CN111024668B - N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒及其制备方法及应用 - Google Patents

N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒及其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明N‑烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒及其制备方法及应用，属于生物荧光分析技术领域；目的在于有效避免入射光背景荧光的干扰，碳纳米棒是是原有碳点表面的胺基与N‑烷基苯乙烯类菁染料的醛基形成C=N双键之后进一步碳化形成；该碳纳米棒在水溶液中对H+表现出高的灵敏度和选择性，具有可见光激发和Stokes位移较大的特点，碳纳米棒pH荧光探针可方便负载于细胞中呈酸性的细胞器溶酶体中，可为相关疾病的诊断和治疗提供帮助。

Description

N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒及其制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物荧光分析技术领域，涉及一种荧光染料，具体涉及N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒及其制备方法及应用。
背景技术
细胞内的质子在细胞内扮演着重要的角色，它参与细胞的新陈代谢、增殖分裂、信号转导、Ca2+的调节、酶的活化等重要的生理活动，研究显示即使是0.1～0.2个pH单位的微小变化，也直接与一些疾病的发生密切相关，如：癌症、帕金森氏病、阿尔茨海默症、神经系统的疾病等，因此，明晰H+在细胞和组织中的分布，清楚H+在生命体系中所扮演的角色和所起的作用至关重要。
荧光分析技术是目前最重要的生物分析检测手段之一，它在DNA测序、药物代谢分析以及细胞内组织成分的测定等方面获得了广泛而深入的应用。荧光染料是荧光分析系统的重要组成部分，它的性质将影响甚至决定整个荧光检测的灵敏度和实用价值，不同的荧光染料即便是应用在同种物质分析过程中，其检测结果却可能有着较大的差异，这主要取决于荧光染料本身的物理化学性质。
目前基于荧光分析法合成的pH探针有基于有机小分子的pH探针，有基于过渡元素配合物合成的探针，有基于纳米材料合成的探针(Xia,S.等人，Sensor Actuat B–Chem，2018，265，699-708；Hou,S.L.等人Anal.Chem.，2019,91(8),5455-5460；Ye，X.等人，Small，2019,1901673；Wang，Q.等人，Microchimica Acta，2019，186，468.)，但到目前为止还未见碳纳米棒作为pH探针的报道。
发明内容
本发明克服了现有技术的不足，本发明提供了N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒及其制备方法及应用。所述碳纳米棒是一种在水体或者生命体系中检测H+的荧光探针；具有可见光激发和Stokes位移较大的特点，可以有效避免入射光背景荧光的干扰。
为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的。
N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒，所述碳纳米棒具有以下结构通式I：
Figure BDA0002336571670000011
式中，R为：
Figure BDA0002336571670000021
中的任意一种；R’为烷基或烷基衍生物；CDs(Carbon Dots，CDs)为原有碳点，原有碳点的碳源来自于含有胺基的化合物。
优选的，所述含有胺基的化合物为烷基胺、苯胺、邻苯二胺、间苯二胺、对苯二胺、苯三胺、多巴胺中的任意一种。
N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒的制备方法，所述碳纳米棒是原有碳点表面的胺基与N-烷基苯乙烯类菁染料的醛基形成C＝N双键的连接后进一步碳化形成。
优选的，所述的N-烷基苯乙烯类菁染料的结构通式Ⅱ为：
Figure BDA0002336571670000022
式中，R为：
Figure BDA0002336571670000023
中的任意一种；R’为烷基或烷基衍生物；
优选的，所述原有碳点采取水热合成法或微波合成法得到，碳化过程采取乙醇回流。
N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒作为检测H+荧光探针的应用。
所述碳纳米棒检测H+的pH＝3.7-7.0，pKa值为5.14。
本发明相对于现有技术所产生的有益效果为。
与现有技术相比，本发明的N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒pH探针是基于光诱导电子转移(photoinduced electron transfer,PET)的原理设计合成的。该探针以原有表面富有胺基的碳点作为荧光团，N-烷基苯乙烯类菁染料在与碳点通过双键结合过程中再次碳化而形成了碳纳米棒。当该碳纳米棒与H+结合时，通过H+的诱导，导致PET过程发生，荧光逐渐猝灭。该碳纳米棒的pH探针充分利用了碳纳米材料好的水溶性和优秀的生物相容性，有效避免了对生命体系的毒性；另外该碳纳米棒pH探针具有在可见光区450nm的激发及105nm的大的Stokes位移，能够有效避免紫外激发光对细胞和生物样品的损伤及细胞或生物样品自身荧光的干扰，提高了检测方法的灵敏度和准确性，使之更有利于活体的检测和荧光成像。本发明的碳纳米棒pH探针可方便孵育进入细胞，通过激光共聚焦荧光显微镜可清晰地观察和检测细胞器溶酶体内的H+浓度的变化。本发明基于N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒的pH探针具有合成方法简单，检测灵敏度高、选择性好的特点，可在亚细胞层面溶酶体内观察和检测H+浓度的异常波动，对相关疾病的早期预防和诊断具有非常重要的价值和意义。
附图说明
图1是N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒粒径分布图。
图2是N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒pH探针与不同浓度的H+在纯水中的吸收光谱图。
图3是N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒pH探针与不同浓度的H+在纯水中的发射光谱图。
图4是pKa线性拟合图。
图5是N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒pH探针孵育进入细胞的溶酶体中，与溶酶体定位染料Lyso-Tracker Red在溶酶体内共定位的细胞成像图。
