JP2023505400A

JP2023505400A - ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＬＦ－ＳＣＨＹ３４とその応用

Info

Publication number: JP2023505400A
Application number: JP2021550088A
Authority: JP
Inventors: 欣趙; 興瑶龍
Original assignee: Chongqing University of Education
Current assignee: Chongqing University of Education
Priority date: 2021-01-29
Filing date: 2021-02-02
Publication date: 2023-02-09
Also published as: WO2022160360A1; KR20220110663A; KR102567035B1; CN112708583B; CN112708583A

Abstract

本発明は、ラクトバチルス・ファーメンタムＬＦ－ＳＣＨＹ３４とその応用を開示している。前記ラクトバチルス・ファーメンタムＬＦ－ＳＣＨＹ３４は、中国一般微生物菌株収集管理センターに保存されており、保存番号がＣＧＭＣＣ第１４９５７号で、微生物技術の分野に属している。ラクトバチルス・ファーメンタムＬＦ－ＳＣＨＹ３４は、体内および体外の鉛イオンを吸着し、血中および臓器中の鉛のレベルを低下させ、肝臓、腎臓および脳組織を保護することができる。また、ラクトバチルス・ファーメンタムＬＦ－ＳＣＨＹ３４は、フリーラジカルを消去し、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２／ＡＲＥシグナル伝達経路を活性化して、より多くの抗酸化物質を分泌することができ、鉛による体内の酸化損傷をよりよく緩和することができる。したがって、ラクトバチルス・ファーメンタムＬＦ－ＳＣＨＹ３４は、強い鉛吸着能力と抗酸化能力を持つ優れた菌株であり、人体に鉛イオンによる酸化ストレスや、他の重金属の毒性を緩和するための大きな可能性と研究価値があると考えられる。

Description

本発明は、微生物学の技術分野に関し、特にラクトバチルス・ファーメンタムＬＦ－ＳＣＨＹ３４とその応用に関するものである。

重金属は食物連鎖を通じて濃縮され、生物分解されず、より毒性の高い有機金属化合物に変化する可能性がある。近年、重金属汚染は広く注目されている。重金属鉛は、親和性と蓄積性がある重金属で、その毒性は高い。工業化の加速に伴い、印刷、塗料、セラミックス、合金、ガソリンなどの産業で広く使用されている鉛は、分解されにくく、強い毒性を持つため、最も深刻な一般汚染物質の一つとなっている。鉛は、主に食事と呼吸の２つの経路で人体に摂取され、体内に一定量まで蓄積されると、脳や神経組織を損傷したり、腎臓や肝臓に蓄積されて、急性または慢性の腎疾患や肝疾患を引き起こし、最終的には体内の多くの器官に全身損傷をもたらす。現在、重金属中毒の治療にはキレート剤が使用されているが、この治療法は体に損傷を与える可能性があり、また、解毒が不完全であるという欠点がある。

酸化的損傷は、鉛がその毒性を発揮する重要な作用のメカニズムの一つと考えられている。数多くの研究により、鉛は細胞の酸化還元状態に変化をもたらし、酸化ストレスを引き起こすから活性酸素（ＲＯＳ）や活性窒素（ＲＮＳ）が過剰に生成されると、抗酸化酵素の活性低下を招き、組織や細胞内でのフリーラジカルの生成を促進することが明らかになっている。フリーラジカルによる損傷に対応する時に、体内では複雑な酸化ストレス応答システムが形成され、体自体も一連の保護タンパク質を誘導して細胞への損傷を軽減しているのである。核因子Ｅ２関連因子２（Ｎｒｆ２）は、酸化ストレスのエクスプレッションに重要な転写因子であり、多数のＲＯＳやＲＮＳを介して細胞の損傷に対応している。生理的状態では、ほとんどのＮｒｆ２はＫｅａｐ１と結合しており、ユビキチンを介したタンパク質分解システムによって細胞質内のＮｒｆ２の不活性な基礎レベルを維持している。体内が酸化ストレスによって刺激されると、ＭＡＰＫやホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩＫ３）などのプロテインキナーゼがＮｒｆ２を直接リン酸化し、Ｋｅａｐ１ーＮｒｆ２の結合体が解けて、Ｎｒｆ２が活性化し、集積して核内に移動し、Ｍａｆと結合してヘテロ二量体を形成し、下流の抗酸化オリジナルであるＡＲＥを認識して結合する。ＡＲＥは、体の酸化ストレス応答システムによって分泌される保護タンパク質の遺伝子の上流に位置している。Ｎｒｆ２はＡＲＥの活性化因子である。Ｎｒｆ２をＡＲＥと組み合わせると、下流の保護抗酸化遺伝子のエクスプレッションを仲介しスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、キノンオキシドレダクターゼ１（ＮＱＯ１）、ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ－１）、γ－グルタミルシステインシンテターゼ（γ－ＧＣＳ）のような保護タンパク質を生成する。これらはすべて細胞の酸化的損傷の面で重要な抑制効果を果たし、酸化的損傷に対する体内の最初の防御線として使用される。Ｎｒｆ２－ＡＲＥ経路は、これまでに発見された最も重要な内因性抗酸化ストレス経路である。

乳酸菌は、発酵可能な糖（炭水化物）を利用して多量の乳酸を産生するナンスポリング（ｎｏｎ－ｓｐｏｒｉｎｇ）、グラム（ｇｒａｍ）染色陽性菌群の総称で、体内の腸内フローラの改善、消化管運動の促進、消化性の向上、腐敗菌の増殖抑制などの効果がある。また、乳酸菌には、免疫力を高める、抗酸化作用、老化を遅らせるなどの機能もある。伝統的な発酵キムチは、主に野菜そのものの乳酸菌を使って発酵させるので、出来上がったキムチには様々な種類の乳酸菌が含まれている。研究の結果、中国のキムチに含まれる発酵菌はラクトバチルスを主として、例えばラクトバチルス・プラント・アルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ペントサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・サケ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）とラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）であることがわかる。発酵食品に含まれる乳酸菌は、食品中の亜硝酸塩を分解するだけでなく、コレステロール低下作用、抗酸化作用、腸の健康を調節する作用など、さまざまな効果を発揮する。

乳酸菌の継続的な研究により、いくつかの乳酸菌が重金属に対して良好な抵抗性と吸着性を持つことがわかってきた。乳酸菌が鉛の毒性を緩和する役割も、２つに分けられる。１つ目は、乳酸菌が重金属を吸着する優れた能力を持っていること。２つ目は、乳酸菌がフリーラジカルによる損傷に対抗するために体内で抗酸化的な役割を果たすことである。バイオレメディエーションを利用し重金属中毒を修復するのは多くの利点がある。例えば、原料の種類が豊富で、低コスト、操作が簡単、環境保護など、それに二次的な危険性を生じない。しかし、乳酸菌をバイオ吸着剤として使用することは、現在の研究ではまだ比較的少ない。主な理由は、ほとんどの乳酸菌は吸着効果が低く、吸着能力の高い乳酸菌は食品製造に使用することが困難であるため、食品に使用でき、重金属鉛イオンに対して良好な吸着能力を持つ乳酸菌の菌株を探すことが、現在盛んに行われている研究である。

