CN102993188A

CN102993188A - 弗霉素b及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN102993188A
Application number: CN2012104352053A
Authority: CN
Inventors: 张治针; 连晓媛; 辛文秀; 叶雪威; 虞斯然
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-11-03
Filing date: 2012-11-03
Publication date: 2013-03-27

Abstract

本发明提供一种生物活性物质弗霉素B，通过从海洋沉积物中分离培养能产生弗霉素B的弗氏链霉菌StreptomycesfradiaePTZ0025，再经制备发酵菌液、高速离心、提取分离纯化和结构鉴定，得到活性单体化合物弗霉素B。本发明的弗霉素B对金黄色葡萄球菌具有显著的抗菌活性，可在制备治疗金黄色葡萄球菌所引起的感染性疾病药物中的应用；弗霉素B还可显著抑制人肠癌HCT-15和SW620细胞以及胶质瘤C6细胞的生长，诱导癌细胞的凋亡和坏死，可在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用。弗霉素B化学结构为：

Description

弗霉素B及其制备方法和用途

技术领域

本发明属医药领域，涉及具有生物活性的新物质弗霉素B(Fradimycin B)及其制备方法，以及在制备抗菌和抗肿瘤药物中的用途。

背景技术

感染性疾病依然严重危害人类的健康和生命，全球每年有超过1700万人死于感染性疾病。金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)是人类的一种重要病原菌，可引起许多严重感染。而且，随着抗生素的广泛应用，不断出现的耐药病源菌，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VRE)等超级耐药菌的感染，已成为医院和社区感染更为棘手的重要问题。我国是世界上抗生素使用最多的国家之一，耐药菌感染性疾病的危害更为突出，是我国10种重大疾病之一。

而恶性肿瘤(癌症)对人类危害就更加严重，为当今世界死亡率最高的疾病，也是我国城乡居民的第一死因。化疗是目前世界上肿瘤手术切除后药物治疗的主要方法，但毒性大疗效有限。虽然分子靶向药物为癌症的治疗开辟了新途径，但其临床效果未达到预期效果，而且癌细胞对抗癌药耐药性的不断增加也严重影响现有药物的疗效。

综上所述，临床上需要研究开发治疗感染性疾病和恶性肿瘤的新型药物。

本发明发现了一种新的生物活性物质弗霉素B (Fradimycin B)。由于弗霉素B不仅对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)具有显著的抗菌活性，而且可显著抑制肠癌HCT-15和SW620细胞以及胶质瘤C6细胞的生长，所以，弗霉素B在制备抗感染和抗肿瘤药物等方面具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种生物活性物质弗霉素B(Fradimycin B)，所述的弗霉素B为一新化合物，它的化学结构式为：

本发明的另一个目的是提供弗霉素B的制备方法，通过以下步骤实现：

（1）弗霉素B产生菌Streptomyces fradiae PTZ0025的培养分离

取空气干燥的海洋沉积物用液体菌种培养液稀释，稀释后的浓度为0.1~0.0001 g/ml,取一定量的样品稀释液均匀分散到含有固体培养基的培养皿中，在常温条件下培养一定时间后,将不同的菌落分别转移到另一含有固体培养基的培养皿中，在常温条件下继续培养一定时间。最后将生长良好的单一菌落(菌株PTZ0025)转移到斜面培养基并置于4°C冰箱保存备用。菌株弗氏链霉菌Streptomyces fradiae PTZ0025已经保藏在中国典型培养物保藏中心-武汉中心(保藏编号CCTCC NO：M2012374)；保藏日期：2012年9月24日，保藏地址：中国武汉武汉大学。

所述的海洋沉积物是从浙江普陀海岸边获得；所述的液体菌种培养液每100ml的组成为：5.0克葡萄糖、1.5克丙三醇、1.5克麦芽提取物、2.5克酵母提取物、0.5克酪蛋白氨基酸和0.1克碳酸钙,或是适宜菌株PTZ0025生长的其它组成的液体培养基。样品稀释液的取样量为50~300 ml。培养皿所含的固体培养基为细菌琼脂(Bacto-agar)培养基或其它固体培养基。培养温度为常温下的20~30°C；培养时间为7~15天。斜面培养基为高氏合成斜面培养基或其它固体斜面培养基。

