KR102567035B1

KR102567035B1 - 락토바실러스 퍼멘텀 lf-schy34 및 그 응용

Info

Publication number: KR102567035B1
Application number: KR1020217036127A
Authority: KR
Inventors: 씬 자오; 씽요우 룽
Original assignee: 충칭 유니버시티 오브 에듀케이션
Priority date: 2021-01-29
Filing date: 2021-02-02
Publication date: 2023-08-14
Also published as: CN112708583B; KR20220110663A; WO2022160360A1; JP2023505400A; CN112708583A

Abstract

본 발명은 락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34및 그 응용을 공개하였다. 상기 락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34는 미생물 기술 분야에 속해 중국보통미생물균종보존관리센터에 CGMCC No.14957번으로 보존되어 있다. 락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34는 체내와 체외에 있는 납이온을 흡착할 수 있어 혈액과 장기의 납함량을 감소시키고, 간장, 신장과 뇌조직을 보호한다. 락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34는 납이 유기체에 가져온 산화 손상을 더욱 잘 완화하기 위하여 라디칼을 없애고 Keap1/Nrf2/ARE신호 전달 경로를 활성화시켜 더 많은 항산화 물질 분비할 수 있다. 그러므로 락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34는 보다 강한 납 흡착 능력과 항산화 능력을 가진 양호한 균주이다. 이는 인체의 납이온이 초래한 산화 스트레스 작용과 기타 중금속 독성의 완화 등의 측면에 더 큰 잠재력과 연구 가치를 가지고 있다.

Description

락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34 및 그 응용

본발명은 미생물 기술 분야에 관한 것으로, 특히 락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34 및 그 응용에 관한 것이다.

중금속은 먹이사슬을 통해 농축될 수 있고 생분해가 안되며 독성이 더 강한 금속 유기 화합물로 전환될 가능성이 있기 때문에, 최근 몇 년간 중금속 오염은 광범위한 관심을 불러일으키고 있다. 중금속 납은 친화성과 축적성을 가진 중금속으로서 강한 독성을 가진다. 산업화가 가속화되면서 납은 인쇄, 페인트, 도자기, 합금, 가솔린 등 업계에 광범위하게 사용되고 있으며, 그의 난분해성과 강한 독성으로 인해 가장 심각한 오염물질 중의 하나로 되고 있다. 인체는 주로 음식과 호흡 이 두 가지 경로를 통해 납을 섭취하게 되는데, 체내에 일정량이 축적되면 대뇌와 신경조직을 손상시키고 신장과 간장에 축적되어 급성 또는 만성 신장 질환과 간질환을 일으키며, 결국 유기체의 여러 기관의 계통성 손상을 일으킬 수 있다. 현재 중금속 중독 치료에는 주로 킬레이트를 사용하고 있지만, 치료와 동시에 유기체에 손상을 줄 수 있고 해독이 불완전한 단점도 있다.

산화 손상은 납이 독성효과를 발휘하는 중요한 메커니즘중의 하나로 간주된다. 대량의 연구 결과에 따르면 납은 세포의 산화 환원 상태를 변화시켜 산화 스트레스를 일으키며, 산화 스트레스는 과량의 활성산소(ROS)와 활성질소(RNS)의 생성을 야기하고 항산화 효소의 활성 저하를 유발하며 조직과 세포에서 라디칼의 생성을 촉진한다. 유기체는 라디칼 손상에 대응할 때 복잡한 산화 스트레스 응답 시스템을 형성하여 세포 손상을 완화할 수 있도록 일련의 보호성 단백질을 자체에서 유도하게 된다. 핵인자 E2에 관련된 인자2(Nrf2)는 대량의 ROS와 RNS를 통해 세포 손상에 대응하는 산화 스트레스를 발현하는 핵심 전사 인자로서, 생리 상태에서 대부분의 Nrf2와 Keap1을 커플링 하고 Keap1은 유비퀴틴을 매개체로 하는 단백질 분해 시스템을 통해 세포질중에서 비활성화 기초레벨에 처해 있는 Nrf2로 유지하여 준다. 산화 스트레스가 유기체를 자극하면 MAPK와 포스파티딜 이노시톨 3 키나제 （PIK3）등 단백질 키나제는 Nrf2를 직접 인산화시켜 Keap1-Nrf2 커플링을 풀어주고 Nrf2가 활성화 및 축적되어 세포핵에로 운반되어 Maf와 결합하여 헤테로다이머를 형성하며, 하위의 항산화 성분 ARE를 인식하고 그와 결합된다. ARE는 유기체 산화 스트레스 반응 시스템에서 분비된 보호성 단백질 유전자의 상위에 위치하고, Nrf2는 ARE의 활성인자로서 ARE와 결합한 후 하위 보호성 항산화 유전자의 발현을 조정하여 슈퍼옥사이드 디스뮤타제（SOD），퀴논산화환원효소 1（NQO1）, 헴옥시게나제 1（HO-1）, γ-글루타밀시스테인합성효소（γ-GCS） 등과 같은 보호성 단백질을 생성하며, 세포 산화 손상의 면에서 중요한 억제작용을 발휘하고, 유기체의 산화손상 길항의 제1방어선을 형성한다. Nrf2-ARE경로는 현재까지 발견된 가장 중요한 내원성 항산화 스트레스의 경로이다.

유산균은 발효성당 (탄수화물)을 이용해 대량의 유산을 생성하는 비포자, 그람 염색 양성 세균의 총칭으로서 인체의 장내 균군의 개선, 위장의 연동을 촉진하고, 소화율을 향상시키며, 부패균의 생장을 억제하는 등 기능을 가진다. 이 밖에도, 유산균은 면역력 강화, 항산화, 노화 지연 등 기능을 가진다. 재래식 발효 파오차이는 주로 야채에 들어 있는 유산균에 의해 발효된다. 때문에 발효된 파오차이중에는 다양한 유산균 종류들이 포함되어 있다. 연구에 따르면 중국 파오차이의 발효 균종은 주로 락토바실러스 플란타룸（Lactobacillus plant arum）, 락토바실러스 펜토수스（Lactobacillus pentosus）, 락토바실러스 사케（lactobacillus sake）, 락토바실러스 브레비스（Lactobacillus brevis）, 락토바실러스 카세이（Lactobacillus casei） 및 락토바실러스 퍼멘텀（Lactobacillus fermentum） 등 유산간균으로 구성된다. 발효식품의 유산균은 식품의 아질산염 생분해, 콜레스테롤 강하, 항산화, 장내 건강 조절 등 여러가지 기능을 가진다.

유산균에 대한 연구가 심화됨에 따라, 일부 유산균들은 중금속에 대해 뛰어난 내성과 흡착성을 가지고 있다는 점이 발견되었다. 유산균이 납의 독성을 완화시키는 작용도 두 가지로 나뉘는 바, 첫째로 유산균은 중금속에 대해 뛰어난 흡착력을 가진다는 점이고, 둘째로 유산균은 유기체내 항산화 작용을 발휘하고 라디칼이 유기체에 끼치는 피해를 막아준다는 점이다. 생물을 통해 중금속 중독을 복구한다는 것은 원료가 풍부하고, 원가가 저렴하며, 조작이 간단하고, 친환경적인 등 많은 장점을 가지며, 이차적인 위해가 생기지 않는다. 하지만 현단계의 연구중 유산균을 생물 흡착제로 하여 진행되는 연구는 상대적으로 적은 편이다. 왜냐하면 대부분 유산균의 흡착 효과가 안 좋고, 뛰어난 흡착력을 가지는 유산균은 식품 생산에 사용되기 어렵기 때문이다. 따라서, 중금속 납이온에 대해 좋은 흡착 능력을 가지는 식품용 유산균을 찾아내는 것이 현재 중요한 과제로 되고 있다.

본 발명은 기존 기술중에 존재하는 문제점을 해결하기 위하여, 락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34 및 그 응용을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명은 LF-SCHY34로 명명된 락토바실러스 퍼멘텀을 제공한다. 이는 중국 보통미생물균종 보존관리센터에 보존되고 보존번호는 CGMCC No.18795이다.

본 발명은 상기 락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34으로 중금속 중독을 치료하거나 예방하는 제품을 제작하는 응용을 더 제공한다.

바람직하게，상기 중금속 중독을 치료하거나 예방하는 제품은 중금속흡착에 사용된다.