本発明の目的は、上記のような先行技術の問題点を解決するための、ラクトバチルス・ファーメンタムＬＦ－ＳＣＨＹ３４とその応用例を提供することである。

上記の目的を達成するために、本発明は以下の解決策を提供する：本発明は、ラクトバチルス・ファーメンタムを提供し、前記ラクトバチルス・ファーメンタムはＬＦ－ＳＣＨＹ３４と命名され、中国一般微生物菌株収集管理センターに保存され、保存番号ＣＧＭＣＣ第１８７９５号である。

また、本発明は、前記ラクトバチルス・ファーメンタムＬＦ－ＳＣＨＹ３４が重金属中毒の治療または予防のための製品の調製における応用を提供する。

さらに、重金属中毒の治療または予防のための前記製品は、重金属を吸着するために使用される。

本発明はさらに、重金属中毒に起因する病症の治療または予防のための製品の調製における、前記ラクトバチルス・ファーメンタムＬＦ－ＳＣＨＹ３４の応用を提供する。

さらに、重金属中毒による前記症状は、肝臓損傷、腎臓損傷または脳組織損傷である。

さらに、前記重金属は重金属鉛であり、前記ラクトバチルス・ファーメンタムの有効量は１回あたり１０^９ＣＦＵである。

本発明はまた、酸化的損傷の治療または予防のための製品の調製における、前記ラクトバチルス・ファーメンタムに従った応用を提供する。

さらに、前記ラクトバチルス・ファーメンタムの有効量は１回あたり１０^９ＣＦＵである。

本発明は、以下の技術的効果を開示している：（１）本発明で開示されたラクトバチルス・ファーメンタムＬＦ－ＳＣＨＹ３４による鉛イオンの吸着は、生体吸着と蓄積の両方を含み、高品質の鉛吸着乳酸菌である。（２）本発明で開示されたラクトバチルス・ファーメンタムＬＦ－ＳＣＨＹ３４は、体外および体内の抗酸化能力が高く、より優れた接着能力を持ち、人体の腸内でより良くコロニー化してプロバイオティクスを果たすことができる。（３）ラクトバチルス・ファーメンタムＬＦ－ＳＣＨＹ３４は、鉛イオンによるＳＤラットの肝臓と腎臓の損傷を緩和し、肝臓と腎臓の炎症の発生を抑え、肝臓と腎臓の細胞の完全性を保護することができる。（４）ラクトバチルス・ファーメンタムＬＦ－ＳＣＨＹ３４は、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２／ＡＲＥシグナル経路の反応を増強し、より多くの下流遺伝子が抗酸化能力を持つことをエクスプレスするＨＯ－１を刺激し、ＮＱＯ１、γ－ＧＣＳを生成し、ＳＤラットの鉛による酸化ストレスをより緩和することができる。

本発明の実施例または先行技術の技術的解決策をより明確に説明するために、以下に、実施例に必要な図面を簡単に紹介する。明らかに、以下の説明の図面は、本発明の一部実施例にすぎない。当業者にとって、創造的な労力なしで、これらの図面に基づいて他の図面を得ることができる。
鉛イオンの吸着前後のＬＦ－ＳＣＨＹ３４乳酸菌の走査型電子顕微鏡および透過型電子顕微鏡画像である。ａは吸着前のＬＦ－ＳＣＨＹ３４の走査型電子顕微鏡画像、ｂは吸着前のＬＦ－ＳＣＨＹ３４透過型電子顕微鏡画像で、ｃは吸着後のＬＦ－ＳＣＨＹ３４の走査型電子顕微鏡画像、ｄは吸着後のＬＦ－ＳＣＨＹ３４の透過型電子顕微鏡画像である。鉛イオン吸着前後のＬＦ－ＳＣＨＹ３４乳酸菌のエネルギースペクトル検出形状と走査エネルギースペクトルを示した画像で、ａは吸着前のＬＦ－ＳＣＨＹ３４のエネルギースペクトル検出形状画像、ｂは吸着前のＬＦ－ＳＣＨＹ３４の走査エネルギースペクトル画像、ｃは吸着後のＬＦ－ＳＣＨＹ３４のエネルギースペクトル検出形状画像、ｄは吸着後のＬＦ－ＳＣＨＹ３４の走査エネルギースペクトル画像である。ＳＤラットの肝臓の切片で、ａは正常群、ｂは鉛誘導群、ｃはＥＤＴＡ群、ｄはＬＦ－ＳＣＨＹ３４群である。ＳＤラットの腎臓の切片で、ａは正常群、ｂは鉛誘導群、ｃはＥＤＴＡ群、ｄはＬＦ－ＳＣＨＹ３４群である。

以下、本発明の実施例における技術的解決策を、本発明の実施例における添付図面と併せて明確かつ完全に説明するが、説明された実施例は、本発明の実施例の一部に過ぎず、その全てではないことは明らかである。本発明の実施例に基づいて、当業者が創造的な労働力を用いずに得た他のすべての実施例は、本発明の保護範囲に入る。

本発明の上述の目的、特徴、および利点をより明白かつ理解しやすくするために、添付の図面および具体的な実施例と併せて、以下に本発明をさらに詳細に説明する。

乳酸菌の分離と識別：重慶のキムチから乳酸菌１株を分離し、抽出したＤＮＡをＰＣＲ増幅し、上流側プライマー２７Ｆ（５’－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３’）１μＬ、下流側プライマー１４９５Ｒ（５’－ＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡ－３’）１μＬ、２×ＴａｑｐｌｕｓＢｕｆｆｅｒ１２．５μＬ、テンプレートＤＮＡ１μＬで、滅菌したｄｄＨ２Ｏを用いてシステムをｗｐ２５μＬまで補充し、テンプレートＤＮＡの代わりに滅菌した超純水をネガティブコントロールとして使用した。増幅条件は、９４℃×５分間、９４℃×３０秒ｓ、５５℃×３０ｓ、７２℃×１分間、共に２９サイクル、最終は７２℃で５分間とし伸長した。増幅産物５μＬをアガロースゲル電気泳動検測を行い、アガロース濃度が１．５％で、電気泳動条件は１１０Ｖ、４５分間である。検測で成功したＰＣＲ産物を北京キングテック・バイオテクノロジー社にシーケンスを行い、１６ＳｒＤＮＡ配列をＳＥＱＩＤＮＯ：１に示すように配列決定し、配列決定に成功した配列をＮＣＢＩでＢＬＡＳＴ比較をしたところ、記載された乳酸菌は乳酸桿菌科、ラクトバシラス属で、９９．９％の類似性を持ち、ＬＦ－ＳＣＨＹ３４と命名され、令和一年１１月４日に中国総合微生物種保存管理センター（ＣＧＭＣＣ、北京）に保存されており、保存番号はＣＧＭＣＣＮｏ．１８７９５である。

