CN111012953B - 一种抗酶解交联透明质酸凝胶的制备方法及所得产品和应用 - Google Patents

一种抗酶解交联透明质酸凝胶的制备方法及所得产品和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗酶解交联透明质酸凝胶的制备方法及所得产品和应用，该方法向交联透明质酸凝胶中加入吲哚美辛微球。本发明的吲哚美辛可以抑制透明质酸酶的活性，做成微球形式既能够提高吲哚美辛在凝胶中的分散均匀程度，又可以缓慢释放长期发挥其抑制作用，增强交联透明质酸的体内维持时间。同时，吲哚美辛的添加也降低了透明质酸注射引起的局部皮肤淤血、感染、疼痛等不良反应。该方法制备的交联透明质酸凝胶，可显著降低交联剂的使用量，用在美容填充领域，有效减少了交联剂用量过多而引起的体内毒性以及机体排异和炎症反应。

Description

一种抗酶解交联透明质酸凝胶的制备方法及所得产品和应用
技术领域
本发明涉及一种长效抗酶解交联透明质酸凝胶的制备方法及所得产品和应用，属于透明质酸技术领域。
背景技术
透明质酸，又称玻尿酸，由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺组成。透明质酸良好的粘弹性和生物相容性使其在医药、美容行业被广泛应用，经常用于手术粘弹剂和软组织填充剂。
天然的透明质酸易被体内的透明质酸酶降解，目前主要通过交联来有效降低透明质酸的降解，延长体内维持时间。为了达到理想的体内维持时间，一般采用加大交联剂用量或优化交联条件和方法来提高凝胶的交联度。专利CN108250462A公开了一种交联透明质酸凝胶的制备方法，采用高低分子量透明质酸相互交联的方式达到其抗热解、抗酶解性能，该方法的交联剂用量相对较大。由于交联剂一般为二乙烯基砜(DVS)、1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)等化学交联剂，随着交联剂用量的增多，其生物相容性和透明度均降低，引发机体产生局部皮肤淤血、感染、疼痛等不良反应，还会影响交联透明质酸凝胶的粘稠度和流动性，推注性能变差，增加操作的困难程度。
黄酮类、生物碱、抗炎药物等具有一定的抑制透明质酸酶活性的作用。专利CN109758607A公开了一种抵抗透明质酸酶水解的交联透明质酸凝胶，将天然黄素辅酶或其衍生物分子添加进凝胶，测定该交联透明质酸凝胶的降解率，发现72h内透明质酸酶催化效率被降低50％以上。但是该专利中天然成分或药物直接添加在透明质酸中，在体内释放较快，达不到预期的效果；此外，对于一些水相或有机相不溶的成分，其有效添加量也限制了这一方法的应用。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种抗酶解交联透明质酸凝胶的制备方法，该方法将透明质酸交联，同时向透明质酸交联产物中加入能够抑制透明质酸酶活性的吲哚美辛微球，减少了交联剂的用量，不仅能够提高透明质酸的抗酶解能力，还能降低透明质酸注射引起的局部皮肤淤血、感染、疼痛等不良反应。
本发明还提供了按照上述方法制得的抗酶解交联透明质酸凝胶，该凝胶中含有交联透明质酸和吲哚美辛微球，吲哚美辛以微球形式存在，延长了在体内的留存时间，提高了抗降解能力。
本发明还提供了该抗酶解交联透明质酸凝胶在美容填充领域的应用。
本发明提供了一种抗酶解交联透明质酸凝胶的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)将透明质酸或其盐溶解在含有交联剂的氢氧化钠溶液中进行交联反应；
(2)反应后将反应凝胶调整pH值至中性，然后用含有吲哚美辛微球的中性磷酸盐缓冲液进行透析；
(3)透析后，进行高压蒸汽灭菌，然后灌装在预灌封注射器中，得抗酶解交联透明质酸凝胶。
