CN108904504A - 吴茱萸碱在制备增强nlrp3炎症小体活化的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了吴茱萸碱和吴茱萸次碱在制备增强NLRP3炎症小体活化药物中的应用。吴茱萸碱和吴茱萸次碱可通过增强巨噬细胞炎症小体活化，产生有活性的Caspase‑1，释放成熟的IL‑1β等炎症介质，促进已致敏巨噬细胞焦亡。吴茱萸碱和吴茱萸次碱的上述活性，可用于增强人体炎症反应强度，治疗炎症小体活化不足的相关疾病，包括结核分枝杆菌胞内感染引起的肺结核和口腔结核、单增李斯特菌病及其他胞内感染细菌引起的相关疾病、致病性真菌感染引起的相关疾病、疮疖、牙根尖周病、慢性胃炎、慢性肠炎、痢疾、腹泻等。

Description

吴茱萸碱在制备增强NLRP3炎症小体活化的药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医学和药物领域，具体涉及吴茱萸碱和/或吴茱萸次碱作为NLRP3炎症小体活化的增强剂及其在制备治疗NLRP3炎症小体活化不足相关疾病的药物中的应用。
背景技术
吴茱萸碱(evodiamine)及其衍生物吴茱萸次碱(rutaecarpin)等是从芸香科中药原植物吴茱萸、石虎和疏毛吴茱萸的果实中提取的有效成分。
吴茱萸碱的分子量303.36，分子式C19H17N3O；吴茱萸次碱的分子量287.32，分子式C18H13N3O，两者的化学结构如下式所示。
吴茱萸碱为黄色粉末，不溶于水，易溶于氯仿、丙酮等有机溶剂。吴茱萸碱有健胃、镇痛、止干呕和止嗳酸等功效，既往研究发现，吴茱萸碱具有阻滞细胞周期、抑制肿瘤细胞迁移和增殖等抗肿瘤活性和减肥等其他活性；另外吴茱萸碱可以保护由酵母多糖引起的小肠损伤，以及在治疗阿尔茨海默病中有一定疗效，这两方面的用途，分别可见公开专利文件(专利号：CN104473931A、CN101829117A)。
NLRP3(NOD-like receptor family,Pyrin containing Domain 3)炎症小体是机体固有免疫第一道防线的重要组成部分。不仅病原体(包括细菌、真菌和病毒)感染能够激活NLRP3炎症小体，损伤相关分子模式如胞外ATP(由细菌或受感染的宿主细胞释放)、尼日利亚菌素(nigericin，来自吸水链霉菌Streptomyceshygroscopicus)、尿酸钠晶体(MSU，痛风致病因子)等危险信号也能激活NLRP3炎症小体。
体内外大量的研究证明，NLRP3炎症小体活化能够强化感染部位的固有免疫应答。致敏的巨噬细胞内NLRP3炎症小体被活化后，产生有活性的Caspase-1，进一步剪切加工pro-IL-1β(白介素/interleukin-1β前体蛋白)，产生并释放成熟IL-1β等炎症介质；后者可趋化中性粒细胞参与吞噬病原微生物，并促进T、B细胞分化和抗体分泌。
其次，NLRP3炎症小体活化后导致的细胞焦亡有利于胞内致病菌的释放，并被其他吞噬细胞所吞噬、杀伤而清除。因此，NLRP3炎症小体的活化有利于清除入侵的病原微生物，加速炎症的缓解和组织修复，例如抑制葡聚糖硫酸钠(肠粘膜损伤模型的常用诱导剂)诱导的小鼠急性肠炎；小檗碱抗痢疾作用，可能与其上调NLRP3炎症小体活化有关。
如果NLRP3炎症小体活化不足，则不能有效清除病原微生物以及被炎症活化的巨噬细胞，势必造成慢性炎症性疾病，甚至细菌性或真菌性败血症的发生。
NLRP3炎症小体活化不足常见于胞内寄生菌(如单增李斯特菌、结核分枝杆菌)、真菌(如白色念珠菌)等病原体感染，使得致病菌在体内或细胞内持续存在和繁殖。
中国专利申请CN 106176741A公开了小檗碱在制备增强炎症小体活化药物中的应用。但是，小檗碱与本发明的吴茱萸碱(和吴茱萸次碱)是不同的药物，其药源植物也不同，一个是黄连，一个是吴茱萸。
目前，尚未有关于吴茱萸碱增强NLRP3炎症小体活化的功能的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供吴茱萸碱和/或吴茱萸次碱在制备增强NLRP3炎症小体活化的药物中的应用。在NLRP3炎症小体活化不足的局部免疫功能低下相关疾病状态下，吴茱萸碱和/或吴茱萸次碱可增强机体巨噬细胞NLRP3炎症小体的活化，从而提高机体的固有免疫机能，增强机体的抵抗和清除感染的能力。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
吴茱萸碱和/或吴茱萸次碱在制备增强NLRP3炎症小体活化的药物中的应用；