実施例１ラクトバチルス・ファーメンタムＬＦ－ＳＣＨＹ３４の体外性能テスト試験
１．１人工胃液中のラクトバチルス・ファーメンタムＬＦ－ＳＣＨＹ３４の生存率の測定
この人工胃液が０．２％のＮａＣｌ、０．３５％ペプシンからなった。１ｍｏｌ／ＬＨＣｌでｐＨを３．０に調整した後、０．２２μｍの滅菌フィルターでろ過して滅菌した。５ｍｌのＭＲＳ液体培地に入れて２回活性化したＬＰ－ＫＦＹ０４を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体を回収した。滅菌生理食塩水で２回洗浄し、５ｍＬの生理食塩水に入れた。この菌液と滅菌した人工胃液を１：１（ｖ／ｖ）で混合し、よく振って３７℃の恒温器で培養し、それぞれ０ｈと３ｈに生菌の数を測定し、式（１）に従って人工胃液中のＬＦ－ＳＣＨＹ３４の生存率を算出した。

１．２胆汁酸塩中でのラクトバチルス・ファーメンタムＬＦ－ＳＣＨＹ３４の成長効率の測定
２％（ｖ／ｖ）接種物で２回活性化したＬＰ－ＫＦＹ０４を０．０％および０．３％のブタ胆汁酸塩を含むＭＲＳ－ＴＨＩＯ培地に接種し（ＭＲＳ培地には０．２％チオグリコレートナトリウムを添加し、１２１℃で１５分間滅菌）、３７℃の恒温振とう機で２４時間、ブランク培地（未接種ＭＲＳ－ＴＨＩＯ培地）を対照し、ブランク培地と接種した培地を９６ウェルプレートに加える。各穴は２００ｍｌで、波長が６００ｎｍのとことで吸光度を測定され、成長効率は式（２）に従って計算された。

１．３ラクトバチルス・ファーメンタムＬＦ－ＳＣＨＹ３４の体外の鉛イオン吸着能力試験
ラクトバチルス・ファーメンタムＳＣＨＹ３４の懸濁液を１５００ｘｇで１０分間遠心分離して菌体を収集し、生理食塩水で２回洗浄した後、遠心分離して菌体を収集した。バクテリアをｐＨ６．３の５０ｍｇ／Ｌ硝酸鉛溶液に加え、バクテリアの最終濃度は１ｇ／Ｌで、３７℃で２４時間培養し、８０００ｘｇで２０分間遠心分離して上澄みを収集し、火炎原子吸着法を使用して元の溶液の鉛イオン濃度Ｃ０、吸着後の鉛イオン濃度Ｃ１を測定し、式（３）に従って鉛イオン吸着率を計算した。

１．４ラクトバチルス・ファーメンタムＦ－ＳＣＨＹ３４の表面疎水性の測定
ラクトバチルス・ファーメンタムＳＣＨＹ３４の懸濁液を１５００ｘｇで１０分間遠心分離して菌体を収集し、生理食塩水で２回洗浄した後、遠心分離して菌体を収集した。波長５８０ｎｍでの吸光度が１．０００になるように生理食塩水で細胞濃度を調整した。細菌懸濁液の調整された吸光度２ｍｌを取り、２ｍｌのキシレンと混合し、１２０分間ボルテックスし、室温で３０分間置き、１ｍｌの上部水相を吸収し、生理食塩水をブランクコントロールとして、５８０ｎｍでの吸光度値Ａ０とサンプル吸光度値Ａ１を測定した。式（４）に従って乳酸菌の表面疎水性を計算した。

１．５ラクトバチルス・ファーメンタムＬＦ－ＳＣＨＹ３４の体外抗酸化力測定法
１．５．１ラクトバチルス・ファーメンタムＬＦ－ＳＣＨＹ３４の体外ヒドロキシルラジカルの消去能力の測定
ラクトバチルス・ファーメンタムＬＦ－ＳＣＨＹ３４を１０^９ｃｆｕ／ｍＬの懸濁液にして使用するサンプルとして用意した。試験管に１ｍＬの０．０５ｍｏｌ／ＬｐＨ７．４リン酸緩衝液と０．５ｍＬの６ｍｍｏｌ／Ｌｏ－ｄｉａｚａｆｉｌを加えて十分に混合した後、０．５ｍＬの６ｍｍｏｌ／ＬＦｅＳＯ_４溶液を加えて直ちに混合した。試験管は、サンプル管、ブランク管、コントロール管に分けて使用した。サンプルチューブに細菌懸濁液のサンプル溶液を０．５ｍＬ、コントロールチューブに０．１％Ｈ_２Ｏ_２溶液を０．５ｍＬ加えてよく混合し、０．５ｍＬの０．１％Ｈ_２Ｏ_２溶液を入れて、最後に４ｍＬに補充し、３７℃で１時間保持し、５３６ｎｍでの吸光度をＡｉおよびＡとして測定した。ブランク管にはサンプル溶液とＨ_２Ｏ_２溶液を添加せず、リン酸緩衝液を直接使用して、後続の実験のために容量を４ｍＬに補充し、最終的に測定された吸光度はＡ０とした。式（５）に従ってヒドロキシルラジカル消去率を計算した。

１．５．２体外でのラクトバチルス・ファーメンタムＬＦ－ＳＣＨＹ３４のＤＰＰＨフリーラジカル消去能力の測定
１ｍＬの２ｍｍｏｌ／ＬＤＰＰＨエタノール溶液を１ｍＬのラクトバチルス・ファーメンタムＬＦ－ＳＣＨＹ３４懸濁液（１０^９ｃｆｕ／ｍＬ）に追加した。１ｍＬのラクトバチルス・ファーメンタムＳＣＨＹ３４懸濁液（１０^９ｃｆｕ／ｍＬ）を１ｍＬの無水エタノールに追加した。１ｍＬの２ｍｍｏｌ／ＬＤＰＰＨエタノール溶液に１ｍＬの無水エタノールを加えて室温で３０分間静置し、５１７ｎｍの波長で測定した吸光度をＡｉ、Ａｊ、Ａ０とし、ＤＰＰＨフリーラジカル消去率を式（６）で計算した。

１．５．３ラクトバチルス・ファーメンタムＬＦ－ＳＣＨＹ３４の体外スーパーオキシドアニオン消去能力の測定
０．１ｍＬのラクトバチルス・ファーメンタムＬＦ－ＳＣＨＹ３４懸濁液（１０^９ｃｆｕ／ｍＬ）を４．５ｍＬのｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液に加え、２５℃の水浴で２０分間予熱した後、０．４ｍＬの２５ｍｍｏｌ／Ｌｏ－トリフェノールを加え、２５℃の水浴で５分間反応させ、直ちに８ｍｏｌ／ＬのＨＣｌを２滴滴下して反応を終了させ、３２５ｎｍの波長で吸光度をＡとして測定し、ブランク群はＡ０として試料を０．１ｍＬＨ_２Ｏに置き換えて、スーパーオキサイドアニオン消去率を式（７）で算出した。

１．５．４ラクトバチルス・ファーメンタムＬＦ－ＳＣＨＹ３４の体外還元力の測定
０．５ｍＬのラクトバチルス・ファーメンタムＬＦ－ＳＣＨＹ３４細菌懸濁液（１０^９ｃｆｕ／ｍＬ）を取り、０．５ｍＬの０．２ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．２のリン酸緩衝液と０．５ｍＬの１％フェリシアン化カリウムを加え、５０°の水浴で培養し、急冷した。次に、０．５ｍＬの１０％トリクロロ酢酸を加え、１５００ｘｇで１０分間遠心分離し、１ｍＬの上清を取り、１ｍＬの蒸留水と１ｍＬの０．１％塩化第二鉄を加えてよく混合した。１０分間後、７００ｎｍの波長で吸光度を測定した。システイングループの異なる用量を標準として設定し、サンプルグループの吸光度を標準グループの測定単位（μｍｏｌ／Ｌ）に変換して比較した。