进一步的，步骤(1)中，氢氧化钠溶液的浓度为0.5-1.5wt％。透明质酸或其盐在其中的质量体积浓度为5-15％。
进一步的，步骤(1)中，所述透明质酸或其盐的分子量可以根据实际应用要求进行选择。其中，所述透明质酸盐可以是透明质酸的钠盐、钾盐、钙盐等，常用的为钠盐。
进一步的，步骤(1)中，所述交联剂为二乙烯基砜或1,4-丁二醇二缩水甘油醚，优选为1,4-丁二醇二缩水甘油醚。交联剂的用量为透明质酸或其盐质量的2-6％。本发明通过透明质酸的交联和吲哚美辛微球共同作用来提高凝胶的抗酶解能力，因为吲哚美辛微球的加入，可以减少交联剂的使用量，减少交联剂过量使用带来的局部皮肤淤血、感染、疼痛等不良反应。
进一步的，步骤(1)中，交联温度为37～42℃，交联时间为12～36h。
进一步的，本发明通过吲哚美辛的加入来提高凝胶的抗酶解能力，为了提高吲哚美辛在体内的留存时间，吲哚美辛以微球的形式加入。试验发现，当微球的粒径较大时，在凝胶中容易分散不均匀或容易沉淀，且粒径较大用于软组织填充也会产生异物感。因此，本发明步骤(2)的吲哚美辛微球的粒径在1-50μm范围内选择。吲哚美辛的微球可以是此粒径范围中的一种，也可以是此粒径范围内的两种或两种以上。试验中惊奇的发现，当吲哚美辛微球选择10～20μm的单一粒径，或者选6～15μm和30～40μm这两个粒径范围时，不仅能保证微球在凝胶中的均匀分散，还能显著提高凝胶的抗酶解能力。更优选的，粒径为30～40μm的微球和粒径为6～15μm的微球的质量比为1:1-5。
进一步的，本发明所用吲哚美辛微球可以采用以下方法制得：
a.将吐温-80、明胶按照1:0.8-1.2的质量比在水中混合均匀，吐温-80的浓度为0.5-0.8wt％，形成水相；
b.将吲哚美辛、聚乳酸按照1：48-52的质量比在二氯甲烷中溶解，吲哚美辛的浓度为0.02-0.04wt％，形成油相；
c.在搅拌下将油相滴加至水相中，油相和水相的体积比为1：8～12，滴完后搅拌乳化，得乳液；
d.将乳液倒入旋转蒸发仪中，室温下挥发去除二氯甲烷，然后将剩余的乳液过滤、洗涤、干燥，得吲哚美辛微球。
上述微球制备方法中，步骤d中，旋转蒸发时的转速为100～500r/min，优选为260～380r/min。通过旋转蒸发转速的调整可以得到不同粒径范围的微球。
进一步的，步骤(2)中，吲哚美辛微球在中性磷酸盐缓冲液中的浓度为0.5～2.5mg/mL。
进一步的，步骤(2)中，反应液在含有吲哚美辛微球的中性磷酸盐缓冲液中透析24-48h。
进一步的，步骤(2)中，所述中性磷酸盐缓冲液的pH为6.7～7.5，优选为6.9～7.3。中性磷酸盐缓冲液中除了吲哚美辛微球外，还含有利多卡因、维生素和多元醇中的至少一种，所述维生素优选为维生素E，所述多元醇优选为甘油。其中，利多卡因在中性磷酸盐缓冲液中的浓度为0.1-0.3wt％，维生素在中性磷酸盐缓冲液中的浓度为0.2-0.4wt％，多元醇在中性磷酸盐缓冲液中的浓度为6-10wt％。
进一步的，步骤(3)中，高压蒸汽灭菌的温度为115～125℃，灭菌时间为10-20min。
本发明上述方法所得的抗酶解交联透明质酸凝胶中交联剂含量少，使用时不良反应少。同时存在交联透明质酸和吲哚美辛微球，抗酶解能力强。因此，按照上述方法所得的产品以及该产品在美容填充领域的应用也在保护范围之内。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明凝胶中含有吲哚美辛微球，吲哚美辛可以抑制透明质酸酶的活性，做成微球形式既能够提高吲哚美辛在凝胶中的分散均匀程度，又可以缓慢释放长期发挥其抑制作用，增强交联透明质酸的体内维持时间。同时，吲哚美辛的添加也降低了透明质酸注射引起的局部皮肤淤血、感染、疼痛等不良反应。
2、本发明凝胶能实现对透明质酸酶的长期抑制作用，同时可显著降低交联剂的使用量，用在美容填充领域能有效减少交联剂用量过多而引起的体内毒性以及机体排异和炎症反应，增加了患者的依从性。
