CN111568855A - 一种可注射水凝胶的制备方法及其在术后肿瘤治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种可注射水凝胶的制备方法及其在术后肿瘤治疗中的应用。采用嗜热菌金属蛋白酶(thermolysin)催化N‑(9‑芴甲氧羰基)‑L‑苯丙氨酸(Fmoc‑F)和L‑苯丙氨酸‑L‑苯丙氨酸‑L‑左旋多巴(FF‑Dopa)形成Fmoc‑F‑FF‑Dopa单元，该单元进一步利用氢键、疏水作用、π‑π堆积等非共价键力可在接近人体温的温度条件下短时自组装形成水凝胶。该酶催化交联水凝胶具有可注射性能且可作为药物储库植入肿瘤手术后形成的空腔中，使所载药物以稳定可控的速率、合适的浓度在手术后形成的空腔局部内缓慢释放，从而充分发挥药效杀伤残余肿瘤细胞，避免全身用药引起的毒副作用。

Description

一种可注射水凝胶的制备方法及其在术后肿瘤治疗中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种可注射水凝胶的制备方法及其 在术后肿瘤治疗中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
恶性肿瘤已成为严重威胁人民健康的重要社会问题之一，其病程进展快，死亡率高，五年生存率低。目前针对乳腺癌、脑胶质瘤、黑色素瘤等恶性肿瘤临床上常采用手术切除的方式，通过对原发病灶或转移病灶做部分或大部分切除，从而减少肿瘤负荷，缓解患者临床症状，为进一步放化疗创造条件。
乳腺癌是发生在女性乳腺上皮组织的恶性肿瘤，也是导致女性癌症死亡的主要原因。手术切除是临床上治疗乳腺癌的有效方式，通过手术切除病灶，术后辅以化疗与放疗，从而杀伤手术后残余肿瘤细胞控制患者病情。但放化疗往往会引起消化道强烈反应以及免疫功能受损等结果，对人体危害较大。
脑胶质瘤是中枢神经系统最常见肿瘤，因其病灶部位的特殊性及复杂性至今仍是诸多肿瘤治疗中最为棘手且最具挑战性的课题之一。其中星形细胞瘤 (Astrocytoma)占胶质瘤的70-80％。而多型性神经胶母细胞瘤(Glioblastoma Multiform；GBM)属恶性程度最高的星形细胞瘤。多形性神经胶质母细胞瘤五年存活率不超过10％。由于GBM呈恶性浸润性生长，与正常组织无明显分界，肿瘤组织周围正常脑组织中均可检测到GBM星形侵袭灶，且多生长在大脑组织中重要结构，如基底节，中央沟区，丘脑，脑干等部位，不仅手术难以全切，而且术后易复发。术后辅助放化疗无论从理论还是实践上，均被证实对恶性脑胶质瘤效果不佳，并且副作用较大，往往导致病人的生存质量大为下降。
黑色素瘤是黑色素细胞病理性增生的高度恶性肿瘤，病程早期伴随转移且预后不佳，中位生存期仅8～9月，三年生存率仅10％～15％。对黑色素瘤患者常规治疗方案首选病灶切除术，辅助放化疗，但黑色素瘤对放化疗敏感性极低且存在较高复发率及转移率。
临床常见抗肿瘤药物经过口服或者静脉注射等全身给药后，仅有少部分可通过体内循环达到肿瘤部位，达到杀伤术后残存肿瘤细胞的目的，大部分药物在到达肿瘤组织之前会被正常组织摄取吸收。全身给药方式使抗肿瘤药物利用率很低，同时对正常组织产生毒副作用，且术后化疗需要不断频繁给药，这也会促使肿瘤细胞产生耐药性从而导致预后不佳。相比较术后全身给药方式，局部递送药物可实现精准给药，增加肿瘤部位的药物浓度，并显著降低全身毒性。其中水凝胶是一类最为常见的用于局部给药的递送载体，水凝胶是高分子单体交联后形成的一种强吸水材料，通过在手术后形成的空腔内植入载药水凝胶具有以下几点优势：(1)可实现术后空腔局部给药并具有较低的全身系统毒性(2)可装载多种药物达到联合治疗的目的。