CN111018955A - 一种抑制病毒基因组rna复制的多肽 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制病毒基因组RNA复制的多肽，属于分子生物学技术领域；所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的多肽能够与病毒基因组RNA竞争NP上的结合位点，导致病毒基因组RNA无法与NP结合，从而使病毒无法复制。本发明的多肽可以开发成为抗病毒的药物。

Description

一种抑制病毒基因组RNA复制的多肽

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种抑制病毒基因组RNA复制的多肽。

背景技术

单分子负链RNA病毒目(Monpnegavirales)包括负黏病毒科、弹状病毒科、丝状病毒科和博尔纳病毒科，病毒基因组为单分子线形负义单链RNA。该目的主要特征是：基因组为负链RNA、螺旋对称核衣壳、基础转录由病毒的RNA依赖性RNA聚合酶起始、有相同的基因排列顺序(3’-非翻译区-核心蛋白基因-囊膜基因-聚合酶基因-非翻译区-5’)、只有一个3’的启动子。

病毒基因组的装配及转录复制的工作机理一直是病毒学研究的核心问题之一。病毒核蛋白(Nucleoprotein，NP)作为病毒的核心蛋白之一，其在病毒基因组的复制与衣壳化的过程中发挥着极为重要的作用。一方面，NP分子与病毒基因组RNA结合，形成核糖核蛋白复合体(Ribonucleoprotein，RNP)核心，保护病毒基因组不被宿主细胞降解。另一方面，它还能与转录复制相关蛋白结合，调节病毒的转录复制过程、参与病毒颗粒的装配与成熟。

如果能够破坏NP结合并保护病毒RNA的作用机制，使病毒基因组RNA失去保护，暴露在外最终被降解，从而使病毒无法复制，将是抗病毒药物研究的一个新思路。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种抑制病毒基因组RNA复制的多肽，本发明的多肽能够与病毒基因组RNA竞争NP上的结合位点，导致病毒基因组RNA无法与NP结合，从而使病毒无法复制。本发明的多肽可以开发成为抗病毒的药物。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二方面，提供一种多核苷酸，其编码上述多肽。

优选的，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.2所示。

包含上述多核苷酸的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌也是本发明的保护范围。

本发明的第三方面，提供上述多肽在制备抑制病毒基因组RNA复制的药物中的应用。

进一步的，所述多肽通过与病毒基因组RNA竞争NP上的结合位点来抑制病毒基因组RNA的复制。

优选的，所述病毒为毒性出血败血症病毒(VHSV)。

本发明的第四方面，提供上述多核苷酸、包含上述多核苷酸的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌在制备抑制病毒基因组RNA复制的药物中的应用。

本发明的第五方面，提供一种抑制病毒基因组RNA复制的药物，其包含上述的多肽。

本发明的第六方面，提供一种合成结合上述多肽的NP蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)将SEQ ID NO.2所述的多核苷酸与NP基因通过PCR引物自退火连接，并进一步PCR扩增，回收PCR产物；

(2)将步骤(1)回收的PCR产物连接到质粒载体上，得到重组质粒；然后将重组质粒转入大肠杆菌，得到阳性重组菌株；

(3)将阳性重组菌株振摇培养1-2h，然后加入IPTG，使IPTG的终浓度为0.5M，诱导培养16-18h；将诱导培养后的菌体离心，沉淀用收菌buffer悬起，用高压匀质机破菌，破菌后进行离心，将离心分离后的上清与镍介质在4℃条件下进行孵育，然后依次进行洗杂、洗脱目的蛋白、浓缩和纯化处理，得到结合上述多肽的NP蛋白。

优选的，所述收菌buffer的组成为：20mM Hepes，500mM NaCl，pH为7.0。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供了一种多肽，该多肽能够与病毒基因组RNA竞争NP上的结合位点，导致病毒基因组RNA无法与NP结合，从而使病毒无法复制。

(2)本发明运用分子生物学技术构建表达载体，通过原核表达的方式表达目的蛋白，得到结合上述多肽的NP蛋白，该NP蛋白不与病毒的RNA分子结合。

附图说明

图1：HiTrap^TM Heparin HP图；其中a为VHSV-NP的HiTrap^TM Heparin HP图；b为结合P肽的VHSV-NP的HiTrap^TM Heparin HP图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，如果能够破坏NP结合并保护病毒RNA的作用机制，使病毒基因组RNA失去保护，暴露在外最终被降解，从而使病毒无法复制，将是抗病毒药物研究的一个新思路。