附图说明
图1为动物试验的标记方式示意图，其中星号为注射位点。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明，下述说明仅是示例性的，并不对其内容进行限定。
下述实施例中，如无特别说明，均为质量百分含量。
下述实施例中，所用透明质酸的分子量均为120万道尔顿。
实施例1
分别称取0.6g的吐温-80和0.6g的明胶，加入100mL的双蒸水中于70℃水浴中助溶，溶解后冷却至室温，得水相。
取2mg吲哚美辛和100mg聚乳酸于10mL二氯甲烷中搅拌溶解，得油相。
将油相在高剪切分散机的高剪切作用下(9000r/min)滴加至水相中，并持续搅拌30min得乳液，将乳液倒入旋转蒸发仪中，在室温下分别以100r/min、260r/min、320r/min、380r/min、500r/min的转速旋转蒸发乳液中的二氯甲烷，除去二氯甲烷后的乳液进行抽滤，固体用双蒸水洗涤3次，冷冻干燥，得吲哚美辛微球。
分别取少量吲哚美辛微球分散在蒸馏水中，超声2min，电镜观察其分散均匀程度，继续超声0.5h，使其充分分散，利用激光粒度仪检测微球的粒径。电镜观察发现，所得各微球在水中的分散性均较好，经检测，100r/min的转速所得到的微球的粒径在15～35μm范围内，260r/min的转速所得到的微球的粒径在6～15μm范围内，320r/min的转速所得到的微球的粒径在10～20μm范围内，380r/min的转速所得到的微球的粒径在30～40μm范围内，500r/min的转速所得到的微球的粒径在35～50μm范围内。
实施例2
本实施例主要考察不同粒径吲哚美辛微球对交联透明质酸凝胶的抗酶解性能影响，具体方法如下：
将2g透明质酸溶于20mL1wt％氢氧化钠溶液中，加入交联剂BDDE，交联剂用量为透明质酸质量的4wt％，混合均匀后于40℃水浴中交联24h，完成后用盐酸溶液调节pH值至中性。
将上述反应凝胶中分别用含有1.5mg/mL的吲哚美辛微球的中性磷酸盐溶液透析24h，分别分为7组，其中2-a组吲哚美辛微球的粒径为10～20μm；2-b组吲哚美辛微球的粒径为6～15μm；2-c组吲哚美辛微球的粒径为30～40μm；2-d组吲哚美辛微球的粒径为30～40μm和6～15μm，这两种粒径的质量比为1:2；2-e组吲哚美辛微球的粒径为15～35μm；2-f组吲哚美辛微球的粒径为35～50μm；2-g组吲哚美辛微球的粒径为10～20μm和35～50μm，这两种粒径的质量比为1:2。
透析后，将各组凝胶在121℃的高压下蒸汽灭菌15min，灌装在预灌封注射器中，得到交联透明质酸凝胶2-a、2-b、2-c、2-d、2-e、2-f、2-g。
实施例3
本实施例主要考察吲哚美辛微球添加进交联透明质酸凝胶的最佳有益剂量，具体方法如下：
将2g透明质酸溶于20mL1wt％氢氧化钠溶液中，加入交联剂BDDE，交联剂用量为透明质酸质量的4wt％，混合均匀后于40℃水浴中交联24h，完成后用盐酸溶液调节pH值至中性。
在分别含有0～2.5mg/mL的吲哚美辛微球的中性磷酸盐溶液中透析24h，吲哚美辛微球的粒径为10～20μm。
透析后，将各组凝胶在121℃的高压下蒸汽灭菌15min，灌装在预灌封注射器中，得到交联透明质酸凝胶。
吲哚美辛微球含量及所得凝胶命名如下：
Figure BDA0002310843450000051
实施例4
将4g透明质酸溶于40mL1wt％氢氧化钠溶液中，后加入交联剂BDDE，交联剂用量为透明质酸质量的6wt％，混合均匀后于40℃水浴中交联24h，完成后用盐酸溶液调节pH值至中性，在含有1.5mg/mL的、粒径为10～20μm吲哚美辛微球的中性磷酸盐溶液中透析24h，该中性缓冲液还含有0.2wt％的利多卡因，0.3wt％的维生素E，8wt％的甘油，透析后121℃蒸汽灭菌15min，灌装在预灌封注射器中，得到交联透明质酸凝胶4。