(3)使药物分子以稳定可控的速率、合适的浓度在术后空腔内持续缓慢地释放。近年来酶催化作用下的寡肽自组装水凝胶得到广泛关注和研究，酶催化方法相较于物理交联、化学交联等，可以避免水凝胶物理性强度低、稳定性差等问题，同时具有生物相容性好、可生物降解等优良特性。酶催化短肽自组装水凝胶是在酶(包括蛋白酶、酯酶、磷酸酶等)的催化下，短肽等底物分子发生特定的化学反应，聚集成纳米尺寸的超分子单元，单元之间通过非共价键作用力在空间上规则排列形成纳米纤维，再进一步表现为宏观的相变, 如水凝胶结构的形成或溶胶-凝胶结构的转变等。然而现有技术报道的酶催化作用下的寡肽自组装水凝胶往往存在着水凝胶形成时间长、酶用量大、酶促温度高等问题，限制了水凝胶用于术后空腔给药载体构建的应用。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明采用嗜热菌金属蛋白酶(thermolysin)催化 N-(9-芴甲氧羰基)-L-苯丙氨酸(Fmoc-F)和L-苯丙氨酸-L-苯丙氨酸-L-左旋多巴 (FF-Dopa)形成Fmoc-F-FF-Dopa单元，该单元进一步利用氢键、疏水作用、π-π堆积等非共价键力可在接近人体温的温度条件下短时自组装形成水凝胶。该酶催化交联水凝胶具有可注射性能，并且在可作为药物储库植入肿瘤手术后形成的空腔中，所述水凝胶软硬适中，无细胞毒性，适宜填补残余空腔，并且在人体温度条件下自组装形成效率高，制备方便，有效满足术后空腔给药及时性需求，使所载药物以稳定可控的速率、合适的浓度在手术后形成的空腔局部内缓慢释放，从而充分发挥药效杀伤残余肿瘤细胞，避免全身用药引起的毒副作用。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明的第一个方面，提供一种酶响应可注射水凝胶，所述可注射水凝胶通过嗜热菌金属蛋白酶(thermolysin)催化N-(9-芴甲氧羰基)-L-苯丙氨酸(Fmoc-F)和 L-苯丙氨酸-L-苯丙氨酸-L-左旋多巴(FF-Dopa)形成Fmoc-F-FF-Dopa单元，接着在35-40℃孵育5-15分钟形成水凝胶。
优选的，37℃形成水凝胶；
进一步优选的，10分钟形成水凝胶。
本发明的第二个方面，提供一种酶响应可注射水凝胶制备方法，所述制备方法如下：
Figure BDA0002528578870000031
通过嗜热菌金属蛋白酶(thermolysin)催化N-(9-芴甲氧羰基)-L-苯丙氨酸(Fmoc-F)和L-苯丙氨酸-L-苯丙氨酸-L-左旋多巴(FF-Dopa)形成Fmoc-F-FF-Dopa 单元，接着在35-40℃孵育5-15分钟形成水凝胶；优选的，37℃形成水凝胶，进一步优选的，10分钟形成水凝胶。
优选的，具体步骤为：
(1)Fmoc-F和FF-Dopa溶于缓冲液，得到混合溶液I，
(2)将碱性溶液加入混合溶液I中调节溶液pH使原料充分溶解，溶解搅拌得到溶液II；
(3)向溶液II中加入酸性溶液，调整pH值至中性，在室温条件下充分搅拌，得到溶液III；
(4)将嗜热菌蛋白酶溶于缓冲液中，加入到溶液III中，得到混合溶液IV；
(5)将混合溶液IV在35-40℃孵育5-15分钟即得。
优选的，步骤(1)中Fmoc-F和FF-Dopa的摩尔质量比为1：1-3；进一步优选的，Fmoc-F和FF-Dopa的摩尔质量比为1：2；进一步优选的，混合溶液I 中Fmoc-F为20mM，FF-Dopa为40mM；
优选的，步骤(1)中缓冲液为PBS(pH 8.5)或者其他的可替代的成分对于人体安全的缓冲液；优选的，缓冲液为2mL PBS(pH 8.5)；