（2）弗霉素B产生菌Streptomyces fradiae PTZ0025的菌种鉴定

步骤（1）所获得的菌株用目前实验室普遍使用的16S rDNA序列分析方法鉴定细菌PTZ0025的种类，确定为菌株弗氏链霉菌，分类命名为Streptomyces fradiae PTZ0025，已被武汉中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号CCTCC NO：M 2012374。

（3）弗霉素B产生菌Streptomyces fradiae PTZ0025发酵菌液的制备

取弗氏链霉菌Streptomyces fradiaePTZ0025的菌落与一定量的灭菌水在微量离心管混合后匀浆，将细菌匀浆液转移到含有一定量液体菌种培养液的小锥形瓶中，将含有PTZ0025的菌种培养液在一定温度条件下旋转振摇培养一定时间后，再转入含有液体培养基的大三角培养瓶，在常温下旋转振摇发酵培养一定时间后，得到具有抗菌活性的PTZ0025发酵菌液。

所述的灭菌水为海水、蒸馏水或实验室其它用水，使用量为100~500 ml。液体菌种培养液同步骤(1)所述，使用量为20~50 ml。大三角培养瓶所用的液体培养基每500 ml的配方为：3.0 g葡萄糖，2.5 g丙三醇，7.5 g 可溶性淀粉，2.0 g 豆粉, 1.5 g 鱼粉，1.5 g氯化钙和50 ml灭菌海水，或是适宜菌株PTZ0025生长的其它配方的液体培养基。所述的培养温度为25~28°C；培养时间为7~15天。

（4）弗霉素B的提取分离纯化和结构鉴定

PTZ0025的发酵菌液经高速离心，弃去上清液后的残留物用有机溶剂提取，提取液经减压浓缩得到的提取物用大孔吸附树脂(Diaion HP-20)和十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)柱层析相结合的方法分离得到含有弗霉素B的活性组分，活性组分用高效液相分离纯化得到活性单体化合物弗霉素B。弗霉素B的结构是根据它的理化性质、NMR和高分辨质谱数据而鉴定。

所述提取使用的有机溶剂为乙醇、甲醇或丙酮；所述柱层析的大孔吸附树脂用量与上量的提取物比例是10~20 ml：1.0 g，ODS用量与上量的样品量比例是40~60 g：1.0 g。所述的高效液相条件是: Agilent 1100高效液相色谱仪，Cosmosil C₁₈ 色谱柱 (250 ′ 10.0 mm, 5 mm)，乙腈/水(50/50)为流动相，检测波长295 nm，流速为3.0 ml/min。

本发明的再一个目的是提供弗霉素B在制备治疗金黄色葡萄球菌所引起的感染性疾病药物中的应用。

所述的感染性疾病是金黄色葡萄球菌等引起的医院和社区感染性疾病。本发明所述的弗霉素B对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)具有显著的抗菌活性。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中的一种重要病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、心包炎等，甚至败血症等全身感染。所以由弗霉素B制备的相关药物在治疗金黄色葡萄球菌所引起的感染性疾病方面具有良好的应用前景。

本发明的第四个目的是提供弗霉素B在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用。弗霉素B还可显著抑制人肠癌HCT-15和SW620细胞以及胶质瘤C6细胞的生长，诱导癌细胞的凋亡和坏死。所述的恶性肿瘤包括消化系统肿瘤和脑肿瘤，如肠癌和脑胶质瘤等。

所述药物为弗霉素B活性成分单独或与其他药物或与有效成分一起，与药学上可接受的载体组成的药物。所述药物的制剂包括:口服制剂、针剂、缓释剂、控释剂、靶向制剂或泡腾剂，口服制剂包括口服片、含片、咀嚼片、丸剂、滴丸、胶囊、软胶囊、颗粒、口服液、糖浆、乳剂、合剂，针剂包括小针剂、大针剂、粉针剂、乳剂、混悬液。

本发明从海洋沉积物中培养分离到活性物质产生菌PTZ0025并从中发现了新的生物活性物质弗霉素B (Fradimycin B)。由于弗霉素B不仅对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)具有显著的抗菌活性，而且可显著抑制肠癌HCT-15和SW620细胞以及胶质瘤C6细胞的生长，所以，弗霉素B在制备抗感染和抗肿瘤药物等方面具有良好的应用前景。