实施例5
将4g透明质酸溶于40mL1wt％氢氧化钠溶液中，后加入交联剂BDDE，交联剂用量为透明质酸质量的4wt％，混合均匀后于40℃水浴中交联24h，完成后用盐酸溶液调节pH值至中性，在含有1.5mg/mL的、粒径为10～20μm的吲哚美辛微球的中性磷酸盐溶液中透析24h，该中性缓冲液还含有0.2wt％的利多卡因，0.3wt％的维生素E，8wt％的甘油，透析后121℃蒸汽灭菌15min，灌装在预灌封注射器中，得到交联透明质酸凝胶5。
实施例6
将4g透明质酸溶于40mL1wt％氢氧化钠溶液中，后加入交联剂BDDE，交联剂用量为透明质酸质量的2wt％，混合均匀后于40℃水浴中交联24h，完成后用盐酸溶液调节pH值至中性，在含有1.5mg/mL的、粒径为10～20μm的吲哚美辛微球的中性磷酸盐溶液中透析24h，该中性缓冲液还含有0.2wt％的利多卡因，0.3wt％的维生素E，8wt％的甘油，透析后121℃蒸汽灭菌15min，灌装在预灌封注射器中，得到交联透明质酸凝胶6。
对比例1
将4g透明质酸溶于40mL 1％氢氧化钠溶液中，后加入交联剂BDDE，交联剂用量为透明质酸质量的4％，混合均匀后于40℃水浴中交联24h，完成后用盐酸溶液调节pH值至中性，在pH为中性磷酸盐溶液中透析24h，该中性缓冲液还含有0.2wt％的利多卡因，0.3wt％的维生素E，8wt％的甘油，透析后121℃蒸汽灭菌15min，灌装在预灌封注射器中，得到交联透明质酸混合凝胶A。
对比例2
将4g透明质酸溶于40mL 1％氢氧化钠溶液中，后加入交联剂BDDE，交联剂用量为透明质酸质量的4％，混合均匀后于40℃水浴中交联24h，完成后用盐酸溶液调节pH值至中性，在含有1.5mg/mL的吲哚美辛的中性磷酸盐溶液中透析24h，该中性缓冲液还含有0.2wt％的利多卡因，0.3wt％的维生素E，8wt％的甘油，透析后121℃蒸汽灭菌15min，灌装在预灌封注射器中，得到交联透明质酸混合凝胶B。
对比例3
将4g透明质酸溶于40mL 1％氢氧化钠溶液中，后加入交联剂BDDE，交联剂用量为透明质酸质量的4％，混合均匀后于40℃水浴中交联24h，完成后用盐酸溶液调节pH值至中性，在含有1.5mg/mL的布洛芬微球的中性磷酸盐溶液中透析24h，该中性缓冲液还含有0.2wt％的利多卡因，0.3wt％的维生素E，8wt％的甘油，透析后121℃蒸汽灭菌15min，灌装在预灌封注射器中，得到交联透明质酸混合凝胶C。
布洛芬微球的制备方法为：
分别称取0.6g的吐温-80和0.6g的明胶，加入100mL的双蒸水中于70℃水浴中助溶，溶解后冷却至室温，得水相。
取2mg布洛芬和100mg聚乳酸于10mL二氯甲烷中搅拌溶解，得油相。
将油相在高剪切分散机的高剪切作用下(9000r/min)滴加至水相中，并持续搅拌30min得乳液，将乳液倒入旋转蒸发仪中，在室温下分别以320r/min的转速旋转蒸发乳液中的二氯甲烷，除去二氯甲烷后的乳液进行抽滤，固体用双蒸水洗涤3次，冷冻干燥，得布洛芬微球。
验证例1
分别精密称取上述实施例2和3制备的凝胶0.5g，各加入0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.0)2mL和透明质酸酶液(600U/mL)2mL，混合均匀后置于37℃水浴中24h，然后煮沸除酶，离心取上清，按照咔唑显色法检测530nm处的光吸收值，测定糖醛酸含量，乘以2.07后折算为交联透明质酸含量，此含量即为降解的交联透明质酸的含量，计算酶解率。酶解率＝(降解的交联透明质酸含量/交联透明质酸初始含量)×100％。酶解率越低，表明凝胶的抗酶解越好，凝胶在体内的效果维持时间越长。
