CN111000876A - 红棕毛筒腔菌在制备逆转肿瘤多药耐药性为敏感性的药物中的应用 - Google Patents

红棕毛筒腔菌在制备逆转肿瘤多药耐药性为敏感性的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种逆转肿瘤细胞多药耐药性为敏感性的红棕毛筒腔菌。该菌株已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日：2019.11.20，保藏登记号为CCTCC M 2019957 PF02‑2。本发明提供了红棕毛筒腔菌PF02‑2发酵获得活性代谢产物的方法；该代谢产物具有逆转肿瘤细胞多药耐药性为敏感性的活性，致使肿瘤细胞对药物重新敏感，有助于抗肿瘤药物发挥药效，为医用药物新来源的开发增添了新的途径。

Description

红棕毛筒腔菌在制备逆转肿瘤多药耐药性为敏感性的药物中 的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及红棕毛筒腔菌在制备逆转肿瘤多药耐药性为敏感性的药物中的应用。
背景技术
肿瘤多药耐药(Multidrug Resistance,MDR)是指肿瘤细胞不仅对一种抗肿瘤药物产生耐药,而且对其他结构不同、作用机制各异的抗肿瘤药物亦产生交叉耐药现象。尽管肿瘤治疗的研究不断进步,但是仅有不到50％肿瘤对化疗敏感，超过50％的肿瘤对化疗药物迅速产生耐药，一旦耐药产生，医生将束手无策。因此，寻找低毒高效的肿瘤耐药逆转剂已是肿瘤化疗药物领域研究的热点。
P-糖蛋白(P-gp)是ABC转运蛋白家族最具有代表性的蛋白之一。 P-gp结构为同源二聚体，每个单体由两束α螺旋和两个核苷酸结合区构成，分子量为170kD，由1280个氨基酸残基组成。P-gp与药物的结合口袋主要位于α螺旋区。核苷酸结合区的功能为与ATP结合，为P-gp 与底物的结合和转运过程提供能量。研究表明，P-gp能够转运化学性质和结构多样性的药物，包括部分抗癌药物，如阿霉素、紫杉烷类等，引起多药耐药(MDR)现象，导致癌症治疗的失败。因此，P-gp抑制剂和底物的研究对于癌症治疗具有重要的意义，可将P-gp抑制剂与化疗药物共同给药作为克服MDR的有效策略。
目前，现已经开发了几代P-gp抑制剂，第一代逆转剂包括他莫昔芬、环孢素A等，其中以维拉帕米和环胞菌素为典型代表。因此类药物通常缺乏P-糖蛋白的特异性，会产生严重的副作用，第一代逆转剂也在临床上受到很大程度的限制(Sato W.et al.1991)。第二代逆转剂孢菌素类似物伐司朴达(valspodar，PSC833)、右旋维拉帕米 (dexverapamil)等，其中以地塞米松为代表，然而，第二代逆转剂的开发由于高毒性和药物相互作用而产生一系列副作用而受到限制 (Rowinsky E.K.et al.1998；Hyafil F.et al.1993；Keller R.P.etal. 1992)。第三代P-糖蛋白抑制剂的主要代表药物有Tariquidar(XR9576)、 Zosuquidar(LY335979)、S9788等，其中以Tariquidar(XR9576)和 WK-X-34为代表(Massey P.R.etal.2014)。而从天然产物及其衍生物中开发P-gp抑制剂已成为第四代抑制剂研发的新方向和重点。目前尚未发现从微生物来源的天然产物中开发P-gp抑制剂的具体报道。
毛筒壳科真菌绝大部分是在陆生木质基质上生长的腐生菌，也有一部分生长在水生栖息地(Boonmee S.et al.2014)。近几年来有很多研究发现可以从水生的环境中分离到毛筒壳科真菌(Luo Z.L.et al. 2017；Chaiwan N.et al.2017)。已有研究证明这个科的真菌拥有产活性次级代谢产物的巨大潜力(Mao Z.L.et al.2014)。在本课题组的前期研究中，从腐烂的木质基质上采集的毛筒壳科真菌中选取了19 株进行研究，采用平板对峙法、生长速率法和MTT法，分别测定了这 19株毛筒壳科真菌活体菌株抑菌活性、发酵物抑菌活性以及发酵粗提物对不同的人体肿瘤细胞增殖的抑制作用(《毛筒壳科真菌次级代谢产物生物活性的评价》，范翠等2019年发表)，发现了该科真菌及其次级代谢产物具有良好的活性，前景非常广阔。但是未研究该科真菌在MDR中的应用，因此，本次研究试图通过从毛筒壳科真菌中来筛选有效的多药耐药逆转剂。
发明内容
本发明为解决上述技术问题，提供了红棕毛筒腔菌在制备逆转肿瘤细胞多药耐药性为敏感性的药物中的应用。
具体是通过以下技术方案来实现的：
