CN111024563A - 一种白细胞分类试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及体外诊断技术领域，公开了一种白细胞分类试剂。本发明所述白细胞分类试剂包括聚氧乙烯型非离子表面活性剂、多元醇型非离子表面活性剂、缓冲液、电导率补充剂、渗透压调节剂和防腐剂。本发明试剂配方简单，不使用染料，主要成分仅有两种特定的非离子表面活性剂，避免了其他试剂可能会使得细胞损伤过度或者同一类细胞体积大小分布跨度太大，不能够有效分类的缺陷，能够将白细胞分为界限清楚的单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞(包含嗜碱性粒细胞)和嗜酸性粒细胞，同时还能对幼稚粒细胞进行分类。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，具体涉及一种白细胞分类试剂。
背景技术
人体血液中的细胞大致分为三类：红细胞、白细胞和血小板，其中白细胞又可以分为单核细胞、淋巴细胞和粒细胞(包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)五个亚类。血细胞在骨髓中生成，从未成熟细胞分化、成熟后再进入末梢血液发挥各自功能。正常健康人的末梢血中的白细胞的各个亚类的比例是恒定的，当人体出现一些疾病时，就会表现出某一类白细胞数量的增大或减小。此外，在正常健康人的静脉血中并不会出现一些未发育成熟的DNA含量比正常白细胞高的未成熟白细胞。而在患有白血病、癌症骨髓转移和重症感染症等病人的静脉血中则往往会出现未成熟白细胞，常见的是幼稚粒细胞。在支气管哮喘、寄生虫病、过敏性疾病、慢性粒细胞白血病等疾病中常伴随着嗜酸性粒细胞增多。因此，将血液样本中各白细胞分类并进行测定在疾病的诊断中具有非常重要的意义。
中国专利CN101008641B介绍了一种幼稚白细胞分析用试剂盒，其中第一试剂是含有非离子表面活性剂和氨基酸的溶血剂对血样进行处理，使幼稚白细胞保持生存状态而使其他白细胞损伤，通过包含荧光染料的第二试剂对受损的成熟白细胞进行染色，幼稚白细胞几乎不染色，根据染色强度的不同即可分辨出成熟白细胞和幼稚白细胞。但该方法只能将白细胞分成单核细胞、淋巴细胞和粒细胞三大类，无法对白细胞进行五分类。此外，现有技术中还存在多种对白细胞分类的试剂盒，但普遍不能对幼稚粒细胞进行分类，且存在各类白细胞分界不清的缺陷；
目前能够对嗜酸性粒细胞进行准确分类的试剂基本都需要染料来对嗜酸性粒细胞进行染色。检测幼稚粒细胞的试剂或试剂盒更是需要荧光染料对核酸进行染色，试剂配方难度大，原料价格昂贵，而且需要在特定能够检测荧光信号的血液分析仪上使用，导致医疗成本高。Sysmex XN-9000(及其配套试剂)就属于这种情形，其是目前在医院应用比较广泛的仪器，它的分类检测原理是利用溶血剂对白细胞进行荧光染色后，通过半导体激光流式细胞术对细胞进行分类。配套试剂包括：血细胞分析用稀释液-CELLPACK DFL、血细胞分析用溶血剂-SULFOLYSER和血细胞分析用溶血剂-Lysercell WPC(用于分类)。该试剂成分复杂，含有染料，会对环境造成污染。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种白细胞分类试剂，使其能够在不使用染料的前提下对淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞以及幼稚粒细胞进行分类，且各类细胞边界清晰明显，适用于SC-9000全自动血液分析仪。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种白细胞分类试剂，包括聚氧乙烯型非离子表面活性剂、多元醇型非离子表面活性剂、缓冲液、电导率补充剂、渗透压调节剂和防腐剂。
针对目前白细胞分类试剂普遍无法分类幼稚粒细胞以及各类白细胞分界模糊的缺点，本发明在不使用荧光染料的前提下，选择特定的两类非离子表面活性剂来溶解红细胞和血小板，使白细胞的细胞膜部分损伤，稳定幼稚粒细胞，同时配合渗透压调节剂改变红细胞的脆性，并使白细胞保持特定形态，改变不同类群白细胞之间的分界，基于电阻抗法和激光散射法对白细胞进行五分类，能够将淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞显著分离，同时能够分离出幼稚粒细胞。