본 발명은 상기 락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34으로 중금속 중독으로 인한 질환을 치료하거나 예방하는 제품을 제작하는 응용을 더 제공한다.

바람직하게，상기 중금속 중독으로 인한 질환은 간장 손상, 신장 손상, 뇌조직 손상이다.

바람직하게, 상기 중금속은 중금속 납이고 상기 락토바실러스 퍼멘텀의 유효용량은 10⁹CFU/회이다.

본 발명은 상기 락토바실러스 퍼멘텀으로 산화손상을 치료하거나 예방하는 제품을 제작하는 응용을 더 제공한다.

바람직하게，상기 락토바실러스 퍼멘텀의 유효용량은 10⁹CFU/회이다.

(1) 본 발명에 개시된 락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34는 납이온에 대한 흡착이 생물 흡착과 축적 등 두 가지로 되어 있어, 뛰어난 납흡착 효과를 가지는 유산균 균주이다.

(2) 본 발명에 개시된 락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34는 비교적 ?穿爭? 체내와 체외의 항산화 능력 및 부착력을 가지며, 인체 장내에 더 잘 정착하여 프로바이오틱스 역할을 할 수 있다.

(3) 본 발명에 개시된 락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34는 납이온이SD쥐 간장과 신장에 끼친 손상을 완화시킬 수 있으며, 간장과 신장의 염증 발생을 저하시켜 간장과 신장 세포의 완전성을 보호할 수 있다.

(4) 본 발명에 개시된 락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34는Keap1/Nrf2/ARE신호 전달 경로의 반응을 강화하고 더욱 많은 하위 유전자가 항산화 능력을 가진 HO-1， NQO1과 γ-GCS를 생성하도록 하여, 납유도로 인한 SD쥐의 산화 스트레스 반응을 완화시키고 납이 유기체에 끼치는 산화손상을 더욱 잘 완화시킨다.

본 발명의 실시예 또는 종래기술 중의 기술수단을 더욱 뚜렷하게 설명하기 위하여, 아래 실시예중에 수요되는 도면에 대해 간단하게 설명하기로 한다. 번연한 사실로, 아래에 설명된 도면은 본 발명의 일부 실시예에 불과하다. 본 분야의 보통 기술자라면 창조적인 노동을 하지 않고서도, 이러한 도면에 근거하여 다른 도면을 얻을 수 있다.
도 1은 LF-SCHY34유산균이 납이온을 흡착하기 전후의 주사형 전자현미경 및 투사형 전자현미경(Transmission Electron Microscope, TEM) 사진이다. 그중, a는 흡착 전 LF-SCHY34의 주사형 전자현미경 사진이고, b는 흡착 전 LF-SCHY34의 투사형 전자현미경 사진이다. c는 흡착 후 LF-SCHY34의 주사형 전자현미경 사진이고, d는 흡착 후 LF-SCHY34의 투사형 전자현미경 사진이다.
도 2는 LF-SCHY34 유산균이 납이온을 흡착하기 전후의 에너지 스펙트럼 탐지 토퍼그래피 사진 및 주사 에너지 스펙트럼 사진이다. 그중, a는 흡착 전 LF-SCHY34의 에너지 스펙트럼 탐지 토퍼그래피 사진이고, b는 흡착 전 LF-SCHY34의 주사 에너지 스펙트럼 사진이며, c는 흡착 후 LF-SCHY34의 에너지 스펙트럼 탐지 토퍼그래피 사진이고 d는흡착 후 LF-SCHY34의 주사 에너지 스펙트럼 사진이다.
도 3은 SD쥐의 간장 절편도이다. 그중, a는 정상 그룹, b는 납 유도 그룹, c는 EDTA 그룹이고, d는 LF-SCHY34 그룹이다. 　
도 4는 SD쥐의 신장 절편도이다. 그중, a는 정상그룹, b는 납 유도 그룹, c는 EDTA 그룹, d는 LF-SCHY34 그룹이다.

아래 본 발명의 실시예 도면에 결합하여, 본 발명 실시예 중의 기술수단을 뚜렷하고 온전하게 설명하기로 한다. 번연한 사실로, 아래에 설명된 부분은 단지 본 발명의 일부 실시예이지, 전부의 실시예는 아니다. 본 발명의 실시예에 근거하여 본 분야의 보통 기술자가 창조적인 노동을 하지 않고서 획득한 모든 다른 실시예들은 모두 본 발명의 보호범위에 속한다.

본 발명의 상기 목적과 특징, 장점을 보다 뚜렷하고 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위하여, 아래 도면과 구체적인 실시형태에 결합하여 본 발명에 대해 좀 더 자세히 설명하기로 한다.

유산균의 분리와 검사：충칭 지역의 파오차이에서 유산균 1주를 분리하여 얻고, 추출된 DNA를 PCR로 증폭한다. 그중, 상위 프라이머(Forward primer) 27F(5'－AGA GTT TGA TCC TGGCTC AG－3' ）1μL, 하위 프라이머(Reverse primer) 1495R（5'－CTA CGG CTA CCTTGT TAC GA－3'）1μL，2×Taq plus Buffer 12.5 μL, 템플릿DNA 1μL은 무균dd H2O로 25μL까지 채운다. 그리고 무균 초순수로 템플릿 DNA를 대체하여 음성 대조군으로 한다. 증폭 조건：94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，총 29차 순환. 마지막으로 72℃에서, 5분 연장한다. 증폭된 생성물 5μL를 취하여, 아가로스 겔 전기영동 분석을 진행한다. 아가로스 농도를1.5%，전기영동 조건을 110V，45분으로 한다. 분석이 완료된 PCR 생성물을 베이징 TSINGKE 생물기술유한공사로 보내어 시퀀싱을 받는다. 16S rDNA서열은 SEQ ID NO：1로 제시된다. 시퀀싱이 완료된 서열을 NCBI에서 BLAST 비교를 진행한다. 상기 유산균은 젖산균과, 젖산균속이고 99.9%의 유사성을 가지며, LF-SCHY34로 명명되어, 2019년 11월 4일 중국보통미생물균종보존관리센터（CGMCC，베이징）에 보존되고 보존 번호는 CGMCC No.18795이다.

실시예1: 락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34의 체외 성능 측정 실험

1.1 인공 위액중 락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34의 생존율 측정

인공 위액은 0.2%의 NaCl과 0.35%의 펩신을 혼합하여 이루어 지며, 1mol/L의HCl로 pH3.0으로 조절한 후, 0.22μm의 무균 여과기로 여과 살균을 한다. 5ml의 MRS액체 배양기 중에서 2번 활성화시킨 LP-KFY04를 3000rpm로 10분간 원심 분리를 하여 균체를 수집하고, 무균 생리 식염수로 2번 씻은 후, 5mL생리 식염수에 재현탁 한다. 균액과 무군 인공 위액을 1:1（v/v）로 균일하게 섞은 후 37℃의 항온 배양기에 넣어 배양시킨다. 0h과 3h에서 생균수를 측정하고, 계산식 (1)에 따라 인공 위액중 LF-SCHY34의 생존을 산출한다.

1.2 담즙염중 락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34의 생장 효율 측정

2% (v/v) 접종량으로 2번 활성화된 LP-KFY04를 취하여 돼지 담즙염 함유량이 0.0% 및 0.3%인 MRS-THIO medium에 접종시켜（MRS 배지중에 0.2% 티오글리콜산 나트륨을 첨가하고 121℃에서 15분간 멸균）， 항온 37℃ 진탕기에서 24시간 배양한 후, 블랭크 배지(미접종 MRS-THIO medium)를 대조군으로 하여 블랭크 배지와 접종된 배지를 96-well판의 각 구멍에 200ml씩 첨가하고, 600nm 파장에서 흡광도를 측정하며, 계산식(2)에 따라 생장 효율을 산출한다.

1.3 락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34의 체외 납이온 흡착력 측정

락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34 세균현탁액을 1500xg 에서 10분간 원심 분리하여 균체를 수집하고 생리 식염수로 2번 씻은 후 원심 분리하여 균체를 수집한다. 수집된 균체를 50mg/L pH6.3 질산납 용액중에 넣어 최종 균체 농도를 1g/L로 한다. 37℃에서 24시간 배양시킨 후, 8000xg에서 20분간 원심 분리하여 상청액을 수집한다. 불꽃 원자 흡수법으로 최초 용액의 납이온 농도 C0과 흡착 후의 납이온 농도 C1을 측정한다. 계산식(3)에 따라 납이온의 흡착률을 산출한다.