本发明所述的红棕毛筒腔菌，是由贵州大学生化工程中心分离获得，命名为红棕毛筒腔菌(Tubeufia rubra Y.Z.Lu,J.C.Kang&K.D. Hyde)PF02-2菌株，保藏单位：中国典型培养物保藏中心保藏，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日：2019.11.20，保藏登记号为CCTCC M 2019957PF02-2。
本发明的红棕毛筒腔菌(Tubeufia rubra Y.Z.Lu,J.C.Kang&K.D. Hyde)PF02-2菌株具有下述性质：
菌落形态特征：在自然腐木基质上，菌落平展，呈网状、点状，量大时连接成片状，新鲜经分离得到的PF02-2纯菌落上呈无色透明到白色，经分离得到的PF02-2纯菌落自然干燥后呈红棕色。部分菌丝体埋生于基质之下，但多为表生，菌丝体由有隔膜带分枝的菌丝组成，无色至深棕色。分生孢子梗圆柱状，单生，弯曲生长，有隔膜， 50-150微米长，4.5-6微米宽，顶端逐渐变细，底部深棕色，顶部透明到浅棕色，表面光滑。产孢细胞单生或多生，圆柱状，具柱状小齿突，合轴生长于分子孢子梗中部到顶部，10-19微米长，3-4微米宽，无色透明状到浅棕色，表面光滑。分子孢子卷旋型，单生，顶侧生，透明，顶端圆形，紧密卷旋时卷曲2-3.5次，直径35-50微米，分生孢子丝3-5微米厚(平均直径45微米，厚度4.5微米)，在水中逐渐松散开，具不清晰的多隔膜，无色到浅棕色，表面光滑。分生孢子在水-琼脂培养基中12h后开始萌发生长。菌落在PDA培养基中置于 25-28℃生长2周可达16mm，棕色，呈圆形，表面粗糙，有明显的突出物，呈脉状皱褶，菌落边缘完整。
分子生物学特征：采用真菌通用引物ITS5和ITS4对5.8S rRNA 基因及ITS rDNA序列进行PCR扩增反应，将PCR扩增产物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序，序列提交NCBI获得GenBank登录号为MH558801。采用真菌通用引物LR0R和LR5对 28S rRNA基因序列进行PCR扩增反应，将PCR扩增产物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序，序列提交NCBI获得GenBank 登录号为MH558926。采用真菌通用引物983F和2218R对TEF1α基因序列进行PCR扩增反应，将PCR扩增产物由生工生物工程(上海) 股份有限公司完成测序，序列提交NCBI获得GenBank登录号为 MH550994。采用真菌通用引物fRPB2-5F和fRPB2-7cR对RPB2基因序列进行PCR扩增反应，将PCR扩增产物由生工生物工程(上海) 股份有限公司完成测序，序列提交NCBI获得GenBank登录号为 MH551128。
本发明所述的红棕毛筒腔菌PF02-2的来源如下：
采样时间：2016年5月14日；
采样地点：广西壮族自治区防城港市屏峰雨林自然保护区；
采样方式：采集位于广西壮族自治区防城港市屏峰雨林自然保护区的腐木，塑料密封袋带回实验室；
本发明所述的红棕毛筒腔菌PF02-2样品分离过程为：
(1)采集的腐木样品置于显微镜下镜检；
(2)接种针消毒，挑取腐木表面白色菌落，转移至40-80μL无菌水中制成孢子悬浮液；
(3)将孢子悬浮液转移到5-15mL水-琼脂(简写为WA)平板培养皿中，置于26-30℃中培养10-14小时后，挑取已萌发生长出菌丝的单个分生孢子接种到5-15mL马铃薯葡萄糖琼脂培养皿(简写为 PDA)中，于26-30℃下培养即得PF02-2纯菌落。
本发明所述的红棕毛筒腔菌PF02-2菌种保存方法为：
(1)单孢源菌种悬浮液的制备：在酒精灯火焰旁用灭菌后的接种针或注射用针头从经分离得到的PF02-2纯菌落上挑取分生孢子，置于40-80μL无菌水，混匀形成单孢源菌种悬浮液；
(2)萌发单孢的制备：将步骤(1)所述的孢子悬浮液转移到 5-15mL水-琼脂(WA)平板培养皿中，置于25-28℃下，12h后孢子开始萌发生长出菌丝；
(3)保存菌落的制备：将步骤(2)所述的已萌发的单个分生孢子在酒精灯火焰旁于显微操作台上快速转移至5-15mL PDA平板培养皿中，密封带密封后置于26-30℃条件下培养，即得待保存菌落。待菌落长到直径为3-6cm后可转移至1-1.5mL PDA及水-甘油冻存管中保藏0-4℃中作为菌种备用。
所述逆转肿瘤多药耐药性，是指逆转癌细胞已产生的多药耐药性，致使其对于抗癌药物重新敏感的活性。所述逆转活性是指红棕毛筒腔菌PF02-2及其代谢产物、药物制剂对P-糖蛋白功能具有抑制作用。
具体地，一种红棕毛筒腔菌PF02-2代谢产物的制备方法，按以下步骤进行：