作为本发明溶解红细胞和血小板并损伤成熟白细胞的细胞膜的聚氧乙烯型非离子表面活性剂，其优选为脂肪醇聚氧乙烯(9)醚(AEO-9)，月桂酸聚氧乙烯(9)酯(LAE-9)，壬基酚聚氧乙烯醚磷酸酯(OP-10)，Triton X-100，Triton X-305，Brij35(十二烷基聚乙二醇醚)中的一种或两种以上；聚氧乙烯型非离子表面活性剂的使用量通常为0.1-5g/L，优选为2-5g/L。
作为本发明稳定幼稚粒细胞的多元醇型非离子表面活性剂，其优选为Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80，Span-20、Span-40、Span-60、Span-80中的一种或两种以上，此外，该类表面活性剂作用温和，在本发明中还参与溶血以及保护白细胞的形态以助于分类；多元醇型非离子表面活性剂的使用量通常为0.5-15g/L，优选2-10g/L。
所述缓冲液可以选择常见的如磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液及Tris-盐酸缓冲液等。作为优选，可选用磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液及2-吗啉乙磺酸缓冲液，缓冲液使用量通常为0.01-0.5mol/L，优选0.02-0.2mol/L。缓冲液的pH优选范围为5-8。
所述电导率补充剂，将本发明所述试剂电导率维持在一定范围内，使其具有导电性，以便用电阻抗法检测细胞体积的大小，一般需维持试剂的电导率为10-25ms/cm，优选15-20ms/cm。所述电导率补充剂包括氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾、磷酸盐等，优选氯化钠、氯化钾。
为了改变红细胞的脆性以及不同类群白细胞之间的分界，并使白细胞保持特定形态，本发明将试剂的渗透压保持在合适范围。本发明试剂的渗透压通常为300-1200mOsm/kg，优选为400-800mOsm/kg，进一步优选为600-800mOsm/kg。所述渗透压调节剂包括碱金属盐、醇类等。常用的有碱金属盐类有氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾等，醇类有甲醇、乙醇、异丙醇等。优选的渗透压调节剂包括氯化钠、氯化钾、甲醇、异丙醇、丙二醇中的一种或多种组合。碱金属盐的使用量通常为1-15g/L，优选4-10g/L。醇类物质使用量通常为1-20g/L，优选2-15g/L。
防腐剂可以抑制试剂在长期放置过程中微生物的滋生，防止试剂变质，延长试剂的储存和使用时间，保证试剂在效期内性能稳定。常用的防腐剂有苯甲酸、山梨酸及其盐类、KroVin400、叠氮钠、Proclin-300、苯氧乙醇、甲醛溶液等，防腐剂的用量通常为0.01-2g/L。所述防腐剂优选KroVin400、山梨酸、Proclin-300中的一种。
本发明的白细胞分类试剂能对粒细胞进行特殊处理，使得粒细胞与单核细胞、淋巴细胞有效分离。SC-9000全自动血液分析仪采用电阻抗法测定白细胞体积大小信息，采用测定角度为8-20度的中角度散射光和测定角度为22-40度的高角度散射光测定白细胞的复杂度特征信息，从而使得白细胞在散点图上可以被分为界限清楚的单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞(包含嗜碱性粒细胞)和嗜酸性粒细胞。对于存在幼稚粒细胞的样本，本发明的试剂还可将幼稚粒细胞与其他成熟白细胞区分开。
由以上技术方案可知，本发明试剂配方简单，不使用染料，主要成分仅有两种特定的非离子表面活性剂，避免了其他试剂可能会使得细胞损伤过度或者同一类细胞体积大小分布跨度太大，不能够有效分类的缺陷，能够将白细胞分为界限清楚的单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞(包含嗜碱性粒细胞)和嗜酸性粒细胞，同时还能对幼稚粒细胞进行分类。
附图说明
图1所示为利用本发明白细胞分类试剂对血液样本的检测结果；其中，a为本发明试剂检测正常样本结果，b为本发明试剂检测含有幼稚粒细胞的异常样本结果；control为试剂(control)检测含有幼稚粒细胞的异常样本结果；Neu表示中性粒细胞，Lym表示淋巴细胞，Mon表示单核细胞，Eos表示嗜酸性粒细胞，IG表示幼稚粒细胞；