1.4 락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34의 표면 소수성 측정

락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34 세균 현탁액을 1500xg에서 10분간 원심 분리하여 균체를 수집한 후 생리 식염수로 2번 씻고 원심 분리하여 균체를 수집한다. 생리 식염수로 균체농도를 조절하고 580nm 파장에서 흡광도 값을 1.000로 한다. 흡광도의 조절이 완료된 세균현탁액 2ml를 취하여 2ml의 자일렌과 혼합하여 120분간의 와동 시킨 후, 실온에서 30분간 방치하여 상층수 1ml를 흡취한다. 생리 식염수를 블랭크 대조군으로 하고, 580nm 파장에서 블랭크 대조군의 흡광도 값 A0와 샘플 흡광도 값 A1을 측정하여, 계산식 (4)에 따라 유산균의 표면 소수성을 산출한다.

1.5 락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34의 체외 항산화 능력 측정

1.5.1 락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34의 체외 히드록실라디칼 제거능력 측정

락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34를 10⁹cfu/mL 세균현탁액으로 조제하여 샘플로 하여 사용에 준비해 둔다. 시험관중에 각기 0.05mol/L pH7.4 인산염 완충액과 1mL，6mmol/L O-페난트롤린 0.5mL을 넣어, 충분히 섞은 후, 6mmol/L FeSO₄용액 0.5mL을 넣어 즉시 혼합한다. 시험관은 샘플관, 공관과 대조관으로 나뉜다. 샘플관에는 세균현탁액 샘플용액 0.5mL를 넣고, 대조관에는 0.1% H₂O₂용액 0.5mL를 넣고 충분히 섞은 후 0.1%의 H₂O₂용액 0.5mL을 넣으며, 마지막으로 용량을 4mL로 채운다. 그 다음에 37℃에서 1h 보온한다. 536nm 파장에서 측정한 흡광도를 각각 Ai, A로 한다. 공관에는 샘플 용액과 H₂O₂용액을 넣지 않고, 직접 인산염 완충액을 4mL로 추가하여 후속 실험을 진행하며, 측정된 최종 흡광도를 A0로하여, 계산식 (5)에 따라 히드록실라디칼 제거율을 산출한다.

1.5.2 락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34의 체외 DPPH기 제거능력 측정

1mL 락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34 세균현탁액（10⁹cfu/mL）중에 2mmol/L DPPH에탄올 용액 1mL를 넣는다. 1mL의 락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34 세균현탁액（10⁹ cfu/mL）중에 무수 에틸에탄올 용액 1mL를 넣는다. 1mL 2mmol/L DPPH에탄올용액중에 무수 에틸에탄올 용액 1mL를 넣고 실온에서 30분간 정치한 후, 517nm 파장에서 측정한 흡광도를 각각 Ai，Aj, A0으로 하며, 계산식（6）에 따라 DPPH 라디칼 제거율을 산출한다.

1.5.3 락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34의 체외 과산화물 음이온 제거능력 측정

4.5mL pH8.0 Tris-HCl 완충액중에 락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34 세균현탁액（10⁹cfu/mL）0.1mL를 넣는다. 25℃에서 20분간 수조에서 예열한 후 25mmol/L의 피로갈롤 0.4mL를 넣고， 25℃에서 5분간 수조에서 반응시킨 후 8mol/L HCl를 2방울 넣어 반응을 중지시킨다. 325nm 파장에서 측정한 흡광도는 A로 하고, 공백 그룹에는 0.1mL H₂O로 샘플을 대체하여 A0로 하며, 계산식식（7）에 따라 과산화물 음이온 제거율을 산출한다.

1.5.4 락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34의 체외 환원력 측정

락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34의 세균현탁액（10⁹ cfu/mL）0.5mL중에 0.2mol/L pH7.2 인산염 완충액 0.5mL와 1% 칼륨페리시안화물 0.5mL를 넣고 50℃에서 20분간 수조에 담근 후 즉시 냉각시킨다. 10% 트리클로로아세트산 0.5mL를 넣고 1500xg에서 10분간 원심 분리한 후 상청액 1mL를 흡취하여 증류수 1mL와 0.1% 염화제이철1mL를 넣고 충분히 섞는다. 10분 후 700nm 파장에서 그의 흡광도를 측정한다. 각기 다른 용량의 시스테인 그룹을 기준으로 설정하여, 샘플 그룹 흡광도를 기준 그룹 계량 단위（μmol/L）로 환산하여 비교한다.

1.6 락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34의 에너지 측정 결과

LF-SCHY34가 인공 위액중의 생존율은 88.71%±0.23% 이고, 인공 담즙염중의 성장효율은 85.32%±0.41% 이며，표면 소수율은 43.78%±0.75% 이고，납이온 흡착률은 69.58%±0.56% 이다. 그리고，히드록실라디칼과 과산화물 음이온 및 DPPH에 대한 제거율은 각각 44.15%±0.41%，66.11%±0.97%, 79.49%±0.87%이고, 환원력은 111.66±1.18μmol/L이다. 각 그룹의 데이터로 볼 때, LF-SCHY34는 강한 체외 항산화 능력을 갖고 있고 라디칼을 효율적으로 제거할 수 있다.

실시예2: 락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34 균체에 대한 납이온 흡착 전후의 주사형 전자현미경, 주사 에너지 분광기 분석과 투사 전자현미경 분석

2.1 주사형 전자현미경과 주사 에너지 스펙트럼 분석

납이온을 함유하지 않는 용액 균체와 50mg/L 납이온을 흡착한 균체를 흡취하여 8000xg에서 20분간 원심 분리한 후, 다시 멸균된 초순수로 3번 씻은 다음, 같은 조건으로 원심 분리하며, 그 후, 글루타르알데히드를 부어 넣어 1.5h 고정시키고, 인산염 완충액으로 3번 씻은 후, 6000xg에서 10분간 원심 분리하고, 다시 각기 다른 농도(50%、70%、90%、100%)의 에탄올로 1번 탈수한 후, 6000xg에서 10분간 원심분리하여 에탄올, t-부틸알콜 혼합액(v/v=1/1), 및 순수한 t-부틸알콜로 1번 씻고 탈수한 후, 6000xg에서 10분간 원심 분리한다. 그 후, 균체를 -20℃에서 30분간 동결시킨 후 동결건조기에 넣어 4시간 동안 건조한다. 마지막으로 이온스퍼터링 코팅기로 샘플 표면에 100~150A 두께의 금속막을 도금하여 관찰실에 넣어 관찰하고, 에너지 분사 분광기로 원소 구성을 분석한다.

2.2 투사 전자현미경 분석

납이온을 포함하지 않는 용액 균체와 50mg/L 납이온을 흡착한 균체를 흡취하여 8000xg에서 20분간 원심 분리한 후，2.5%의 글루타르알데히드용액을 사용하여 온도 4℃에서 고정시켜 밤을 새우고, 고정액을 버리고 0.1M，pH7.0 인산염 완충액으로 샘플을 총 3번, 매번 15분간씩 헹군다. 1%의 오스뮴산용액으로 샘플을 1-2시간 동안 고정한다. 오스뮴산 폐액을 조심스럽게 제거하고 0.1M，pH7.0 인산염 완충액으로 샘플을 총3번, 매번 15분간씩 헹군다. 그 후, 단계별 농도 （30%，50%，70%，80%，90%와95% 총 6 가지 농도를 포함）의 에탄올 용액으로 샘플을 탈수 처리하고, 각 농도별로 15분간 처리한 후 다시 100% 에탄올로 20분간 처리한다. 포매제와 아세톤의 혼합액(v/v=1/1)로 1시간동안 샘플을 처리한다. 포매제와 아세톤의 혼합액(v/v=3/1)로 3시간동안 샘플을 처리한다. 순포매제로 샘플을 처리해 밤을 새우고. 삼투 처리된 샘플을 포매하여 70℃에서 밤새 가열한 후 포매 완료된 샘플을 얻는다. 샘플을 절편한 후 구연산납 용액과 우라닐아세테이트를 50%함유하는 에탄올 포화 용액으로 각각 5-10분 간 염색하여 건조한 후 투사형 전자현미경으로 관찰한다.