检测结果如表1所示。
表1
凝胶 酶解率(％)
2-a 61.18
2-b 69.36
2-c 66.23
2-d 60.69
2-e 65.14
2-f 68.33
2-g 64.12
3-1 87.93
3-2 72.83
3-3 66.14
3-4 61.22
3-5 60.88
3-6 60.82
从凝胶2-a～2-g的酶解结果可以看出，吲哚美辛微球的粒径对凝胶的抗酶解性能有影响，其中粒径为10～20μm的微球和粒径为6～15μm和30～40μm的微球混合物对凝胶的抗酶解性能的提高最佳。
从凝胶3-1～3-6的酶解结果可以看出，吲哚美辛微球含量为0～1.5mg/mL时，随着微球含量的增加，对透明质酸酶的抑制作用变化最明显，1.5mg/mL之后随着吲哚美辛微球含量的增加，对透明质酸酶的抑制作用没有明显的提高，因此微球在中性磷酸盐缓冲液中的最佳含量为1.5mg/mL。
验证例2
分别精密称取上述实施例4-6和对比例1-3制备的凝胶1g，各加入0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.0)2mL和透明质酸酶液(600U/mL)500μL，混合均匀后置于37℃水浴中，分别于1d、2d、4d、7d取500μL的混合液与0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.0)1mL混合均匀，然后煮沸除酶，离心取上清，按照咔唑显色法检测530nm处的光吸收值，测定糖醛酸含量，乘以2.07后折算为交联透明质酸含量，此含量即为降解的交联透明质酸的含量，计算酶解率。酶解率＝(降解的交联透明质酸含量/交联透明质酸初始含量)×100％。
检测结果如表2所示。
表2
Figure BDA0002310843450000081
从上表结果可以看出，与不加入吲哚美辛、吲哚美辛以原药粉末的形式加入的凝胶A和B相比，本发明加入吲哚美辛微球的凝胶的抗酶解能力明显提升，且在抗酶解性能相当的情况下，本发明交联剂使用量大大减少。从凝胶C看，向凝胶中加入布洛芬微球比加入吲哚美辛微球的的抗酶解性能差异明显，吲哚美辛微球对透明质酸凝胶的抗酶解性能提升有意料之外的突出效果。
验证例3
取健康的新西兰大白兔18只，雌雄各半，试验前适应性饲养5天以上。用脱毛剂对兔背部进行脱毛，在每只兔背部以纹身的形式做标记，两侧各三个点，每个点之间距离超过2cm，如图1所示，1-6标记处分别注射凝胶4-6和凝胶A-C。
分别在术后7d、14d、28d进行局部检查，记录有无肉眼可见淤血或红肿现象，根据皮肤刺激性试验记分标准(如表3-1)进行记录，结果见下表3-2。
分别在第7d、14d和28d取新西兰兔标记部位的皮肤组织，深度至皮下(包括表皮、真皮及部分皮下组织)，每次6只新西兰兔，术后予以缝合，所取组织放入10％福尔马林溶液固定。制备病理切片并进行HE染色，参考炎症分级标准(如表4-1)对6个位置的病理切片进行炎症分级。结果见下表4-2。
表3-1皮肤刺激性试验记分标准
Figure BDA0002310843450000082
Figure BDA0002310843450000091
表3-2局部皮肤刺激性试验记分表
凝胶4 凝胶5 凝胶6 凝胶A 凝胶B 凝胶C
第7d 2.25 1.91 1.53 2.42 1.91 2.25
第14d 1.53 0.98 0 1.91 1.33 1.83
第28d 0 0 0 0 0 0
注：记分表3-2中所得分数＝淤血程度得分×50％+红肿程度得分×50％
表4-1炎症反应分级标准
定义 得分
每高倍镜视野下炎症细胞＝0个 0
每高倍镜视野下炎症细胞1-2个 1
每高倍镜视野下炎症细胞3-5个 2
每高倍镜视野下炎症细胞6-10个 3
每高倍镜视野下炎症细胞>10个 4
表4-2炎症反应分级比较