图2所示为利用本发明白细胞分类试剂对血液样本的检测结果；其中，c为本发明试剂检测正常样本结果，d为本发明试剂检测含有幼稚粒细胞的异常样本结果；Neu表示中性粒细胞，Lym表示淋巴细胞，Mon表示单核细胞，Eos表示嗜酸性粒细胞，IG表示幼稚粒细胞；
图3所示为利用本发明白细胞分类试剂对血液样本的检测结果；其中，e为本发明试剂检测正常样本结果，f为本发明试剂检测含有幼稚粒细胞的异常样本结果；Neu表示中性粒细胞，Lym表示淋巴细胞，Mon表示单核细胞，Eos表示嗜酸性粒细胞，IG表示幼稚粒细胞；
图4所示为中性粒细胞相关性线性回归方程；
图5所示为淋巴细胞相关性线性回归方程；
图6所示为单核细胞相关性线性回归方程；
图7所示为嗜酸性粒细胞相关性线性回归方程；
图8所示为实施例4的试剂对其中一例血液样本的检测结果；
图9所示为幼稚粒细胞分类参数相关性线性回归方程；
图10所示为实施例5的试剂对其中一例血液样本的检测结果。
具体实施方式
本发明公开了一种白细胞分类试剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述白细胞分类试剂已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述白细胞分类试剂进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
以下就本发明所提供的一种白细胞分类试剂做进一步说明。
实施例1：本发明所述白细胞分类试剂及其应用检测
测试上述配方配制的试剂的理化性质，pH为7.0，渗透压为396mOsm/kg，电导率为18ms/cm。使用上述试剂在SC-9000全自动血液分析仪上测试血液样本a(正常样本)和b(异常样本-存在幼稚粒细胞)结果如图1-a和图1-b所示。Neu表示中性粒细胞，Lym表示淋巴细胞，Mon表示单核细胞，Eos表示嗜酸性粒细胞，IG表示幼稚粒细胞。白细胞被分为中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞(及幼稚白细胞)几类，各类细胞界限清晰。
配制不使用本发明多元醇型非离子表面活性剂所配制的试剂(control)配方如下：
试剂(control)测试样本b的分类结果如图1-control，各类细胞团聚集在一起，分类效果不佳，且不能分类出幼稚粒细胞。
实施例2：本发明所述白细胞分类试剂及其应用检测
按上述配方配制的试剂，测试试剂的理化性质，pH为5.5，渗透压为525mOsm/kg，电导率为22ms/cm。使用上述试剂在SC-9000全自动血液分析仪上测试血液样本c(高嗜酸样本)和d(异常样本-存在幼稚粒细胞)，结果如图2-c和2-d所示，散点图上白细胞被分为淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞及嗜酸性细胞四个清晰的细胞团，存在幼稚粒细胞的样本中，幼稚粒细胞也单独成团。
同样按照实施例1配制试剂(control)，用十二烷基三甲基氯化铵取代本实施例配方中Tween-40，以试剂(control)检测样本d，结果仍然是各类细胞团聚集在一起，分类效果不佳，且不能分类出幼稚粒细胞。
实施例3：本发明所述白细胞分类试剂及其应用检测
按上述配方配制试剂，测试试剂的理化性质，pH为8.0，渗透压为685mOsm/kg，电导率为20ms/cm。使用上述试剂在SC-9000全自动血液分析仪上测试血液样本e(正常样本)和f(异常样本-存在幼稚粒细胞)，结果如图3-e和f所示，散点图上白细胞被分为淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞及嗜酸性细胞四个清晰的细胞团，存在幼稚粒细胞的样本中，幼稚粒细胞也单独成团。
同样按照实施例1配制试剂(control)，用十二烷基三甲基氯化铵取代本实施例配方中Tween-60，以试剂(control)检测样本d，结果仍然是各类细胞团聚集在一起，分类效果不佳，且不能分类出幼稚粒细胞。
实施例4：成熟白细胞分类相关性分析
本发明配方：
将本发明试剂在SC-9000全自动血液分析仪上的测试结果与Sysmex XN-9000(参考仪器)的测试结果相比较。即随机取100例新鲜血样本进行白细胞分类计数，如表1所示，以XN-9000结果为横坐标，以本发明试剂的结果为纵坐标，得到各分类参数相关性线性回归方程，如图4-7所示。结果表明，本发明试剂的白细胞分类结果与参考仪器有良好的相关性，而本试剂的测试成本大大低于对比仪器；图8显示是100例样本中一例含有IG的样本用本实施例试剂检测的结果，各类细胞边界清晰可见，且能够分类出幼稚粒细胞。