(1)菌种活化培养：将保存的红棕毛筒腔菌PF02-2菌种移至 5-15mL马铃薯葡萄糖PDA培养基上，在26-30℃条件下培养，至菌丝覆盖整个培养皿，用直径为7mm打孔器打孔获得菌饼，供接种用；
(2)液体发酵培养：发酵液由以下重量份数的物质组成：葡萄糖4份、蛋白胨1份、水100份，每500mL三角瓶装发酵液200mL；配制后121℃灭菌20-30min，待冷却至40℃在无菌条件下挑取1直径为7mm菌饼，在26-30℃条件下，静置发酵培养28-32天；
(3)发酵液提取：发酵完毕后收集发酵液，加入发酵液体积2-4 倍乙酸乙酯萃取，在真空条件下浓缩至浸膏，即得。
所述肿瘤包括但不限于肝癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、骨癌、结肠癌、宫颈癌、胰腺癌、淋巴癌、白血病。
所述抗癌药包括但不限于紫杉醇、紫杉烷类、阿霉素、丝裂霉素、顺铂、氟尿嘧啶、环磷酰胺。
所述制备逆转肿瘤细胞多药耐药性为敏感性的药物，是指将红棕毛筒腔菌PF02-2及其代谢产物加入药学上可接受的辅料或载体，制成所需的药物制剂。
所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂等。
有益效果：
本发明提供了红棕毛筒腔菌PF02-2发酵获得代谢产物的方法；该代谢产物具有逆转肿瘤细胞多药耐药性为敏感性的活性，致使肿瘤细胞对药物重新敏感，有助于抗肿瘤药物发挥药效，为医用药物新来源的开发增添了新的途径。
下面是本发明的代谢产物的部分药理试验及结果(本部分用 PF02-2代谢产物由本文件实施例4-5的方法得到)：
1.样品的MTS实验
MTS实验评估从采集的毛筒壳科真菌中选取35株，从中提取的次级代谢产物共81个样品对人乳腺癌细胞MCF-7/ADM细胞毒性(此 81个样品按照本文件代谢产物制备方法，经发酵后的菌丝体部分和发酵液部分分别由乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到不同的次级代谢产物，在本实验部分分别表示为：发酵液的乙酸乙酯部分提取物、菌丝体的乙酸乙酯部分提取物、发酵液正丁醇提取物和菌丝体正丁醇提取物)。
实验方法如下：
取对数生长期MCF-7/ADM细胞，胰酶消化，加含血清培养基终止反应，离心制成细胞悬液，按1×105个/mL接种于96孔板，每孔 100μL。置37℃，5％CO2培养箱中培养24h。取毛筒壳科真菌次级代谢产物以及对照品维拉帕米溶于DMSO，用新鲜的培养基配成不同的药物浓度，每个浓度设置4个复孔，阴性对照组为只含细胞不含药物，另设溶剂对照组和空白组，放回培养箱培养48h，去除孔中原液，每孔加入10％MTS 10μL，继续培养2h，酶标仪在波长490nm处测量 OD值。细胞增值率公式如下，并采用SPSS法计算用于细胞毒性的化合物的IC50值。
细胞增值率＝[(OD药物组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白)]× 100％。
以下是部分实验结果：
Figure BDA0002311797130000071
Figure BDA0002311797130000081
结果显示，菌株粗提物对MCF-7/ADM的IC50值均高于100μg ·mL-1。
2.样品对肿瘤MDR逆转效果实验
本发明前期评估毛筒壳科35株真菌对MCF-7/ADM细胞中ADM 耐药性的逆转作用，每个样品分别选取发酵液的乙酸乙酯部分提取物、菌丝体的乙酸乙酯部分提取物，得到81个样品进行初筛，初筛筛选浓度为100μg·mL-1。
取对数生长期的MCF-7/ADM细胞以1×105个/mL接种于96孔板，置37℃，5％CO2培养箱中培养24小时后，加入125μg·mL-1、 62.5μg·mL-1、31.25μg·mL-1、15.625μg·mL-1、7.8125μg·mL-1的ADM 每个浓度4个复孔，只含化疗药物组为阴性对照组，VRP为阳性对照组，另设一组空白组，实验组培养一个小时后加入无细胞毒性的毛筒壳科真菌代谢产物样品，放回培养箱继续培养48h。每孔加入 10％MTS 10μL，继续培养2h，酶标仪在波长490nm处测量OD值。采用SPSS法计算用于细胞毒性的化合物的半抑制浓度(Half maximalinhibitory concentration,IC50)。初筛后得到的活性组需独立重复三次实验。部分结果如下：
Figure BDA0002311797130000082
Figure BDA0002311797130000091