凝胶4 凝胶5 凝胶6 凝胶A 凝胶B 凝胶C
第7d 0.88 0.74 0.64 1.01 0.88 0.88
第14d 0.49 0.37 0.30 0.88 0.58 0.56
第28d 0.09 0 0 0.41 0.09 0.09
从表3和表4可以看出，吲哚美辛微球的加入显著降低了凝胶的不良反应，凝胶4-6比凝胶A-C相对来说具有更小的皮肤刺激和更低的炎性反应，患者依从性更好。

Claims (12)

1.一种抗酶解交联透明质酸凝胶的制备方法，其特征是包括以下步骤：
（1）将透明质酸或其盐溶解在含有交联剂的氢氧化钠溶液中进行交联反应；
（2）反应后将反应凝胶调整pH值至中性，然后用含有吲哚美辛微球的中性磷酸盐缓冲液进行透析；
（3）透析后，进行高压蒸汽灭菌，然后灌装在预灌封注射器中，得抗酶解交联透明质酸凝胶；
所述吲哚美辛微球为质量比1:1-5的粒径为30~40μm的微球和粒径为6~15μm的微球的混合物；
交联剂的用量为透明质酸或其盐质量的2-6%。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（2）中，吲哚美辛微球在中性磷酸盐缓冲液中的浓度为0.5~2.5mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征是：吲哚美辛微球的制备方法为：
a.将吐温-80、明胶按照1:0.8-1.2的质量比在水中混合均匀，吐温-80的浓度为0.5-0.8wt%，形成水相；
b.将吲哚美辛、聚乳酸按照1：48-52的质量比在二氯甲烷中溶解，吲哚美辛的浓度为0.02-0.04wt%，形成油相；
c.在搅拌下将油相滴加至水相中，油相和水相的体积比为1：8~12，滴完后搅拌乳化，得乳液；
d.将乳液倒入旋转蒸发仪中，室温下挥发去除二氯甲烷，然后将剩余的乳液过滤、洗涤、干燥，得吲哚美辛微球；通过旋转蒸发转速的调整得到不同粒径范围的微球。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是：步骤d中，旋转蒸发时的转速为100~500r/min。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是：步骤d中，旋转蒸发时的转速为260~380r/min。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（1）中，氢氧化钠溶液的浓度为0.5-1.5wt%；所述交联剂为二乙烯基砜或1,4-丁二醇二缩水甘油醚。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（1）中，透明质酸或其盐的质量体积浓度为5-15 %。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（1）中，交联温度为37~42℃，交联时间为12~36h；步骤（2）中，透析时间为24-48h。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（2）中，中性磷酸盐缓冲液中还含有下述浓度的成分中的至少一种：a.0.1-0.3wt%的利多卡因，b.0.2-0.4wt%的维生素，c.6-10wt%的多元醇。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征是：所述维生素为维生素E，所述多元醇为甘油。
11.按照权利要求1-10中任一项所述的抗酶解交联透明质酸凝胶的制备方法制得的抗酶解交联透明质酸凝胶。
12.权利要求11所述的抗酶解交联透明质酸凝胶在制备美容填充用品中的应用。
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