附图说明

图1-1、图1-2、图1-3和图1-4是弗霉素B的氢谱(¹H-NMR)图。

图2-1、图2-2、图2-3、2-4和图2-5是弗霉素B的碳谱(¹³C-NMR)图。

图3-1、图3-2和图3-3是弗霉素B的氢-氢相关谱(¹H-¹H COSY)图。

图4-1、图4-2、图4-3和图4-4是弗霉素B的氢-碳相关谱(HMQC)图。

图5-1、图5-2、图5-3、图5-4、图5-5、图5-6和图5-7是弗霉素B的远程氢-碳相关谱(HMBC)图。

图6是弗霉素B的高分辨质谱(HRESIMS)图。

图7是弗霉素B的紫外光谱图。

图8-是弗霉素B化学结构主要的HMBC相关性。

图9是弗霉素B阻滞HCT-15 细胞G₀/G₁周期图。

图10-1是弗霉素B诱导人肠癌HCT-15细胞凋亡和坏死的形态图。

图10-2是弗霉素B诱导人肠癌SW620细胞凋亡和坏死的形态图。

图10-3是弗霉素B诱导鼠胶质瘤C6细胞凋亡和坏死的形态图。

图11是弗霉素B诱导人肠癌HCT-15细胞凋亡和坏死的定量分析图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述。但是，本发明不限于这些实施例。

实施例1

1．弗霉素B产生菌Streptomyces fradiae PTZ0025的培养分离

取海洋沉积物5 g置于45 ml灭菌离心管中在空气中自然干燥10天。干燥的样品用菌种培养液(每100 ml 含5.0克葡萄糖、1.5克丙三醇、1.5克麦芽提取物、2.5克酵母提取物、0.5克酪蛋白氨基酸和0.1克碳酸钙)稀释到0.01g/ml。取200μl样品稀释液均匀分散到细菌琼脂(Bacto-agar)培养皿后在常温下(20-28°C)孵化10天后，将不同的菌落用消毒过的接种针仔细挑选并分别转移到另一细菌琼脂培养皿并在常温下继续培养7天。将生长良好的单一PTZ0025菌落转移到高氏合成琼脂斜面培养基并置于4°C冰箱中保存备用。

2．弗霉素B产生菌Streptomyces fradiae PTZ0025的菌种鉴定

使用16S rDNA序列分析方法鉴定所获得菌株PTZ0025的种类。

2.1 实验试剂及仪器

PCR试剂：EX Taq酶（TaKaRa），dNTP（TaKaRa），引物（Invitrogen合成），引物序列是: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和GGTTACCTTGTTACGACTT。Marker：DL5000

实验仪器：离心机，电泳仪，PCR仪，ABI 3730XL测序仪。

2.2 实验步骤

细菌基因组DNA抽提；电泳检测；PCR扩增；

a. PCR反应体系

10×Ex Taq buffer 2.0μl

25mM MgCl₂ 1.6μl

2.5mM dNTP Mix 1.6μl

5p Primer 1 1.0μl

5p Primer 2 1.0μl

Template 0.5μl

5u Ex Taq 0.2μl

ddH ₂ O 12.1μl

Total volume 20.0μl

b. PCR反应条件

95℃ 5min

95℃ 30s

55℃ 30s 24cycles

72℃ 1min30s

72℃ 10min

10℃ ∞

c. 电泳检测；

d. 测序: 切胶纯化测序；

e. 分析结果: 拼接序列。

2.3 实验结果

拼接后的序列为：TGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAG

CAATGCTGATCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGACCGGCTTTTTGAGATTCGCTCCACCTTGCGGTATCGCAGCTCTTTGTACCGGCCATTGTAGCACGTGTGCAGCCCAAGACATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCTCCCGTGAGTCCCCAGCACCACAAGGGCCTGCTGGCAACACGGGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTACACCGACCACAAGGGGGCACCCATCTCTGGGTGTTTCCGGTGTATGTCAAGCCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAAtTAAGCCACATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGAACTTAATGCGTTAGCTGCGGCACGGACGACGTGGAATGTCGCCCACACCTAGTTCCCAACGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTATCGGCCCAGAGATCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCCTCCTGATATMTGCGCATTTCACCGCTACACCAGGAATTCCGATCTCCCCTACCGAACTCTAGCCTGCCCGTATCGAATGCAGACCCGGGGTTAAGCCCCGGGCTTTCACATCCGACGTGACAGGCCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCGCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGCGCTTCTTCTGCAGGTACCGTCACTTTCGCTTCTTCCCTGCTGAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTTCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCGCCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTGATAGGCCGCGGGCTCATCCTGCACCGCCGGAGCTTTCCACCACCATCAGATGCCTGAAGTGGTCGTATCCGGTATTAGACCCCGTTTCCAGGGCTTGTCCCAGAGTGCAGGGCAGATTGCCCACGTGT 。