表1
实施例5：幼稚粒细胞分类相关性分析
本发明配方：
将本发明试剂在SC-9000全自动血液分析仪上测试的异常样本(存在IG)与参考仪器Sysmex XN-9000的测试结果相比较。即选取30例存在幼稚粒细胞的样本进行白细胞分类计数，统计IG％的分类结果，如表2所示。以XN-9000测试结果为横坐标，以本发明试剂的测试结果为纵坐标，得到幼稚粒细胞的相关性线性回归方程，如图9所示。结果表明，本发明试剂的测试幼稚粒细胞的结果与对比仪器有良好的相关性，而本试剂的测试过程及成本远低于对比仪器；图10显示是30例样本中的一例用本实施例试剂检测的结果，各类细胞边界清晰可见，且能够分类出幼稚粒细胞。
表2
| 样本编号 | XN-9000 | 发明试剂 | 样本编号 | XN-9000 | 发明试剂 | 样本编号 | XN-9000 | 发明试剂 |
| 1 | 2.1 | 1.91 | 11 | 4.4 | 3.52 | 21 | 0.6 | 0.63 |
| 2 | 3.7 | 3.16 | 12 | 3.5 | 2.37 | 22 | 1.74 | 1.10 |
| 3 | 4.5 | 4.23 | 13 | 4.6 | 3.51 | 23 | 2.5 | 2.37 |
| 4 | 2.7 | 2.38 | 14 | 4.4 | 3.12 | 24 | 4.7 | 3.68 |
| 5 | 2.9 | 2.50 | 15 | 2.5 | 1.96 | 25 | 1.5 | 1.32 |
| 6 | 2.2 | 2.13 | 16 | 2.0 | 1.67 | 26 | 0.4 | 0.11 |
| 7 | 2.7 | 2.44 | 17 | 4.2 | 3.99 | 27 | 1.1 | 0.85 |
| 8 | 2.6 | 2.52 | 18 | 3.4 | 2.74 | 28 | 3.6 | 3.08 |
| 9 | 2.7 | 2.30 | 19 | 2.3 | 1.97 | 29 | 2.9 | 3.12 |
| 10 | 4.0 | 2.91 | 20 | 3.2 | 2.92 | 30 | 2.4 | 2.16 |
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种白细胞分类试剂，其特征在于，包括聚氧乙烯型非离子表面活性剂、多元醇型非离子表面活性剂、缓冲液、电导率补充剂、渗透压调节剂和防腐剂。
2.根据权利要求1所述白细胞分类试剂，其特征在于，所述聚氧乙烯型非离子表面活性剂选自脂肪醇聚氧乙烯(9)醚，月桂酸聚氧乙烯(9)酯，壬基酚聚氧乙烯醚磷酸酯，TritonX-100，Triton305，Brij35中的一种或两种以上。
3.根据权利要求1或2所述白细胞分类试剂，其特征在于，所述聚氧乙烯型非离子表面活性剂用量为0.1-5g/L。
4.根据权利要求1所述白细胞分类试剂，其特征在于，所述多元醇型非离子表面活性剂选自Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80，Span-20、Span-40、Span-60、Span-80中的一种或两种以上。
5.根据权利要求1或4所述白细胞分类试剂，其特征在于，所述多元醇型非离子表面活性剂的用量为0.5-15g/L。
6.根据权利要求1所述白细胞分类试剂，其特征在于，所述电导率补充剂为氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾、磷酸盐中的一种或两种以上。
7.根据权利要求1或6所述白细胞分类试剂，其特征在于，所述电导率补充剂的用量为使白细胞分类试剂的电导率在10-25ms/cm。
8.根据权利要求1所述白细胞分类试剂，其特征在于，所述渗透压调节剂选自碱金属盐和醇类中的一种或两种以上。
9.根据权利要求1或8所述白细胞分类试剂，其特征在于，所述渗透压调节剂的用量为1-20g/L。
10.根据权利要求1所述白细胞分类试剂，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液或Tris-盐酸缓冲液。
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