优选的，步骤(2)溶液II搅拌方法为磁力搅拌，搅拌速率为40-60rpm/min，进一步优选的，为50rpm/min；
优选的，步骤(2)中溶液II的pH不超过8.5；进一步优选的，用NaOH溶液调节溶液pH；
优选的，步骤(3)中溶液III的pH值为6-8，进一步优选的，pH值为7.0-7.5，接近人体pH值环境，方便进一步注射时与人体内pH值环境差距较小；进一步优选的，用HCl溶液调节溶液pH；
优选的，步骤(3)中充分搅拌10-15分钟；优选的，搅拌方法为涡旋；
优选的，步骤(4)中嗜热菌蛋白酶浓度为1.0U/mL，优选的，步骤(4) 中缓冲液为pH＝7.2的PBS缓冲液或者其他的可替代的成分对于人体安全的缓冲液；
优选的，步骤(5)中混合溶液IV在37℃孵育10分钟。
本发明的第三个方面，提供可注射水凝胶在制备具有生物相容性的药物载体中的应用。
优选的，提供可注射水凝胶在制备术后空腔递药系统中的应用；进一步优选的，提供可注射水凝胶在制备肿瘤术后空腔局部递送药物载体中的应用。
本发明有益效果：
(1)本发明提供一种酶响应可注射水凝胶制备方法，制备方法简单易行，材料安全易得，制备形成的水凝胶无细胞毒性，具有3D网状结构，适宜固定药物组分作为递送药物载体应用。
(2)本发明提供的酶响应可注射水凝胶在室温下制备时，由于不处于酶反应的最佳条件下，在最后孵育步骤前保持溶液状态，注射性能良好，同时水凝胶自组装时间恰好适宜，不会迅速形成水凝胶堵塞注射针孔，方便预先制备，然后根据需要通过注射器轻松注射。
(3)本发明提供的酶响应可注射水凝胶，作为药物载体植入肿瘤手术后形成的空腔中；在人体温度条件下，少量酶催化即可在短时间内形成固态水凝胶，制备效率高，防止形成时间太长，容易导致水凝胶不能及时定形，以液体状态扩散流失，失去术后空腔局部给药的针对性治疗效果。
(4)采用本发明的制备方法在接近人体温的温度条件下短时即可获得水凝胶，所述水凝胶软硬适中，保持高弹性且安全无害，作为通过注射植入的载体或支架具有足够强度，同时不至于压迫人体内器官，适宜填补不同形状的空腔，满足不同手术需求；具有3D网状结构，使所载药物固定在网状结构中，有效满足术后空腔给药的需要，使所载药物以稳定可控的速率、合适的浓度在手术后形成的空腔局部内缓慢释放，实现精准给药，增加肿瘤部位的药物浓度，并显著降低全身毒性。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1制备酶响应水凝胶成胶宏观图。
图2为本发明实施例1制备酶响应水凝胶可注射性能表征图。
图3为本发明实施例1制备酶响应水凝胶冻干粉扫描电镜图(Scanning ElectronMicroscope,SEM)，Scale bar＝100μm。
图4为本发明实施例1制备酶响应水凝胶时间扫描流变学分析，以1rad/s 的应变频率进行动态时间扫描，记录空白水凝胶储能模量(G')和损耗模量(G”) 随时间变化曲线图。
图5为本发明实施例1制备酶响应水凝胶频率扫描流变学分析，以应变幅度为0.5％进行频率范围为0.1-100rad/s扫描，记录空白水凝胶储能模量(G')和损耗模量(G”)随频率变化曲线图。
图6为本发明实施例1制备酶响应水凝胶Fmoc-F和FF-dopa在不同浓度嗜热菌金属蛋白酶催化下形成Fmoc-F-FF-Dopa单元的效率。
图7为本发明实施例1制备酶响应水凝胶浸提液对不同细胞体外毒性实验；
图7A为实施例1制备酶响应水凝胶浸提液对鼠源乳腺癌4T1，鼠源正常乳腺上皮细胞HC11以及人源乳腺癌细胞MCF-7体外毒性实验结果图；
图7B为实施例1制备酶响应水凝胶浸提液对星形胶质细胞(鼠源脑胶质瘤细胞GL261、鼠源原代星形胶质细胞以及人源胶质母细胞瘤U87)体外毒性实验结果图；
