属(如铅，镉和汞)的储存和再利用，因为它们通过胆 汁从肝脏释放到肠腔，再从肠腔被重新吸收并重新运输到肝脏。据报道，FXR -FGF15轴在BA稳态中起重要作用。BA可以激活FXR，进一步有机溶质转运 蛋白(Ostα)的表达，这与回肠中BA的细胞基底外侧分泌有关。FXR激活也 上调回肠Fgf15的表达，其反过来向肝脏发出信号以抑制限速酶如7α-羟化酶 (Cyp7a1)和甾醇-12α-羟化酶(Cyp8b1)的表达，从而抑制肝脏BA合成。
口服植物乳杆菌LP33诱导的Ostα和顶端钠胆汁酸转运蛋白(Asbt)的回 肠mRNA表达水平显著低于模型组(P<0.05)(图9A)。此外，植物乳杆菌LP33 处理显著增加肝脏中Cyp7a1、Cyp8b1、胆汁盐输出泵(Bsep)和多药物抗性相 关蛋白2(Mrp2)mRNA的表达，而显著降低肝脏小异二聚体伴侣(Shp)和牛 磺胆酸钠协同转运多肽(Ntcp)表达(P<0.05，图9B)。植物乳杆菌LP33诱导Pb排泄的作用部分依赖于肠肝Fxr-Fgf15轴。在口服施用植物乳杆菌LP33后， 显著抑制成纤维细胞生长因子15(Fgf15)和法尼醇X受体(Fxr)的回肠mRNA 表达(P<0.05，图9A)，还显著抑制肝脏组织中Fxr和成纤维细胞生长因子受 体4(Fgfr4)的mRNA表达(P<0.05，图9B)。
总之，这些结果表明，口服植物乳杆菌LP33可通过下调Fxr-Fgf15轴诱导 肝脏BA合成并增加粪便BA排泄。这种调节可以反过来切断铅肠肝循环，增强 粪便中铅的排泄，具体机制见图10。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通 过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员 应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利 要求书所限定的本发明的精神和范围。
序列表
<110> 西南大学
<120> 植物乳杆菌LP33及其在制备用于促进铅排泄的产品中的应用
<130> 1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1384
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌33(Lactobacillus plantarum LP33)
<400> 1
tgattggtgc ttgcatcatg atttacattt gagtgagtgg cgaactggtg agtaacacgt 60
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ttgcgaactc gcgagagtaa gctaatctct taaagccatt ctcagttcgg attgtaggct 1260
gcaactcgcc tacatgaagt cggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa 1320
tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg agagtttgta acacccaaag 1380
tcgg 1384
Claims (9)
1.一种植物乳杆菌LP33(Lactobacillus plantarum LP33)，其保藏编号为CCTCC NO：M2019594。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌LP33在制备用于促进铅排泄的药物中的应用。
3.权利要求1所述的植物乳杆菌LP33在制备用于促进铅排泄的食品中的应用。
4.权利要求1所述的植物乳杆菌LP33在制备用于促进铅排泄的保健品中的应用。
5.一种用于促进铅排泄的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物中含有保藏编号为CCTCC NO：M 2019594的药学有效剂量的植物乳杆菌LP33。
6.一种用于促进铅排泄的食品，其特征在于：所述食品中含有保藏编号为CCTCC NO：M2019594的植物乳杆菌LP33。
7.一种用于促进铅排泄的食品添加剂，其特征在于：所述食品添加剂中含有保藏编号为CCTCC NO：M 2019594的植物乳杆菌LP33。
8.一种用于促进铅排泄的保健品，其特征在于：所述保健品中含有保藏编号为CCTCCNO：M 2019594的植物乳杆菌LP33。
9.一种铅离子吸附剂，其特征在于：所述吸附剂中含有保藏编号为CCTCC NO：M2019594的植物乳杆菌LP33。
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