所述增强NLRP3炎症小体活化的表现包括如下方面：增强NLRP3炎症小体诱导剂诱导的巨噬细胞中Caspase-1的活化，增强ASC斑块的形成，促进炎症因子的成熟和释放，促进Gasdermin D蛋白的切割产生具有膜成孔能力的N端片段，并诱导细胞焦亡，从而增强抵抗病原微生物感染的能力；
所述的NLRP3炎症小体诱导剂是以下组合中的一种：
A、脂多糖(LPS)与三磷酸腺苷(ATP)；
B、LPS与尼日利亚菌素(nigericin)；
C、LPS与尿酸钠晶体(MSU)；
D、LPS与二氧化硅纳米颗粒；
E、LPS与β-葡聚糖(β-glucan)。
所述的炎症因子包括IL-1β；
所述的细胞焦亡是一种程序性的炎症性细胞死亡方式，表现为细胞鼓胀而破裂，细胞内多种炎症介质被释放，因而有利于清除胞内感染菌，增强炎症反应；
所述的增强抵抗病原微生物感染的能力是通过增强组织局部炎症反应强度而实现的，包括IL-1β分泌水平提高，从而抵抗腹腔细菌感染而导致的死亡；
所述的病原微生物包括大肠杆菌，但不限于大肠杆菌，还包括其它革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌、粪肠球菌[Enterococcus faecalis]、单增李斯特菌、结核杆菌、肺炎链球菌等)，以及真菌等。
NLRP3活化不足的局部免疫功能低下相关疾病，包括(但不限于)结核分枝杆菌胞内感染引起的肺结核和口腔结核、单增李斯特菌病及其他胞内感染细菌引起的相关疾病(呕吐、出血性皮疹、化脓性结膜炎、发热、脑膜炎、败血症等)、致病性真菌感染引起的相关疾病(肺炎、肝炎、脑膜炎、口腔粘膜病、阴道炎、宫颈炎、肾炎、心包炎、支气管炎、脚气等)、疮疖、牙根尖周病、慢性胃炎、慢性肠炎、痢疾、腹泻。
所述的增强NLRP3炎症小体活化的药物包含可接受的辅料；
所述的辅料优选为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂；
所述的增强NLRP3炎症小体活化的药物可为片剂、颗粒剂、胶囊、滴丸、膏剂、缓释剂、口服液、注射剂。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
吴茱萸碱和吴茱萸次碱可显著促进LPS+ATP或LPS+尼日利亚菌素诱导的炎症因子IL-1β的释放及ASC斑块的形成，同时促进细胞焦亡，并可有效降低腹腔细菌感染引起的死亡。吴茱萸碱的上述新活性与用途，尚未见公开文献报道。吴茱萸碱通过增强NLRP3炎症小体活化，提高IL-1β分泌，从而增强固有免疫细胞的功能，对临床治疗因NLRP3等炎症小体活化不足的局部免疫功能低下相关疾病具有重要意义，可用于相关药物开发。
附图说明
图1是吴茱萸碱对LPS+ATP诱导的小鼠骨髓来源巨噬细胞炎症小体激活的促进作用的免疫印迹分析图。
图2是吴茱萸碱对LPS+ATP诱导的小鼠骨髓来源巨噬细胞免疫荧光显微术分析ASC斑块形成的促进作用试验结果图；其中，A为ASC斑块的免疫荧光显微分析图，B为含有ASC斑块的细胞百分比分析直方图。
图3是吴茱萸碱对LPS+nigericin诱导的小鼠骨髓来源巨噬细胞免疫荧光显微术分析ASC斑块形成的促进作用试验结果图；其中，A为ASC斑块的免疫荧光显微分析图，B为含有ASC斑块的细胞百分比分析直方图。
图4是吴茱萸碱对LPS+ATP诱导的小鼠骨髓来源巨噬细胞细胞焦亡的促进作用的碘化丙锭(PI)染色荧光图和Gasdermin D切割免疫印迹分析图；其中，A为PI染色荧光显微图，B为焦亡细胞占总细胞的百分比分析图，C为GasderminD被Caspase-1切割产生N端片段(32kDa)的免疫印迹分析图。
图5是吴茱萸碱对LPS+nigericin诱导的小鼠骨髓来源巨噬细胞细胞焦亡的促进作用的碘化丙锭(PI)染色荧光图和Gasdermin D切割免疫印迹分析图；其中，A为PI染色荧光显微图，B为焦亡细胞占总细胞的百分比分析图，C为Gasdermin D被Caspase-1切割产生N端片段(32kDa)的免疫印迹分析图。
图6是吴茱萸碱提高腹腔细菌感染小鼠的存活率的分析图。
图7是吴茱萸次碱促进LPS+ATP诱导的小鼠骨髓来源巨噬细胞炎症小体活化的免疫印迹分析图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中所用到的材料，其来源如下：
吴茱萸碱(Evodiamine)(产品编号E140884)购于Aladdin公司。三氯乙酸(TCA)购于广州化学试剂厂。