逆转倍数(Reversion Fold,RF)，RF数值越大表示逆转耐药性的作用越强。对照ADMb Control为空白对照组，空白对照组的RI值是判断有无逆转耐药性的作用的基础。由前期筛选的结果可得，在本次筛选的81个样品中，几乎所有的样品对ADM耐药性的逆转都没有帮助，而PF02-2代谢产物和VPR能够增加MCF-7细胞对化疗药物的敏感程度。其中，PF02-2代谢产物的IC50值为15.25，逆转倍数为3.79，高于阳性对照VPR。因此提示PF02-2代谢产物很可能具有强于阳性对照药品VPR的肿瘤耐药性逆转作用。
3.荧光分析
为证实实验2中得到的结论，本文件采用荧光分析法验证。
3.1分析PF02-2代谢产物对ADM在MCF-7/ADM细胞积累的影响
阿霉素(ADM)具有荧光特性，可作为P-gp的荧光底物。可利用倒置显微镜倒置相差荧光显微镜观察荧光光强，评估MCF-7/ADM 细胞中ADM胞内蓄积情况。盐酸维拉帕米(VRP)作为阳性对照组，结果如图2所示。
细胞铺24孔板进行孵育后，无耐药性的MCF-7细胞加入ADM 后的荧光图像显示胞内含大量红色荧光(a1)，而耐药细胞MCF-7/ADM几乎看不到荧光(a2)。PF02-2代谢产物处理组(b1: 90μg/mL，b2:50μg/mL，b3:25μg/mL)的荧光强度高于用VRP处理组(d1:4.91μg/mL，d2:0.98μg/mL，d3:0.098μg/mL)的荧光强度，表明PF02-2代谢产物抑制多药耐药的作用强于VRP。
3.2分析PF02-2代谢产物对P-gp外排功能抑制的影响
为了进一步确认阳性药物能否可以逆转P-gp介导多药耐药，选择P-gp的另外一种荧光底物罗丹明123(Rho123)进行实验，通过倒置显微镜倒置相差荧光显微镜观察荧光强弱，比较不同处理组的 P-gp外排功能。
盐酸维拉帕米(VRP)作为阳性对照组，结果见图3。无耐药性的MCF-7细胞加入ADM后的荧光图像显示胞内含大量红色荧光 (a3)，而耐药细胞MCF-7/ADM几乎看不到荧光(a4)，这说明 P-gp过表达。PF02-2代谢产物处理组(e1:90μg/mL，e2:45μg/mL， e3:25μg/mL)MCF-7/ADM细胞胞内荧光强度明显升高，且荧光强度呈剂量依赖性增加。说明PF02-2代谢产物能够抑制P-gp介导的药物外排功能，且作用强度高于VRP(VRP处理组：g1：4.91μg/mL，g2： 0.98μg/mL，g3：0.098μg/mL)。
荧光分析的结果表明，PF02-2代谢产物能够通过抑制P-gp介导的药物外排功能，抑制肿瘤多药耐药的发生。并且此效果强于阳性药物VRP。
4.PF02-2代谢产物的肿瘤MDR逆转持续时间实验
本实验继续研究PF02-2代谢产物对肿瘤MDR逆转持续时间的影响。以VRP为阳性对照组，实验浓度为2.45μg/mL。PF02-2代谢产物的实验浓度为100μg/mL。耐药持续时间见表2。
Figure BDA0002311797130000101
Figure BDA0002311797130000111
由实验结果可以看到，当移除培养基后，阳性对照药物逆转作用几乎消失，此实验结果表明阳性对照药物的逆转持续时间低于6h。而PF02-2代谢产物从培养基中移除6个小时时，还依然具有逆转活性。此时药物的IC50为40.06μg/mL(RF值为1.44)。这些结果表明PF02-2代谢产物可以有效的逆转多药耐药性，它的作用持续时间明显高于阳性对照药物。
综上，本发明针对从毛筒壳科真菌菌株中寻找P-gp抑制剂的筛选中发现PF02-2代谢产物通过增加药物在MCF-7/ADM细胞中的蓄积并阻止其从细胞内排出。显示出与传统的P-gp抑制剂VRP具有相当甚至更高的逆转活性，PF02-2代谢产物还表现出比VRP更长的化学致敏作用(≥6小时)。而传统的P-gp抑制剂VRP在移除后在6 小时时基本没有可逆性了。并且，PF02-2代谢产物在100μg/mL浓度下对所有的细胞均无细胞毒性。
另外，采用同样的研究思路、研究方法，用PF02-2代谢产物对产生多药耐药性的前列腺癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、骨癌细胞、结肠癌细胞、宫颈癌细胞、胰腺癌细胞、淋巴癌细胞、白血病细胞等进行研究，发现PF02-2代谢产物对这些已产生多药耐药性的肿瘤细胞具有与MCF-7/ADM同等的逆转作用，因此，可以认为PF02-2代谢产物有望用于开发P-gp介导的MDR逆转剂。
说明书附图
图1红棕毛筒腔菌PF02-2菌落形态图
图2红棕毛筒腔菌PF02-2对ADM在MCF-7/ADM细胞积累的影响
图3红棕毛筒腔菌PF02-2代谢产物对P-gp外排功能抑制的影响
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利所要求保护的范围。