１．６ラクトバチルス・ファーメンタムＬＦ－ＳＣＨＹ３４の能力測定結果
人工胃液中のＬＦ－ＳＣＨＹ３４の生存率は８８．７１％±０．２３％、人工胆汁酸塩での増殖効率は８５．３２％±０．４１％、表面疎水性率は４３．７８％±０．７５％、鉛イオン吸着率は６９．５８％±０．５６％、ヒドロキシルラジカル、スーパーオキシドアニオンおよびＤＰＰＨの除去率はそれぞれ４４．１５％±０．４１％、６６．１１％±０．９７％および７９．４９％±０．８７％であり、還元力は１１１．６６±１．１８μｍｏｌ／Ｌである。データの各グループは、ＬＦ－ＳＣＨＹ３４がｉｎｖｉｔｒｏで強力な抗酸化能力を持ち、フリーラジカルを効果的に除去できることを示していた。

実施例２
鉛イオンの吸着前後のラクトバチルス・ファーメンタムＬＦ－ＳＣＨＹ３４菌体の走査型電子顕微鏡法、走査型エネルギースペクトル分析および透過型電子顕微鏡法分析
２．１走査型電子顕微鏡と走査型エネルギースペクトル分析
鉛イオン溶液を含まない菌体と５０ｍｇ／Ｌの鉛イオンを吸着した菌体を取り、８０００ｘｇで２０分間遠心分離し、滅菌超純水で３回洗い、上記と同じ条件で遠心分離し、次にジアルデヒドに注ぎ、１．５ｈで固定し、リン酸緩衝液で３回洗浄し、６０００ｘｇで１０分間遠心分離し、次に異なる濃度（５０％、７０％、９０％、１００％）のエタノールで１回脱水し、次に６０００ｘｇで１０分間遠心分離し、その後エタノールとｔｅｒｔ－ブタノールの混合物（ｖ／ｖ＝１／１）と純粋なｔｅｒｔ－ブタノールで１回洗浄し、６０００ｘｇで１０分間遠心分離し、菌体を－２０℃で３０分間凍結し、凍結乾燥機で４時間乾燥し、最後にサンプルの表面に厚さ１００～１５０Ａの金属膜をイオンスパッタリングコーターでプレーティングし、観察室に置いて観察し、エネルギー分散分光計で素子組成を分析した。

２．２透過型電子顕微鏡分析
鉛イオン溶液のない菌体と５０ｍｇ／Ｌの鉛イオンを吸着した菌体を取り、８０００ｘｇで２０分遠心分離し、２．５％グルタルアルデヒド溶液で４℃で固定し一夜を過ごし、固定液をぶちまけて、０．１Ｍ、ｐＨ７．０のリン酸緩衝液でサンプルを３回（１５分間／回）洗い、１％オスミウム酸溶液で１～２時間固定し、オスミウム酸廃液を丁寧に取り除き、０．１Ｍ、ｐＨ７．０のリン酸緩衝液でサンプルを３回（１５分間／回）洗った。濃度の異なるエタノール溶液（３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％）でサンプルに１５分間／回で脱水した後、１００％エタノールで２０分間処理した。埋込剤とアセトンの混合液（ｖ／ｖ＝１／１）で１時間処理し、埋込剤とアセトンの混合液（ｖ／ｖ＝３／１）で３時間処理し、純粋な包埋剤で一夜処理し、浸透処理した試料を包埋し、７０℃で一夜加熱して包埋試料を得た。試料は切片にして、クエン酸鉛溶液と５０％エタノール飽和酢酸ウラニル溶液でそれぞれ５～１０分間染色し、乾燥させて透過型電子顕微鏡での観察に備えた。

２．３結果
図１は、鉛イオン吸着前後のＬＦ－ＳＣＨＹ３４乳酸菌の走査型電子顕微鏡像と透過型電子顕微鏡像である。図１－ａは、吸着前の正常群のＬＦ－ＳＣＨＹ３４菌体の走査型電子顕微鏡像であり、観察により、乳酸菌細胞は形態的に無傷であり、輪郭がはっきりしていて、清潔で充実しており、表面が滑らかで、エッジの境界がはっきりしており、表面に粒子状物質や付着物がないことがわかる。図１－ｃは、鉛吸着後のＬＦ－ＳＣＨＹ３４菌体の走査型電子顕微鏡像であり、菌体の走査型電子顕微鏡像を見ると、乳酸菌の菌株細胞の変形は深刻で、細胞は扁平に凹み、粗い外観になり、細胞の縁の輪郭はぼやけ、さらにはピースに付着して不規則に凝集するような現象が見られ、同時に細胞の便の表面が微粒子で覆われていることもわかった。

図１－ｂは吸着前の正常群のＬＦ－ＳＣＨＹ３４菌の透過型電子顕微鏡像で、正常群の菌株細胞の断面には沈着物が現れず、表面がクリアで付着物がないことがわかった。図１－ｄは吸着後のＬＦ－ＳＣＨＹ３４菌体の透過型電子顕微鏡像で、正常群の菌体と比較して、鉛吸着後の乳酸菌の細胞断面には黒い沈着物が多く見られ、細胞内には空白部分が現れている。

図２はＬＦ－ＳＣＨＹ３４乳酸菌の鉛イオン吸着前後のエネルギースペクトル検出形状図と走査エネルギースペクトル図を示し、表２に鉛イオン吸着前後の乳酸菌の走査エネルギースペクトルの素子変化を示す。図２と表１から、正常群と比べると、鉛吸着後の乳酸菌菌体の表面のＯおよびＮ素子の含有量は減少し、Ｃ、Ｐ、およびＰｂ素子の含有量は増加したとわかる。

表1 鉛イオン吸着前後の乳酸菌の走査エネルギースペクトルにおける素子変化の表

実施例３
ラットにおける酢酸鉛誘導性酸化ストレスに対するラクトバチルス・ファーメンタムＬＦ－ＳＣＨＹ３４の緩和効果

以下の実験は、血清および組織サンプルの３回の並行測定を実行し、次に平均値を計算した。ＳＰＳＳソフトウェア（ＳＰＳＳｖ．２５ｆｏｒＷｉｎｄｏｗｓ、ＩＢＭＳｏｆｔｗａｒｅＧｒｏｕｐ、シカゴ、イリノイ、米国）を使用して、データを平均化および分析した。Ｄｕｎｃａｎの多重範囲検定を使用して、１因子ＡＮＯＶＡによって各グループの平均値の差を評価した。ｐ＜０．０５の差は、統計学的意義があると見なされた。