图7C为实施例1制备酶响应水凝胶浸提液对表皮黑色素细胞(鼠源黑色素瘤细胞B16F10、鼠源原代表皮黑色素细胞以及人源黑色素瘤细胞A375)体外毒性实验结果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
如前所述，现有技术中的酶催化作用下的寡肽自组装水凝胶往往存在着水凝胶形成时间长、酶用量大、酶促温度高等问题，限制了水凝胶用于制备术后空腔递药系统构建的应用。因此，本发明提供一种酶响应可注射水凝胶及其制备方法和应用，所述酶响应可注射水凝胶形成时间短且适宜、酶促温度适宜、酶用量小，在应用于制备具有生物相容性的药物载体中。
本发明的一个特别优秀的实施方案中构建的酶催化交联水凝胶具有3D网状结构，保持高弹性且安全无害。
根据本发明，所述可注射水凝胶孵育前具有可注射性，在接近人体温的温度条件下短时即可孵育形成水凝胶，可作为药物储库植入肿瘤手术后形成的空腔中，为载体构建提供便捷。
根据本发明，所述可注射水凝胶通过嗜热菌金属蛋白酶(thermolysin)催化 N-(9-芴甲氧羰基)-L-苯丙氨酸(Fmoc-F)和L-苯丙氨酸-L-苯丙氨酸-L-左旋多巴 (FF-Dopa)形成Fmoc-F-FF-Dopa单元，接着35-40℃，5-15分钟形成。本发明的一个特别优秀的实施方案中为37℃、10分钟形成水凝胶，嗜热菌金属蛋白酶浓度为 1U/mL。
嗜热菌金属蛋白酶和N-(9-芴甲氧羰基)-L-苯丙氨酸(Fmoc-F)和L-苯丙氨酸 -L-苯丙氨酸-L-左旋多巴(FF-Dopa)均为可直接购买到的商品。
嗜热菌金属蛋白酶可在35-40℃均保持较好的催化活性，活性最佳的温度为 37℃。催化反应的时间为5-15分钟是指，35-40℃下5分钟-10分钟内，水凝胶已具有初步的固体化，流动性大大下降；10分钟是最佳酶促反应温度下全面形成稳定的固体状态水凝胶的时间转点；大于10分钟小于15分钟时，在最佳酶促活性温度下水凝胶将进一步使结构稳定，在其他温度条件下分别对应不同的转点，对应全面形成稳定的固体状态水凝胶。
本领域的技术人员可知，人体温度正常状态下是在37℃，存在波动范围在 35-40℃内，本发明制备的水凝胶可以很好的适应人体温度波动条件下的制备要求。
本领域的技术人员可以知晓，当水凝胶组装时间过短，如低于5分钟时，对于注射过程中，接触并处于空腔温度的注射器针头考验较高。注射器的针头容易在适宜的温度条件下，短时间内快速组装固态水凝胶因而堵塞针头，造成注射过程的难以推进。但当水凝胶组装时间过程长，虽然方便注射器的注射，但是注射入空腔的水凝胶如果不能短时间快速固体化，将会无法控制水凝胶定形，形成贴合的形状填充空腔，而是以液体状态扩散流失，失去术后空腔局部给药的针对性治疗效果。
采用本发明的制备方法在接近人体温的温度条件下短时即可获得水凝胶，所述水凝胶软硬适中，保持高弹性且安全无害(图5、图7所示)，作为通过注射植入的载体或支架具有足够强度，同时不至于过于坚硬压迫人体内器官，适宜填补不同形状的空腔，满足不同手术即时需求。
本发明的一个特别优秀的实施例中提供酶响应水凝胶冻干粉扫描电镜图，由图3可见本发明制备的水凝胶具有3D网状结构，可使所载药物固定在网状结构中，满足作为药物载体或支架的需求。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。
实施例1：酶响应可注射水凝胶制备方法
(1)取一个洁净干燥的5mL透明玻璃瓶，精密称定一定量的Fmoc-F和 FF-Dopa粉末，加入2mL pH＝8.5磷酸缓冲溶液，使得Fmoc-F终浓度为20mM， FF-Dopa终浓度为40mM，混溶并加入磁力搅拌子。