以上获得的16S rDNA序列与美国NIH的NCBI GenBank 数据库比较，其结果表明:菌株PTZ0025的16S rDNA序列与GenBank库中的弗氏链霉菌Streptomyces fradiae strain CO-4的16S rDNA序列有99%的相似性(登录号: JF915304.1)。因此，本发明所获得的菌株PTZ0025鉴定为弗氏链霉菌Streptomyces fradiae。

3．弗霉素B产生菌Streptomyces fradiae PTZ0025发酵菌液的制备

取PTZ0025菌落置于含300 μl灭菌海水的1.5ml微量离心管混合后匀浆。细菌匀浆液转移到含有30 ml 菌种培养液的250 ml锥形瓶中。含有菌株PTZ0025的菌种培养液在26°C条件下旋转振摇培养7天后再转入含有500 ml液体培养基的2升三角培养瓶，在常温下条件下旋转振摇发酵培养10天，得到具有抗菌活性的PTZ0025发酵菌液。每500 ml液体培养基的配方：3.0 g葡萄糖，2.5 g丙三醇，7.5 g 可溶性淀粉，2.0 g 豆粉, 1.5 g 鱼粉，1.5 g氯化钙和50 ml灭菌海水。

4．弗霉素B的提取分离纯化和结构鉴定

上述实验3获得的发酵菌液(8.0升)合并后离心(8000转/每分钟) 20分钟，弃去上清液后的残留物用95%乙醇提取两次(每次2.0升)。乙醇提取液经减压浓缩得到的提取物(30.0 g)用大孔吸附树脂(Diaion HP-20，500 ml)分离，先后用30%和95%乙醇洗脱。合并的95%乙醇洗脱液经减压浓缩得到的组分(5.0 g)用十八烷基硅烷键合硅胶(ODS，250克)柱层析分离，先后用40%和70%乙醇洗脱。分段收集70%乙醇洗脱液，并用高效液相(仪器：Agilent 1100；层析柱：Cosmosil C₁₈ column，250 ′ 10.0 mm，5 mm；流动相：乙腈/水：50/50；检测波长：295 nm；流速：3.0 ml/min)检测各组分。将含有弗霉素B的组分合并，合并液经减压浓缩得到的残留物(100毫克)溶解于1.0 ml二甲基亚砜中并用上述高效液相条件分离纯化，收集含有弗霉素B的组分，回收乙腈后并经冷冻干燥得到纯弗霉素B (38.7毫克)。

根据弗霉素B的¹H谱(附图1-1，1-2，1-3和1-4)，¹³C谱(附图2-1，2-2，2-3，2-4和2-5)，COSY谱(附图3-1，3-2和3-3)，HMQC谱(附图4-1，4-2，4-3和4-4)，HMBC谱(附图5-1，5-2，5-3,5-4，5-5,5-6和5-7)，高分辨质谱(附图6)和紫外光谱(附图7)，弗霉素B鉴定为一新化合物，其主要的远程¹H-¹³C相关性(HMBC)参见附图8。

弗霉素B的理化性质：橘红色粉末，[α]²³ _D +36.3 °C (c 0.05, MeOH); UV (c 0.05, MeOH) λ_max (log ε) 222 (7644), 294 (4544), 427 (584) nm，高分辨质谱为m/z [M + H]⁺ 719.2408 (计算值C₃₈H₃₉O₁₄, 719.2340) 和 [M + Na]⁺ 741.2247 (计算值 C₃₈H₃₈NaO₁₄, 741.2159)，¹³C 和¹H NMR 信号归属总结见表一。

实施例2 弗霉素B的生物活性测定

1.弗霉素B的抗菌活性

测定了弗霉素B在MH培养基(Mueller-Hinton Broth)中对金黄色葡萄球菌的抗菌作用。将弗霉素B配成2 mg/ml 的二甲基亚砜(DMSO)储存液，取一定量的储存液用DMSO进行两倍量稀释制备成一系列测试样品液。在96孔微量培养皿中，将10 ml的每个待测样品液分别和90 ml含有对数期生长细胞(细菌细胞密度OD600 mm = 0.001)的MH培养基混合后，在37°C条件下孵化培养18小时后，观察各浓度的测试样品液对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)生长的抑制作用，判断弗霉素B的最低抑菌浓度(MIC)。实验结果表明弗霉素B对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)为2.0 mg/ml (0.0027 mM)。