３．１動物実験
６週齢のＳＰＦ雄性ＳＤラット４８匹を、１週間の馴化給餌後、正常群を１２匹、鉛誘導群を１２匹、ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＳｔＬｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）群を１２匹、ＬＦ－ＳＣＨＹ３４群を１２匹の計４群にランダムに分けた。正常群のラットには，実験期間中，ＡＩＧ－９３Ｇ飼料を与え、酢酸鉛を含まない水を自由に飲ませた。他の３群のラットは、ＡＩＧ－９３Ｇの餌を与えながら、１週目から１２週目まで、飲料水の代わりに２００ｍｇ／Ｌの濃度の酢酸鉛溶液を自由に飲ませた。ＥＤＴＡ群のラットには８週目から１２週目まで、１日あたり５０ｍｇ／ｋｇの濃度のＥＤＴＡを注射し、ＬＦ－ＳＣＨＹ３４群のラットには、１週目から１２週目まで毎日１×１０^９ＣＦＵ／ｋｇ（ｂ．ｗ）のＬＦ－ＳＣＨＹ３４を経口投与した。

１２週間後、すべてのラットを１２時間絶食させた後、エーテルで麻酔し、眼窩静脈から採血して犠牲にした。ラットの心臓、肝臓、腎臓、脳組織を液体窒素で採取し、－８０°で保存し後で使用するためのものであった。この研究はヘルシンキ宣言に従って実施され、この方案は２０１９年６月８日（中国、重慶）に重慶機能性食品共同イノベーションセンターの倫理委員会によって承認された（２０１９０６００８Ａ）。

３．２ＳＤラットの血液、肝臓、腎臓、脳の組織中の鉛の測定
それぞれ０．０，０．４，０．８，１．２，１．６，２．０ｍＬの鉛標準液を正確に計量し５０ｍＬのメスフラスコに入れた後、１２．５％のリン酸二水素アンモニウムと２．５％の硝酸マグネシウムの混合物をそれぞれ２ｍＬ加え、２％の硝酸で溶液を定容した。グラファイトファーネスアトマイザーに、上記の異なる濃度の標準液をそれぞれ２０μＬ取り、吸光度を測定し、標準曲線を作成した。

採取した血液５００μＬと各組織５０ｍｇをテトラフルオロエチレン消化タンクに入れ、５ｍＬの硝酸を加えて消化し、冷却後、１２．５％のリン酸二水素アンモニウムと２．５％の硝酸マグネシウムを含む１ｍＬの混合溶液を加え、硝酸を使用し２５ｍＬまで定容し、２０μＬの定容した溶液を加えて、グラファイトファーネスアトマイザーに吸光度を測定し、標準曲線から血中の鉛含有量を計算した。

^ａ－ｄは、Ｄｕｎｃａｎの新しいＭＲＴによると、同じテーブル内の異なる文字の平均数値に重要な差異があることを示している（ｐ＜０．０５）。

表２のデータによると、酢酸鉛で誘導していない正常群のラットは、血液、肝臓、腎臓、脳組織における鉛の濃度がすべての群の中で最も低かった。一方、鉛を誘導したグループでは、血液、肝臓、腎臓、脳組織における鉛の濃度が全グループの中で最も高かった。血液中の鉛濃度は正常群の２０倍、腎臓中の鉛濃度は正常群の１７倍だった。ＥＤＴＡ薬とＬＦ－ＳＣＨＹ３４の介入を使用した後、ラットの血液、肝臓、腎臓、脳組織中の鉛濃度は特に低下され、特にＬＦ－ＳＣＨＹ３４の介入後のラットの血液と腎臓中の鉛濃度は、正常群の約７倍と１０倍で、介入効果はＥＤＴＡ製剤よりも優れていた。

それだけでなく、データを比較すると、酢酸鉛で誘導されたマウスの血液中の鉛濃度が最も高く、組織や臓器中の鉛濃度よりもはるかに高いこともわかった。３つの組織・器官の中では、腎臓が最も鉛含有量が高く、次いで肝臓、最後に脳組織だった。

３．３ＳＤラットの肝臓および腎臓組織の形態学的分析
ＳＤラットの各群の肝臓および腎臓の同一部位の組織を１０％ホルマリン（ｖ／ｖ）で２４時間固定し、脱水、除去、ワックス掛け、埋め込み、セクショニング、染色の各ステップを経て、光顕微鏡（ＢＸ４３；オリンパス、東京、日本）で組織形態を観察し、写真撮影を行った。

ＳＤラットの肝臓切片を図４に示す。図４から、正常群のラットの肝小葉（図４ａ）が順番に構造化されており、中心静脈と肝類洞が透明であることがわかる。酢酸鉛で誘導されたラット（図４ｂ）の肝小葉はぼやけ、肝索は無秩序に配置され、単球は異なる各隙間に凝集し、肝細胞の限局性壊死および大きな炎症細胞の浸潤、核間封入体および核の破砕がある。ＥＤＴＡ薬（図４ｃ）およびＬＦ－ＳＣＨＹ３４（図４ｄ）による介入した酢酸鉛は、ラットの肝細胞をより整然とした配置、より少ない炎症性細胞浸潤、および肝細胞のより少ない損傷および壊死を誘導した。

ＳＤラットの腎臓切片を図５に示す。図５から、正常群（図５ａ）のラットの糸球体と尿細管の構造は正常であり、細胞は密に配置されており、細胞は正常である。酢酸鉛によって誘導された（図５ｂ）ＳＤラットの腎臓切片では、尿細管と糸球体が大きくなって、細胞も過剰で、毛細血管拡張症、うっ血で拡大し、腎臓の尿細管内腔は拡張し、空胞化しているように見え、上皮細胞の顆粒状変性、細胞の破砕、リンパ球の浸潤が見られた。鉛誘導群と比較して、ＥＤＴＡ群（図５ｃ）およびＬＦ－ＳＣＨＹ３４群（図５ｄ）のＳＤラットの腎臓切片は、糸球体および尿細管の損傷が少なく、細胞の完全性が高く、炎症細胞浸潤の現象が少なかった、深刻な腎尿細管の拡張と空胞化はなかった。ＬＦ－ＳＣＨＹ３４で介入したＳＤラットの肝臓と腎臓の形態は正常群のものに近かった。

３．４ＳＤラットの血清、肝臓、腎臓、脳組織の酸化レベルの測定
１００ｍｇのさまざまな臓器や組織の重さを量り、生理食塩水でホモジナイズした後、血液を遠心分離し、実験のために上澄み液を採取した。キットの操作方法（中国の南京江城生物工学研究所）に従って、臓器生化学的指標カタラーゼ（ＣＡＴ）、活性酸素種（ＲＯＳ）、総スーパーオキシドジスムターゼ（Ｔ－ＳＯＤ）、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）およびグルタチオン（ＧＳＨ）レベルを測定した。

ＳＤラットの血清、肝臓、腎臓、脳組織における酸化指標のデータを表３に示す。表３から、正常群のラットの血液、肝臓、腎臓、脳組織におけるＣＡＴ、Ｔ－ＳＯＤ、ＧＳＨが４群の中で最も高く、ＭＤＡ、ＲＯＳが４群の中で最も低いことがわかる。鉛誘導群の血液、肝臓、腎臓、脳組織の傾向は正常群とは全く逆で、ＣＡＴ、ＴＥＤＴＡ群とＬＦ－ＳＣＨＹ３４群の酸化指標の傾向は正常群と似ており、ＬＦ－ＳＣＨＹ３４の酸化指標の値はより正常群に近いものであった。