2.3 결과

도 1은 LF-SCHY34 유산균 납이온 흡착 전후의 주사형 전자현미경과 투사 전자현미경 사진이다. 도 1-a는 흡착 전 정상 그룹 LF-SCHY34 균체의 주사형 전자현미경 사진이다. 관찰을 통해 유산균 세포는 형태가 온전하고, 윤곽이 선명하고, 깨끗하고 포만하며, 표면이 매끄럽고 가장자리 경계가 뚜렷하며, 표면에 과립물이나 점착물이 없음을 발견하였다. 1-c는 납 흡착 후 LF-SCHY34 균체의 주사형 전자현미경의 사진이다. 유산균 균주 세포가 심하게 변형되어 있고 균체 세포가 움푹하게 패어진 형태를 나타내고, 외관이 거칠고, 세포가장자리의 윤곽이 흐려져 있고, 심지어는 유착하여 조각을 이루고 불규칙적인 응집 현상이 발견됨과 동시에, 세포 표면이 미세한 입자로 커버되어 있음이 발견되었다.

도 1-b는 흡착 전 정상 그룹 LF-SCHY34의 투사 전자현미경 사진이다. 정상 그룹 균주 세포 단면에 침전물과 접착합물 없이 깨끗한 표면을 가지고 있다. 도 1-d는 흡착 후 LF-SCHY34 균체의 투사 전자현미경의 사진이다. 정상 그룹 균체에 비해 납이 흡착된 유산균 세포 단면에는 대량의 흑색 침적물이 생겨 있고, 세포 내부에 여백 부위가 나타나 있었다.

도 2는 납이온 흡착 전후 LF-SCHY34 유산균의 에너지 스펙트럼 탐지 토퍼그래피 사진과 주사 에너지 스펙트럼 사진이다. 표 2는 납이온 흡착 전후 유산균의 주사 에너지 스펙트럼 원소 변화표이다. 도 2와 표 1에 표시된 바와 같이, 정상 그룹에 비해 납이 흡착된 유산균 균체 표면에는 O와N 원소의 함유량이 저하되고, C，P，Pb 원소 함유량이 증가됨을 알 수 있다.

납이온 흡착 전후 유산균의 주사 에너지 스펙트럼 원소 변화표

	납이온 흡착 전		납이온 흡착 후
원소	wt%	원자 백분율	wt%	원자 백분율
C	47.34	53.29	47.55	55.17
N	25.83	24.93	22.91	22.80
O	25.00	21.13	23.99	20.90
P	1.45	0.63	1.99	0.89
Pb	0.38	0.02	3.56	0.24
총량	100.00	100.00	100.00	100.00

실시예3: 아세트산납으로 인해 유발된 쥐의 산화스트레스에 대한 락토바실러스 퍼멘텀 LF-SCHY34의 완화 효과

아래 실험에서 혈청 및 조직샘플에 관한 측정을 총 3번 동시에 진행하여, 평균값을 산출한다. SPSS 소프트웨어（SPSS v.25 for Windows, IBM Software Group, Chicago, IL, USA）로 데이터의 평균값을 구하고 분석을 진행한다. Duncan 다중범위 검정은 단일요소에 대 한 분산 분석을 통해 각 그룹 평균값 간의 차이를 평가한다. 차이 p<0.05일 경우, 통계학적인 의미가 있다고 판단된다.

3.1 동물실험

48마리의 6주 차 SPF급 수컷 SD쥐들에게 적응성 먹이를 1주일 먹인 후 무작위로 4개 그룹으로 나눈다. 즉 정상 그룹 12마리, 납유도 그룹 12마리, EDTA（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）그룹 12마리 및 LF-SCHY34 그룹 12마리로 한다. 정상 그룹의 쥐는 전체실험 주기중 AIG-93G 사료를 자유로 먹게 하고, 아세트산납을 함유하지 않는 음용수를 자유로 마시게 한다. 나머지 세 그룹은 AIG-93G 사료를 자유로 먹게함과 동시에, 첫 주차부터 12주 차까지 음용수 대신에 농도가200mg/L인 아세트산납 용액을 자유로 마시게 한다. EDTA 그룹 쥐에게는 8주차부터 12주 차까지 매일 농도가 50mg/kg인 EDTA를 주사한다. LF-SCHY34 그룹 쥐에게는 첫 주차부터 12주차까지 매일 1×10⁹CFU/kg(b.w) LF-SCHY34를 위내 투약한다.

12주 후 모든 쥐에게 12시간 금식한 후, 에테르로 마취하고 눈가 정맥에서 혈액을 채취한 후에 죽이며, 액체 질소로 쥐의 심장, 간장, 신장, 뇌조직을 채취하고 -80℃에서 보관하여, 사용에 준비하여 둔다. 본 연구는 헬싱키 선언에 따라 진행되며, 해당 방안은 2019년6월8일(중국 충칭시) 충칭시 기능식품 협동혁신 센터 윤리 위원회의 승인(201906008A)을 받았다.

3.2 SD쥐의 혈액, 간장, 신장과 뇌조직중의 납 함유량 측정

납 표준 용액 0.0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0 mL를 정확히 취하여, 50mL의 정량 플라스크에 넣고, 12.5% 인산이수소암모늄과 2.5% 질산마그네슘을 함유하는 혼합용액 2mL를 넣어 2%의 질산으로 용량을 채운 후, 상기 각기 다른 농도의 표준 용액을 20μL씩 흡취하여 흑연로 원자화기중에 넣어 흡광도를 측정하고 표준 그래프를 작성한다.

수집된 혈액 500μL및 각 조직을 50mg 취하여, 테트라플루오로에틸렌 소화조중에 넣고 질산 5ml를 넣어 소해시키고 식힌 후 12.5% 인산이수소암모늄과 2.5% 질산마그네슘을 함유하는 혼합용액 1mL를 넣고 질산으로 용량을 25 mL까지 채운 후 이 용액을 20μL 취하여 흑연로 원자화기중에 넣어 흡광도를 측정하고 표준 그래프로 혈액의 납 함량을 산출한다.

SD쥐의 혈액, 간장, 신장과 뇌조직중의 납 함량

Group	혈액 납함량 （μg/L）	간장 납함량 （μg/g）	신장 납함량 （μg/g）	뇌조직 납함량 （μg/g）
정상그룹	2.14±0.30^a	0.84±0.11^a	1.69±0.18^a	0.45±0.07^a
납유도그룹	32.48±1.28^d	13.05±0.26^d	23.39±1.97^d	6.75±0.09^d
EDTA그룹	21.69±0.49^c	10.41±0.20^c	20.28±0.19^c	3.34±0.06^c
LF-SCHY34그룹	18.93±0.52^b	6.16±0.18^b	13.54±0.94^b	2.48±0.04^b

^a-d는 Duncan의 새로운 MRT에 근거하여, 동일표중의 각기 다른 알파벳 평균치 간에는 현저한 차이(p <0.05)가 있다는 것을 설명한다.

표 2의 데이터에 따르면 아세트산 납 용액에 의해 유도되지 않은 정상 그룹 쥐의 혈액, 간장, 신장과 뇌조직중의 납함량은 모든 그룹별 중에서 가장 낮았다. 반대로 납유도 그룹 쥐의 혈액, 간장, 신장과 뇌조직중의 납함량은 모든 그룹별 중에서 가장 높았다. 그중 혈액과 신장에서의 납함량은 정상 그룹 쥐의 20배와 17배였다. EDTA 약물 및 LF-SCHY34로 간섭된 쥐의 혈액, 간장, 신장 및 뇌 조직중의 납함량은 뚜렷하게 감소되어 있었다. 특히 LF-SCHY34로 간섭된 쥐의 혈액과 신장중의 납함량은 정상 그룹의 7배와 10배였다. 이는 간섭 효과가 EDTA약물 보다 좋다는 것을 말한다.

뿐만 아니라 데이터 비교를 통해 아세트산 납에 의해 유도된 쥐의 혈액 중의 납함량이 가장 높고, 조직 및 장기 보다 훨씬 더 높다는 것이 발견되었다. 세 가지 조직 및 장기 중에서 납함량을 높은 순위에서 낮은 순위로 배열한다면 신장, 간장 그리고 뇌조직이다.

3.3 SD쥐의 간장, 신장 조직에 대한 형태학적 분석

각 그룹의 SD쥐의 간장과 신장 조직의 같은 부위 조직을 취하여 10% 포르말린(v/v)중에서 24시간동안 고정한 후, 조직 탈수, 제거, 왁싱, 포매, 절편 및 염색 단계를 거쳐 광학 현미경 (BX43; Olympus, Tokyo, Japan)으로 조직학적 형태를 관찰하고 사진을 찍는다.