图6是N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒pH探针在结合H+前的细胞成像图。
图7是N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒pH探针在结合H+后的细胞成像图。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下面结合实施例及附图详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。
实施例1
一种N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒，所述碳纳米棒具有以下结构式：
Figure BDA0002336571670000031
CDs为原有碳点，碳点的碳源来自于邻苯二胺。
N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒的制备方法，是原有碳点表面的胺基与N-烷基苯乙烯类菁染料的醛基形成C＝N双键后进一步碳化。
反应物N-烷基苯乙烯类菁染料的结构式为：
Figure BDA0002336571670000041
原有碳点采取水热合成法，碳化过程采取乙醇回流。制备得到的碳纳米棒的粒径大小为长16.78nm，宽4.64nm，粒径分布图如图1所示。
上述结构式N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒pH探针具体是用于检测水体及生命体系中细胞或组织内H+浓度的变化，该碳纳米棒pH探针可借助激光共聚焦荧光显微镜在亚细胞层面溶酶体内检测H+浓度的变化。
该碳纳米棒长16.78nm，宽4.64nm，对H+有高的灵敏度和选择性，随着H+增加，荧光逐渐猝灭。该碳纳米棒测定H+的激发波长为450nm，发射波长为555nm，具有可见光激发和Stokes位移较大的特点，大的Stokes位移可以有效避免入射光背景荧光的干扰。该碳纳米棒pH探针还具有好的水溶性和优秀的生物相容性；在pH＝4.34-5.92之间与H+呈现良好的线性关系，其pKa值为5.14。在激光共聚焦荧光显微镜下成像显示该碳纳米棒pH探针定位在细胞器溶酶体内，溶酶体属于酸性细胞器，这样完全符合其作为pH探针检测H+的目的。
试验例1
将实施例1制备的含有N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒pH探针加入到纯水中，配成0.02mg/mL的溶液，其吸收峰位于410nm处，将H+溶液加入到上述溶液中，随着溶液中H+浓度的增加，吸收光谱逐渐红移至450nm，吸收强度逐渐增强，在422nm处出现了一个清晰的等吸收点，如图2所示。
试验例2
将实施例1制备的含有N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒pH探针加入到纯水中，配成0.02mg/mL的溶液，将H+溶液加入到该溶液中，随着溶液中H+浓度的增加，荧光强度逐渐降低，预示着光诱导电子转移过程(PET)的发生，荧光呈现明显的“on-off”特点(图3)，pKa为5.14(图4)。
试验例3
将实施例1制备的基于N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒的pH探针孵育到人的喉癌细胞Hep-2中(0.05mg/mL)，在37℃、5％CO2培养箱中孵育1小时后，用PBS缓冲溶液洗涤3次后，接着继续加入含有溶酶体定位功能的红色染料Lyso-Tracker Red(50nmol/L)，继续37℃、5％CO2培养箱中孵育30分钟之后，用PBS缓冲溶液洗涤3次，放于共聚焦激光扫描显微镜下，固定激发波长为458nm,发射波长为分别为500-580nm和580-630nm，可看到在500-580nm范围内基于N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒在细胞内的溶酶体成像为明亮的黄色荧光，在580-630nm范围内红色染料Lyso-Tracker Red在溶酶体内呈现红色荧光，两者在溶酶体内实现了共定位效应，说明基于N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒可实现在溶酶体内检测H+浓度的变化。(图5)
试验例4
将实施例1制备的基于N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒pH探针孵育到人的喉癌细胞Hep-2中(0.05mg/mL)，在37℃、5％CO2培养箱中孵育1小时后，用PBS缓冲溶液洗涤3次，放于激光共聚焦荧光显微镜下，发射波长设置为458nm，激发波长为500-580nm下，可看到未结合H+时N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒在溶酶体中呈现明亮的黄色荧光(图6)，之后在细胞中加入H+，使之浓度达到200μM，即pH为3.7下继续观察细胞内荧光强度的变化，随着时间的推移，细胞内的荧光强度逐渐降低，呈现荧光猝灭现象(图7)。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施方式仅限于此，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定专利保护范围。

Claims (5)

1.N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒，其特征在于，所述碳纳米棒具有以下结构式：
Figure 558270DEST_PATH_IMAGE001
CDs为原有碳点，碳点的碳源来自于邻苯二胺；
N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒的制备方法，是原有碳点表面的胺基与N-烷基苯乙烯类菁染料的醛基形成C=N双键后进一步碳化；
反应物N-烷基苯乙烯类菁染料的结构式为；
Figure 413093DEST_PATH_IMAGE002
。
2.根据权利要求1所述的N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒，其特征在于，所述的原有碳点采取水热合成法或微波合成法得到。
3.根据权利要求1所述的N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒，其特征在于，所述碳化是采取乙醇回流的方法。
4.如权利要求1所述的N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒作为检测H+荧光探针的应用。
5.根据权利要求4所述的N-烷基苯乙烯类菁染料功能化碳纳米棒作为检测H+荧光探针的应用，其特征在于，所述碳纳米棒检测H+的pH=3.7-7.0，pKa值为5.14。
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