３．５ＳＤラットの血清、肝臓、腎臓の炎症性因子レベルの測定
ラット血清および組織ホモジネート上清を採取し、キットの操作方法（ＳｈａｎｇｈａｉＹａｊｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．Ｌｔｄ．Ｓｈａｎｇｈａｉ）に従って、血清中のＩＬ－６，ＩＬ－１０，ＩＬ－１β，ＴＮＦ－α，ＩＦＮ－γのレベルを測定した。

表４は、ＳＤラットの血清、肝臓、腎臓の炎症指標のデータを示す。正常群の血清、肝臓、腎臓のＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γのレベルは４つのグループの中で最低であった。ＩＬ－１０レベルは４つのグループの中で最高であった。鉛誘導性のＩＬ－１０レベルは４つのグループの中で最も低く、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、およびＩＦＮ－γのレベルは４つのグループの中で最も高かった。ＥＤＴＡ群およびＬＦ－ＣＱＰＣ群のＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γのレベルはすべて、鉛誘導群と比較して減少傾向を示し、ＩＬ－１０レベルは鉛誘導群と比較しすべて増加を示す。ＬＦ－ＳＣＨＹ３４群の下降傾向と上昇傾向はＥＤＴＡ群よりも明らかである。

３．６ＳＤラットの血清δ－ＡＬＡＤ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＣＲＥおよびＢＵＮレベルの測定
ラット血清を採取し、キットの操作方法（ＳｈａｎｇｈａｉＹａｊｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．Ｌｔｄ．、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）に従って、血清中のδ－アミノレブリン酸デヒドラターゼ（δ－ＡＬＡＤ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ），血清クレアチニン（ＣＲＥ）および血清尿素窒素（ＢＵＮ）レベルを測定した。

表５は、ＳＤラットの血清中のＡＬＴ、ＡＳＴ、δ－ＡＬＡＤの活性とＢＵＮおよびＣＲＥの含有量を示す。ラットの４つのグループの中で、正常群のＳＤラットはＡＴＬおよびＡＳＴ酵素活性が最も低く、δ－ＡＬＡＤは酵素活性が最も高く、ＢＵＮおよびＣＲＥ含有量は最も低かった。肝臓関連のＡＴＬとＡＳＴの酵素活性は鉛誘導群で最も低く、δ－ＡＬＡＤの酵素活性と腎臓関連のＢＵＮとＣＲＥの含有量は鉛誘導群で最も高かった。ＥＤＴＡ群とＬＦ－ＳＣＨＹ３４群の３つの酵素活性傾向とＢＵＮとＣＲＥの含有量は正常群と同様である。酵素活性とＢＵＮとＣＲＥ含有量の値から、ＬＦ－ＳＣＨＹ３４の介入効果ＥＤＴＡよりも良かった。

３．７ＳＤラットの肝・腎組織のｍＲＮＡ解析
肝臓組織からＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＲＮＡを抽出し、ＲＮＡの濃度を１ μｇ／μＬに調整した。ｃＤＮＡ逆転写キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＲＮＡをｃＤＮＡとして合成した。続いて、合成したｃＤＮＡと１０ μＬのＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２ μＬのプライマー（表６）、および蒸留水を混合させ、ｑＰＣＲ装置に入れた。ｑＰＣＲプログラム：９５℃ ６０秒；９５℃ １５秒，５５℃ ３０秒，７２℃ ３５秒、４０サイクル；９５℃ ３０秒；５５℃ ３５秒。３－ホスホグリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を内部参照遺伝子として用い、２^{－ΔΔＣｔ}式を用いて相対的なｍＲＮＡ転写レベルを算出した。

この実験では、肝臓と腎臓のＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２ＡＲＥ経路に関連するＫｅａｐ１、Ｎｒｆ２、ＨＯ－１、ＳＯＤ、ＧＳＨ、ＮＱＯ１、およびγ－ＧＣＳのｍＲＮＡエクスプレッションが検出された。表７は、ＳＤ肝臓および腎臓におけるＫｅａｐ１、Ｎｒｆ２、ＨＯ－１、ＳＯＤ１、ＳＯＤ２、ＧＳＨ、ＮＱＯ１、およびγ－ＧＣＳのｍＲＮＡエクスプレッションのデータを示す。

表７から、正常群と比較して、ＳＯＤおよびＧＳＨのエクスプレッション量に加えて、残りの４つの群のラットのＫｅａｐ１、Ｎｒｆ２、ＨＯ－１、ＳＯＤ、ＧＳＨ、ＮＱＯ１、およびγ－ＧＣＳのｍＲＮＡのエクスプレッション量が増加の程度が異なった。正常群のＳＯＤとＧＳＨのｍＲＮＡエクスプレッション量は４群の中で最も高かった。鉛誘導群のＫｅａｐ１、Ｎｒｆ２、ＨＯ－１、ＮＱＯ１およびγ－ＧＣＳのｍＲＮＡエクスプレッションレベルは正常群よりも高かったが、有意差はなかった（ｐ＜０．０５）。鉛誘導群と比較して、ＥＤＴＡ群およびＬＦ－ＳＣＨＹ３４群におけるＫｅａｐ１、Ｎｒｆ２、ＨＯ－１、ＳＯＤ１、ＳＯＤ２、ＧＳＨ、ＮＱＯ１およびγ－ＧＣＳｍＲＮＡエクスプレッション量が特に増加した。ＬＦ－ＳＣＨＹ３４群の関連遺伝子のｍＲＮＡエクスプレッション量はＥＤＴＡ群のそれより高かった。

３．８ＳＤラットの肝臓および腎臓組織のＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ解析
肝組織１００ｍｇを１ｍＬのＲＩＰＡ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）と１０μＬのＰＭＳＦ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）でホモジナイズし、１２，０００×ｇで５分間、４℃で遠心分離した。ＢＣＡプロテインアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いてタンパク質を定量した。タンパク質サンプルをサンプルバッファー（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）と４：１で混合し、９５℃で５分間加熱した後、サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルのゲルウェルにスポットし、１００Ｖで泳がせた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上のバンドをＰＶＦＤ膜に転写し、ＰＶＤＦ膜を５％脱脂乳で１時間封入した後、一次抗体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）と４℃で一夜培養し、洗浄後、抗体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を加えて１時間培養した。ＷｅｓｔｅｒｎＥＣＬ基板（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて化学発光させた後、ｉＢｒｉｇｈｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で画像を取得した（図７）。

３．９結果分析
１０^６ＣＦＵの生菌が腸や胃に到達してプロバイオティクス効果を高めることができることを示す文書がある。人間の胃液のｐＨは通常約３．０で、小腸の胆汁酸塩含有量は０．０３～０．３０％である。酸や胆汁酸塩に対する耐性が低い乳酸菌はこの環境では生き残ることはできない。この環境に適応できる乳酸菌は消化管で生き残ることができる。ＬＦ－ＳＣＨＹ３４が胃酸中の生存能力は８８．７１％で、胆汁酸塩中の増殖効率は８５．３２％であり、１０^９ＣＦＵのＬＦ－ＳＣＨＹ３４を摂取することで腸のプロバイオティクス効果をスムーズに達成できることを示す。