实施例1
本发明所述的红棕毛筒腔菌，是由贵州大学生化工程中心分离获得，命名为红棕毛筒腔菌(Tubeufia rubra Y.Z.Lu,J.C.Kang&K.D. Hyde)PF02-2菌株，保藏单位：中国典型培养物保藏中心保藏，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日：2019.11.20，保藏登记号为CCTCC M 2019957PF02-2。
本发明所述的红棕毛筒腔菌PF02-2样品分离过程为：
(1)采集的腐木样品置于显微镜下镜检；
(2)接种针消毒，挑取腐木表面白色菌落，转移至40μL无菌水中制成孢子悬浮液；
(3)将孢子悬浮液转移到5mL水-琼脂(简写为WA)平板培养皿中，置于26℃中培养10小时后，挑取已萌发生长出菌丝的单个分生孢子接种到5mL马铃薯葡萄糖琼脂培养皿(简写为PDA)中，于 26℃下培养即得PF02-2纯菌落。
本发明所述的红棕毛筒腔菌PF02-2菌种保存方法为：
(1)单孢源菌种悬浮液的制备：在酒精灯火焰旁用灭菌后的接种针或注射用针头从经分离得到的PF02-2纯菌落上挑取分生孢子，置于40μL无菌水，混匀形成单孢源菌种悬浮液。
(2)萌发单孢的制备：将步骤(1)所述的孢子悬浮液转移到 5mL水-琼脂(WA)平板培养皿中，置于25℃下，12h后孢子开始萌发生长出菌丝。
(3)保存菌落的制备：将步骤(2)所述的已萌发的单个分生孢子在酒精灯火焰旁于显微操作台上快速转移至5mL PDA平板培养皿中，密封带密封后置于26℃条件下培养，即得待保存菌落。待菌落长到直径为3cm后可转移至1mL PDA及水-甘油冻存管中保藏0℃中作为菌种备用。
具体地，一种红棕毛筒腔菌PF02-2代谢产物的制备方法，按以下步骤进行：
(1)菌种活化培养：将保存的红棕毛筒腔菌PF02-2菌种移至 5mL马铃薯葡萄糖PDA培养基上，在26℃条件下培养，至菌丝覆盖整个培养皿，用直径为7mm打孔器打孔获得菌饼，供接种用；
(2)液体发酵培养：发酵液由以下重量份数的物质组成：葡萄糖4份、蛋白胨1份、水100份，每500mL三角瓶装发酵液200mL；配制后121℃灭菌20min，待冷却至40℃在无菌条件下挑取1直径为 7mm菌饼，在26℃条件下，静置发酵培养28天；
(3)发酵液提取：发酵完毕后收集发酵液，加入发酵液体积2 倍乙酸乙酯萃取，在真空条件下浓缩至浸膏，即得。
所述肿瘤包括但不限于肝癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、骨癌、结肠癌、宫颈癌、胰腺癌、淋巴癌、白血病。
所述逆转肿瘤多药耐药性，是指逆转癌细胞已产生的多药耐药性，致使其对于抗癌药物重新敏感的活性。所述逆转活性是指红棕毛筒腔菌PF02-2及其代谢产物、药物制剂对P-糖蛋白功能具有抑制作用。
所述抗癌药包括但不限于紫杉醇、紫杉烷类、阿霉素、丝裂霉素、顺铂、氟尿嘧啶、环磷酰胺。
所述制备具有逆转肿瘤细胞多药耐药性为敏感性的药物，是指将红棕毛筒腔菌PF02-2及其代谢产物加入药学上可接受的辅料或载体，制成所需的药物制剂。
所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。
实施例2
本发明所述的红棕毛筒腔菌PF02-2样品分离过程为：
(1)采集的腐木样品置于显微镜下镜检；
(2)接种针消毒，挑取腐木表面白色菌落，转移至80μL无菌水中制成孢子悬浮液；
(3)将孢子悬浮液转移到15mL水-琼脂(简写为WA)平板培养皿中，置于30℃中培养14小时后，挑取已萌发生长出菌丝的单个分生孢子接种到15mL马铃薯葡萄糖琼脂培养皿(简写为PDA)中，于30℃下培养即得PF02-2纯菌落。
所述逆转肿瘤多药耐药性，是指逆转癌细胞已产生的多药耐药性，致使其对于抗癌药物重新敏感的活性。所述逆转活性是指红棕毛筒腔菌PF02-2，及其代谢产物、药物制剂对P-糖蛋白功能具有抑制作用。
本发明所述的红棕毛筒腔菌PF02-2菌种保存方法为：
(1)单孢源菌种悬浮液的制备：在酒精灯火焰旁用灭菌后的接种针或注射用针头从经分离得到的PF02-2纯菌落上挑取分生孢子，置于80μL无菌水，混匀形成单孢源菌种悬浮液。
(2)萌发单孢的制备：将步骤(1)所述的孢子悬浮液转移到 15mL水-琼脂(WA)平板培养皿中，置于28℃下，12h后孢子开始萌发生长出菌丝。
(3)保存菌落的制备：将步骤(2)所述的已萌发的单个分生孢子在酒精灯火焰旁于显微操作台上快速转移至15mL PDA平板培养皿中，密封带密封后置于30℃条件下培养，即得待保存菌落。待菌落长到直径为3-6cm后可转移至1.5mL PDA及水-甘油冻存管中保藏 4℃中作为菌种备用。