金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中的一种重要病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。由于弗霉素B对金黄色葡萄球菌具有很强的抗菌活性，所以由弗霉素B制备的相关药物在治疗金黄色葡萄球菌所引起的感染性疾病方面具有良好的应用前景。

2. 弗霉素B抑制肿瘤细胞生长的作用

人肠癌HCT-15和SW620分别用含有10%FBS的RPMI 1640和DMEM培养基在37°C、含有5%二氧化碳的孵化箱中培养。鼠胶质瘤C6细胞用Leibovitz's L15培养基在37°C、没有5%二氧化碳的孵化箱中培养。经过三代培养的细胞用于本发明的实验研究。

用磺酰罗丹明B (SRB)法测定肿瘤细胞存活率。细胞接种于96孔板中，贴壁24 h后加入不同浓度的弗霉素B。药物处理72 h后用SRB染色，用酶标仪测定515 nm处的吸收光度值，检测肿瘤细胞的存活率，计算弗霉素B的IC₅₀值。实验结果表明：弗霉素B对人肠癌HCT-15细胞、SW620细胞和胶质瘤C6细胞有显著的抑制作用，并成剂量依赖性，其IC₅₀值分别为0.13 ± 0.04 mM (HCT-15)、4.33 ± 1.56 mM (SW620)和0.47 ± 0.09 mM (C6)。

3. 弗霉素B对肿瘤细胞生长周期的影响

用碘化丙啶(PI) DNA染色后流式细胞仪分析弗霉素B对人肠癌HCT-15细胞生长周期的影响。将人肠癌HCT-15细胞用弗霉素B (1.25 mM)处理3 h, 6 h, 12 h和24 h 后，收集细胞并与冰冻的70%乙醇混合后在4°C条件下过夜。过夜后的混合液经离心(1900 rpm，7分钟)分离得到的细胞用PBS洗涤两次。细胞重新分散在含有RNase A的PBS中，在37°C 孵化30分钟，最后用碘化丙啶(PI)在4°C黑暗处染色30 分钟。用FACScan流式细胞仪分析弗霉素B对HCT-15细胞周期的改变。实验结果显示：与对照组比较，弗霉素B (1.25 mM)处理人肠癌HCT-15细胞3 h, 6 h, 12 h和24 h 后，细胞周期的G₀/G₁期细胞比例分别增加了4.34 %， 5.89 %，10.75 % 和21. 91 % (表二，附图9)。

4. 弗霉素B诱导肿瘤细胞凋亡和坏死的作用

用Hoechst 33342和碘化丙啶(PI)双重染色测定弗霉素B引起人肠癌HCT-15和SW620细胞以及胶质瘤C6细胞凋亡和坏死的作用。肿瘤细胞和不同浓度的弗霉素B在37°C的孵化箱中培养72小时后用10 mg/ml的Hoechst 33342和5 mg/ml 的PI在室温下染色20分钟。用PBS洗涤两次后，在40倍的荧光显微镜观察肿瘤细胞凋亡和坏死情况，凋亡细胞经Hoechst 33342染色后为亮蓝色，坏死细胞经碘化丙啶(PI)染色后为红色。实验结果显示：弗霉素B 在浓度0.625 mM和1.25 mM引起人肠癌HCT-15细胞(附图10-1)和胶质瘤C6细胞(附图10-3)凋亡和坏死，而弗霉素B在浓度2.5和5.0 mM引起肠癌SW620细胞(附图10-2)凋亡和坏死。

用Annexin V-FITC/PI双染色分析方法对弗霉素B诱导肠癌HCT-15细胞凋亡和坏死的作用进行了定量分析。将肠癌HCT-15细胞用弗霉素B (1.25 mM)处理24和72小时后，收集1′10⁶个细胞。细胞用冷的PBS缓冲液洗涤后重新分散在100 ml 含有5ml Annexin V-FITC 和1 ml 100 μg/ml PI 工作液的结合缓冲液中。细胞在室温下孵化15分钟后加入400 ml 结合缓冲液，用流式细胞仪检测其荧光(激发波长：488 nm；发射波长：530 nm 和575 nm)。实验结果表明：与对照组HCT-15细胞凋亡和坏死率(16.44 %)比较，弗霉素B (1.25 mM)处理后24 h和72 h，可分别引起HCT-15细胞凋亡和坏死率升高到28.46 % 和 43.04 % (参见附图11，图中左下角为正常细胞，右下角为早期凋亡细胞，右上角为晚期凋亡细胞，左上角为坏死细胞。