乳酸菌による重金属の吸着は、一般に、生体吸着と生体蓄積の２つの段階に分けられる。生体吸着には、細胞外沈殿、表面錯化、イオン交換が含まれる。これは主に、タンパク質、多糖類、脂質などの微生物の表面にある化学基及び細胞表面に含まれる一部のイオンは金属と相互作用して金属錯体を形成する。生体蓄積には、膜貫通型輸送、細胞内蓄積、細胞の生理的代謝、自己調節機構などがある。実験の結果として、ＬＦ－ＳＣＨＹ３４の鉛イオンへの体外吸着率は７４．８％であり、吸着容量は、３９．７０％から６９．６０％の範囲の鉛吸収率を持つＨａｌｔｔｕｎｅｎらによって発見されたものよりもはるかに高いことがわかる。動物実験の結果は、ＬＦ－ＳＣＨＹ３４がＳＤラットの血液、肝臓、腎臓、脳組織の鉛含有量を減らすことができることも明確に示している。走査型電子顕微鏡法、透過型電子顕微鏡法、走査型エネルギー分光法の実験的分析により、ＬＦ－ＳＣＨＹ３４は、鉛吸着に関与する過程で溶液中の鉛イオンをよりよく吸収できることがわかる。吸着の過程では、菌体の表面にＣがあり、Ｐの基が関与している。大量のＰｂイオンを吸着した後、乳酸菌の一部が形態的に損傷したり、内部が変化したり、さらには破裂したりして、細胞内のＯ，Ｎ含有物質が溶出し、Ｏ，Ｎ素子の含有量が大幅に増加したという。従って、ＬＦ－ＳＣＨＹ３４によるＰｂイオンの吸着は、生体吸着と蓄積の両方を含んでおり、高品質のＰｂ吸着性乳酸菌株であることが推察される。

一方、人体や動物の組織や臓器が鉛に長期間さらされると、活性酸素種（ＲＯＳ）レベルが上昇し、グルタチオン（ＧＳＨ）レベルやＳＯＤやＣＡＴなどの重要な抗酸化酵素の活性が低下または不活性化し、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）レベルが上昇して、細胞膜の脂質過酸化のプロセスが加速される。活性酸素種（ＲＯＳ）には、主に過酸化物、酸素イオン、酸素を含むフリーラジカルなどがある。乳酸菌は、細胞周辺の活性酸素ラジカルを消去することで、酸化損傷や脂質過酸化を緩和し、また、宿主細胞の抗酸化関連のシグナル経路を調節することで、生物の酸化ストレスをさらに防御することができる。今回の体外データによると、ＬＦ－ＳＣＨＹ３４は、ヒドロキシルラジカル、スーパーオキシドアニオン、ＤＰＰＨをそれぞれ４４．１５％±０．４１％、６６．１１％±０．９７％、７９．４９％±０．８７％の消去率で、還元力は１１１．６６±１．１８μｍｏｌ／Ｌである。ＴａｋａｓｈｉＫｕｄａらは、異なる乳酸菌のＤＰＰＨの消去率およびスーパーオキシドアニオンの消去率はおおよそ７８％～９０％と４５％～６２％で、ＲａｍｉｌａＡＺＡＴらの実験結果では乳酸菌のヒドロキシルラジカル消去率が４５．７９％と最も高く、Ｚｈａｉらの実験結果では乳酸菌の還元力が最も高く、９９．４１μｍｏｌ／ＬのＬ－システインに相当することが分る。上記の実験結果は本実験のデータと比較すると、ＬＦ－ＳＣＨＹ３４はフリーラジカルの消去効率が高く、体外抗酸化力が高いことがわかる。動物実験では、ＬＦ－ＳＣＨＹ３４群は鉛誘導群と比較して、血清、肝臓、腎臓、脳組織のＳＯＤ、ＣＡＴ活性、ＧＳＨレベルが高く、ＲＯＳ、ＭＤＡレベルが低いことが判明したことから、ＬＦ－ＳＣＨＹ３４’ｓは体外および体内の抗酸化力が高い優れた株であると推察された。

疎水性は、乳酸菌細胞の腸上皮細胞への付着を示す重要な指標の１つであり、疎水性が高いほど、乳酸菌の付着性が高くなる。この実験でのＬＦ－ＳＣＨＹ３４の疎水性は４３．７８％±０．７５％であり、ＬＦ－ＳＣＨＹ３４が良好な接着能力を持ち、人体の腸内にうまくコロニーを作ってプロバイオティクスの役割を果たすことができることを示していると、ＮａｄｉａＳ．ＡｌＫａｌｂａｎｉらは、実験を通じてそれを発現した。

鉛はまず腎臓から排泄されるが、腎臓の排泄能力が最大になると、鉛が近位尿細管の上皮細胞に濃縮されて沈着し、細胞の代謝に影響を与え、腎臓の構造と機能の損傷につながる。細胞の損傷や壊死が起こると、腎尿細管の再吸収能力が低下につれてクレアチニンや尿素が血中に残るため、血中クレアチニン濃度や尿素濃度は腎損傷の有無を反映できる。鉛は体内のδ－アミノケトバレレートデヒドラターゼ（δ－ＡＬＡＤ）活性を阻害し、血中のＡＬＡを増加させ、δ－ＡＬＡは尿中に排泄されるため、血中δ－ＡＬＡ濃度が低下する。肝臓は、体内で最も重要な解毒器官であり、消化器系から体内に入ってきたさまざまな毒素を、生化学反応によって毒性の低い物質に変えて排泄する。鉛は様々な重症度の肝臓病変を引き起こし、激しい炎症反応を起こし、肝臓関連酵素の活性に影響を与え、最終的には肝損傷を引き起こすことが明らかになった。ＡＬＴとＡＳＴは肝細胞に分布しており、肝細胞が損傷を受けると細胞質内のＡＬＴとＡＳＴが血液中に放出されるため、血液中のＡＬＴとＡＳＴの濃度は肝細胞の損傷の程度を示すことができる。血清や臓器組織中の炎症性因子は、体内の炎症性損傷の程度を反映した。血清、肝臓、腎臓の炎症因子レベル、血清δ－ＡＬＡＤ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＣＲＥ、ＢＵＮ、肝臓と腎臓の切片のケーススタディを行った結果、ＬＦ－ＳＣＨＹ３４はＳＤラットの肝臓と腎臓の鉛イオンによる損傷を緩和し、肝臓と腎臓の炎症を抑え、肝臓と腎臓の細胞の完全性を保護することがわかった。