具体地，一种红棕毛筒腔菌PF02-2代谢产物的制备方法，按以下步骤进行：
(1)菌种活化培养：将保存的红棕毛筒腔菌PF02-2菌种移至 15mL马铃薯葡萄糖PDA培养基上，在30℃条件下培养，至菌丝覆盖整个培养皿，用直径为7mm打孔器打孔获得菌饼，供接种用；
(2)液体发酵培养：发酵液由以下重量份数的物质组成：葡萄糖4份、蛋白胨1份、水100份，每500mL三角瓶装发酵液200mL；配制后121℃灭菌30min，待冷却至40℃在无菌条件下挑取1直径为 7mm菌饼，在30℃条件下，静置发酵培养32天；
(3)发酵液提取：发酵完毕后收集发酵液，加入发酵液体积4 倍乙酸乙酯萃取，在真空条件下浓缩至浸膏，即得。
所述肿瘤包括但不限于肝癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、骨癌、结肠癌、宫颈癌、胰腺癌、淋巴癌、白血病。
所述抗癌药包括但不限于紫杉醇、紫杉烷类、阿霉素、丝裂霉素、顺铂、氟尿嘧啶、环磷酰胺。
所述制备逆转肿瘤细胞多药耐药性为敏感性的药物，是指将红棕毛筒腔菌PF02-2及其代谢产物加入药学上可接受的辅料或载体，制成所需的药物制剂。
所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂等。
实施例3
本发明所述的红棕毛筒腔菌PF02-2样品分离过程为：
(1)采集的腐木样品置于显微镜下镜检；
(2)接种针消毒，挑取腐木表面白色菌落，转移至50μL无菌水中制成孢子悬浮液；
(3)将孢子悬浮液转移到8mL水-琼脂(简写为WA)平板培养皿中，置于27℃中培养11小时后，挑取已萌发生长出菌丝的单个分生孢子接种到7mL马铃薯葡萄糖琼脂培养皿(简写为PDA)中，于 27℃下培养即得PF02-2纯菌落。
本发明所述的红棕毛筒腔菌PF02-2菌种保存方法为：
(1)单孢源菌种悬浮液的制备：在酒精灯火焰旁用灭菌后的接种针或注射用针头从经分离得到的PF02-2纯菌落上挑取分生孢子，置于50μL无菌水，混匀形成单孢源菌种悬浮液。
(2)萌发单孢的制备：将步骤(1)所述的孢子悬浮液转移到 7mL水-琼脂(WA)平板培养皿中，置于26℃下，12h后孢子开始萌发生长出菌丝。
(3)保存菌落的制备：将步骤(2)所述的已萌发的单个分生孢子在酒精灯火焰旁于显微操作台上快速转移至7mL PDA平板培养皿中，密封带密封后置于27℃条件下培养，即得待保存菌落。待菌落长到直径为4cm后可转移至1.1mL PDA及水-甘油冻存管中保藏1℃中作为菌种备用。
所述逆转肿瘤多药耐药性，是指逆转癌细胞已产生的多药耐药性，致使其对于抗癌药物重新敏感的活性。所述逆转活性是指红棕毛筒腔菌PF02-2，及其代谢产物、药物制剂对P-糖蛋白功能具有抑制作用。
具体地，一种红棕毛筒腔菌PF02-2代谢产物的制备方法，按以下步骤进行：
(1)菌种活化培养：将保存的红棕毛筒腔菌PF02-2菌种移至 7mL马铃薯葡萄糖PDA培养基上，在27℃条件下培养，至菌丝覆盖整个培养皿，用直径为7mm打孔器打孔获得菌饼，供接种用；
(2)液体发酵培养：发酵液由以下重量份数的物质组成：葡萄糖4份、蛋白胨1份、水100份，每500mL三角瓶装发酵液200mL；配制后121℃灭菌20-30min，待冷却至40℃在无菌条件下挑取1直径为7mm菌饼，在27℃条件下，静置发酵培养29天；
(3)发酵液提取：发酵完毕后收集发酵液，加入发酵液体积3 倍乙酸乙酯萃取，在真空条件下浓缩至浸膏，即得。
所述肿瘤包括但不限于肝癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、骨癌、结肠癌、宫颈癌、胰腺癌、淋巴癌、白血病。
所述抗癌药包括但不限于紫杉醇、紫杉烷类、阿霉素、丝裂霉素、顺铂、氟尿嘧啶、环磷酰胺。
所述制备逆转肿瘤细胞多药耐药性为敏感性的药物，是指将红棕毛筒腔菌PF02-2及其代谢产物加入药学上可接受的辅料或载体，制成所需的药物制剂。
所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂等。
实施例4
本发明所述的红棕毛筒腔菌PF02-2样品分离过程为：
(1)采集的腐木样品置于显微镜下镜检；
(2)接种针消毒，挑取腐木表面白色菌落，转移至60μL无菌水中制成孢子悬浮液；
(3)将孢子悬浮液转移到9mL水-琼脂(简写为WA)平板培养皿中，置于28℃中培养12小时后，挑取已萌发生长出菌丝的单个分生孢子接种到9mL马铃薯葡萄糖琼脂培养皿(简写为PDA)中，于 28℃下培养即得PF02-2纯菌落。
本发明所述的红棕毛筒腔菌PF02-2菌种保存方法为：
