CN111012786B - 一种激活炎症小体的小分子化合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种激活炎症小体的小分子化合物Z19527315及其应用，经试验验证由化合物Z19527315处理后的细胞内炎症小体相关蛋白caspase‑1活化和成熟炎症因子IL‑1β含量明显增加，且细胞外的炎症因子IL‑1β释放也有明显上升；同时化合物Z19527315的这些炎症小体活性的激活作用呈浓度依赖性，且在较低的浓度就有很好的激活炎症小体活性的作用，为进一步的免疫活化药物研发提供的强有力的理论基础和实践基础，具有重要的研发价值和开发意义。

Description

一种激活炎症小体的小分子化合物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，设计一种激活炎症小体的小分子化合物及其应用，具体涉及化合物Z19527315在制备炎症小体激活制剂中的应用。
背景技术
炎症小体系统(inflammasomes)是哺乳动物体内一种重要的固有免疫系统。机体识别自我与非我的第一道防御就是固有免疫，为了准确的检测和迅速的识别并对这些外来刺激做出反应，许多构成宿主防御系统的前线免疫细胞都表达有一种名为模式识别受体(PRR)的特异受体。PRR检测病原相关的分子模式(PAMP)如细菌或病毒成分，继而引发固有免疫应答，包括细胞因子、趋化因子的分泌，免疫细胞的成熟和分化，后者继而引发获得性免疫反应。
目前已经研究和分类了部分炎症小体，主要包括NLRP3炎症小体、AIM2炎症小体以及RIG-I炎症小体。在PRR识别特异的PAMP之后，它们作为特异炎症小体复合物的脚手架蛋白，诱导caspase和细胞因子的活化。目前，研究学者们普遍认为，病毒首先激活了炎症小体，然后反过来介导了宿主的抗病毒反应。
炎症小体的激活受到内源性或外源性刺激因素水平、以及炎症小体成分的调控。目前研究较多炎症小体包括NLRs家族中的典型家族成员NLRPl、NLRP3、NLRC4以及核酸感受器AIM2。炎症小体NLRPl和NLRC4分别被特定的PAMP激活，如胞壁酰二肽和鞭毛蛋白。NLRP3炎症小体则可被多种刺激因素激活，包括病原微生物和内源性介质，如活性氧(reactiveoxygen species，ROS)，线粒体损伤相关分子和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)，以及尿酸、β-淀粉样蛋白和二氧化硅等。AIM2炎症小体被双链DNA(double-strandedDNA，dsDNA)特异性激活，其dsDNA可能来自宿主的核酸和线粒体或病原体。最近研究表明，大多数情况下NLR炎症小体的激活途径需要通过特定的蛋白介质结合。神经元凋亡抑制蛋白(neuronal apoptosis inhibitory protein，NAIP)特异性结合鞭毛蛋白和Ⅲ型分泌系统蛋白，从而激活NLRC4炎症小体。类似的，Nek7与NLRP3结合，使细胞内钾水平下降，导致激活NLRP3炎症小体。
虽然近十年来炎症小体的研究取得了较大进展，但是其具体的活化及调控机制还不是很明确，对于使用小分子化合物诱导和抑制的炎症小体仍然有很多尚待研究的地方。炎症小体在体内的功能和生物学意义仍待进一步阐明，如是否存在活化炎症小体的直接配体，是否有其他类型的炎症小体，吞噬小体破裂和ROS产生的机理等问题都有待研究。因此，随着这些问题的深入研究，将对理解caspase-1活化及IL-1β、IL-18等炎性因子分泌的复杂机制具有重要意义，同时这也为使用小分子化合物诱导炎症小体活性的研究与开发和基于此的感染性疾病的诊治提供新的思路。
化合物Z19527315具有如下化学结构式：
Figure BDA0002318971460000021
可购自Enamine公司或在其基础上进行人工合成，目前没有报道该类化合物用于激活炎症小体实验或其他类似的功效。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种激活炎症小体的化合物Z19527315及其在制备炎症小体激活制剂中的应用。
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了：