以上结果表明：弗霉素B显著抑制人肠癌HCT-15和SW620细胞以及胶质瘤C6细胞的生长，诱导癌细胞的凋亡和坏死。所以，由弗霉素B制备的相关药物在恶性肿瘤的治疗方面具有应用前景。

<110> 浙江大学

<120> 弗霉素B及其制备方法和用途

<160> 3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

GGT TAC CTT GTT ACG ACT T

<210> 3

<211> 1280

<212> DNA

<213> 弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae PTZ0025)

<220>

<222> (1)…(1280)

<440>1

TGACGGGCGG TGTGTACAAG GCCCGGGAAC GTATTCACCG CAGCAATGCT 50

GATCTGCGAT TACTAGCGAC TCCGACTTCA TGGGGTCGAG TTGCAGACCC 100

CAATCCGAAC TGAGACCGGC TTTTTGAGAT TCGCTCCACC TTGCGGTATC 150

GCAGCTCTTT GTACCGGCCA TTGTAGCACG TGTGCAGCCC AAGACATAAG 200

GGGCATGATG ACTTGACGTC GTCCCCACCT TCCTCCGAGT TGACCCCGGC 250

GGTCTCCCGT GAGTCCCCAG CACCACAAGG GCCTGCTGGC AACACGGGAC 300

AAGGGTTGCG CTCGTTGCGG GACTTAACCC AACATCTCAC GACACGAGCT 350

GACGACAGCC ATGCACCACC TGTACACCGA CCACAAGGGG GCACCCATCT 400

CTGGGTGTTT CCGGTGTATG TCAAGCCTTG GTAAGGTTCT TCGCGTTGCG 450

TCGAATTAAG CCACATGCTC CGCCGCTTGT GCGGGCCCCC GTCAATTCCT 500

TTGAGTTTTA GCCTTGCGGC CGTACTCCCC AGGCGGGGAA CTTAATGCGT 550

TAGCTGCGGC ACGGACGACG TGGAATGTCG CCCACACCTA GTTCCCAACG 600

TTTACGGCGT GGACTACCAG GGTATCTAAT CCTGTTCGCT CCCCACGCTT 650

TCGCTCCTCA GCGTCAGTAT CGGCCCAGAG ATCCGCCTTC GCCACCGGTG 700

TTCCTCCTGA TATMTGCGCA TTTCACCGCT ACACCAGGAA TTCCGATCTC 750

CCCTACCGAA CTCTAGCCTG CCCGTATCGA ATGCAGACCC GGGGTTAAGC 800

CCCGGGCTTT CACATCCGAC GTGACAGGCC GCCTACGAGC TCTTTACGCC 850

CAATAATTCC GGACAACGCT TGCGCCCTAC GTATTACCGC GGCTGCTGGC 900

ACGTAGTTAG CCGGCGCTTC TTCTGCAGGT ACCGTCACTT TCGCTTCTTC 950

CCTGCTGAAA GAGGTTTACA ACCCGAAGGC CGTCATCCCT CACGCGGCGT 1000

CGCTGCATCA GGCTTTCGCC CATTGTGCAA TATTCCCCAC TGCTGCCTCC 1050

CGTAGGAGTC TGGGCCGTGT CTCAGTCCCA GTGTGGCCGG TCGCCCTCTC 1100

AGGCCGGCTA CCCGTCGTCG CCTTGGTGAG CCGTTACCTC ACCAACTAGC 1150

TGATAGGCCG CGGGCTCATC CTGCACCGCC GGAGCTTTCC ACCACCATCA 1200

GATGCCTGAA GTGGTCGTAT CCGGTATTAG ACCCCGTTTC CAGGGCTTGT 1250

CCCAGAGTGC AGGGCAGATT GCCCACGTGT 1280

Claims

1.一种生物活性物质弗霉素B，所述的弗霉素B由海洋弗氏链霉菌Streptomyces fradiaePTZ0025产生，具有以下化学结构式：