SD쥐의 간장 절편 단면도는 도4와 같다. 도 4에서 정상 그룹(도 4a) 쥐의 간소엽 구조가 순서적이고 중심정맥과 간 정현파를 뚜렷하게 관찰할 수 있었다. 아세트산납으로 유도된 쥐(도 4b)의 간소엽은 흐려져 있었고, 간세포판이 무질서하게 배열되어 있었으며, 단핵 세포가 각기 다른 틈새에서 응집 및 분산되어 있어, 간 세포의 소상괴사 및 대면적 염증세포의 침윤으로 인해 세포핵간 봉입체와 세포핵이 파쇄된다. 약물 EDTA（도 4c）와 LF-SCHY34（도 4d）로 간섭되고 아세트산납으로 유도된 쥐의 간장 세포는 배열이 더 질서적이였고 염증 세포의 침윤과 간장 세포에 대한 파손과 괴사도 적었다.

SD쥐 신장 절편 단면도는 도 5와 같다. 도 5로부터 정상 그룹(도 5a)중 쥐의 사구체와 세뇨관 구조가 정상이고 세포가 조밀하게 배열되어 있고 세포수가 정상이란 것을 알 수 있다. 아세트산납에 의해 유도된 SD 쥐의 신장절편(도 5b)중 사구체와 세뇨관의 확대와 과다한 세포수, 모세혈관 확장 및 충혈, 세뇨관 내강 확장, 액포 형성, 상피 세포 과립 변성, 세포 파쇄, 림프구 침윤이 발견되었다. 납유도 그룹에 비해, EDTA 그룹(도 5c) 및 LF-SCHY34 그룹(도 5d)의 SD쥐의 신장 절편중 사구체 및 세뇨관 손상이 적고 세포 온정성이 좋고 염증 세포 침윤 현상이 적었으며, 심각한 세뇨관 확장 및 액포화 현상이 없었다. LF-SCHY34로 처리한 SD쥐의 간장과 신장 형태가 정상 그룹 쥐의 형태와 더 가까웠다.

3.4 SD쥐의 혈청, 간장, 신장 및 뇌조직중 산화 레벨 측정

각 장기 및 조직 100mg를 취하여, 생리 식염수로 균질화하고 혈액을 원심 분리한 후 상청액을 흡취하여 실험을 진행한다. 키트（Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China）사용법에 따라 기관 생화학적 지표 카탈라아제(CAT), 활성산소(ROS), 총과산화물디스뮤타제(T-SOD), 말론디알데히드(MDA) 및 글루타티온(GSH)의 레벨을 측정한다.

SD쥐의 혈청, 간장, 신장 및 뇌조직 중 산화 지표 데이터는 표3과 같다. 표3에 표시된 바와 같이, 정상 그룹의 쥐의 혈액, 간장, 신장과 뇌조직중의 CAT、T-SOD와 GSH는 4개 그룹 중 가장 높았고, MDA와 ROS는 가장 낮았다. 납유도 그룹의 혈액, 간장, 신장과 뇌조직중의 추세는 정상 그룹과 정 반대였다. 납유도 그룹의 CAT、T-SOD와 GSH는 4개 그룹 중 가장 낮았고, MDA와 ROS는 가장 높았다. EDTA그룹과 LF-SCHY34그룹의 산화 지표 추세는 정상 그룹과 비슷히였다. 그중 LF-SCHY34그룹의 산화 지표 레벨은 정상 그룹 산화 지표 레벨과 더 가까웠다.

SD쥐의 혈액, 간장, 신장, 뇌조직중 산화지표의 함량

항목	조직 및 혈청	그룹
		정상그룹	납유도그룹	EDTA그룹	LF-SCHY34그룹
T-SOD	간U/mgprot	253.78±14.29^d	155.41±10.76^a	182.33±9.91^b	224.65±10.37^c
	신장U/mgprot	111.95±4.38^d	56.18±2.56^a	86.21±4.31^b	99.39±3.68^c
	뇌U/mgprot	264.72±7.26^d	94.59±6.76^a	146.34±8.43^b	200.75±10.76^c
	혈청U/mlprot	409.48±10.58^d	218.67±7.29^a	338.45±15.47^b	386.47±3.85^c
CAT	간U/mgprot	52.48±1.71^d	13.84±0.79^a	30.76±3.01^b	41.58±1.78^c
	신장U/mgprot	12.79±0.64^d	2.18±0.30^a	4.16±0.71^b	8.59±0.45^c
	뇌U/mgprot	45.89±1.96^d	18.15±1.03^a	28.43±1.61^b	35.97±1.97^c
	혈청U/mlprot	37.81±1.45^d	13.49±1.48^a	25.49±1.56^b	31.33±1.72^c
GSH	간umol/g	416.81±14.56^d	206.81±11.74^a	290.25±18.65^b	352.24±15.51^c
	신장umol/g	291.46±16.45^d	118.64±15.71^a	186.93±13.52^b	235.02±15.23^c
	뇌umol/g	354.32±10.53^d	178.52±17.10^a	221.85±18.79^b	295.11±10.25^c
	혈청umol/l	286.57±15.22^d	104.82±14.67^a	195.64±13.71^b	247.50±11.63^c
MDA	간nmol/mgprot	1.11±0.04^a	3.35±0.20^d	2.87±0.14^c	1.58±0.19^b
	신장nmol/mgprot	0.57±0.14^a	3.30±0.54^d	2.16±0.21^c	1.40±0.17^b
	뇌nmol/mgprot	7.49±0.45^a	28.56±0.12^d	18.43±0.25^c	12.71±0.57^b
	혈청nmol/mlprot	1.45±0.09^a	7.97±0.53^d	5.36±0.41^c	3.04±0.30^b
ROS	간(Х10⁴)	2.32±0.19^a	6.41±0.12^d	3.61±0.17^c	2.88±0.13^b
	신장(Х10⁴)	1.94±0.41^a	5.82±0.21^d	6.57±0.23^c	4.99±0.17^b
	뇌(Х10⁴)	0.94±0.14^a	6.14±0.32^d	3.87±0.16^c	2.60±0.37^b
	혈청(Х10⁴)	2.74±0.10^a	9.96±0.39^d	6.68±0.29^c	4.56±0.26^b

3.5 SD쥐의 혈청, 간장 및 신장중 염증 인자 레벨 측정

쥐의 혈청 및 조직 균질화 된 상청액을 취하여 키트（Shanghai Yaji Biotechnology Co. Ltd. Shanghai, China）사용법에 따라 혈청중 IL-6, IL-10, IL-1β, TNF-α, IFN-γ의 레벨을 측정한다.

SD쥐의 혈청, 간장 및 신장 염증 지표의 관련 데이터는 표 4와 같다. 정상 그룹의 혈청, 간장과 신장중의 IL-1β，IL-6、TNF-α와IFN-γ레벨은 4개 그룹중에서 가장 낮았고, IL-10레벨이 가장 높았다. 하지만 납유도 그룹중 IL-10레벨이 4개 그룹에서 가장 낮았고, IL-1β，IL-6、TNF-α와 IFN-γ레벨이 가장 높았다. EDTA 그룹과 LF-CQPC 그룹의 IL-1β，IL-6、TNF-α와 IFN-γ레벨이 납유도 그룹과 비교하면 하락되는 추세를 보였고, 그리고 IL-10레벨이 납유도 그룹에 비해 상승하는 추세를 보였다. 하지만 LF-SCHY34 그룹의 하락 및 상승 추세는 EDTA 그룹 보다 더욱 뚜렷하였다.