化合物在制备炎症小体激活制剂中的应用，所述化合物为以下化合物中的至少一种：
a)化合物Z19527315；
b)化合物Z19527315在药学上可接受的盐；
c)化合物Z19527315进行1～2个基团的修饰得到的化合物；
d)化合物Z19527315进行1～2位点的改造得到的化合物。
在一些实例中，所述炎症小体激活由细胞内炎症小体相关蛋白Caspase-1活化引起。或所述炎症小体激活制剂适于活化细胞内炎症小体相关蛋白Caspase-1。
在一些实例中，所述炎症小体激活由细胞内炎症因子IL-1β含量增加引起。或所述炎症小体激活制剂适于增加细胞内炎症因子IL-1β含量。
在一些实例中，所述炎症小体激活由细胞外的炎症因子IL-1β的释放增加引起。或所述炎症小体激活制剂适于增加细胞外的炎症因子IL-1β的释放。
在本发明的第二方面，本发明提出了：
试剂在制备细胞模型中的应用，所述细胞模型为炎症小体活性激活的细胞，所述试剂选自以下化合物中的至少一种：
a)化合物Z19527315；
b)化合物Z19527315在药学上可接受的盐；
c)化合物Z19527315进行1～2个基团的修饰得到的化合物；
d)化合物Z19527315进行1～2位点的改造得到的化合物。
在本发明的第三方面，本发明提出了：
一种制备细胞模型的方法，所述细胞模型为炎症小体活性激活的细胞模型，在细胞培养基中加入试剂，
所述试剂选自以下化合物中的至少一种：
a)化合物Z19527315；
b)化合物Z19527315在药学上可接受的盐；
c)化合物Z19527315进行1～2个基团的修饰得到的化合物；
d)化合物Z19527315进行1～2位点的改造得到的化合物。
在本发明的第四方面，本发明提出了：
试剂在制备动物模型中的应用，所述动物模型为炎症小体活性激活的动物模型，所述试剂选自以下化合物中的至少一种：
a)化合物Z19527315；
b)化合物Z19527315在药学上可接受的盐；
c)化合物Z19527315进行1～2个基团的修饰得到的化合物；
d)化合物Z19527315进行1～2位点的改造得到的化合物。
一种制备动物模型的方法，所述动物模型为炎症小体活性激活的细胞模型，所述方法为向动物给药药物组合物，所述药物组合物中含有下述化合物中的至少一种，
a)化合物Z19527315；
b)化合物Z19527315在药学上可接受的盐；
c)化合物Z19527315进行1～2个基团的修饰得到的化合物；
d)化合物Z19527315进行1～2位点的改造得到的化合物。
本发明的有益效果是：
本发明提供了化合物Z19527315对炎症小体的激活作用以及该化合物在制备炎症小体激活制剂中的应用，经试验验证由化合物Z19527315处理后的细胞内炎症小体相关蛋白caspase-1活化和成熟炎症因子IL-1β含量明显增加，且细胞外的炎症因子IL-1β释放也有明显上升；同时化合物Z19527315的这些炎症小体活性的激活作用呈浓度依赖性，且在较低的浓度就有很好的激活炎症小体活性的作用，为进一步的免疫活化药物研发提供的强有力的理论基础和实践基础，具有重要的研发价值和开发意义。
附图说明
图1：western检测化合物Z19527315在人单核巨噬细胞THP-1细胞中对炎症小体活性的激活作用；
图2：ELISA检测化合物Z19527315在人单核巨噬细胞THP-1细胞中对炎症小体活性的激活作用；
图3：western检测化合物Z19527315在小鼠单核巨噬细胞Raw264.7细胞中对炎症小体活性的激活作用。
具体实施方式
下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明阐述的原理做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适范围内的选择，而并非要限定于下文示例的具体数据。
THP-1作为一株典型的人单核巨噬细胞株，对于炎症小体活性的激活或者抑制都有明显的表现，具体表现为，细胞内炎症小体下游相关的蛋白caspase-1的成熟切割形式p20或p10含量增加，炎症小体下游相关细胞因子IL-1β和IL-18的成熟切割形式含量也会增加，同时，这些下游的蛋白和细胞因子也会分泌到细胞外微环境中，造成胞外细胞因子的含量上升。同样的，对于小鼠的典型单核巨噬细胞株Raw264.7，炎症小体活性的激活也有类似的现象。因此，检测THP-1和Raw264.7细胞株细胞内和细胞外相应的蛋白以及细胞因子的含量可以作为评估药物对于人或者小鼠体内炎症小体活性的激活或抑制作用的一种手段。