Figure BDA0002528578870000071
Figure BDA0002528578870000081
(2)取一个洁净干燥的25mL小烧杯，精密称定一定量的氢氧化钠粉末，加入双蒸水并用玻璃棒搅拌使其溶解，NaOH溶液终浓度为1M。将上述透明玻璃瓶置于磁力搅拌器上，以50rpm/min匀速搅拌，边搅拌边用滴管向玻璃瓶混合溶液内缓慢滴加NaOH溶液，滴加过程中不断用pH计检测混合溶液的pH,使总体溶液pH不超过8.5。
(3)取一个洁净干燥的10mL小烧杯，精密量取一定量浓盐酸，加入双蒸水用玻璃棒搅拌使终浓度为0.1M，上述玻璃瓶溶液内缓慢滴加HCl溶液，用pH 计检测混合溶液的pH,调节混合溶液pH至7.2，并将玻璃瓶封口在涡旋仪上涡旋 10-15分钟。
(4)取一个洁净干燥的2mL EP管，精密称量一定量嗜热菌金属蛋白酶粉末，加入1mL pH＝7.2的PBS缓冲液，使得嗜热菌金属蛋白酶溶液浓度为1U/ml， EP管在水浴中超声10s，随后将嗜热菌金属蛋白酶溶液逐滴加入透明玻璃瓶的混合溶液中。
(5)将上述混合溶液放入提前预热好的37℃烘箱中孵育10分钟，酶催化形成Fmoc-F-FF-Dopa单元，随后在烘箱中下孵育条件下，Fmoc-F-FF-Dopa单元进一步利用氢键、疏水作用、π-π堆积等非共价键力自组装形成水凝胶，如图1 所示。
Figure BDA0002528578870000082
实施例2：酶响应可注射水凝胶制备方法
(1)取一个洁净干燥的5mL透明玻璃瓶，精密称定一定量的Fmoc-F和 FF-Dopa粉末，加入2mL pH＝8.5碳酸氢盐缓冲溶液，使得Fmoc-F终浓度为10 mM，FF-Dopa终浓度为30mM，混溶并加入磁力搅拌子。
(2)取一个洁净干燥的25mL小烧杯，精密称定一定量的氢氧化钠粉末，加入双蒸水并用玻璃棒搅拌使其溶解，NaOH溶液终浓度为1M。将上述透明玻璃瓶置于磁力搅拌器上，以60rpm/min匀速搅拌，边搅拌边用滴管向玻璃瓶混合溶液内缓慢滴加NaOH溶液，滴加过程中不断用pH计检测混合溶液的pH,使总体溶液pH不超过8.5。
(3)取一个洁净干燥的10mL小烧杯，精密量取一定量浓盐酸，加入双蒸水用玻璃棒搅拌使终浓度为0.1M，上述玻璃瓶溶液内缓慢滴加HCl溶液，用pH 计检测混合溶液的pH，调节混合溶液pH至7.3，并将玻璃瓶封口在涡旋仪上涡旋10-15分钟。
(4)取一个洁净干燥的2mL EP管，精密称量一定量嗜热菌金属蛋白酶粉末，加入1mL pH＝7.2的碳酸氢盐缓冲液，使得嗜热菌金属蛋白酶溶液浓度为1 U/mL，EP管在水浴中超声10s，随后将嗜热菌金属蛋白酶溶液逐滴加入透明玻璃瓶的混合溶液中。
(5)将上述混合溶液放入提前预热好的40℃烘箱中孵育11分钟，酶催化形成Fmoc-F-FF-Dopa单元，随后在烘箱中下孵育条件下，Fmoc-F-FF-Dopa单元进一步利用氢键、疏水作用、π-π堆积等非共价键力自组装形成水凝胶。
实施例3：酶响应可注射水凝胶制备方法
(1)取一个洁净干燥的5mL透明玻璃瓶，精密称定一定量的Fmoc-F和 FF-Dopa粉末，加入2mL pH＝8.5磷酸缓冲溶液，使得Fmoc-F终浓度为30mM， FF-Dopa终浓度为30mM，混溶并加入磁力搅拌子。
(2)取一个洁净干燥的25mL小烧杯，精密称定一定量的氢氧化钠粉末，加入双蒸水并用玻璃棒搅拌使其溶解，NaOH溶液终浓度为1M。将上述透明玻璃瓶置于磁力搅拌器上，以40rpm/min匀速搅拌，边搅拌边用滴管向玻璃瓶混合溶液内缓慢滴加NaOH溶液，滴加过程中不断用pH计检测混合溶液的pH，使总体溶液pH不超过8.5。