脂多糖(LPS)(产品名称Lipopolysaccharides from Escherichia coli 0111:B4，目录号:L4391)、三磷酸腺苷(ATP)(目录号：A6419)、碘化丙锭(PI)(目录号：P4170)、Hoechst 33342(目录号：B2261)、二甲基亚砜(DMSO)(目录号：D8418)、脱氧胆酸钠(目录号：D6750)、Tween-80(目录号：P8074)均购自Sigma-Aldrich公司。
细胞完全培养基DMEM、青霉素/链霉素、胎牛血清(FBS)购于ThermoFisher公司。
抗NLRP3抗体购于Adipogen AG公司。抗Caspase-1(目录号：ab138483)、GasderminD(目录号：ab209845)抗体购于Abcam公司。抗IL-1β(目录号：#12242)、ASC(目录号：#67824)、Actin(目录号：#3700S)抗体均为Cell Signaling Technology公司产品。
体外细胞实验吴茱萸碱溶于DMSO，体内实验吴茱萸碱溶于含2％(v/v)Tween-80的PBS溶液。
实施例1
吴茱萸碱活化NLRP3炎症小体的试验，包括以下步骤：
(1)L929细胞培养上清的制备：
L929细胞购自中国科学院昆明动物研究所细胞库。细胞培养方法参照Monack实验室的操作程序(Stanford University)，将1.5×107个细胞培养于75cm2的培养瓶中，培养基为DMEM完全培养基(30mL/瓶)，培养14天后收集上清冻存备用。(2)小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)的培养方法：
C57BL/6小鼠，6-8周，雌性，购自南方医科大学实验动物中心。经颈椎脱臼处死后，取其后腿骨，用注射器将骨髓细胞用冷PBS冲出。得到的细胞用BM-Mac培养基[即80％(v/v)DMEM完全培养基+20％(v/v)L929细胞培养上清]，培养于培养皿(密度为5×106/皿，培养基体积为10mL)。培养3天，添加5mL新鲜的BM-Mac培养基；培养第5天，替换为10mL新鲜BM-Mac培养基。培养第7天，收集细胞，培养于含10％FBS和含100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM完全培养基的6孔板中，细胞密度为1.2×106/孔(2mL培养基)，培养24小时。然后换液，加入含500ng/mL LPS的DMEM完全培养基(2mL)预处理处理4小时，激活BMDM细胞，再经含不同浓度的吴茱萸碱(1.25、2.50、5.00μmol/L)的培养基(1.2mL)处理1小时，最后补加2mmol/LATP处理30分钟。
(3)上清中Caspase-1和IL-1β的检测方法：
细胞经上述处理后，吸取培养上清1.2mL，经300×g离心5分钟，去除细胞碎片；上清转移至另一新的离心管中，先加入22μL的10％(w/v)脱氧胆酸钠溶液(终浓度为0.15％(w/v))，摇匀后，再加入94μL的100％三氯乙酸(终浓度为7.2％(w/v))混合均匀后，在4℃沉淀蛋白过夜。然后经18800×g离心30分钟，弃上清。往沉淀中加入800μL冷丙酮，洗去沉淀中的三氯乙酸；18,800×g离心5分钟。弃上清，用上述冷丙酮重复洗三次。最后一次洗涤离心后，弃上清；使沉淀中残余的丙酮在常温下挥发，最后用蛋白电泳样品液溶解。煮沸5分钟，经上述处理后的蛋白，用免疫印迹方法检测。
(4)结果：
炎症小体激活程度以Caspase-1(p10片段)活化水平和成熟IL-1β(17kDa)释放反映。在细胞培养上清中活化Caspase-1(p10)和IL-1β的表达水平随吴茱萸碱的剂量增加而升高。说明吴茱萸碱(evodiamine)可以剂量依赖性地促进LPS+ATP诱导的BMDM细胞中炎症小体的活化(图1)。其中Actin是电泳上样的内参标准蛋白。
实施例2
吴茱萸碱活化NLRP3炎症小体的试验，包括以下步骤：
(1)ASC斑块形成的检测：
将BMDM细胞接种在玻璃底培养皿中(密度为5×105/孔)，过夜后，500ng/mL LPS诱导4小时，加入吴茱萸碱5μmol/L作用1小时，然后加入2mmol/LATP刺激30分钟，最后吸弃培养基，每孔加入1mL 4％(w/v)多聚甲醛，室温固定15分钟，然后每孔加2mL冷甲醇于-20℃条件下通透10分钟，再用封闭液室温封闭1小时，加一抗(ASC稀释比例为1:300，100μL/孔)，4℃孵育过夜，洗涤后加无交叉反应的CF568-山羊抗兔IgG(购于美国Biotium公司)，室温孵育1小时，Hoechst 33342染核10分钟并避光，蔡司倒置荧光显微镜观察并拍照。
(2)结果：