实施例1
Western检测化合物Z19527315对人单核巨噬细胞THP-1细胞内炎症小体活性的激活作用
1)取生长良好的THP-1细胞，接种于6孔透明平底板中，每孔细胞密度达到75％。使用的培养基是完全培养基：RPMI1640，10％胎牛血清以及1％双抗，培养条件是5％二氧化碳、37℃；
2)TPA诱导12h使其分化为巨噬细胞贴壁；
3)换新鲜RPMI1640完全培养基，加入不同浓度梯度的化合物Z19527315，12h后收细胞进行蛋白印迹实验。
结果如图1所示：在THP-1细胞内，化合物Z19527315对炎症小体的活性有明显的激活作用，且具有一定的浓度依赖性。
实施例2
ELISA检测化合物Z19527315对人单核巨噬细胞THP-1细胞内炎症小体活性的激活作用
1)取生长良好的THP-1细胞，接种于6孔透明平底板中，每孔细胞密度达到75％。使用的培养基是完全培养基：RPMI1640，10％胎牛血清以及1％双抗，培养条件是5％二氧化碳、37℃；
2)用TPA诱导12h使其分化为巨噬细胞贴壁；
3)换新鲜RPMI1640完全培养基，加入不同浓度梯度的化合物Z19527315，12h后收培养基上清进行ELISA实验。
结果如图2显示：在THP-1细胞内，化合物Z19527315对炎症小体的活性有明显的激活作用，且具有一定的浓度依赖性。
实施例3
Western检测化合物Z19527315对小鼠单核巨噬细胞Raw264.7细胞内炎症小体活性的激活作用
1)取生长良好的Raw264.7细胞，接种于6孔透明平底板中，每孔细胞密度达到75％。使用的培养基是完全培养基：RPMI1640，10％胎牛血清以及1％双抗，培养条件是5％二氧化碳、37℃；
2)用TPA诱导12h使其分化；
3)换新鲜RPMI1640完全培养基，加入不同浓度梯度的化合物Z19527315，12h后收细胞进行蛋白印迹实验。
结果如图3显示：在Raw264.7细胞内，化合物Z19527315对炎症小体的活性有明显的激活作用，且具有一定的浓度依赖性。
上述实施例表明化合物Z19527315处理后的细胞内炎症小体相关蛋白Caspase-1活化和成熟炎症因子IL-1β含量明显增加，且细胞外的炎症因子IL-1β的释放也有明显上升；同时化合物Z19527315的这些炎症小体活性的激活作用呈浓度依赖性，且在较低的浓度就有很好的激活炎症小体活性的作用，为进一步的免疫活化药物研发提供的强有力的理论基础和实践基础，具有重要的研发价值和开发意义。

Claims (6)

1.化合物在体外非治疗目的地激活炎症小体中的应用，所述化合物为以下化合物中的至少一种：
a)化合物Z19527315
Figure DEST_PATH_IMAGE001
；
b)化合物Z19527315在药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述激活炎症小体由细胞内炎症小体相关蛋白Caspase-1活化引起。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述激活炎症小体由细胞内炎症因子IL-1β含量增加引起。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述激活炎症小体由细胞外的炎症因子IL-1β的释放增加引起。
5.试剂在制备细胞模型中的应用，所述细胞模型为炎症小体活性激活的细胞，所述试剂选自以下化合物中的至少一种：
a)化合物Z19527315；
b)化合物Z19527315在药学上可接受的盐。
6.一种制备细胞模型的方法，所述细胞模型为炎症小体活性激活的细胞模型，其特征在于：在细胞培养基中加入试剂，所述试剂选自以下化合物中的至少一种：
a)化合物Z19527315；
化合物Z19527315在药学上可接受的盐。
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