CN111035630B - 调控人胰岛蛋白聚集状态的方法及二型糖尿病的治疗预防药物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种调控人胰岛蛋白聚集状态的方法，将hIAPP与磷酸缓冲盐溶液混合，形成蛋白溶液，将固绿和去离子水混合，形成固绿溶液，将固绿溶液和蛋白溶液混合形成混合溶液。本发明通过固绿对hIAPP的聚集程度进行调控，能够有效对hIAPP的聚集进行抑制或者促进。低浓度的固绿能够阻断hIAPP二聚体的形成，从而使胰腺胰岛β‑cells的存活率得到有效提升，高浓度的固绿则能有效促进hIAPP的聚集，且其聚集程度相比未添加固绿时有效增加，达到提升hIAPP聚集程度的作用。此外高浓度固绿情况下，hIAPP聚集速度加快，降低了hIAPP有毒中间体(二聚体等)的存在时间，从而从另一个角度提升了胰腺胰岛β‑cells的存活率。因而固绿也能够作为一种二型糖尿病的预防和治疗药物。

Description

调控人胰岛蛋白聚集状态的方法及二型糖尿病的治疗预防 药物
【技术领域】
本发明涉及一种调控人胰岛蛋白聚集状态的方法及二型糖尿病的治疗预防药物，属于生物蛋白质调控领域。
【背景技术】
淀粉样蛋白聚集物(Amyloid)是一种不可溶的纤维性蛋白质，如果在器官中不正常的堆积，会造成类淀粉样纤维沉积(amyloidosis)。在许多神经性疾病，如阿兹海默症、帕金森氏症以及II型糖尿病中，都可以观察到系统中出现大量淀粉样纤维的累积沉淀。大部分学者认为它可能导致脑部或其他相关的器官退化或功能障碍。淀粉样蛋白聚集物的产生会经历一个过程，从单体聚集成寡聚体，这个过程被称为成核时期。然后寡聚体聚集形成前体纤维，再快速形成纤维，最后达到稳定的成熟纤维。由于整个过程不可逆转，因此将纤维聚集物分解变得异常困难。越来越多的证据表明，早期的寡聚体比成熟的原纤维更具有细胞毒性，可能是导致相关细胞死亡的主要因素。因此，寻找药物小分子对寡聚体和纤维的形成进行抑制成为一种潜在的治疗手段。然而，由于低聚物的非均质性和短暂性，以及纤维的多态性，其聚集/毒性机制尚不清楚，寻找有效的抑制剂非常具有挑战性。
人胰岛淀粉样多肽(islet amyloid polypeptide,hIAPP)是II型糖尿病患者胰岛中淀粉样蛋白沉积的主要成分，是由37个氨基酸组成的多肽。人胰岛淀粉样多肽最引人注目的生物学作用就是对体内血糖稳态起调节作用。实验表明，hIAPP能抑制肌细胞对葡萄糖的摄取和利用，使肌糖原磷酸化酶活性增加而糖原合成酶活性降低。因此，酶活性变化与hIAPP剂量有明显的调控关系。然而，人胰岛淀粉样多肽的异常聚集导致了对血糖调节的失控，从而诱发II型糖尿病。研究人员发现，人胰岛淀粉样多肽的纤维化过程与一般的淀粉样纤维化过程一致，因此，寻找小分子等药物对其调控成为一种潜在的手段治疗II型糖尿病。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术的不足而提供一种调控人胰岛蛋白聚集状态的方法及二型糖尿病的治疗预防药物，从而有效对hIAPP的聚集程度进行调节。
解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种调控人胰岛蛋白聚集状态的方法，将hIAPP与磷酸缓冲盐溶液混合，形成蛋白溶液，将固绿和去离子水混合，形成固绿溶液，将固绿溶液和蛋白溶液混合形成混合溶液。
本发明混合溶液中hIAPP的浓度为aμM，固绿的浓度为bμM，b≤1.6a，以抑制hIAPP的聚集。
本发明固绿通过抑制hIAPP中间体的形成，从而减少β-sheet-rich纤维的形成。
本发明混合溶液中hIAPP的浓度为aμM，固绿的浓度为bμM，b≥16a，以促进hIAPP的聚集。
本发明固绿通过促进hIAPP纤维的形成，从而减少中间体的产生时间，加快β-sheet-rich寡聚物的形成。
一种二型糖尿病的治疗预防药物，包括固绿。
本发明通过固绿对hIAPP的聚集程度进行调控，能够有效对hIAPP的聚集进行抑制或者促进。低浓度的固绿能够阻断hIAPP二聚体的形成，从而使胰腺胰岛β-cells的存活率得到有效提升，高浓度的固绿则能有效促进hIAPP的聚集，且其聚集程度相比未添加固绿时有效增加，达到提升hIAPP聚集程度的作用。此外高浓度固绿情况下，hIAPP聚集速度加快，降低了hIAPP有毒中间体(二聚体等)的存在时间，从而从另一个角度提升了胰腺胰岛β-cells的存活率。因而固绿也能够作为一种二型糖尿病的预防和治疗药物。调节固绿浓度，能够有效改变hIAPP的聚集程度，实现hIAPP聚集促进或者抑制，对hIAPP聚集度进行调控。
本发明的其他特点和优点将会在下面的具体实施方式、附图中详细的揭露。
【附图说明】
下面结合附图对本发明做进一步的说明：
图1为本发明实施例空白组的AFM图；
图2为本发明实施例样品一的AFM图；
图3为本发明实施例样品二的AFM图；
图4为本发明实施例样品三的AFM图；
图5为本发明实施例空白组的红外光谱图；
图6为本发明实施例样品二的红外光谱图；
图7为本发明实施例样品三的红外光谱图；