ASC斑块(ASC speck)的形成是NLRP3炎症小体活化的另一重要指标。图2是吴茱萸碱对LPS+ATP诱导的小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)免疫荧光显微术检测ASC斑块(ASCspeck)的形成。由此图可见，吴茱萸碱能显著地促进LPS+ATP诱导的BMDM细胞中ASC斑块的形成，进一步说明了可以促进NLRP3炎症小体的活化。***表示P<0.001。
实施例3
吴茱萸碱活化NLRP3炎症小体的试验，包括以下步骤：
(1)ASC斑块形成的检测：
方法同“实施例3”，区别在于细胞铺板过夜后，500ng/mL LPS诱导4小时，加入吴茱萸碱5μmol/L作用1小时，然后加入5μmol/L nigericin刺激1小时。
(2)结果：
ASC斑块(ASC speck)的形成是NLRP3炎症小体活化的另一重要指标。图3是吴茱萸碱对LPS+nigericin诱导的小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)免疫荧光显微术检测ASC斑块(ASC speck)的形成。由此图可见，吴茱萸碱能显著地促进LPS+nigericin诱导的BMDM细胞中ASC斑块的形成，进一步说明了可以促进NLRP3炎症小体的活化。***表示P<0.001。
实施例4
吴茱萸碱促进NLRP3炎症小体诱导剂ATP诱导的细胞焦亡试验，包括以下步骤：
(1)细胞培养和处理：
将BMDM细胞接种于24孔板中(密度为1.5×105/孔)，过夜后，用500ng/mLLPS诱导4小时，加入吴茱萸碱(1.25、2.5、5μmol/L)作用1小时，然后加入2mmol/L ATP刺激30分钟，最后加入PI(2μg/mL)和Hoechst 33342(5μg/mL)室温下染色10分钟，置于蔡司倒置荧光显微镜下观察拍照并统计PI阳性率。
(2)细胞中Gasdermin D的检测：
细胞处理方法同“实施例1”，经上述处理后，最后用免疫印迹方法检测。
(3)结果：
激活NLRP3炎症小体后，同时诱导发生细胞焦亡，细胞焦亡后，可被PI染色呈阳性，同时细胞内的Gasdermin D的会被活化切割成N端产物(32kDa)。因此，通过PI染色以及检测细胞内Gasdermin D的活化水平，可分析细胞焦亡的情况。图4是吴茱萸碱对LPS+ATP诱导的小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)细胞焦亡的促进作用的碘化丙锭(PI)染色荧光图和免疫印迹图。红色荧光(PI染色)表示该细胞已焦亡，吴茱萸碱剂量依赖性地促进LPS+ATP诱导的BMDM细胞的细胞焦亡。同时细胞中Gasdermin D的N端产物(32kDa)水平随吴茱萸碱的剂量增加而升高(图4C)，说明吴茱萸碱促进了活化Caspase-1对Gasdermin D的切割，增强了细胞焦亡的诱导作用。图4C中Actin是电泳上样的内参标准蛋白。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
实施例5
吴茱萸碱促进NLRP3炎症小体诱导剂尼日利亚菌素诱导的细胞焦亡试验，包括以下步骤：
(1)细胞培养和处理：
将BMDM细胞接种于24孔板中(密度为1.5×105/孔)，过夜后，用500ng/mLLPS诱导4小时，加入吴茱萸碱(1.25、2.5、5μmol/L)作用1小时,然后加入5μmol/L nigericin刺激1小时，最后加入PI(2μg/mL)和Hoechst 33342(5μg/mL)室温下染色10分钟，置于蔡司倒置荧光显微镜下观察拍照并统计PI阳性率。
(2)细胞中Gasdermin D的检测：
细胞处理方法同“实施例2”，经上述处理后，最后用免疫印迹方法检测。
(3)结果：
激活NLRP3炎症小体后，同时诱导发生细胞焦亡，细胞焦亡后，可被PI染色呈阳性，同时细胞内的Gasdermin D的会被活化切割成N端产物(32kDa)。因此，通过PI染色以及检测细胞内Gasdermin D的活化水平，可分析细胞焦亡的情况。图5是吴茱萸碱对LPS+nigericin诱导的小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)细胞焦亡的促进作用的碘化丙锭(PI)染色荧光图和免疫印迹图。红色荧光(PI染色)表示该细胞已焦亡，吴茱萸碱剂量依赖性地促进LPS+nigericin诱导的BMDM细胞的细胞焦亡。同时细胞中Gasdermin D的N端产物(32kDa)水平随吴茱萸碱的剂量增加而升高(图5C)，说明吴茱萸碱促进了活化Caspase-1对Gasdermin D的切割，增强了细胞焦亡的诱导作用。图5C中Actin是电泳上样的内参标准蛋白。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