(1)单孢源菌种悬浮液的制备：在酒精灯火焰旁用灭菌后的接种针或注射用针头从经分离得到的PF02-2纯菌落上挑取分生孢子，置于60μL无菌水，混匀形成单孢源菌种悬浮液。
(2)萌发单孢的制备：将步骤(1)所述的孢子悬浮液转移到 9mL水-琼脂(WA)平板培养皿中，置于27℃下，12h后孢子开始萌发生长出菌丝。
(3)保存菌落的制备：将步骤(2)所述的已萌发的单个分生孢子在酒精灯火焰旁于显微操作台上快速转移至9mL PDA平板培养皿中，密封带密封后置于28℃条件下培养，即得待保存菌落。待菌落长到直径为5cm后可转移至1.2mL PDA及水-甘油冻存管中保藏2℃中作为菌种备用。
所述逆转肿瘤多药耐药性，是指逆转癌细胞已产生的多药耐药性，致使其对于抗癌药物重新敏感的活性。所述逆转活性是指红棕毛筒腔菌PF02-2，及其代谢产物、药物制剂对P-糖蛋白功能具有抑制作用。
具体地，一种红棕毛筒腔菌PF02-2代谢产物的制备方法，按以下步骤进行：
(1)菌种活化培养：将保存的红棕毛筒腔菌PF02-2菌种移至 9mL马铃薯葡萄糖PDA培养基上，在28℃条件下培养，至菌丝覆盖整个培养皿，用直径为7mm打孔器打孔获得菌饼，供接种用；
(2)液体发酵培养：发酵液由以下重量份数的物质组成：葡萄糖4份、蛋白胨1份、水100份，每500mL三角瓶装发酵液200mL；配制后121℃灭菌23min，待冷却至40℃在无菌条件下挑取1直径为 7mm菌饼，在28℃条件下，静置发酵培养30天；
(3)发酵液提取：发酵完毕后收集发酵液，加入发酵液体积2 倍乙酸乙酯萃取，在真空条件下浓缩至浸膏，即得。
所述肿瘤包括但不限于肝癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、骨癌、结肠癌、宫颈癌、胰腺癌、淋巴癌、白血病。
所述抗癌药包括但不限于紫杉醇、紫杉烷类、阿霉素、丝裂霉素、顺铂、氟尿嘧啶、环磷酰胺。
所述制备逆转肿瘤细胞多药耐药性为敏感性的药物，是指将红棕毛筒腔菌PF02-2及其代谢产物加入药学上可接受的辅料或载体，制成所需的药物制剂。
所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂等。
实施例5
本发明所述的红棕毛筒腔菌PF02-2样品分离过程为：
(1)采集的腐木样品置于显微镜下镜检；
(2)接种针消毒，挑取腐木表面白色菌落，转移至70μL无菌水中制成孢子悬浮液；
(3)将孢子悬浮液转移到11mL水-琼脂(简写为WA)平板培养皿中，置于29℃中培养13小时后，挑取已萌发生长出菌丝的单个分生孢子接种到11mL马铃薯葡萄糖琼脂培养皿(简写为PDA)中，于29℃下培养即得PF02-2纯菌落。
本发明所述的红棕毛筒腔菌PF02-2菌种保存方法为：
(1)单孢源菌种悬浮液的制备：在酒精灯火焰旁用灭菌后的接种针或注射用针头从经分离得到的PF02-2纯菌落上挑取分生孢子，置于70μL无菌水，混匀形成单孢源菌种悬浮液。
(2)萌发单孢的制备：将步骤(1)所述的孢子悬浮液转移到 13mL水-琼脂(WA)平板培养皿中，置于27℃下，12h后孢子开始萌发生长出菌丝。
(3)保存菌落的制备：将步骤(2)所述的已萌发的单个分生孢子在酒精灯火焰旁于显微操作台上快速转移至13mL PDA平板培养皿中，密封带密封后置于29℃条件下培养，即得待保存菌落。待菌落长到直径为5cm后可转移至1.4mL PDA及水-甘油冻存管中保藏 3℃中作为菌种备用。
所述逆转肿瘤多药耐药性，是指逆转癌细胞已产生的多药耐药性，致使其对于抗癌药物重新敏感的活性。所述逆转活性是指红棕毛筒腔菌PF02-2，及其代谢产物、药物制剂对P-糖蛋白功能具有抑制作用。
具体地，一种红棕毛筒腔菌PF02-2代谢产物的制备方法，按以下步骤进行：
(1)菌种活化培养：将保存的红棕毛筒腔菌PF02-2菌种移至 13mL马铃薯葡萄糖PDA培养基上，在29℃条件下培养，至菌丝覆盖整个培养皿，用直径为7mm打孔器打孔获得菌饼，供接种用；
(2)液体发酵培养：发酵液由以下重量份数的物质组成：葡萄糖4份、蛋白胨1份、水100份，每500mL三角瓶装发酵液200mL；配制后121℃灭菌20-30min，待冷却至40℃在无菌条件下挑取1直径为7mm菌饼，在29℃条件下，静置发酵培养31天；
(3)发酵液提取：发酵完毕后收集发酵液，加入发酵液体积4 倍乙酸乙酯萃取，在真空条件下浓缩至浸膏，即得。
所述肿瘤包括但不限于肝癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、骨癌、结肠癌、宫颈癌、胰腺癌、淋巴癌、白血病。
所述抗癌药包括但不限于紫杉醇、紫杉烷类、阿霉素、丝裂霉素、顺铂、氟尿嘧啶、环磷酰胺。