SD쥐의 혈액, 간장 및 신장 중 염증 지표의 함량

항목	조직 및 혈청	그룹
		일반그룹	납유도그룹	EDTA그룹	LF-SCHY34그룹
IL-1β	간μmol/g	20.16±1.24^a	39.18±1.33^d	31.76±1.18^c	27.03±1.10^b
	신장μmol/g	21.37±1.05^a	45.61±1.95^d	36.70±1.54^c	39.18±1.31^b
	혈청μmol/L	20.07±0.37^a	30.30±0.63^d	26.36±0.46^c	23.33±0.39^b
IL-6	간μmol/g	63.78±1.52^a	120.48±1.77^d	100.79±1.85^c	82.67±1.22^b
	신장μmol/g	52.56±1.69^a	88.12±1.35^d	75.32±1.61^c	61.98±1.34^b
	혈청μmol/L	51.66±1.13^a	93.25±1.57^d	80.88±1.96^c	72.01±1.08^b
IL-10	간μmol/g	41.13±1.36^d	17.70±1.15^a	25.86±1.84^b	33.95±1.37^c
	신장μmol/g	57.51±0.94^d	13.68±1.45^a	27.45±1.74^b	39.56±1.05^c
	혈청μmol/L	43.94±1.18^d	21.55±1.68^a	29.45±1.63^b	36.97±1.56^c
TNF-α	간μmol/g	256.34±6.31^a	389.97±10.65^d	332.21±9.45^c	289.56±8.45^b
	신장μmol/g	175.66±7.15^a	292.96±10.75^d	273.55±4.33^c	232.76±6.73^b
	혈청μmol/L	144.67±7.23^a	259.21±9.51^d	212.31±5.41^c	189.33±6.40^b
IFN-γ	간μmol/g	34.74±1.42^a	83.74±1.85^d	68.41±1.24^c	55.68±1.75^b
	신장μmol/g	36.75±1.69^a	75.15±1.34^d	61.25±1.54^c	49.61±1.28^b
	혈청μmol/L	40.26±1.67^a	90.25±1.56^d	75.42±1.21^c	59.84±1.13^b

3.6 SD쥐 혈청δ-ALAD, ALT, AST, CRE와BUN의 레벨 측정

쥐 혈청을 취하여 키트(Shanghai Yaji Biotechnology Co. Ltd., Shanghai, China) 사용법에 따라 혈청중의 δ-아미노레불린산탈수효소（δ-ALAD）, 알라닌아미노전이소（ALT）, 아스파르트산아미노기전달효소（AST）, 혈액크레아틴（CRE）과 혈액요소성질소（BUN）의 레벨을 측정한다.

SD쥐의 혈청중 ALT，AST、δ-ALAD효소 활성과 BUN、CRE 함량은 표 5와 같다. 4개 그룹중 정상그룹 SD쥐의 ATL와 AST의 효소 활성이 가 가장 낮았고, δ-ALAD의 효소 활성이 가장 높았으며, BUN、CRE 함량이 가장 낮았다. 납유도 그룹의 간장 관련 ATL，AST의 효소 활성이 가장 낮았고, δ-ALAD효소 활성과 신장 관련 BUN、CRE함량이 납유도 그룹중에서 가장 높았다. EDTA 그룹과 LF-SCHY34 그룹의 3가지 효소 활성 추세와 BUN、CRE 함량은 정상 그룹과 비슷하였다. 효소 활성과 BUN，CRE 함량의 데이터로부터 보면，LF-SCHY34의 간섭 효과가 EDTA그룹 보다 더 좋다.

SD혈청 중 ALT、AST、BUN、CRE와 δ-ALAD의 함량

Goups	ALT(μmol/L)	AST(μmol/L)	BUN(μmol/L)	CRE(μmol/L)	δ-ALAD(μmol/L)
정상 그룹	31.06±2.52^a	58.51±2.78^a	1344.85±48.76^a	29.48±1.21^a	505.04±16.98^d
납유도그룹	63.79±2.42^d	87.43±2.85^d	2070.89±49.60^d	42.12±1.14^d	351.47±15.74^a
EDTA그룹	51.46±2.87^c	76.67±2.45^c	1859.42±36.81^c	34.49±1.82^c	390.24±17.85^b
LF-SCHY34그룹	42.30±1.65^b	69.65±2.74^b	1609.09±37.64^b	31.12±1.34^b	435.74±15.87^c

3.7 SD쥐 간장 및 신장 조직mRNA분석

TRIzol（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）를 사용하여 간장 조직중의 RNA를 추출하고, RNA 농도를 1μg/μL로 조절하며, cDNA역전사 시약 키트(Thermo Fisher Scientific)로 RNA를 cDNA로 합성한다. 그 후, 합성된 cDNA와 10μL SYBR Green PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific）, 2μL 프라이머（표 6）와 증류수를 혼합한 후 qPCR 기기에 넣어 처리를 한다. qPCR 프로그램은 다음과 같다. 95℃ 60초, 95℃ 15초, 55℃ 30초, 72℃ 35초, 40개 순환. 95℃ 30초, 55℃ 35초. 글리세르알데하이드 3-인산탈수소효소 (GAPDH)를 내부참조 유전자로 사용하고, 2^-△△Ct계산식에 따라 mRNA에 대응하는 전사 레벨을 산출한다.

프라이머 서열

Gene	Forward Sequence	Reverse Sequence
SOD1	5′-GCGTCATTCACTTCGAGCAGA- 3′（SEQ ID NO:4）	5′-CATATTGATGGACATGGAACCCA- 3′（SEQ ID NO:5）
SOD2	5′-AGCCTCCCTGACCTGCCTTAC- 3′（SEQ ID NO:6）	5′-CGCCTCGTGGTACTTCTCCTC- 3′（SEQ ID NO:7）
HO-1	5′-CATGTCCCAGGATTTGTCCG- 3′（SEQ ID NO:8）	5′-GGGTTCTGCTTGTTTCGCTCT- 3′（SEQ ID NO:9）
NQO1	5′-GTCTGGAGACTGTCTGGGAGGA- 3′（SEQ ID NO:10）	5′-TCGGCTGGAATGGACTTGC- 3′（SEQ ID NO:11）
γ-GCS	5′-TCTGAGGCAAGATACCTTTATGACC- 3′（SEQ ID NO:12）	5′-AAATCACTCCCCAGCGACAAT- 3′（SEQ ID NO:13）
Keap1	5′-GTGCTCAACCGCTTGCTGTAT- 3′（SEQ ID NO:14）	5′-AATCATCCGCCACTCATTCCT- 3′（SEQ ID NO:15）
Nrf2	5′-CAGCACATCCAGACAGACACCA- 3′（SEQ ID NO:16）	5′-TCCAGGGCAAGCGACTCAT- 3′（SEQ ID NO:17）
GAPDH	5′-AAGTTCAACGGCACAGTCAAGG- 3′（SEQ ID NO:18）	5′-ACGCCAGTAGACTCCACGACAT- 3′（SEQ ID NO:19）

실험을 통해 간장 및 신장의 Keap1/Nrf2ARE경로와 관련되는 Keap1, Nrf2, HO-1, SOD, GSH, NQO1와 γ-GCS의 mRNA의 발현을 측정하였다. SD쥐의 간장 및 신장중 Keap1, Nrf2, HO-1, SOD1, SOD2, GSH, NQO1와 γ-GCS의 mRNA 발현량 데이터는 표 7과 같다.

표 7에 따르면 정상 그룹애 비해 SOD와 GSH의 발현량 뿐만 아니라, 다른 4개 그룹중 쥐의 Keap1, Nrf2, HO-1, SOD, GSH, NQO1 와 γ-GCS의 mRNA 발현은 모두 어느정도로 증가되어 있었다. 정상 그룹의 SOD와 GSH의 mRNA발현량은 4개 그룹 중에서 가장 높았다. 납유도 그룹의 Keap1、Nrf2、HO-1、NQO1와 γ-GCS의 mRNA발현량은 정상 그룹 보다 높지만 현저한 차이는 없었다（p＜0.05）. 납유도 그룹에 비해 EDTA그룹과 LF-SCHY34 그룹의 Keap1, Nrf2, HO-1, SOD1, SOD2, GSH, NQO1와 γ-GCS의 mRNA발현량은 모두 대폭 증가되었다. LF-SCHY34 그룹은 관련 유전자의 mRNA발현량 면에서 EDTA그룹의 발현량 보다 현저히 높았다.