磷蛋白(phosphoprotein，P)是病毒体内的一种蛋白(其氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示)，其在前期的时候会同病毒NP相互作用，使NP分子保持RNA-free的状态，但在病毒需要进行复制时，磷蛋白会与NP分离。

为了能够持续的与病毒NP相互作用，本发明对磷蛋白进行了结构改造，对磷蛋白进行了截短处理，但是，不同方法获得的截短型突变体的表达水平是无法预测的，在截短体中即使出现1个或几个氨基酸的差异，均可显著影响其表达水平；另一方面，所获得的截短型突变体的性能也难以进行预测。因此，如何使所获得的截短型突变体与野生型蛋白具有等效或者更高效的作用，同时获得比野生型蛋白更高的表达效率，是目前研究的难点所在。

本发明选取磷蛋白N端40个氨基酸得到多肽进行研究，结果发现，该段多肽能够与病毒基因组RNA竞争NP上的结合位点，导致病毒基因组RNA无法与NP结合，从而使病毒无法复制。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1：抑制病毒基因组RNA复制的多肽(P肽)

本发明的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该段多肽可采用现有的人工合成多肽技术合成得到。

实施例2：结合上述多肽的NP蛋白的合成

(1)将SEQ ID NO.2所述的多核苷酸与病毒性出血败血症病毒(VHSV)的NP基因通过PCR引物自退火连接，并进一步PCR扩增，回收PCR产物，称为N⁰P基因；

所采用的PCR引物如下：

NP-1-S

ATGGAAGGTGGCATCCGCGC；(SEQ ID NO.4)

NP-404-AS

TTAGTCACTATCCTCCGGATAATC。(SEQ ID NO.5)

P40-1-S

ATGGCTGACATTGAGATGAGCGAG；(SEQ ID NO.6)

P40-NP1-AS

GGCGCGGATGCCACCTTCCAT。(SEQ ID NO.7)

(2)将N⁰P基因与质粒载体PET-28a用XhoI和BamHI 37℃酶切过夜。

(3)酶切体系进行琼脂糖凝胶电泳后切胶回收。

(4)将回收的基因和质粒通过T4连接酶连接。

(5)连接体系转化E.coli DH5α。

(6)挑单克隆，PCR鉴定，阳性重组质粒由青岛擎科梓熙生物技术有限公司进行序列测定。

(7)测序正确的质粒转化E.coli BL21(DE3)。

(8)挑克隆，摇菌，摇混后用IPTG 16℃诱导16-18h。

(9)菌体用美国贝克曼公司Avanti J-26S XP高速离心机4℃6000rpm离心15min，倒掉上清，沉淀用收菌buffer悬起。

(10)用高压匀质机破菌，温度调至4℃。至流出的菌液不再粘稠，能在液面打出气泡为止。

(11)将上一步的菌液使用美国贝克曼公司Avanti J-26S XP在4℃条件下12000rpm离心30min。

(12)上清与镍介质在四度冰箱孵育

(13)洗杂:分别用25mM和50mM的咪唑洗去杂蛋白，25mM咪唑每次静置5min，洗5-6次，50mM咪唑每次静置3min，洗3次。该步骤在四度冰箱或冰上进行。

(14)用30ml 500mM的咪唑洗脱目的蛋白，每次静置5min。该步骤在四度冰箱或冰上进行。

(15)蛋白溶液用30kDa的浓缩管浓缩。浓缩时转速为3500rpm/min，4℃。

(16)浓缩至1ml后开始换低盐溶液，缓慢加入，防止局部盐浓度变化太大使蛋白沉淀，1:1换4次，至溶液中的盐浓度为200mM为止。

(17)蛋白溶液使用GE AKTA Protein Purification System过HiTrap^TM HeparinHP，收集出峰位置的蛋白溶液。

(18)将收集到的蛋白溶液重复(14)、(15)步，得到纯化的蛋白。

所述步骤(9)中使用的收菌buffer为20mM Hepes，500mM NaCl，PH为7.0。

所述步骤(13)-(14)中使用的咪唑都是先配1M咪唑，成分为1M咪唑，20mM Hepes，200mM NaCl，PH为7.0，然后用收菌buffer稀释成需要的浓度。

所述步骤(16)中使用的低盐溶液为20mM Hepes，200mM NaCl，PH为7.0。

采用上述步骤可获得结合P肽的NP蛋白。

单独纯化NP过HiTrap^TM Heparin HP时254nm的核酸峰远高于280nm的蛋白峰，说明NP结合了核酸，当在NP的C末端加上P肽后，发现280nm的蛋白峰远高于254nm的核酸峰，说明N⁰P不结合核酸(图1a和图1b)。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 济南大学