体内には有害な環境因子に対する自己防衛システムがあり、それによって組織や細胞の形態や機能に対する有害な影響を軽減し、細胞の生存を促進する。核内因子Ｅ２関連因子２（Ｎｒｆ２）は、生体の自己防衛システムの重要なメンバーである。Ｎｒｆ２は細胞内の抗酸化反応に主に関与する酸化還元感受性転写因子であり、生体内の重要な抗酸化因子である。正常な状態では、Ｋｅｌｃｈｌｉｋｅｅｐｉｃｈｌｏｒｏｈｙｄｒｉｎ関連タンパク質１（Ｋｅａｐ１）は、細胞質内で細胞質状態のＮｒｆ２に結合し、Ｎｒｆ２を不活性化し、ユビキチン化を進行させる。生体が酸化ストレスにさらされると、細胞質のＮｒｆ２はＫｅａｐ１から解離して核に移動し、特定の遺伝子の上流にある抗酸化応答要素（ＡＲＥ）領域に結合して遺伝子エクスプレッションを開始する（図Ｘ）。遺伝子コードはＮＱＯ１、ＨＯ－１、γ－ＧＣＳなどが含まれる。これらの細胞保護遺伝子のエクスプレッションは、有害な刺激に対する細胞の自己防衛能力を高め、細胞の生存を促進することができる。ＨＯ－１は、線維芽細胞、肝細胞、腎上皮細胞などに対して抗酸化、抗炎症、抗アポトーシス保護効果がある。また、ヘムの酸化促進分解を触媒する最初の律速酵素であり、最終分解産物が一酸化炭素、ビリベルジン、イオンであり、抗酸化作用と抗炎症作用の二重の効果があり、さまざまな心血管疾患、肝臓や腎臓の機能損傷、中枢神経系疾患において重要な保護的役割を果たしている。ＨＯ－１タンパク質とｍＲＮＡの含有量の増加は、一般的に酸化ストレスと細胞損傷に抵抗する体の能力を向上させる。ＮＱＯ１は、ほぼすべての動物種に共通して存在する可溶性フラボノイド酵素で、脂肪細胞、血管内皮細胞、上皮細胞などのエクスプレッションレベルが高い。ＮＱＯ１は、ＮＡＤＰＨをドナーとして安定したハイドロキノンを生成することで、毒性のあるセミキノンラジカルの生成や活性酸素の一電子還元、細胞内のスルフヒドリル基の直接反応を回避した。ＮＱＯ１は活性の強いキノン類を解毒し、脂溶性酸化防止剤の還元形態を維持し、それによって生体の酸化ストレスを避けた。γ－ＧＣＳは、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２／ＡＲＥシグナル伝達経路の下流の抗酸化因子でもあり、ＧＳＨ生合成の律速酵素である。エクスプレッションレベルが上昇すると、多数のフリーラジカルを除去して細胞の酸化的損傷を軽減できた。ＦａｎｇＹｅとＭｉａｏＬｏｎｇらは、鉛誘導酸化ストレスモデルにおいて、Ｎｒｆ２が細胞質内のＫｅａｐ１、ＳＯＤ１、ＳＯＤ２、ＧＳＨ、ＨＯ－１、ＮＱＯ１、およびγ－ＧＣＳのエクスプレッション程度と有意に正の相関があることを発見した。細胞質核内のＫｅａｐ１と負の相関がある。この実験では、肝臓と腎臓のＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２／ＡＲＥシグナル伝達経路で関連する遺伝子とタンパク質のエクスプレッションを検出することにより、鉛によって誘導されたすべてのＳＤラットが酸化ストレスを生成し、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２／ＡＲＥの活性化につながり、生物の保護メカニズムを形成するが、下流のタンパク質エクスプレッションの活性化の程度は異なることがわかった。鉛誘導群の抗酸化タンパク質のエクスプレッションは増加したが、正常群と有意差はなく、鉛誘導の酸化ストレスが最初に細胞内のＳＯＤやＧＳＨなどの抗酸化物質を減少させるためと考えられる。体は後の自己調節によって少量の抗酸化物質を生成することができるが、鉛イオンの継続的な損傷による損傷は体の修復能力よりも大きいため、生成された抗酸化物質は鉛による酸化的損傷にほとんど抵抗できなかった。ＬＦ－ＳＣＨＹ３４は、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２／ＡＲＥシグナル伝達経路の応答を強化し、より下流の遺伝子のエクスプレッションを刺激して、ＳＤラット反応で鉛によって誘導される酸化ストレスを軽減する抗酸化能を持つＨＯ－１、ＮＱＯ１、およびγ－ＧＣＳを生成させた。

この実験では、自然発酵させたキムチから分離した乳酸菌を用いて、体内および体外の鉛イオンに対する吸着能力と抗酸化能力を調べ、ＬＦ－ＳＣＨＹ３４が一方では鉛イオンを効果的に吸着し、他方ではフリーラジカルを消去して抗酸化能力を高めることができることを確認し、両方同時に、鉛による酸化ストレスによる損傷から両方で体を保護し、鉛中毒を緩和するための食品グレードの乳酸菌に関する後の研究のための理論的およびデータサポートを提供した。

要約すると、ＬＦ－ＳＣＨＹ３４は、体の内外で鉛イオンを吸収し、血液や臓器の鉛含有量を減らし、肝臓、腎臓、脳組織を保護することができる。さらに、ＬＦ－ＳＣＨＹ３４はフリーラジカルを除去し、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２／ＡＲＥシグナル伝達経路を活性化して、より多くの抗酸化物質を分泌させ、鉛によって引き起こされる体への酸化的損傷をよりよく軽減できる。この観点から、ＬＦ－ＳＣＨＹ３４は強力な鉛吸着能力と抗酸化能力を備えた優れた菌株である。ＬＦ－ＳＣＨＹ３４は今後も研究価値が高く、人体の鉛イオンによる酸化ストレスや他の重金属の毒性緩和など、大きな可能性と研究価値がある。

上記の実施例は、本発明の好ましい方式を説明するだけであり、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の設計の精神から逸脱することなく、当業者が本発明の技術的解決策に加えたあらゆる種類の変形および改良は、本発明の請求項によって決定される保護の範囲に入るものとする。

Claims

ＬＦ－ＳＣＨＹ３４と命名され、中国一般微生物菌株収集管理センターに保存され、保存番号がＣＧＭＣＣ第１８７９５号である、ことを特徴とするラクトバチルス・ファーメンタム。
重金属中毒を治療または予防のための製品の調製における請求項１に記載のラクトバチルス・ファーメンタムの応用。
重金属中毒を治療または予防するための製品が、重金属を吸着するために使用される、ことを特徴とする請求項２に記載のラクトバチルス・ファーメンタムの応用。
当該ラクトバチルス・ファーメンタムが重金属中毒による病症を治療または予防するための製品の調製における請求項１に記載のラクトバチルス・ファーメンタムの応用。
前記重金属中毒による病症が肝臓損傷、腎臓損傷、脳組織損傷である、ことを特徴とする請求項４に記載のラクトバチルス・ファーメンタムの応用。
前記重金属が重金属鉛であり、前記ラクトバチルス・ファーメンタムの有効量が１回あたり１０^９ＣＦＵである、ことを特徴とする請求項２ー５のいずれか１項に記載のラクトバチルス・ファーメンタムの応用。
当該ラクトバチルス・ファーメンタムが酸化的損傷を治療または予防のための製品の調製である請求項１に記載のラクトバチルス・ファーメンタムの応用。
当該ラクトバチルス・ファーメンタムの有効量が１回あたり１０^９ＣＦＵである、ことを特徴とする請求項７に記載のラクトバチルス・ファーメンタムの応用。