Goups	납유도 그룹	EDTA 그룹	LF-SCHY34 그룹
Keap1	1.00±0.03^b	3.46±0.11^c	4.59±0.09^d
Nrf2	1.00±0.07^b	4.34±0.07^c	5.71±0.11^d
HO-1	1.00±0.06^a	3.35±0.11^b	4.98±0.13^c
SOD1	1.00±0.08^a	3.67±0.09^b	5.51±0.09^c
SOD2	1.00±0.11^a	3.18±0.12^b	5.07±0.10^c
GSH	1.00±0.09^a	4.47±0.12^b	6.01±0.17^c
NQO1	1.00±0.13^a	3.97±0.14^b	5.95±0.08^c
γ-GCS	1.00±0.11^a	3.58±0.09^b	5.88±0.13^c

3.8 SD쥐의 간장 및 신장 조직중 Western blot분석

간조직 100mg를 1mL RIPA(Thermofisher, Waltham, MA, USA)와 10μL PMSF(Thermofisher)에 넣어 균질화 하고 4℃에서 12000xg로 5분간 원심분리 한다. BCA 단백질 측정키트(Thermofisher)로 단백질을 정량화 시킨다. 단백질샘플과 샘플완충액(Thermofisher)을 4:1로 혼합하고 95℃에서 5분간 가열한 다음 샘플을 SDS-PAGE 겔 구멍에 주입하여 100V에서 겔을 제거한다. SDS-PAGE 겔에 위의 밴드를 PVFD 필름에로 옮겨 5% 탈지우유중에서 PVDF필름을 1시간동안 차단한 후, 4℃에서 1차항체 (Thermofisher)와 함께 밤새 부화하고, 필름 세척후 항체(Thermofisher)를 넣어 1시간 동안 부화한다. western ECL substrate（Thermofisher）를 사용하여 화학적 발광을 진행한 후 iBright（Thermofisher）중에서 이미지를 획득한다（도 7）.

3.9 결과 분석

선행 문헌에 따르면 10⁶CFU의 생균이 위장까지 도착하면 더 좋은 프로바이오틱스 효능을 발휘할 수 있다. 인간 위액의 pH레벨은 일반적으로 약 3.0이고 소장의 담즙염 함량은 0.03-0.30% 이다. ??문에 산과 담즙염에 대한 내성이 낮은 유산균은 이런 환경에서 생존할 수 없다. 반대로 이런 환경에 적응할 수 있는 유산균은 소화관에서도 생존할 수 있다. 위산중 LF-SCHY34의 생존율은 88.71%, 담즙염중의 생장율은 85.32%이다. 이는 10⁹CFU LF-SCHY3를 섭취했을 경우, 장내에 순조롭게 도달하여 프로바이오틱스의 효능을 발휘할 수 있다는 것을 말한다.

유산균의 중금속 흡착은 일반적으로 생물 흡착과 생물 축적 2단계로 나뉜다. 생물 흡착은 세포외 침전, 표면착화 및 이온교환 등 작용이 포함되는데, 주로 일부 미생물의 표면단백질, 다당류, 지질 등 물질의 화학 그룹과 세포 표면에 함유되는 일부 이온이 금속과 상호작용하여 금속착합물을 형성하게 되며, 생물 축적은 필름간 수송, 세포내 축적, 세포 생리적 대사 및 자체 조절 메커니즘 등이 포함된다. 실험 결과에 따르면납이온에 대한 LF-SCHY34의 체외 흡착률은 74.8%로서, Halttunen 등이 발견한 약 39.70~69.60% 범위 보다 훨씬 납흡수율을 가지는 유산균이 발견되었다. 동물실험 결과도 LF-SCHY34는 SD 쥐의 혈액, 간장, 신장 및 뇌조직중의 납함량을 감소시킬 수 있다고 밝혔다. 주사형 전자현미경, 투사형 전자현미경과 주사 에너지 스펙트럼 분석을 통하여, LF-SCHY34는 납흡착에 참여하는 과정중에서 용액중의 납이온을 더 잘 흡수할 수 있으며, 흡착 과정중 균체 표면이 함유하는 C 및 P 그룹도 납흡착에 참여하였다. 대량의 납이온을 흡착한 후, 일부 유산균 균체의 형태가 손상되거나 내부에 변화가 생기고 심지어는 파열되어, 세포내의 O 및 N 원소를 함유하는 물질이 용출되어, O 및 N 원소 함량의 대폭 증가하게 된다. 때문에 LF-SCHY34는 우수한 납흡착유산균으로서 생물 흡착과 축적 흡착 등 두 가지 납이온의 흡착 방식이 포함된다.

다른 한편으로, 인간과 동물의 조직과 장기가 장기간 납노출 상태에 처하면, 활성산소(ROS)의 함량이 증가되고 글루타치온(GSH)의 함량과 일부 중요한 항산화효소, 예컨대SOD과 CAT의 활성이 낮아지거나 심지어는 상실되며, 디알데히드(MDA)의 함량이 증가되어, 세포막중의 지질 과 산화과정을 가속화한다. 활성산소(ROS)는 주로 과산화물, 산소이온 및 산소함유 라디칼이 포함된다. 유산균은 세포주변의 활성산소 라디칼을 제거함으로써 산화손상과 지질 과산화를 완화할 수 있으며, 숙주세포의 항산화를 통해 관련된 신호 전달 경로를 조절함으로써, 유기체의 산화스트레스를 더한층 효과적으로 막아줄 수 있다. 이번 체외 데이터에 따르면, LF-SCHY34이 수산기 라디칼, 과산화물 음이온 및 DPPH에 대한 제거율은 각각 44.15% ± 0.41%, 66.11% ± 0.97%, 79.49% ± 0.87%이며, 환원력은 111.66 ± 1.18μmol/L이다. Takashi Kuda 등은 다른 유산균의 DPPH 제거율과 과산화물 음이온 제거율이 약 78%-90%, 45%~62%에 달한다고 밝혔다. Ramila AZAT 등은 실험을 통해 유산균의 수산기 라디칼 제거율이 최고 45.79%까지 달한다고 밝혔다. Zhai 등에 의해 측정된 유산균의 최고 높은 환원력은 99.41μmol/L의 L-시스테인과 상당하였다. 상기 실험 결과를 이번 실험에서 나온 데이터와 비교하면 LF-SCHY34가 더 효율적으로 라디칼을 제거할 수 있고, 더 강한 체외 항산화 능력을 가진다는 것을 알 수 있다. 동물 실험에서도 납유도 그룹에 비해 LF-SCHY34 그룹의 혈청, 간장, 신장 및 뇌조직중의 SOD, CAT 활성, GSH 함량이 비교적 높고, ROS 및 MDA 레벨이 비교적 낮다는 것을 확인할 수 있다. 때문에, LF-SCHY34는 더욱 높은 체외와 체내 항산화 능력을 갖는 우수한 균주라는 것을 추론할 수 있다.

소수성은 유산균세포가 장내상피세포에 부착하는 중요한 지표중의 하나이다. 소수성이 높으면 높을 수록 유산균의 부착성이 더 좋아진다. Nadia S.AlKalbani 등은 실험을 통해, 유산균의 소수성이 0.5%-44.1%라고 밝혔는데, 본 실험에 의한 LF-SCHY34의 소수성은 43.78%±0.75%였다. 이는 LF-SCHY34의 접착력이 더욱 좋으며, 인간의 장내에 더 잘 정착하여 프로바이오틱스 효과를 발휘할 수 있다는 것을 의미한다.

인체내의 납은 먼저 신장을 통해 배설되는데, 신장의 납의 최대 배설량에 달하면 납이 농축되어 근단 뇨세관 상피세포에 축적되어, 세포의 신진대사에 영향을 끼치게 되고, 신장의 구조와 기능이 손상된다. 세포가 손상되거나 괴사되면 세뇨관의 재흡수 기능이 저하되되며, 따라서 크레아티닌과 요소가 혈액중에 잔류하게 됨으로써, 혈액중의 크레아티닌 농도와 요소질소 농도는 신장기능 손상여부를 반영할 수 있다. 납은 체내의 δ-아미노레불린산탈수 효소（δ-ALAD） 활성을 억제하고 혈액중의 ALA를 증가시킨다. δ-ALA는 소변을 통해 배설되기에 혈액중의 δ-ALA 함량이 감소된다. 간은 인체의 가장 중요한 해독기관으로 소화기관을 통해 체내로 들어온 각종 독소를 생화학적 반응을 통해 저독성 물질로 전환하여 배설한다. 실험 결과에 따르면, 납은 다양한 정도의 간질환을 일으키고 심한 염증을 유발하고, 간관련효소의 활성에 영향을 끼치고, 간의 손상을 일으킬 수 있다. ALT와 AST는 간세포에 분포되어 있어, 간 세포가 손상되면 세포질중에 존재하는 ALT와 AST가 혈액중에 방출되기 때문에 혈액내의 ALT와 AST의 농도를 통해 간세포의 손상정도를 판단할 수 있다. 혈청 및 기관조직의 염증인자는 유기체의 염증손상정도를 반영할 수 있다. 혈청, 간장 및 신장염증인자 레벨, 혈청δ-ALAD, ALT, AST, CRE 및 BUN 검사 결과, 그리고 간장 및 신장 절편의 증례분석을 통해, LF-SCHY34는 납이온으로 인한 SD쥐의 간장 및 신장 손상을 완화할 수 있으며, 간장과 신장의 염증을 감소시키고 간장과 신장 세포의 온전성을 보호할 수 있다는 것이 발견되었다.