图8为本发明实施例空白组的AFM高度图；
图9为本发明实施例样品一的AFM高度图；
图10为本发明实施例样品二的AFM高度图；
图11为本发明实施例样品三的AFM高度图。
图1-4中的虚线分别为图8-11的测高线。
【具体实施方式】
下面结合本发明实施例的附图对本发明实施例的技术方案进行解释和说明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其他实施例，都属于本发明的保护范围。
在下文描述中，出现诸如术语“内”、“外”、“上”、“下”、“左”、“右”等指示方位或者位置关系仅是为了方便描述实施例和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或者元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
实施例：
本实施例提供了调控人胰岛蛋白聚集状态的方法，包括如下步骤：
1、将固绿粉末与去离子水在200w条件下超声混合震荡1分钟，形成1mM的固绿溶液；
2、将hIAPP与磷酸缓冲盐溶液混合，形成500μM的蛋白溶液；
3、将蛋白溶液中加入去离子水震荡稀释，使蛋白溶液浓度降低至50μM；
4、1mM的固绿溶液分成三份，然后分别稀释成8μM、80μM和800μM的固绿溶液；
5、从蛋白溶液中取出40μL，然后加入40μL的去离子水，以形成hIAPP浓度为25μM的空白组；
6、从蛋白溶液中取出40μL，然后加入40μL的8μM固绿溶液，以形成hIAPP浓度为25μM、固绿浓度为4μM的样品一；
7、从蛋白溶液中取出40μL，然后加入40μL的80μM固绿溶液，以形成hIAPP浓度为25μM、固绿浓度为40μM的样品二；
8、从蛋白溶液中取出40μL，然后加入40μL的800μM固绿溶液，以形成hIAPP浓度为25μM、固绿浓度为400μM的样品三；
9、将空白组、样品一、样品二和样品三在37℃条件下放置于震荡培养器中培养24h。
从空白组、样品一、样品二和样品三中分别使用移液器取5μL，分别滴在四片云母片的表面，待自然风干后得到待扫描样品。将四个待扫描样品进行AFM测试。
参见图1-4，可以看到空白组中hIAPP经过24h的培养后发生了聚集，形成了较大体积的聚合物。而在样品一中，hIAPP聚合情况相对空白组有所降低，但是降低程度并不明显，说明了4μM的固绿浓度对hIAPP聚合起到了一定的抑制作用。样品二中，40μM的固绿条件下hIAPP的聚合几乎完全受到抑制，说明固绿能够用于制备二型糖尿病的治疗预防药物。但是在样品三中，400μM的固绿使得hIAPP的聚合获得明显增强，且样品三中hIAPP的聚合程度相比空白组更强，说明高浓度的固绿能够促进hIAPP的聚合。
综上所述，固绿相对hIAPP浓度的变化，能够有效改变hIAPP的聚合状态，从而实现对hIAPP自组装程度的调控。
参见图5-7，空白组中在1625cm-1处形成了非常明显的成熟纤维的峰位，而在样品二中，1625cm-1处的峰值被有效抑制，充分说明hIAPP聚合向中间体以及成熟纤维转变的过程被有效抑制。样品三中1625cm-1处的峰位重新出现，同时峰值相比空白组其峰值大小更强，充分说明高浓度固绿对成熟纤维的形成具有良好的促进调控作用。
样品三中，淀粉样蛋白聚集后形成高度有序的纳米结构为生物自组装提供了一种新的合成结构。使用淀粉样蛋白进行合成有着低价方便的特点，通过调节固绿浓度能够有效的调节其合成过程和结果，比如合成速度和最终的合成形状，极大提高淀粉样蛋白自组装的效率。
参见图8，未添加固绿的情况下，成熟纤维的高度最高为4.5nm，且形成位置仅在相对集中的几条。参见图9-11，随着固绿浓度的加入及其浓度增大，淀粉样蛋白的聚集形貌出现极大的变化，聚合物高度先降低后增加。其原因在于低浓度固绿对淀粉样蛋白的中间体形成良好的抑制作用，淀粉样蛋白与固绿的结合体相对均匀地分布。而高浓度的固绿促进淀粉样蛋白的中间体向成熟纤维的转变，减少了中间体存在的时间，固绿和淀粉样蛋白形成了全新的条状纤维结构，并通过毒理测试，显示新形成的成熟纤维结构几乎无细胞毒性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，熟悉该本领域的技术人员应该明白本发明包括但不限于附图和上面具体实施方式中描述的内容。任何不偏离本发明的功能和结构原理的修改都将包括在权利要求书的范围中。

Claims (2)

1.一种调控人胰岛蛋白聚集状态的方法，其特征在于，将hIAPP与磷酸缓冲盐溶液混合，形成蛋白溶液，将固绿和去离子水混合，形成固绿溶液，将固绿溶液和蛋白溶液混合形成混合溶液，混合溶液中hIAPP的浓度为aμM，固绿的浓度为bμM，b≥16a，以促进hIAPP的聚集。
2.根据权利要求1所述的调控人胰岛蛋白聚集状态的方法，其特征在于，固绿通过促进hIAPP纤维的形成，从而减少中间体的产生时间，加快β-sheet-rich寡聚物的形成。
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