(3)取一个洁净干燥的10mL小烧杯，精密量取一定量浓盐酸，加入双蒸水用玻璃棒搅拌使终浓度为0.1M，上述玻璃瓶溶液内缓慢滴加HCl溶液，用pH 计检测混合溶液的pH，调节混合溶液pH至7，并将玻璃瓶封口在涡旋仪上涡旋 10-15分钟。
(4)取一个洁净干燥的2mL EP管，精密称量一定量嗜热菌金属蛋白酶粉末，加入1mL pH＝7.2的PBS缓冲液，使得嗜热菌金属蛋白酶溶液浓度为1U /mL，EP管在水浴中超声10s，随后将嗜热菌金属蛋白酶溶液逐滴加入透明玻璃瓶的混合溶液中。
(5)将上述混合溶液放入提前预热好的35℃烘箱中孵育12分钟，酶催化形成Fmoc-F-FF-Dopa单元，随后在烘箱中下孵育条件下，Fmoc-F-FF-Dopa单元进一步利用氢键、疏水作用、π-π堆积等非共价键力自组装形成水凝胶。
实施例4：酶响应水凝胶可注射性能考察
将磨口玻璃瓶溶液(包含Fmoc-F、FF-Dopa及嗜热菌金属蛋白酶)与红色素混合溶液在放进孵箱前通过25号注射器注射到含有SDU样的模具中，随之将模具放入37℃烘箱中孵育10分钟，撤去模具后的水凝胶形状。结果显示本发明酶响应水凝胶具有可注射性能。如图2所示。
实施例5：酶响应可注射水凝胶流变学考察
在流变仪(Anton-Paar，MCR302)上测量水凝胶的流变性。将空白酶响应水凝胶放在间隙为0.8mm的50mm平行板上，并在37±0.1℃下进行测量。为了检测水凝胶的触变性，以1rad/s的应变频率进行了动态时间扫描，记录水凝胶储能模量(G')和损耗模量(G”)随时间的变化，结果显示G’和G”值均随时间增加，并且G'值比G”值高约10倍，这是水凝胶形成的有力证据。如图4所示。
酶响应水凝胶频率扫描流变学分析，以应变幅度为0.5％进行频率范围为 0.1-100rad/s扫描，记录空白水凝胶G’和G”随频率变化曲线图，如图5所示，结果显示G’和G”与频率无关性，表明酶响应水凝胶保持高弹性。
实施例6：酶响应可注射水凝胶最佳嗜热菌金属蛋白酶使用浓度考察
取四个洁净干燥的2mL EP管，精密称量一定量嗜热菌金属蛋白酶粉末，分别加入1mL pH＝7.2的PBS缓冲液，使得嗜热菌金属蛋白酶溶液终浓度为0.2、 0.5、1.0、1.5U/mL，EP管在水浴中超声10s，随后将嗜热菌金属蛋白酶溶液逐滴加入磨口玻璃瓶中的混合溶液中，在相同时间点内取相同量水凝胶溶液，借助高效液相色谱(HPLC)检测Fmoc-F-FF-Dopa转化率，结果证实1.0U/mL Fmoc-F-FF-Dopa转化率最高，为最佳嗜热菌金属蛋白酶使用浓度。如图6所示。
实施例7：酶响应可注射水凝胶体外安全性考察
将鼠源乳腺癌4T1，鼠源正常乳腺上皮细胞HC11以及人源乳腺癌细胞 MCF-7、星形胶质细胞(鼠源脑胶质瘤细胞GL261、鼠源原代星形胶质细胞以及人源胶质母细胞瘤U87)和表皮黑色素细胞(鼠源黑色素瘤细胞B16F10、鼠源原代表皮黑色素细胞以及人源黑色素瘤细胞A375)分别接种于96孔板上，每孔细胞数量为5×103，每孔体积200μL，接种后，将96孔板于37℃、体积分数为 5％的二氧化碳的培养箱中培养过夜。每孔加入100μL不同浓度范围水凝胶浸提液(0.1-40μg/mL)于37℃、5％的二氧化碳的培养箱中培养24h后，每孔加入 MTT溶液(10μL，5mg/mL)，然后于37℃、5％的二氧化碳的培养箱中培养4h，用酶联免疫检测仪于490nm处测其吸光度值，计算细胞存活率。结果如图7所示，本发明酶响应水凝胶对肿瘤细胞以及正常细胞均不具有明显杀伤效果，具有较高安全性。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种酶响应可注射水凝胶，其特征在于，所述可注射水凝胶通过嗜热菌金属蛋白酶(thermolysin)催化N-(9-芴甲氧羰基)-L-苯丙氨酸(Fmoc-F)和L-苯丙氨酸-L-苯丙氨酸-L-左旋多巴(FF-Dopa)形成Fmoc-F-FF-Dopa单元，接着在35-40℃孵育5-15分钟形成水凝胶；优选的，37℃形成水凝胶；优选的，10分钟形成水凝胶。