所述制备逆转肿瘤细胞多药耐药性为敏感性的药物，是指将红棕毛筒腔菌PF02-2及其代谢产物加入药学上可接受的辅料或载体，制成所需的药物制剂。
所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂等。

Claims (10)

1.红棕毛筒腔菌在制备逆转肿瘤细胞多药耐药性为敏感性的药物中的应用，其特征在于，所述红棕毛筒腔菌命名为红棕毛筒腔菌(Tubeufia rubra Y.Z.Lu,J.C.Kang&K.D.Hyde)PF02-2，保藏单位：中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日：2019.11.20，保藏登记号为CCTCC M 2019957PF02-2。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述红棕毛筒腔菌PF02-2由以下方法获得：
(1)经采集的腐木在显微镜下镜检；
(2)接种针消毒，挑取腐木表面白色菌落，转移至40-80μL无菌水中制成孢子悬浮液；
(3)将孢子悬浮液转移到5-15mL水-琼脂平板培养皿中，置于26-30℃中培养10-14小时后，挑取已萌发生长出菌丝的单个分生孢子接种到5-15mL马铃薯葡萄糖琼脂培养皿中，于26-30℃下培养即得PF02-2纯菌落。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述红棕毛筒腔菌PF02-2由以下方法保存：
(1)单孢源菌种悬浮液的制备：在酒精灯火焰旁用灭菌后的接种针或注射用针头从经分离得到的PF02-2纯菌落上挑取分生孢子，置于40-80μL无菌水，混匀形成单孢源菌种悬浮液；
(2)萌发单孢的制备：将步骤(1)所述的孢子悬浮液转移到5-15mL水-琼脂(WA)平板培养皿中，置于25-28℃下，12h后孢子开始萌发生长出菌丝；
(3)保存菌落的制备：将步骤(2)所述的已萌发的单个分生孢子在酒精灯火焰旁于显微操作台上快速转移至5-15mL PDA平板培养皿中，密封带密封后置于26-30℃条件下培养，即得待保存菌落。待该菌落长到直径为3-6cm后转移至1-1.5mL PDA及水-甘油冻存管中，保藏于0-4℃中作为菌种备用。
4.如权利要求1所述红棕毛筒腔菌在制备具有逆转肿瘤多药耐药敏感性药物中的应用，其特征在于，所述逆转活性是指红棕毛筒腔菌PF02-2，及其代谢产物、药物制剂对P-糖蛋白功能具有抑制作用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述红棕毛筒腔菌PF02-2代谢产物的制备方法，按以下步骤进行：
(1)菌种活化培养：将保存的红棕毛筒腔菌PF02-2菌种移至5-15mL马铃薯葡萄糖PDA培养基上，在26-30℃条件下培养，至菌丝覆盖整个培养皿，用直径为7mm打孔器打孔获得菌饼，供接种用；
(2)液体发酵培养：发酵液由以下重量份数的物质组成：葡萄糖4份、蛋白胨1份、水100份，每500mL三角瓶装发酵液200mL；配制后121℃灭菌20-30min，待冷却至40℃在无菌条件下挑取1直径为7mm菌饼，在26-30℃条件下，静置发酵培养28-32天；
(3)发酵液提取：发酵完毕后收集发酵液，加入发酵液体积2-4倍乙酸乙酯萃取，在真空条件下浓缩至浸膏，即得。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括但不限于肝癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、骨癌、结肠癌、宫颈癌、胰腺癌、淋巴癌、白血病。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述逆转肿瘤多药耐药性，是指逆转癌细胞已产生的多药耐药性，致使其对于抗癌药物重新敏感的活性。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗癌药包括但不限于紫杉醇、紫杉烷类、阿霉素、丝裂霉素、顺铂、氟尿嘧啶、环磷酰胺。
9.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述制备逆转肿瘤细胞多药耐药性为敏感性的药物，是指将红棕毛筒腔菌PF02-2及其代谢产物加入药学上可接受的辅料或载体，制成所需的药物制剂。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。
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