Figure 2012104352053100001DEST_PATH_IMAGE001

。

2.根据权利要求1所述的一种生物活性物质弗霉素B的制备方法，通过以下步骤实现：

（1）弗霉素B产生菌Streptomyces fradiae PTZ0025的培养分离

取空气干燥的海洋沉积物用液体菌种培养液稀释，稀释后的浓度为0.1~0.0001 g/ml,取稀释液均匀分散到含有固体培养基的培养皿中，在常温的20~30°C条件下培养7~15天,将不同的菌落分别转移到另一含有固体培养基的培养皿中，在常温的20~30°C条件下继续培养，最后将生长良好的单一菌落转移到斜面培养基并置于4°C冰箱保存备用；

所述的液体菌种培养液每100ml的组成为：5.0克葡萄糖、1.5克丙三醇、1.5克麦芽提取物、2.5克酵母提取物、0.5克酪蛋白氨基酸和0.1克碳酸钙，或是适宜菌株PTZ0025生长的其它组成的液体培养基；

（2）弗霉素B产生菌Streptomyces fradiae PTZ0025的菌种鉴定

步骤（1）所获得的菌株用目前实验室普遍使用的16S rDNA序列分析方法鉴定种类，确定为菌株弗氏链霉菌，分类命名为Streptomyces fradiae PTZ0025，已被武汉中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号CCTCC NO：M 2012374；

（3）弗霉素B产生菌Streptomyces fradiae PTZ0025发酵菌液的制备

取步骤（1）的单一菌落与灭菌水在微量离心管混合后匀浆，将细菌匀浆液转移到含有液体菌种培养液的小锥形瓶中，旋转振摇培养7~15天，培养温度为25~28°C，再转入含有液体培养基的大三角培养瓶，在常温条件下25~28°C旋转振摇发酵培养7~15天，得到具有抗菌活性的PTZ0025发酵菌液；

其中大三角培养瓶所用的液体培养基每500 ml的配方为：3.0 g葡萄糖，2.5 g丙三醇，7.5 g 可溶性淀粉，2.0 g 豆粉, 1.5 g 鱼粉，1.5 g氯化钙和50 ml灭菌海水，或是适宜菌株PTZ0025生长的其它配方的液体培养基；

（4）弗霉素B的提取分离纯化和结构鉴定

PTZ0025的发酵菌液经高速离心，弃去上清液后的残留物用有机溶剂提取，提取液经减压浓缩得到的提取物用Diaion HP-20大孔吸附树脂和十八烷基硅烷键合硅胶柱层析相结合的方法分离得到含有弗霉素B的活性组分，活性组分用高效液相分离纯化得到活性单体化合物弗霉素B。

3.根据权利要求2所述的一种生物活性物质弗霉素B的制备方法，其特征在于，步骤（1）样品稀释液的取样量为50~300 ml，培养皿所含的固体培养基为细菌琼脂培养基或其它固体培养基，斜面培养基为高氏合成斜面培养基或其它固体斜面培养基。

4.根据权利要求2所述的一种生物活性物质弗霉素B的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述的灭菌水为海水、蒸馏水或实验室其它用水，使用量为100~500 ml，液体菌种培养液同步骤(1)所述，使用量为20~50 ml。

5.根据权利要求2所述的一种生物活性物质弗霉素B的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述的有机溶剂为乙醇、甲醇或丙酮；所述柱层析的大孔吸附树脂用量与上量的提取物比例是10~20 ml：1.0 g，十八烷基硅烷键合硅胶用量与上量的样品量比例是40~60 g：1.0 g；所述的高效液相条件是: Agilent 1100高效液相色谱仪，Cosmosil C₁₈ 色谱柱 250 ′ 10.0 mm，5 mm，乙腈/水为流动相，检测波长295 nm，流速为3.0 ml/min。

6.根据权利要求1所述的一种生物活性物质弗霉素B在制备治疗金黄色葡萄球菌所引起的感染性疾病药物中的应用。

7.根据权利要求1所述的一种生物活性物质弗霉素B在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的恶性肿瘤为消化系统肿瘤和脑肿瘤，涉及肠癌和脑胶质瘤。

9.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述药物由弗霉素B单独或与其他抗感染药物或抗肿瘤药物或与其它活性化合物一起，与制剂允许的赋形剂或载体制成。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物的制剂形式为液体制剂、固体制剂、胶囊制剂、缓释制剂。