유기체는 환경유해요소에 저항하는 자기방어시스템을 갖추고 있어, 조직, 세포형태 및 기능에 대한 불리한 영향을 줄이고 세포생존을 촉진한다. 핵인자 E2의 관련인자 2(Nrf2)는 유기체의 자기방어시스템의 중요한 구성원이다. Nrf2는 산화환원상태에 민감한 전사 인자로서 주로 세포의 항산화 반응에 참여하므로, 유기체의 중요한 항산화인자로 간주된다. 정상적인 조건하에서 Kelch 상 에폭시클로로프로판 관련단백질 1(Keap1)은 세포질에서 Nrf2와 결합여 비활성화되고 점차 유비퀴틴으로 생분해된다. 유기체가 산화스트레스를 받으면 세포질중의 Nrf2가 Keap1에서 분리되어 나와 포핵으로 전달되어 일부 유전자의 상위의 항산화반응요소(ARE) 영역과 결합하여 유전자 발현을 시동(도X)하게 되는데, 이러한 유전자 코드로는 NQO1、HO-1와 γ-GCS가 포함된다. 이러한 세포보호용 유전자의 발현은 유해한 자극에 대한 세포의 자기방어 능력을 향상시키고 세포생존을 촉진할 수 있다. HO-1은 섬유아세포, 간세포, 신상피세포 등에 대해 항산화, 항염증 및 항자멸 등 보호 효과를 가지며, 헤모글로빈의 산화분해 반응을 촉진하는 첫 단계 속도 제한 효소로서, 최종 분해 산물은 일산화탄소, 빌리베르딘 및 이온 등으로서, 항산화 및 항염증의 이중효과를 가지며, 각종 심혈관 질환, 간장 및 신장기능 장애와 중추신경계 질환에 대해 중요한 보호역할을 한다. HO-1 단백질과 mRNA 함량의 증가는 일반적으로 체내의 산화스트레스와 세포손상에 저항하는 능력을 향상시킨다. NQO1은 거의 모든 동물의 체내에 보편적으로 존재하는 가용성 플라보나제로서, 이는 지방세포, 혈관내피세포, 상피세포중에서 높은 발현 수준을 갖고 있다. NQ01은 NADPH를 공여체로, 안정적인 하이드로퀴논을 생성하여 독성을 가지는 세미퀴논 라디칼과 활성산소의 단일전자 환원반응 및 세포내 설프히드릴의 직접 반응을 피면한다. NQ01은 강한 활성을 가지는 퀴논 물질을 해독하고 지용성 항산화제의 환원 형태를 유지하여 산화 스트레스로 받지 않도록 유기체를 보호할 수 있다. γ-GCS는 Keap1/Nrf2/ARE 신호 전달 경로의 하위 항산화 인자이기도 하다. 이는GSH 생물 합성중의 속도 제한 효소로서, 발현량 수준이 증가되면 대량의 라디칼을 제거할 수 있어, 세포의 산화 손상을 경감시킨다. Fang Ye 등과 Miao Long 등은 납유도 산화 스트레스 모델에서 Nrf2가 세포질 내 Keap1, SOD1, SOD2, GSH, HO-1，NQO1와 γ-GCS의 발현 정도와 현저한 포지티브 상관관계를 나타내고, 세포핵 내 Keap1와 네가티브 상관관계를 나타낸다고 밝혔다. 이 실험중에서 간장과 신장의 Keap1/Nrf2/ARE 신호 전달 경로상의 관련유전자 및 단백질의 발현상황에 대한 분석을 통해, 납으로 인해 유도된 모든 SD 쥐는 모두 산화스트레스을 나타냈으며, 체내의 Keap1/Nrf2/ARE를 활성화하여 유기체에 대한 보호메커니즘을 형성했지만, 하위 단백질 발현의 정도는 일정한 차이가 있었다. 납유도 그룹의 항산화 단백질 발현은 비록 어느정도 증가되었지만, 정상 그룹에 비해 큰 차이가 없었다. 이는 납유도의 산화 스트레스가 먼저세포내의 SOD와 GSH 등 항산화 물질을 감소시키기 때문이다. 비록 유기체가 후기에는 자기의 조절을 통해 일부 항산화 물질을 생성할 수 있지만 납이온의 지속적 손상이 가져온 피해가 유기체의 회복능력 보다 더 크기 때문에 생성된 항산화 물질이 납으로부터 유발된 산화손상에 저항하기 어렵다. LF-SCHY34는 Keap1/Nrf2/ARE 신호 전달 경로의 반응을 향상시키고 납에 의해 유도된 SD쥐의 산화스트레스 반응을 완화하도록 더 많은 하위 유전자의 발현을 자극하여 항산화능력을 가지는 HO-1, NQO1 및γ-GCS를 생성할 수 있게 한다.

이 실험은 자연 발효 파오차이로부터 분리한 유산균을 사용하여 생체내 및 생체외에서의 납이온 흡착 능력과 항산화 능력을 연구한다. LF-SCHY34는 한편으로 납이온을 효과적으로 흡착하고, 다른 한편으로 라디칼을 제거할 수 있으며 유기체의 항산화능력을 강화할 수 있다고, 두 가지 측면에서 납으로 인한 산화스트레스 손상으로부터 유기체를 보호한다는 것을 입증하였다. 그리고 후속적인 납중독을 완화하기 위해 사용하는 식품급 유산균의 관련 연구에 이론 및 데이터 지원을 제공한다.

상술한 바와 같이, LF-SCHY34는 체내, 체외의 납이온을 흡수하고 혈액, 장기의 납함량을 감소시키며 간장, 신장, 뇌조직을 보호할 수 있다. 그리고, LF-SCHY34는 라디칼을 제거하고 Keap1/Nrf2/ARE 신호 전달 경로를 활성화하여 더 많은 항산화제를 분비해 체내의 납으로 인한 산화손상을 더욱 잘 완화할 수 있다. 때문에 LF-SCHY34는 강한 납흡착능력과 항산화 능력을 가지는 우수한 균주로 간주된다. 향후, LF-SCHY34에 대한 연구는 더욱 큰 가치를 가지며, 체내납이온이 초래한 산화스트레스작용 및 기타 중금속의 독성완화 등 면에서 큰 잠재력과 연구가치가 있다.

상기 실시예는 본발명의 바람직한 기술수단에 대한 설명이지, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본발명의 설계정신에서 벗어나지 않는 한, 본 분야의 일반기술자가 본 발명의 기술수단에 대한 변형과 개선은 모두 본 발명 특허 청구의 범위에 속한다.

Claims

삭제
LF-SCHY34로 명명되고, 중국보통미생물균종보존관리센터에 보존되어 있으며, 보존 번호가 CGMCC No.18795인, 락토바실러스 퍼멘텀을 유효성분으로 포함하는, 중금속 중독을 치료하거나 예방하기 위한, 약학적 조성물.
제2항에 있어서,
상기 조성물은 중금속 흡착에 사용되는, 약학적 조성물.
LF-SCHY34로 명명되고, 중국보통미생물균종보존관리센터에 보존되어 있으며, 보존 번호가 CGMCC No.18795인, 락토바실러스 퍼멘텀을 유효성분으로 포함하는, 중금속 중독으로 인해 유발된 병증을 치료하거나 예방하기 위한, 약학적 조성물.
제4항에 있어서,
상기 중금속 중독으로 인해 유발된 병증은 간장손상, 신장손상 또는 뇌조직손상인, 약학적 조성물.
제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 중금속은 중금속납이고, 상기 락토바실러스 퍼멘텀의 유효 용량은 10⁹CFU/회인, 약학적 조성물.
제6항에 있어서,
상기 조성물은 체내 중금속납 또는 중금속납 이온으로 인한 세포 손상을 치료하거나 예방하기 위한 것인, 약학적 조성물.
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