2.如权利要求1所述的酶响应可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，通过嗜热菌金属蛋白酶(thermolysin)催化N-(9-芴甲氧羰基)-L-苯丙氨酸(Fmoc-F)和L-苯丙氨酸-L-苯丙氨酸-L-左旋多巴(FF-Dopa)形成Fmoc-F-FF-Dopa单元，接着在35-40℃孵育5-15分钟形成水凝胶；优选的，37℃形成水凝胶，进一步优选的，10分钟形成水凝胶；
优选的，所述制备方法步骤如下：
(1)Fmoc-F和FF-Dopa溶于缓冲液，得到混合溶液I，
(2)将碱性溶液加入混合溶液I中调节溶液pH，溶解搅拌得到溶液II；
(3)向溶液II中加入酸性溶液，调整pH值至中性，在室温条件下充分搅拌，得到溶液III；
(4)将嗜热菌蛋白酶溶于缓冲液中，加入到溶液III中，得到混合溶液IV；
(5)将混合溶液IV在35-40℃孵育5-15分钟即得。
3.如权利要求2所述的酶响应可注射水凝胶制备方法，其特征在于，优选的，步骤(1)中Fmoc-F和FF-Dopa的摩尔质量比为1：1-3；进一步优选的，Fmoc-F和FF-Dopa的摩尔质量比为1：2；进一步优选的，混合溶液I中Fmoc-F为20mM，FF-Dopa为40mM；
优选的，步骤(1)中缓冲液为PBS(优选为pH 8.5)或者其他可替代的、成分对于人体安全的缓冲液；优选的，缓冲液为1-3mL PBS(优选为pH 8.5)。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，优选的，步骤(2)溶液II搅拌方法为磁力搅拌，搅拌速率为40-60rpm/min，进一步优选的，为50rpm/min；
优选的，步骤(2)中溶液II的pH不超过8.5；进一步优选的，用NaOH溶液调节溶液pH。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，优选的，步骤(3)中溶液III的pH值为6.5-8，进一步优选的，pH值为7.0-7.5(优选为7.2)；进一步优选的，用HCl溶液调节溶液pH；
优选的，步骤(3)中充分搅拌10-15分钟，优选的，搅拌方法为涡旋。
6.如权利要求2所述的酶响应可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，优选的，步骤(4)中嗜热菌蛋白酶浓度为1.0U/mL，优选的，步骤(4)中缓冲液为pH＝7.2的PBS缓冲液或者其他的可替代的成分对于人体安全的缓冲液。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中混合溶液IV在37℃孵育，优选的，孵育10分钟。
8.如权利要求1所述的酶响应可注射水凝胶在制备具有生物相容性的药物载体中的应用。
9.如权利要求1所述的酶响应可注射水凝胶在制备术后空腔局部递药系统中的应用。
10.如权利要求1所述的酶响应可注射水凝胶在制备肿瘤术后空腔局部递送药物载体中的应用。
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