<120> 一种抑制病毒基因组RNA复制的多肽

<130> 2020

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ala Asp Ile Glu Met Ser Glu Ser Leu Val Leu Ser His Gly Ser

1 5 10 15

Leu Ala Asp Leu Asp Lys Arg Leu Asp Asn Ala Pro Lys Asp Asn Arg

20 25 30

Ser Ala Leu Phe Ser Ser Thr Ser

35 40

<210> 2

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggctgaca ttgagatgag cgagtccttg gtcctgtccc acggttccct agctgacctg 60

gacaagagac tagacaacgc ccccaaagac aacaggtcag ctctattctc atccacctca 120

<210> 3

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Ala Asp Ile Glu Met Ser Glu Ser Leu Val Leu Ser His Gly Ser

1 5 10 15

Leu Ala Asp Leu Asp Arg Lys Leu Asp Asn Ala Pro Lys Asp Asn Arg

20 25 30

Ser Ala Leu Phe Ser Ser Thr Ser Gly Ser Thr Arg Gln Lys Ser Ser

35 40 45

Pro Lys Lys Lys Ser Asn Pro Thr Thr Leu Glu Glu Ile Ile Glu Tyr

50 55 60

Phe Val Pro Glu Asp Leu Gln Leu Asp Ala Thr Lys Ser Phe Gly Gln

65 70 75 80

Leu Leu Arg Arg Ile Lys Met Ser His Gln Glu Glu Leu Thr Gln His

85 90 95

Leu Glu Arg Val Asn Gly Glu Asn Arg Ala Arg Met Gly Ala Leu Leu

100 105 110

Glu Ser Gln Lys Glu Asn Gly Lys Lys Thr Asp Asn Ile Leu Ser Ile

115 120 125

Leu Ile Ser Met Arg Gly Glu Gly Ala Glu Asn Ala Ser Lys Lys Pro

130 135 140

Lys Val Leu Asp Gly Asp Gln Val Arg Ser Glu Arg Ala Leu Gly Phe

145 150 155 160

Asn Arg Gly Leu Thr Thr Ala Ala Ile Ala Met Arg Lys Phe Lys Leu

165 170 175

Glu Asp Pro Leu Ala Leu Cys Lys Gly Ser Val Lys Arg Ala Ala Leu

180 185 190

Ser Ala Met Glu Lys Glu Glu Tyr Asp Gly Glu Arg Glu Thr Tyr Ser

195 200 205

Thr Val Ser Lys Ala Ile Lys Ala Glu Leu Asp Lys Leu Glu

210 215 220

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggaaggtg gcatccgcgc 20

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttagtcacta tcctccggat aatc 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atggctgaca ttgagatgag cgag 24

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggcgcggatg ccaccttcca t 21

Claims (10)

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种多核苷酸，其编码权利要求1所述的多肽。

3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.2所示。

4.包含权利要求2或3所述的多核苷酸的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌。

5.权利要求1所述的多肽在制备抑制病毒基因组RNA复制的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述多肽通过与病毒基因组RNA竞争NP上的结合位点来抑制病毒基因组RNA的复制。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述病毒为毒性出血败血症病毒。

8.权利要求2或3所述的多核苷酸、包含权利要求2或3所述的多核苷酸的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌在制备抑制病毒基因组RNA复制的药物中的应用。

9.一种抑制病毒基因组RNA复制的药物，其包含权利要求1所述的多肽。

10.一种合成结合上述多肽的NP蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将SEQ ID NO.2所述的多核苷酸与NP基因通过PCR引物自退火连接，并进一步PCR扩增，回收PCR产物；

(2)将步骤(1)回收的PCR产物连接到质粒载体上，得到重组质粒；然后将重组质粒转入大肠杆菌，得到阳性重组菌株；

(3)将阳性重组菌株振摇培养1-2h，然后加入IPTG，使IPTG的终浓度为0.5M，诱导培养16-18h；将诱导培养后的菌体离心，沉淀用收菌buffer悬起，用高压匀质机破菌，破菌后进行离心，将离心分离后的上清与镍介质在4℃条件下进行孵育，然后依次进行洗杂、洗脱目的蛋白、浓缩和纯化处理，得到结合上述多肽的NP蛋白。

Images