实施例6
吴茱萸碱处理增强小鼠抗细菌感染能力的试验，包括以下步骤：
(1)细菌培养
大肠杆菌DH5α在Luria Broth(LB)培养基中摇菌过夜(37℃)，次日按10％(v/v)菌液在新鲜LB培养基中继续摇菌扩增4小时(37℃)。扩增后的菌液在1,824×g离心力下离心10分钟，PBS洗涤后，重悬于PBS溶液备用。细菌密度用微量紫外分光光度计(Nanodrop2000；Thermo Scientific)测定；对应的菌落形成单位(CFU)由LB琼脂糖平板涂布培养确定。
(2)动物实验
C57BL/6小鼠，6-8周，雌性，购自南方医科大学实验动物中心，适应性养殖一周后，按10mg/kg和20mg/kg体重的剂量将含吴茱萸碱的PBS溶液预灌胃，3小时后，腹腔接种大肠杆菌(2.0×109CFU/只)，1小时后，再次给小鼠灌胃上述含吴茱萸碱的PBS溶液。接下来的120小时内，每6小时观察记录小鼠存活情况，并绘制小鼠Kaplan-Meier生存曲线分析存活率。小鼠存活率的差异分析采用Long-rank检验，P<0.05视为差异有统计意义。
(3)结果
大肠杆菌感染，可导致小鼠因感染而死亡；而吴茱萸碱处理后可有效提高腹腔细菌感染小鼠的存活率(图6)。**P<0.01；***P<0.001。
实施例7
吴茱萸次碱促进ATP诱导的NLRP3炎症小体活化的试验，包括以下步骤：
(1)吴茱萸次碱处理细胞对LPS+ATP诱导的炎症小体活化的细胞处理方法和检测方法参照实施例1.
(2)结果：吴茱萸次碱处理可上调细胞培养上清中活化Caspase-1(p10)和IL-1β的表达水平，说明吴茱萸次碱也可以促进LPS+ATP诱导的BMDM细胞中炎症小体的活化(图7)。其中Actin是电泳上样的内参标准蛋白。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.吴茱萸碱和/或吴茱萸次碱在制备增强NLRP3炎症小体活化的药物和在制备治疗NLRP3炎症小体活化不足相关疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述增强NLRP3炎症小体活化的表现包括如下方面：增强NLRP3炎症小体诱导剂诱导的巨噬细胞中Caspase-1的活化，增强ASC斑块的形成，促进炎症因子的成熟和释放，促进Gasdermin D蛋白的切割产生具有膜成孔能力的N端片段，并诱导细胞焦亡，从而增强抵抗病原微生物感染的能力。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的NLRP3炎症小体活化不足相关疾病包括：结核分枝杆菌胞内感染引起的肺结核和口腔结核、单增李斯特菌病引起的疾病、致病性真菌感染引起的疾病、疮疖、牙根尖周病、慢性胃炎、慢性肠炎、痢疾、腹泻。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的NLRP3炎症小体诱导剂是以下组合中的一种：
A、脂多糖与三磷酸腺苷；
B、脂多糖与尼日利亚菌素；
C、脂多糖与尿酸钠晶体；
D、脂多糖与二氧化硅纳米颗粒；
E、脂多糖与β-葡聚糖。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的病原微生物包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的革兰氏阴性菌为大肠杆菌。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、单增李斯特菌、结核杆菌、肺炎链球菌。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物包含可接受的辅料。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的辅料为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。
10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物为片剂、颗粒剂、胶囊、滴丸、膏剂、缓释剂、口服液、注射剂。
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